人乳腺癌多西紫杉醇耐药细胞株的建立及其耐药机制的探讨
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乳腺癌的化疗药物耐药机制研究乳腺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,化疗是乳腺癌治疗的重要手段之一。
然而,随着化疗的广泛应用,乳腺癌患者出现耐药问题,限制了药物治疗的效果。
为了克服这一挑战,科研人员对乳腺癌的化疗药物耐药机制进行了深入研究。
化疗药物耐药是指乳腺癌细胞对药物的抗性增强,导致治疗效果降低或失效。
针对乳腺癌的化疗药物耐药机制,目前研究主要集中在多种因素上,如基因突变、肿瘤微环境、肿瘤干细胞等。
基因突变是乳腺癌药物耐药机制中的重要因素之一。
研究发现,某些细胞因子受体基因的突变会导致乳腺癌细胞对药物的耐药性增强。
例如,HER2阳性乳腺癌患者常常出现HER2基因突变,使得HER2受体对靶向药物的敏感性下降。
此外,BRCA1、BRCA2等基因的突变也与乳腺癌化疗药物耐药性相关。
肿瘤微环境也为乳腺癌细胞抵抗化疗药物提供了条件。
肿瘤组织中存在的低氧环境、富含细胞因子的炎症环境等都是导致耐药性产生的重要因素。
这些环境因素不仅促进了肿瘤细胞的生存和增殖,还引起了炎症反应,降低了化疗药物的疗效。
此外,肿瘤干细胞也是乳腺癌化疗药物耐药性的重要原因。
肿瘤干细胞具有自我更新和多向分化的能力,能够在化疗过程中幸存下来,并通过激活特定的信号通路来产生抗药性。
乳腺癌患者中的肿瘤干细胞具有高度的耐药性,是导致药物治疗失败的主要原因之一。
针对乳腺癌的化疗药物耐药机制,科研人员提出了一系列的应对策略。
首先,基于基因突变的耐药机制,研究人员开发出了新的靶向药物,如HER2抑制剂和PARP抑制剂,以增强对耐药乳腺癌的治疗效果。
其次,通过抑制肿瘤微环境中的炎症反应和肿瘤血管生成,可以增强化疗药物的疗效。
此外,研究人员还通过免疫治疗、肿瘤干细胞靶向治疗等方式来应对化疗耐药问题。
总之,乳腺癌的化疗药物耐药机制是一个复杂的问题,涉及多个因素的相互作用。
通过深入研究这些机制,可以为乳腺癌的治疗策略提供新的思路和方法。
未来,科研人员将继续努力,进一步揭示该领域的奥秘,为乳腺癌患者的治疗提供更为有效的方案。
广西中医学院硕士学位论文多西紫杉醇长循环脂质体的研究研究生:罗远导师:韦文俊教授指导老师奉建芳研究员院系(部所):药学院专业:中药学研究方向:药物新制剂、新剂型的研究与开发完成日期:2008年 6 月 1 日目录中文摘要 (1)ABSTRACT (3)引言 (5)1 多西紫杉醇来源、分子结构 (5)2 多西紫杉醇的作用机制、药理作用及药动学研究情况 (6)2.1多西紫杉醇的作用机制 (6)2.2 多西紫杉醇药理作用及临床应用 (7)2.3多西紫杉醇药动学研究情况 (7)3 多西紫杉醇现有的制剂应用情况及问题 (7)4 长循环脂质体的研究进展 (8)5 关于多西紫杉醇脂质体文献及实验资料 (9)6 多西紫杉醇长循环脂质体的提出背景 (10)正文 (11)第一章多西紫杉醇长循环脂质体的处方前研究 (11)1 仪器与试药 (11)1.1 主要仪器 (11)1.2 试药及试剂 (11)2 方法与结果 (12)2.1 分析方法的建立 (12)2.2 多西紫杉醇在水中饱和溶解度的测定 (17)3 讨论 (17)4 结论 (17)第二章多西紫杉醇长循环脂质体制备工艺的研究 (19)1 仪器与试药 (19)1.1 主要的仪器 (19)1.2 试药及试剂 (19)2 方法与结果 (20)2.1 Doce-lipo中Docetaxel含量测定 (20)2.2 制备工艺的研究 (24)2. 3 Doce-lipo质量评价 (33)3 讨论 (35)4 结论 (35)第三章多西紫杉醇长循环脂质体冻干制剂及质量标准的研究 (37)1仪器与材料 (37)1.1 主要的仪器 (37)1.2 试药及试剂 (37)2方法和结果 (38)2.1 冻干工艺的考察 (38)2.2 冷冻干燥的处方筛选 (39)2. 3 Doce-lipo冻干针剂质量评价 (42)3 多西紫杉醇脂质体冻干粉针剂质量标准 (45)3.1性状 (45)3.2复溶时间 (45)3.3粒径与分布 (45)3.4 pH值 (46)3.5干燥失重 (46)3.6含量测定 (46)3.7包封率测定 (46)4 讨论 (47)5 结论 (47)第四章多西紫杉醇脂质体冻干针剂稳定性及安全性初步考察 (49)1仪器、试药及动物 (49)1.1 主要仪器 (49)1.2 试药及动物 (49)2 方法及结果 (50)2.1 Doce-lipo稳定性实验 (50)2.2 初步安全性试验 (51)3 讨论 (54)4.结论 (55)第五章多西紫杉醇长循环脂质体冻干针剂大鼠体内药物动力学研究 .. 57 1 仪器、试药及动物 (57)1.1主要仪器 (57)1.2 试药及动物 (57)2 方法及结果 (58)2.1血浆样品测定方法的建立 (58)2.2 Doce-lipo冻干针剂大鼠体内药代动力学试验设计 (62)2.3 Doce-lipo冻干针剂大鼠体内药代动力学试验结果 (63)3 讨论 (65)4 结论 (66)第六章多西紫杉醇长循环脂质体冻干针剂小鼠体内分布的研究 (67)1仪器、试药及实验动物 (67)1.1主要仪器 (67)1.2 试药及动物 (67)2 方法与结果 (68)2.1组织样品测定方法的建立 (68)2.2 Doce-lipo冻干针剂小鼠体内分布试验设计 (75)2.3 Doce-lipo冻干粉针剂小鼠体内分布试验结果 (75)3 讨论 (85)4 结论 (85)全文总结 (87)参考文献 (89)综述 (91)致谢 (101)攻读学位期间发表的学术论文目录 (101)广西中医学院研究生学位论文作者声明 (103)个人简历 (104)中文摘要目的:(1)建立多西紫杉醇长循环脂质体(Doce-lipo)的制备工艺、冻干工艺及质量标准。
乳腺癌的药物耐药机制研究乳腺癌是中老年女性最常见的恶性肿瘤之一,而药物治疗是乳腺癌治疗的重要手段之一。
然而,乳腺癌的耐药性问题一直困扰着医学界,使得部分患者无法获得有效的治疗效果。
为了解决这一问题,科学家们对乳腺癌的药物耐药机制进行了广泛的研究。
近年来,多项研究表明,乳腺癌的药物耐药主要与以下几个机制相关。
1. 靶向药物抵抗性突变:乳腺癌患者常常会被给予靶向治疗药物,如HER2抑制剂或激素受体拮抗剂。
然而,乳腺癌细胞存在着突变的倾向,使得它们对药物的作用产生变异。
这些突变可以导致靶向药物的结合位点发生改变,从而使得药物无法正常与肿瘤细胞结合,丧失治疗效果。
2. 药物外排泵增加:乳腺癌细胞往往通过上调药物外排泵,如P-gp 泵,来主动排出药物,减少药物在细胞内的积累。
这种细胞对药物的主动排出导致了药物浓度降低,使得有效治疗难以实现。
3. DNA修复机制增强:乳腺癌细胞的DNA修复机制是维持其正常生长和功能的一个重要环节。
然而,在药物治疗过程中,这些细胞会通过激活DNA修复途径来修复被药物破坏的DNA,减少药物对其的杀伤作用。
这就造成了药物治疗效果的降低。
4. 转录因子的改变:乳腺癌细胞的转录因子在癌细胞的生长和分化过程中发挥着重要的调节作用。
某些转录因子的改变可以导致乳腺癌细胞对药物的敏感性降低,从而产生耐药性。
针对以上机制,科学家们正在不断努力寻找乳腺癌耐药性的解决方案。
基于对乳腺癌细胞耐药机制的理解,新的药物设计和研发正在不断进行。
例如,研究人员正在致力于设计新型的靶向药物,以克服乳腺癌细胞突变导致的耐药问题。
此外,结合药物外排泵抑制剂的应用也被提出作为一种可行的解决方案。
另外,研究人员还通过抑制DNA修复途径,增加药物对乳腺癌细胞的杀伤作用。
通过抑制转录因子的活性,也有望恢复乳腺癌细胞对药物的敏感性。
这些新的治疗策略为乳腺癌的药物治疗提供了新的希望。
尽管乳腺癌的药物耐药机制研究已经取得了不少进展,但目前仍存在许多挑战。
多西他赛的药理与临床研究多西他赛是紫杉醇类抗肿瘤药,通过干扰细胞有丝分裂和分裂间期细胞功能所必需的微管网络而起抗肿瘤作用,主要用于先期化疗失败的晚期或转移性乳腺癌、使用以顺铂为主的化疗失败的晚期或转移性非小细胞肺癌的治疗。
现综述其药理毒理作用、药动学、临床研究、药物不良反应及注意事项的研究进展。
[Abstract] Docetaxel is an antineoplastic of paclitaxel.It interferences microtubule webs that is necessary by cell function in its mitosis and interphase. It used to treat advanced and metastatic breast cancer therapeutic failure in early stage, and to treat advanced and metastatic non-small cell lung cancer therapeutic failure using cisplatin . The article reviewed its pharmacology and toxicology, pharmacokinetics, clinical research, ADRS and precautions.[Key words] Docetaxel; Antitumor; Pharmacological effect; Clinical study多西他赛(docetaxel,DOC,多西紫杉醇)是紫杉醇类抗肿瘤药,通过干扰细胞有丝分裂和分裂间期细胞功能所必需的微管网络而起抗肿瘤作用,主要用于先期化疗失败的晚期或转移性乳腺癌、使用以顺铂为主的化疗失败的晚期或转移性非小细胞肺癌等的治疗。
DOC由法国罗纳普朗克·乐安公司研制开发并生产,先后在美国、日本等80 多个国家相继上市,1996 年进入我国开始临床验證,2002 年起先后有多家国内企业开始生产DOC仿制品。
紫杉醇耐药原因
紫杉醇是一种广泛应用于肿瘤治疗的化疗药物。
尽管它在治疗癌症方面具有较高的效果,但一些肿瘤细胞会对紫杉醇产生耐药性,即不再对该药物敏感。
以下是一些可能导致紫杉醇耐药的原因:
1. 细胞内药物排出机制:某些细胞可能表达了多种药物泵,例如P-glycoprotein(P-糖蛋白),这些泵可以将药物从细胞内
排出,减少药物在细胞内的积累。
2. 基因突变:细胞内的基因突变可能导致细胞对紫杉醇的耐药性。
例如,突变可能发生在药物的靶点微管蛋白(如β-tubulin)上,导致药物无法结合或影响其结合效果。
3. 细胞死亡途径异常:紫杉醇主要通过干扰肿瘤细胞的有丝分裂过程诱导细胞死亡。
因此,某些肿瘤细胞可能具有异常的细胞死亡途径,不受紫杉醇的影响。
4. 细胞内修复机制:细胞可能具有有效的DNA修复机制,可
以修复紫杉醇引起的DNA损伤,从而减少药物对细胞的毒性
作用。
5. 其他耐药机制:除上述原因外,还有多种其他机制可能导致细胞对紫杉醇产生耐药,例如细胞信号转导通路的异常、细胞周期调控异常等。
需要指出的是,不同的肿瘤类型和个体之间对紫杉醇的耐药机
制可能有所不同,因此准确确定耐药原因需要进行个体化的研究。
紫杉醇对癌症的疗效紫杉醇(paclitaxel)是从红豆杉科红豆杉属(Taxus)植物的树皮中提取得到的二萜类化合物。
它是一种新型的微管稳定剂,具有独特抗癌活性,被美国国立癌症研究所认为是近15~20年来肿瘤化疗的最重要的进展。
作为晚期卵巢癌的二线治疗药,至今已在40多个国家获准上市,并在乳腺癌、肺癌、白血病、胃肠道癌及介入治疗后的血管再狭窄等治疗上显示了令人鼓舞的疗效。
紫杉醇由于资源匮乏和水溶性低的问题而限制了它的临床应用。
1、多西紫杉醇结构多西紫杉醇是在C4和C5位置上含有一个带有氧四环的紫杉烷环结构,并在C13位置上含有一个庞大的酯侧链。
在其体外活性结构关系中显示C13酯侧链的特性和构型对于多西紫杉醇体外抗微管蛋白活性是置关重要的。
2、作用机制多西紫杉醇的作用机制主要在微管。
微管是由微管蛋白聚合而成。
微管蛋白则是α由和β两个多肽亚单位所组成的分子量为10万kDa的蛋白质。
在微管蛋白的聚合作用和微管的解聚作用之间存在动态平衡。
多西紫杉醇能加快微管蛋白聚合成微管的速度并延缓微管的解聚作用,导致形成稳定的非功能性的微管束,从而破坏有丝分裂和细胞增殖。
2、多西紫杉醇的药代动力学的药代动力学体外实验证实,多西紫杉醇对多种小鼠及人的肿瘤细胞株具有细胞毒作用,其细胞毒作用是紫杉醇的1.3-12 倍。
多西紫杉醇与紫杉醇的细胞内药代动力学比较显示出,(1)细胞内的药物浓度是紫杉醇的3倍;(2)细胞内贮留时间是紫杉醇的3倍;(3)药物表现为作用时间和浓度的依赖性。
研究表明泰索帝对5-Fu、DDP、VCR或VP16产生获得性耐药的多种细胞株无耐药性。
此外,尽管已有报道多药耐药细胞株会导致对紫杉醇获得性耐药,但研究显示,对紫杉醇的耐药细胞株仍对多西紫杉醇敏感。
对于药代动力学来讲,多西紫杉醇的血药浓度时间曲线下面积与所给多西紫杉醇剂量成正比,与多西紫杉醇清除无关,这符合线形药代动力学。
多西紫杉醇主要在肝脏中经细胞色素P450代谢形成4种主要代谢产物。
多西紫杉醇说明书
一、多西紫杉醇说明书1. 多西紫杉醇的适应症2. 多西紫杉醇的用法用量3. 多西紫杉醇的注意事项4. 多西紫杉醇的药理毒理二、多西紫杉醇的不良反应三、多西紫杉醇和紫杉醇的区别是什么
多西紫杉醇说明书
1、多西紫杉醇的适应症适用于局部晚期或转移性乳腺癌的治疗。
适用于局部晚期或转移性非小细胞肺癌的治疗,即使是在以顺铂为主的化疗失败后。
2、多西紫杉醇的用法用量静脉滴注。
泰索帝的推荐剂量为每三周75mg/m2滴注一小时。
为减轻体液潴留,除有禁忌症外,所有人在接受泰索帝治疗前均必须预服药物。
此类药物只能包括口服糖皮质激素类,如地塞米松,在泰索帝滴注一天前服用,每天16mg(例如:每日2次,每次8mg),持续3天。
只有医生才能修改治疗方案。
泰索帝不能用于中性粒细胞数目低于1500/mm3的病人。
泰索帝治疗期间,如果病人发生发热性中性粒细胞减少且中性粒细胞数目持续一周以上低于500/mm3,出现严重或蓄积性皮肤反应或外周神经症状,泰索帝的剂量应酌情递减。
3、多西紫杉醇的注意事项3.1、必须在有癌症化疗药物应用经验的医生指导下使用。
3.2、除有禁忌症外,所有病人在接受治疗前需预服药物以减轻体液潴留的发生。
3.3、中性粒细胞减少是最常见的不良反应。
治疗期间应经常对血细胞数目进行监测。
3.4、在开始滴注的最初几分钟内有可能发生过敏反应。
3.5、治疗期间可能发生外周神经毒性。
可能发生体液潴留。
CD44与乳腺癌化疗耐药的相关研究的开题报告一、研究背景乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,有严重的健康与生活威胁。
化疗是乳腺癌治疗中的主要手段之一,但是耐药是其治疗效果不佳的主要原因之一。
因此,寻找耐药机制并开发新的治疗靶点,对乳腺癌的治疗具有重要意义。
CD44是一种跨膜蛋白,在乳腺癌中被广泛研究。
研究表明,CD44在乳腺癌的侵袭、转移以及药物耐药中都起着重要的作用。
因此,探究CD44与乳腺癌化疗耐药之间的关系,对于乳腺癌的治疗具有重要意义。
二、研究目的本研究旨在探究CD44在乳腺癌化疗耐药中的作用及其机制,并探讨是否可以将CD44作为治疗靶点,提高乳腺癌化疗的疗效。
三、研究内容及方法1. 研究内容(1)构建乳腺癌细胞耐药模型:采用化学药物对乳腺癌细胞进行处理,筛选出化疗耐药的细胞株作为模型。
(2)分析CD44表达:采用免疫荧光、Western blotting等方法检测CD44在化疗敏感与耐药乳腺癌细胞中的表达水平。
(3)CD44功能验证:利用siRNA或者 shRNA等技术实现CD44的敲减或knockout,观察其对乳腺癌化疗敏感性的影响。
(4)机制探究:深入探究CD44在乳腺癌化疗耐药中的作用机制,例如其对抗氧化应激、细胞周期、凋亡调控的影响等。
2. 研究方法(1)细胞培养:选择MCF-7等常用的乳腺癌细胞系,用于细胞的生长、维护和处理。
(2)化学药物处理:利用多种化疗药物,如多柿菜碱、紫杉醇、环磷酰胺等,对乳腺癌细胞进行化疗。
(3)免疫荧光:利用免疫荧光技术检测细胞中CD44的表达情况。
(4)Western blotting:利用Western blotting技术检测CD44在细胞中的表达情况。
(5)siRNA或shRNA转染:利用siRNA或shRNA敲减或knockoutCD44,在细胞水平上检测CD44对化疗敏感性的影响。
(6)细胞实验:采用细胞凋亡检测、细胞周期分析等方法探究CD44的作用机制。
人乳腺癌多西紫杉醇耐药细胞株的建立及特性李文静1,张磊2,赖娅娜2,唐金海3,钟山亮1,恽文3,赵建华1(210009 江苏南京,南京医科大学附属省肿瘤医院临床检验中心1、科研科第三实验室2和普外科3)[摘要] 目的建立人乳腺癌多西紫杉醇(Docetaxel,Doc)耐药细胞模型MCF-7/Doc,初步探讨其生物学特性。
方法采用Doc低浓度逐步加量诱导法建立MCF-7/Doc耐药株;通过细胞形态学观察、生长曲线和群体倍增时间测定、MTT 法药物敏感试验及流式细胞术评价其生物学特性;实时荧光定量PCR和Western blot分别检测多药耐药基因MDR1 mRNA和蛋白的表达。
结果经10个月的诱导成功建立MCF-7/Doc细胞株,可在100 ng/ml Doc培养液中稳定生长,耐药指数为亲代敏感细胞MCF-7/S的33.3倍,对其他多种化疗药物呈交叉耐药状态。
光镜下,药物处理后细胞变圆变小、核分裂像减少;MCF-7/Doc倍增时间较MCF-7/S延长(41.6h vs 30.6h;P<0.01)。
与亲代相比,耐药细胞处于G1期和G2期的细胞增加、S期减少;MDR1基因表达水平增高90.7倍,蛋白表达转为阳性,而雌激素受体阳性表达丢失。
结论MCF-7/Doc细胞具有典型的多药耐药性,MDR1基因和蛋白过表达是其获得性耐药的主要机制之一。
[关键词] 乳腺癌细胞;多西紫杉醇;多药耐药;P糖蛋白[中图分类号] R737.9乳腺癌属全身性疾病,综合治疗非常关键,其中化疗是不可替代的重要手段之一;然而多药耐药(multi-drug resistance, MDR)常导致治疗失败以及后期肿瘤的复发和转移,严重威胁患者生存。
多西紫杉醇(Doc)是在天然抗肿瘤药物紫杉醇的基础上,经结构修饰后获得的一种新型抗肿瘤药物,溶解性好,药效更优。
临床实践表明,以Doc为主的联合化疗是乳腺癌、尤其是淋巴结阳性患者最有希望的治疗方案[1],但耐药问题也不容忽视,据报道其对转移性乳腺癌的治疗反应率为[基金项目]江苏省社会发展科技计划项目(BS),国家自然科学基金资助项目()第一作者:李文静,女,硕士研究生,主要方向:临床检验诊断学,电话:,E-mail:通讯作者:赵建华,女,硕士生导师,研究员,主要从事临床检验诊断学及肿瘤学研究:电话:, E-mail:30-50%[2]。
已知耐药细胞株是研究肿瘤MDR发生和逆转的重要模型,国内外报道现已建立多种乳腺癌耐药细胞株,但关于Doc乳腺癌耐药细胞株的建立国内还未见报道。
为此,本文通过低剂量逐步加量法体外诱导建立人乳腺癌多西紫杉醇耐药株,并对其生物学及耐药特性进行了初步研究。
1 材料和方法1.1 材料乳腺癌细胞株MCF-7/S为典型的雌激素受体(ER)阳性细胞株,分离自人乳腺腺癌组织上皮(上海细胞生物所);Doc、顺铂和卡铂(齐鲁制药),紫杉醇(太极制药)、多柔比星(海正药业)、吉西他滨(豪森药业)、他莫昔芬(扬子江药业)、甲氨蝶呤和依托泊苷(恒瑞医药)、羟喜树碱(李时珍药业);四甲基偶氮唑盐(MTT,Sigma);鼠抗人P-gp单克隆抗体(ABcam);辣根过氧化物酶(HRP)标记抗小鼠IgG (康为生物) 、HRP标记抗兔IgG(博士德生物)。
1.2 细胞培养MCF-7/S细胞培养于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100ug/ml 链霉素的DMEM高糖培养液, 在37℃、5% CO2饱和湿度条件下培养,经2-3次传代后至指数生长期进行实验。
1.3 MCF-7/Doc的建立首先测定Doc对MCF-7/S的半数致死浓度(IC50);以IC50的1/1000 Doc为起始浓度作用MCF-7/S细胞24h,生理盐水洗五遍,撤药常规培养并每天换液去除死细胞,约7-18天后存活细胞生长恢复,待进入对数生长期后传代1次,继续培养至生长良好且稳定时进行浓度逐步递增性诱导(梯度为10 ng/ml);如此反复,历时10个月,直至细胞能在100 ng/ml Doc培养液中稳定地传代生长。
双目倒置显微镜下观察各时段细胞的生长情况。
1.4 生长曲线测定将对数期MCF-7/S和MCF-7/Doc细胞经胰酶消化后制成2×104单细胞悬液,接种于24孔板,接种后第1~5天计数,每次计数3孔取平均值,绘制生长曲线。
按Patterson公式计算细胞在对数生长期的倍增时间:T d=Tlg2/lg(N T/N0),T d为倍增时间(h),T为细胞数由N0增至N T所用的时间,N为细胞数。
1.5 细胞IC50及耐药指数RI的检测1.5.1MCF-7对Doc的敏感性取1×105/ml MCF-7/S或MCF-7/Doc单细胞悬液,接种于96孔板,100μl/孔;培养24h后加入含相应浓度药物的培养液100μl/孔,每个药物浓度设4个复孔,同时设空白组和无药对照组;继续培养48 h,MTT法染色,CliniBio128 酶标仪检测550 nm处的吸光度(A)值,计算生长抑制率:生长抑制率= 1-(实验组平均吸光值/对照组平均吸光值)×100%;根据生长抑制率计算IC50[3] 和RI ,RI= IC50(MCF-7/Doc)/ IC50(MCF-7/S)。
独立重复3次。
1.5.2交叉耐药性按上述方法分别检测MCF-7/S和MCF-7/Doc细胞对常规化疗药物:紫杉醇、表柔比星、甲氨蝶呤、羟喜树碱、卡铂、顺铂、依托泊苷、吉西他滨及内分泌治疗药物他莫西芬的IC50,计算各RI。
1.6 细胞周期分布取对数期细胞消化制成单细胞悬液,1ml预冷70%酒精固定,-20℃过夜,PBS洗两次,碘化丙啶(PI)避光染30分钟,以流式细胞仪(美国BD FACSCalibur)于FLA-2参数下检测细胞周期,定量分析各时期的百分率及凋亡、坏死细胞的百分率。
独立重复3次。
1.7 MDR1基因相对定量使用TRIZOL法,提取细胞总RNA,测A260/A280值(NanoDrop2000)并计算其纯度和RNA含量;按BU-Script RT KIT说明,逆转录合成cDNA。
取2µl cDNA作为模板进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR;BIO-RAD iCycle扩增仪)。
MDR1引物:上游GTTGCTGCTTACATTCAGGTTTC和下游ACCAGCCTATCTCCTGTCGC,Taqman探针:TTGGTGCCTGGCAGCTGGAAGAC;β-actin引物:上游ACCGAGCGCGGCTACAG和下游CTTAATGTCACGCAGATTTCC,探针:TTCACCACCACGGCCGAGC。
以2-ΔΔCt计算MDR1 mRNA的相对表达量。
1.8 Western Blot检测P-gp和ER的表达蛋白上样量80µg,100V电泳2h;300mA 湿转2h;室温封闭1h;P-gp鼠单抗(1:500)、ER兔单抗(1:200)、β-actin鼠单抗(1:5000) 4℃过夜;HRP标记抗鼠二抗(1:2000)、HRP标记抗兔二抗(1:9000)室温1h;ECL液暗室发光显影。
1.9统计学分析采用SPSS16.0统计软件作t检验和单因素方差分析。
2结果2.1 细胞形态学观察光镜下,上皮来源的MCF-7/S细胞贴壁生长,呈长梭形或多角形、排列均匀,可见较多分裂像细胞。
加入Doc 24h后,细胞发生明显改变,胞体变圆变小,折光性增强,分裂像细胞数明显减少,且敏感细胞不断死亡,需数次换液不断清除死细胞,最后仅存少数贴壁细胞。
这些细胞不规则突起增多,胞体变大,空泡增多,继续培养中仍会有少量细胞崩解死亡,但随着撤药时间的延长,存活细胞最终可恢复原来形态并成团生长(图1)。
2.2 细胞生长曲线 MCF-7/S 和MCF-7/Doc 细胞的倍增时间分别为30.6±1.11h 、41.6±1.58h ,后者是前者的1.36倍,增殖速度明显减慢(t =﹣9.797,P =0.001;图2)。
2.3 细胞的耐药特性 与MCF-7/S 相比,MCF-7/Doc 不仅对Doc 有较高的耐药性,对其他多种药物也存在不同程度的交叉耐药性;其中对甲氨蝶呤、羟喜树碱有强的耐药,对紫杉醇、表柔比星、吉西他滨有较强耐药,对他莫西芬有轻度耐药,而对卡铂、顺铂及依托泊苷无明显耐药性(表1)。
表1 MCF-7/S 和MCF-7/Doc 细胞的药物敏感性细胞生长曲线5010015020012345培养时间(天)细胞数/1000MCF-7/S MCF-7/Doca . MCF-7/Sb . 加药24小时后 f . 20天左右完全恢复c . 撤药3-5天d . 撤药7-10天e . 撤药15天左右 图1 多西紫杉醇作用前、后及细胞恢复的全过程(放大倍数10×10)药物IC50/mg·L-1RI MCF-7/S MCF-7/Doc多西紫杉醇 2.49±0.87 82.89±5.21 33.29 紫杉醇0.39±0.13 7.80±2.07 20.00表柔比星0.86±0.24 18.37±0.98 21.36甲氨蝶呤0.02±0.01 3.71±0.99 185.35羟喜树碱0.14±0.03 44.33±2.60 310.00卡铂39.57±6.36 43.67±2.36 1.10顺铂 4.57±0.94 4.63±0.84 1.01 依托泊苷11.25±1.26 14.69±1.97 1.31吉西他滨0.32±0.08 7.27±1.84 22.72他莫西芬 5.03±0.11 14.87±2.03 2.962.4 细胞周期流式细胞仪结果显示,与MCF-7/S相比,MCF-7/Doc处于G0/G1期细胞增加、S期细胞减少、G2/M期细胞增加(表2、图3)。
表2MCF-7/S和MCF-7/Doc细胞的周期分布细胞类型细胞周期(%)G0/G1S G2/M MCF-7/S 54.19±1.14 41.02±6.37 1.57±0.34MCF-7/Doc 68.87±6.44 25.67±7.67 5.46±2.672.5 MDR1基因和P-gp 、ER 蛋白的表达 RT-qPCR 结果显示,MCF-7/Doc 细胞MDR1 mRNA 表达水平是MCF-7/S 的90.66±6.28倍(F =611.445,P <0.001)。