分子生物学实验教案2007上——张荃for student

教案2006-2007学年第二学期课程名称：分子生物学实验课程编号：4131204-学院、专业、年级：生命科学院生科04级***师：**教师所在单位：生命科学院生物技术系山东师范大学《分子生物学实验》教案-------------------------------------------------------------------------------课程简介本课程的前6个实验须完成整个分子克隆的基本系列程序，首先进行PCR扩增外源片段，经琼脂糖凝胶电泳并从琼脂糖凝胶中回收该外源DNA片段；再将回收的外源DNA片段与质粒载体pMD18-T进行连接，并CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞，之后将连接产物导入大肠杆菌感受态细胞，实现外源DNA转化的目的；转化子经蓝白斑筛选，再进行质粒的提取并对提取的质粒进行酶切鉴定，以确定整个系列实验的成功与否。

后2个实验是进行植物材料的DNA和总RNA的提取，让学生掌握这两个基本分子生物学实验的实验原理和方法。

本课程包括以下几个方面：1．聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段及琼脂糖凝胶电泳：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）简称PCR技术，是一种体外扩增特异DNA片段的技术。

PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。

PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。

利用PCR技术可在短时间内获得数百万个特异的DNA序列的拷贝。

PCR技术在分子克隆、遗传病的基因诊断等方面得到了广泛的应用。

几乎所有核酸实验都需要进行电泳。

电泳能按分子大小分离核酸分子，而且操作简便，用途广泛，诸如分子长度测定和核酸混合物的分离等。

实验目的：掌握PCR反应的原理及技术；了解琼脂糖凝胶电泳的原理，掌握琼脂糖凝胶的制作及进行电泳的方法。

2（1）．从琼脂糖凝胶中回收DNA片段：本实验所用的回收试剂盒的原理是在DR-1 Buffer存在的条件下，使含有DNA片段的凝胶融化，使DNA片段吸附于Spin column的滤膜上。

最后用Elution Buffer或灭菌的双蒸水溶出DNA。

实验目的：了解DNA片段回收的原理，掌握用试剂盒回收DNA的方法。

2（2）．DNA片段的连接（向质粒载体中插入外源DNA片段）：DNA片段之间的连接主要是在DNA连接酶的作用下，使DNA裂口上核苷酸裸露的3'羟基和5'磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使原来断开的DNA裂口连接起来。

实验在pMD18-T质粒载体中加入上个实验回收的DNA（插入片段）的DNA，在连接酶和Buffer的作用下于16℃进行连接反应。

产物放于-20℃冰箱中，用于下次实验的转化。

实验目的：了解DNA片段连接的原理，掌握DNA连接的方法。

3．大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）：用于感受态细胞制备的大肠杆菌菌株一般是限制-修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。

受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有外源DNA的载体分子进入的感受态细胞。

实验目的：学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。

4．转化及重组子的筛选：转化（transformation）是将异源DNA分子导入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。

其原理是细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。

转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。

进入细胞的DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞表现新的遗传性状。

将经转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转化体（transformant），即带有异源DNA分子的受体细胞。

实验目的：了解细胞转化的概念及其在分子生物学上研究中的意义；学习外源DNA转化入受体菌细胞并筛选转化体的方法。

5．质粒的提取(碱法) ：质粒是一种染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。

碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。

这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。

在碱性条件（pH12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。

当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中，用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。

实验目的：了解碱法提取质粒的原理，掌握碱法提取质粒的方法。

6．质粒的酶切验证：限制修饰系统在细菌中普遍存在，其目的是保护自身DNA不被外源基因污染，即限制和修饰的区分使外来的DNA易被限制性酶识别，由于其缺乏适当位点的甲基化而被切割掉。

基因工程中应用的是II类限制性内切酶，它们能识别特定的靶序列（4-6bp），每一种酶仅负责限制作用，每一独立的酶负责同一序列的甲基化反应，即内切酶和甲基化酶分离。

II类限制性内切酶可识别特异的、相当短的DNA序列作为结合位点，结合之后在识别位点处切割。

切割反应在DNA 重组和体外测序中应用广泛。

本实验利用限制性内切酶把环状质粒DNA切开，以检测质粒pMD18-T 载体中是否含有克隆的外源DNA片段。

实验目的：了解酶切原理。

教学大纲实验学时：18；实验个数：6 ；每个实验：3学时课程编号: 4131204 –课程性质：（必做）适用专业：生物科学 2004级教学方法与手段：实验与多媒体教学使用教材和主要参考书：1.《分子克隆实验指南》(第二版)，【美】J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯，科学出版社，19952.《精编分子生物学实验指南》，【美】F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿；颜子颖王海林译，科学出版社，19993.《基因工程》，楼士林，阳盛昌，龙敏南，章军，科学出版社，20024.《植物基因与分子操作》，顾红雅、陈章良等著，北京大学出版社，19955.《基因工程及其分子生物学基础》，静国忠主编，北京大学出版社，19996.《植物工程》，李立家，肖庚富，科学出版社，20047.《最新分子生物学实验技术》梁国栋主编科学出版社20018.《分子生物学理论与技术》顾晓松等主编北京科学技术出版社2001大纲执笔人：张荃一、实验课的性质与任务本课程为本科生分子生物学课实验教学部分而设定。

除了增进对分子生物学内容的理解，更重要的是培养学生的实验技能和创新思维设计。

二、实验课程目的与要求实验目的：为了适应分子生物学技术的发展，落实培养创新人才的目标，特开展本实验课程，以培养学生的动手能力，加强学生对分子生物学实验技术的理解。

实验要求：通过本实验课程的学习，要求学生掌握分子生物学的基本技能：核酸生化技术、蛋白质分离纯化技术等；除了实验操作，还要求学生学会实验分析及问题讨论。

三、实验项目1.聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段（及琼脂糖凝胶电泳）2.从琼脂糖凝胶中回收DNA片段；DNA片段的连接（向质粒载体中插入外源DNA片段）3.大肠杆菌感受态细胞的制备（CaCl2法）4.转化及重组子的筛选5.质粒的提取(碱法)6.质粒的酶切验证四、内容提要：见课程简介四、实验内容安排（包括教学目的与要求，教学重点和难点）：见各个分教案授课时间2007 .5.14（5.17 /5.19）第 1 次课《分子生物学实验》教案授课时间2007 .5.21（5.24/5.26）第 2 次课《分子生物学实验》教案授课时间2007 .5.21（5.24/5.26）第 2 次课教学内容：实验二（2）DNA片段的连接（向质粒载体中插入外源DNA片段）实验目的了解DNA片段连接的原理，掌握DNA连接的方法。

实验原理DNA片段之间的连接主要是在DNA连接酶的作用下，使DNA裂口上核苷酸裸露的3'羟基和5'磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使原来断开的DNA裂口连接起来。

实验仪器、材料与试剂（一）仪器1. 恒温水浴锅或恒温箱2. 微量取液器（二）材料实验二（一）回收的DNA片段。

（三）试剂试剂盒所带实验步骤1.加入pMD18-T Vector（约0.03pmol，质粒载体DNA）1μL，及上个实验回收的DNA（约0.1～0.3pmol，插入片段）的DNA溶液（TE缓冲液或去离子水）4μL，总体积为5μL。

2.加入与DNA溶液等量的Solution I（其中包括连接酶、Buffer、双蒸水）5μL。

3. 混合均匀后,3000-4000rpm 离心20-30秒；最好再混合并离心一次。

4. 16℃下连接45分钟至1小时。

5. 放于-20℃冰箱中，用于下次实验的转化。

6.当直接进行转化时，取上述连接反应液10～20μL 转化至100μL的感受态细胞。

注意事项➢回收的PCR产物、载体以及SolutionI组成的10μL反应体系需充分混匀。

➢在取SolutionI时，应使之不离开冰盒，以防酶活性的破坏。

➢如果反应温度升高（>26℃），较难形成环状DNA。

因此反应必须于16℃进行。

➢当连接反应难以进行时，可以适当延长反应时间。

当连接效率仍然无所改变时，可对DNA进行乙醇沉淀从而浓缩后再反应。

➢连接反应液可以直接用于转化，如发现转化效率偏低时，反应结束后向反应液中添加NaCl使其终浓度为500mM，然后进行转化，可改善转化效率。

pMD18-T Vector《分子生物学实验》教案授课时间2007 .5.28（5.31/6.2）第 3 次课《分子生物学实验》教案授课时间2007 .6. 4 （6. 7/6. 9）第 4 次课《分子生物学实验》教案授课时间2007 .6.11（6.14/6.16）第 5 次课《分子生物学实验》教案授课时间2007 . 6.18（6.21/6.23）第 6 次课。