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分光光度计使用原理及操作方法分光光度计使用原理及操作方法一、引言分光光度计是一种用于测定物质在不同波长下吸收或透射光的仪器。
它广泛应用于化学、生物、环境科学等领域的实验室研究和工业生产过程中。
本文将介绍分光光度计的使用原理和操作方法。
二、使用原理1.分光光度计基本构成分光光度计由光源、样品室、检测器和信号处理系统等组成。
光源通常使用可见光波段的白炽灯、氘灯或钨灯等。
样品室包含了样品槽和光路，用于将光从光源引导到样品上，并将样品吸收或透射的光引导到检测器上。
检测器一般是光电二极管或光电倍增管，用于将光信号转换为电信号。
信号处理系统对电信号进行放大、滤波和数值计算等处理，最终给出光吸收或透射的数值结果。
2.工作原理分光光度计的工作原理基于比耦光度计定律，即光强与样品中物质浓度成正比。
当光通过样品时，样品中的物质会吸收特定波长的光，导致光强减弱。
通过测量光源发出的光经样品后的光强，可以推导出样品中物质的浓度。
三、操作方法1.准备工作（1）将分光光度计放置在平稳的台面上，并接通电源。
（2）设置所需的工作波长和光强范围，确保仪器处于所需工作状态。
（3）清洁样品室和样品槽，确保无灰尘或杂质影响测量结果。
2.插入样品（1）打开样品室，将待测样品精确地放置在样品槽中，并确保样品紧密地与光路接触。
（2）关闭样品室，确保样品室的密封性。
3.零点校正（1）选择空白试样，即不含待测物质的样品，放置在样品槽中。
（2）按下零点校正按钮，使分光光度计记录下此时的光强值作为参考值。
4.测量样品（1）选择待测样品，放置在样品槽中。
（2）按下测量按钮，分光光度计会记录下此时样品吸收或透射的光强值。
（3）重复进行多次测量，以提高结果的准确性。
5.数据处理利用分光光度计提供的信号处理系统，对测量到的光强值进行相应的操作，如放大、滤波和数值计算等。
四、附件本文档无附加内容。
五、法律名词及注释（1）分光光度计：一种用于测定物质在不同波长下吸收或透射光的仪器。
分光光度计第三章分光光度计分光光度计和光电比色计的工作原理相同，都是利用物质对不同波长的光选择性吸收的现象，对物质进行定量及定性分析的仪器。
第一节分光光度计的类型分光光度计也有多种分类方法。
按工作波长范围不同来划分，分光光度计分为红外分光光度计、紫外分光光度计和可见(光)光分光光度计三类。
其中的紫外分光光度计均兼有可见光分光光度计的功能。
按待分析物质对光的吸收性质不同，可分为分子吸收光分光光度计和原子吸收分光分光光度计两类。
上述的红外、紫外和可见分光光度计均属于分子吸收分光光度计。
按待分析物质对光的作用效果来分，可分为发射光谱类分光分光光度计和吸收光谱类分光光度计两大类。
在医学上应用的发射光谱类分光光度计主要有荧光(分光)光度计和火焰(分光)光度计两类。
分子吸收光分光光度计和原子吸收分光分光光度计都属于吸收类分光光度计。
本节主要介绍基层医院最常用的721及722型两种可见(光)光分光光度计。
第二节可见分光光度计的原理及结构一、工作原理吸收式分光光度计都是根据物质对不同波长的光具有选择性地吸收的特点而进行工作的，它们都以朗伯-比尔定律作为定量依据。
当一束平行的、特定波长的单色光照射到有色溶液后，该有色溶液就会对光产生吸收。
溶液的浓度越大，对光的吸收越多。
其吸收程度符合朗伯-比尔定律。
即T,(，,，)100% t0,,,lg，,，,,,, t0式中:,为透射比。
，为透过光的强度。
t，入射光的强度。
0,为吸光度。
也叫消光度或光密度。
,为吸收系数。
,为溶液的浓度,为溶液的厚度。
朗伯-比尔定律(,,,,,)说明:当一束光通过有色溶液后，溶液的吸光度A与溶液的浓度C及液层厚度L成正比。
吸光度A与溶液的透射比T成负对数关系。
比色分析时，溶液的透射比T很容易测量出来。
通过对透射进行负对数计算，可以得到吸光度值。
再将吸光度除以相应的系数，便可求出待测溶液的浓度。
二、基本结构一般的可见分光光度计由光源、单色器、比色皿、光电转换器、前置放大器、对数放大器、显示部件及电源电路组成。
分光光度计的基本部件
分光光度计是一种常用的光谱测量仪器，用于测量物质的吸光度或透射率。
分光光度计的基本部件包括：
1. 光源：通常使用可见光源，如白炽灯或钨丝灯，可以发射连续光谱的光线。
2. 分光装置：将光源发出的光谱分解成不同波长的组成部分，常见的分光装置有棱镜或光栅。
3. 样品室：放置待测物质的区域，光线通过样品室时与样品发生相互作用，并产生吸收或透射。
4. 探测器：用于测量经过样品室的光的强度，常见的探测器有光电二极管或光电倍增管。
5. 电子分析系统：对探测器输出的信号进行放大、滤波、放大和数字化处理，以得到样品的吸光度或透过率。
6. 数据显示和处理：将处理后的数据显示在屏幕上，并通过计算机系统进行数据分析和存储。
这些基本部件共同组成了分光光度计，用于测量物质在特定波长范围内的吸光度或透射率，并可应用于分析化学、生物化学、环境科学等领域。
分光光度计使用时的注意事项分光光度计是利用物质对光的选择性吸取的特性，以较纯的单色光作为入射光，测定物质对光的吸取，从而对物质进行定性或定量分析的仪器，是基于物质对光（对光的波长）的吸取具有选择性，不同的物质都有各自的吸取光带，所以，当光色散后的光谱通过某一溶液时，其中某些波长的光线就会被溶液吸取。
在确定的波长下，溶液中物质的浓度与光能量减弱的程度有确定的比例关系，即符合比尔定律。
一、分光光度计日常使用注意事项①连续使用仪器的时间不应超过2小时，可以是间歇0.5小时后，再连续使用。
②比色皿每次使用完毕后，要用去离子水洗净并倒置晾干后，存放在比色皿盒内。
在日常使用中应注意保护比色皿的透光面，使其不受损坏或产生划痕，以免影响透光率。
③仪器不能受潮。
在日常使用中，应常常注意单色器上的防潮硅胶（在仪器的底部）是否变色，如硅胶的颜色已变红，应立刻取出烘干或更换。
④在托运或移动仪器时，应注意当心轻放。
二、分光光度计误差紧要是由4个原因导致1、复色光对比耳定律的偏离比耳定律成立的前提条件是人射光是单色光，但是精度再高的仪器，即使是双单色器的分光光度计，也只能获得近乎单色的光，无法获得纯单色光，它仍旧含有狭窄光通带，具有复色光的性质。
而复色光会导致比耳定律的正或负偏离。
固定狭缝的紫外分光光度计光谱带宽一般为1nm或2nm，可调狭缝的可以做到0、1nm；可见分光光度计带宽6nm、snm，甚至十几纳米。
光谱带宽应当是越小越好，但是，随着光谱辨别率的提高，仪器的灵敏度降低，所以，选择仪器时要综合考虑各种条件的影响。
当溶液浓度较小且单色光较纯时，可貌似认为符合比耳定律。
2、杂散光的影响杂散光是指进人检测器的处于待测波长光谱带宽范围外的其他波长组分，它是光谱测量中误差的紧要来源。
产生原因有：分光光度计的色散元件、反射镜、透镜及单色器内壁灰尘等。
在分光光度计工作波段边缘波优点，由于单色器透光率、光源辐射强度、检测器灵敏度都较低，杂散光的影响更为显着。
分光光度计工作原理
分光光度计是一种用来测量物质吸收、发射或透射光谱的仪器。
其工作原理主要包括以下几个方面：
1. 光源：分光光度计通过一个稳定的光源产生一束光。
常见的光源有白炽灯、钨丝灯、氘灯等。
光源发出的光通过空气或光学元件进入进样室。
2. 进样室：进样室是一个容器，光线进入其中与样品发生相互作用。
进样室通常由透明的材料制成，在光路上引入待测样品。
3. 分光装置：分光光度计采用一种称为分光器的光学元件，将进入进样室的光束分成两束。
其中一束光束与样品相互作用，这些光被样品吸收、发射或透射。
另一束光不经样品直接通过。
4. 检测器：分光光度计采用一种灵敏的检测器来测量透射或发射光的强度。
常见的检测器有光电二极管（Photodiode）、光
电倍增管（Photomultiplier tube）等。
5. 数据处理：分光光度计通过检测器测量样品光的强度，然后将其转换为电信号。
这些电信号经过放大、滤波、数值转换等处理，最终转化为测量结果。
常见的数据处理包括吸光度测量、发射光谱、透射光谱等。
总的来说，分光光度计通过光源、进样室、分光装置、检测器和数据处理等部件的协同工作，实现了对样品光的测量和分析。
这种测量分析方法可以广泛应用于化学、生物、医学等领域，用于研究物质的光学性质和测量物质的浓度等。
分光光度计的使用一、分光光度计的基本原理分光光度计是利用物质对特定波长的光吸收的原理来测量其浓度的仪器。
其基本原理是，通过可见光或紫外光源将特定波长的光线通过样品，然后检测经过样品后的光强度变化。
当物质吸收一定波长的光线时，吸收光线的强度与物质的浓度呈线性关系。
通过测量吸收光强的变化，可以推算出物质的浓度。
二、分光光度计的使用步骤1.打开仪器：首先打开分光光度计的电源开关，并等待一段时间，让仪器进行预热。
2.调节波长：选择合适的波长以适应被测物质的光吸收范围。
调节波长的方式因仪器不同而有所不同，通常通过旋钮、数字显示屏或软件界面等方式完成。
3.校准空白样本：将待测样品取出，放入容器中，并注入合适的溶剂制成空白样本。
将空白样本置于仪器上，按下校准按钮，以设定空白样本的吸光度为零基准。
4.加入待测样品：将待测样品加入容器中，注意保证样品的溶解度或稀释浓度适宜。
然后将样品置于仪器上，以便后续测量。
5.测量吸光度：按下测量按钮，仪器将自动扫描并记录样品的吸光度变化。
测量时间的长短与样品的吸光度变化速率有关。
6.计算浓度：利用仪器自带的软件或计算公式，根据测得的吸光度数据计算出样品的浓度。
三、分光光度计的注意事项1.玻璃容器：分光光度计通常使用玻璃容器来容纳样品，由于玻璃对紫外光的吸收较大，因此在紫外区域测量时需要使用石英或镀膜的玻璃容器。
2.样品制备：为保证测量结果的准确性，样品的制备应严格按照实验要求进行，避免样品中存在杂质或干扰物质。
3.清洗容器：在进行样品测量之前，应确保容器干净，无灰尘或杂质。
同时，使用纯净水或适当的溶剂来清洗容器，避免杂质对测量结果的影响。
4.光程：光程是指光线在样品容器中的传播距离，光程的选择应根据待测物质的吸光度范围进行，并尽量保持一致。
光程过长会降低灵敏度，而光程过短则易产生误差。
5.波长选择：根据实验需要选择合适的波长。
不同物质的最大吸收波长不同，选择错误的波长可能导致测量结果的不准确。
分光光度计的种类
分光光度计是用来测量光的强度的仪器，这种仪器可以测量波长
在可见光段的幅值，精度可以达到千分之一以上。
它通常分为三种类型：近红外分光光度计、可见光/紫外分光光度计和全光谱分光光度计。
1. 近红外分光光度计：使用基于近红外技术的专业仪器，可以检
测室内温度、湿度、光照度、环境压力、天气状况和污染物含量等参数，也可以测量星系中光频率的变化。
2. 可见光/紫外分光光度计：主要用于测量波长范围在
400nm~750nm之间的可见光和紫外光，精度可达到百分之一以上，常见
的紫外分光光度计可以用来测量测试光照度、紫外线强度、激发源的
能量分布和其他用于传感的实验检测等。
3. 全光谱分光光度计：这是一种将光的波长分解成不同区段的分
光光度计，可以用来测量宽幅度的光谱，测试当前样本中所有可见光
和紫外光含量，也可以用来测量源光光谱，从而推断样本的性质和含量。
分光光度计一．分光光度计基本结构简介能从含有各种波长的混合光中将每一单色光分离出来并测量其强度的仪器称为分光光度计。
分光光度计因使用的波长范围不同而分为紫外光区、可见光区、红外光区以及万用（全波段）分光光度计等。
无论哪一类分光光度计都由下列五部分组成，即光源、单色器、狭缝、样品池，检测器系统。
（1）光源要求能提供所需波长范围的连续光谱，稳定而有足够的强度。
常用的有白炽灯（钨比灯、卤钨灯等），气体放电灯（氢灯、氘灯及氙灯等），金属弧灯（各种汞灯）等多种。
钨灯和卤钨灯发射320－2000nm连续光谱，最适宜工作范围为360－1000nm，稳定性好，用作可见光分光光度计的光源。
氢灯和氘灯能发射150－400nm的紫外结，可用作紫外光区分光光度计的光源。
红外线光源则由纳恩斯特（Nernst）棒产生，此棒由ＺrＯ2:Ｙ2Ｏ3=17:3（Ｚr为锆，Ｙ为钇）或Ｙ2Ｏ3，ＧeＯ2（Ｇe为铈）及ＴhＯ2（Ｔh为钍）之混合物制成。
汞灯发射的不是连续光谱，能量绝大部分集中在253.6nm波长外，一般作波长校正用。
钨灯在出现灯管发黑时应及更换，如换用的灯型号不同，还需要调节灯座的位置的焦距。
氢粘及氘灯的灯管或窗口是石英的，且有固定的发射方向，安装时必须仔细校正接触灯管时应戴手套以防留下污迹。
（2）分光系统（单色器）单色器是指能从混合光波中分解出来所需单一波长光的装置，由棱镜或光栅构成。
用玻璃制成的棱镜色散力强，但只能在可见光区工作，石棱镜工作波长范围为185￣4000nm，在紫外区有较好的分辩力而且也适用于可见光区和近红外区。
棱镜的特点是波长越短，色散程度越好，越向长波一侧越差。
所以用棱镜的分光光度计，其波长刻度在紫外区可达到0.2nm，而在长波段只能达到5nm。
有的分光光系统是衍射光栅，即在石英或玻璃的表面上刻划许多平行线，刻线处不透光，于是通过光的干涉和衍射现象，较长的光波偏折的角度大，较短的光波偏折的角度小，因而形成光谱。
第六章 吸光光度法例6-1 铁(Ⅱ)-邻菲罗啉的摩尔吸光系数4101.1⨯=ε，计算桑德尔灵敏度。
解 240050.0101.185.55-⋅=⨯==cm g MS με例6-2 一种含有+2Mn、+3Cr 的未知试液，经氧化处理后得MnO ，CrO 试液，分别在440nm ，545nm 测得吸光度为0.385，0.653，b=1cm ，求试液中+2Mn，+3Cr浓度。
(已知5092,201,23,786545440545440====MnMn Cr Cr εεεε)解=--=+++MnCr Cr Mn MnCr Cr Mn Cr Cr Mn A A c 4405454405454405455454402εεεεεε 141024.1201237865092385.023653.0786--⋅⨯=⨯-⨯⨯-⨯L mol=⨯⨯-=-=-++7861024.1201385.044404404403CrMnMn Cr Mn Cr c A c εε141058.4--⋅⨯L mol对于吸收曲线有重叠的混合物试样、混浊样品或其他北京吸收较大的试样，由于存在很强的散射和非特征吸收，难以找到一个合适的参比消除其影响。
利用双波长技术可以从分析波长的信号中减去来自参比波长的信号，以消除散射以在测定波长时吸收的其它物质的干扰，从而提高选择性灵敏度，并简化了分析混合物的手续，扩大了光度分析的应用范围。
双波长分光光度计测得值为两波长下吸光度差值定量测定依据为bc A A A I I )(lg121212λλλλεε-=∆=-=- 标准曲线c A -∆曲线表示，试样溶液在两个波长1λ，2λ处的吸光度差值与试样溶液中待测物质浓度呈正比。
用双波长测定时，作为参比的不是另外参比液而是试液本身对某一波长的吸光度，这样抵消了样品混浊与基本不一致的误差，提高了灵敏度及选择性。
例6-3 某有色溶液在2.00cm 吸收池中，测得百分透光率T=50%，若改用(1)1cm ，(2)3cm 厚的吸收池时，其T 和A 各为多少？解 先求有色溶液在2cm 吸收池中吸光度A ，由公式可得30.0%50lg lg =-=-=T A由吸光度与液层厚度成正比，可求得厚度为1cm 和3cm 时有色溶液的吸光度，又据公式可求各自的T ：(1) b=1cm ，15.000.100.230.0=⨯=A 85.115.022%lg =-=-=A TT=71%（2）b=3cm ，45.000.300.230.0=⨯=A 55.145.022%lg =-=-=A TT=35%例6-4 某有色溶液置于1cm 吸收池中，测得吸光度为0.30，则入射光强度减弱了多少？若置于3cm 吸收池中，入射光强度又减弱了多少？解 求入射光强度减弱了多少，即求光通过溶液后，吸收光强度与入射光强度的比值。
已知当b=1cm 时，A=0.30，由入射光强度0I 、透过光强度I 及吸收光强度a I 三者之间的关系，以及吸光度与透光率的关系，即可求出a I 与0I 的比值。
Kbc I I A ==0lgIIA 0lg = 已知a I I I +=0，而T I I =0，则T I I a-=10又据公式T A lg -= A T -=10因此A aT I I --=-=10110(1)当b=1cm 时，A=0.30则此时入射光强度减弱的程度为%5050.050.0110110130.00==-=-=-=--A aI I (2)由公式A=Kbc ，当b=3cm ，其吸光度为1cm 时的3倍，即30.03⨯=A此时入射光强度减弱的程度为%4.87874.0126.0110110190.00==-=-=-=--A aI I例6-5 称取0.3511g O H SO NH FeSO 242446)(⋅⋅溶于水，加入1：4的42SO H 20mL ，定容至500mL 。
取VmL 铁标准溶液置于50mL 容量瓶中，用邻二氮菲显色后加水稀释至刻度，分别测得吸光度列于下表，用表中数据绘制工作曲线。
吸取5.00mL 试液，稀释至250mL ，再吸收此稀试液2.00L 置于容量瓶中，与绘制工作曲线相同条件下显色后，测得吸光度A=0.281。
求试液中铁含量(1-⋅mL mg )。
(已知85.55,17.39226)(24244==⋅⋅Fe O H SO NH rFeSO Ar M )解 先计算铁标准溶液的浓度1000.050017.39285.553511.0103=⨯⨯⨯=Fec 1-⋅mL mg工作曲线中各标准溶液中的铁的浓度：由上表数据绘制工作曲线如下：从工作曲线上查出当A=0.281时，对应的Fe 的浓度为1.4×10-31-⋅mL mg 。
这是50mL显色液中Fe 的浓度，它是由原试液取5.00mL 稀至250mL ，从其中取2.00mL 显色(体积为50mL)，因此原溶液的浓度为75.100.500.225050104.13=⨯⨯⨯⨯=-Fec 1-⋅mL mg例6-6 1，10-邻二氮菲测Fe ，已知+2Fe 浓度为500L g /μ，b=2cm ，nm 508max =λ，测得A=0.19，计算ε，s 。
(mol g M Fe /85.55=)解 66109.8185.55105002--⨯=⨯⨯==+V M m c Fe Fe 1-⋅L m o l cm mol L bc A ⋅⨯=⨯⨯==-/101.1109.8219.046ε 24/0050.0101.185.55cm g M s με=⨯== 例6-7 测定苯甲酸的离解常数，配制三种含苯甲酸浓度相同的溶液；0.11-⋅L mol42SO H 溶液，0.11-⋅L mol NaOH 溶液，0.11-⋅L mol NaAc —0.11-⋅L mol 42SO H 溶液(pH=4.74)，在nm 279=λ测的苯甲酸在三种溶液中的吸光度分别为A=0.540，300.0=-L A ,840.0=HL A ,求a K 值解 将A=0.540，300.0=-L A ,840.0=HL A ,代入式AA A A pH pK HL La --+=-lg64.4800.0lg 74.4)540.0840.0300.0540.0lg(74.4=+=--+=a pK即: 5103.2-⨯=a pK例6-8 有一分光光度计，刻度上透光度的读书误差为1格(相当于%1=∆T )，分别计算当测得的透光度为(1)1%，(2)50%时测定的相对误差。
解 透光度读书误差为1格，即%1=∆T =0.01 (1)当T=1%=0.01时，测定的相对误差可按式计算。
%2222.02434.001.0lg 01.001.0434.0-=-=-=⨯=∆c c 答案为负值，这是因为在计算中透光度读数误差用的是正值，若用负值，即01.0-=∆T 时，则计算得的相对误差为+22%。
实用上我们常忽略正负号而取绝对值。
(2)T=50%=0.50时%303.050.0lg 50.001.0434.0-=-=⨯=∆c c T=-0.50时%3=∆cc任何光度计都有一定的测量误差，这是由于光源不稳定，读数不准确等因素造成的。
一般分光光度计透光度读数误差T ∆为0.2%~2%。
两级测试。
例6-9 某金属离子与络合剂应生成1：1配合物，其摩尔吸光系数cm mol L ⋅⨯=/100.14ε。
测量时若使仪器测量误差最小，将吸收光度的读数范围控制在0.2~0.8，所用比色皿光径长度b=1cm ，试计算需配置金属离子的浓度c 的范围是多少？解 A=bcA=0.2， 541021100.12.0/-⨯=⨯⨯==b A c ε1-⋅L mol A=0.8， 541081100.18.0/-⨯=⨯⨯==b A c ε1-⋅L mol 在此显色体系中，欲使A 在0.2~0.8范围，应配置金属离子溶液浓度在10-5~10-41-⋅L mol 范围内。
例6-10 用摩尔比法测定镁与有机试剂的络合比，用HR 表示有机试剂，固定镁的总浓度为1×10-31-⋅L mol ，加入不同量配成一系列溶液，分别测定吸光度，测得的数据如下表所示，求络合物所含HR 与Mg 的摩尔比。
号码1 [HR]/[Mg]=0.2×10-3/1×10-3=0.2 号码 []/Mg (1-⋅L mol )[]/RH (1-⋅L mol )A 1 1×10-3 0.2×10-3 0.065 2 1×10-3 0.4×10-3 0.150 3 1×10-3 0.6×10-3 0.225 4 1×10-3 0.8×10-3 0.294 5 1×10-3 1.0×10-3 0.355 6 1×10-3 1.2×10-3 0.385 7 1×10-3 1.4×10-3 0.400 -3-3号码2~8 [HR]/[Mg]分别为0.4~2.0。
以[HR]/[Mg]为横坐标，A 为纵坐标作图，延长直线部分，相交于B 点，测的结果为[][]1:107.1:1:≈=Mg HR所以该络合物的组成为MgR 。
由图可得A 1=0.400，A 2=0.365，则522102.1101)400.0/365.01(400.0/365.0⨯=⨯-=-a K 例6-11 某有色溶液以试剂空白作参比，用1cm 吸收池，于最大吸收波长处，测得A=1.120，已知有色溶液的114105.2--⋅⋅⨯=cm mol L ε。
若用示差法测定上述溶液时，使其测量误差最小，则参比溶液的浓度为多少？ (示差法使用吸收池亦为1cm 厚)解法一 已知b=1cm ，4105.2⨯=ε，由公式bc A ε=，有色溶液的浓度为1541048.4105.21120.1/-⋅⨯=⨯⨯==mol L b A c ε用示差法测定有色溶液，欲使其测量相对误差最小，即测量的吸光度A=0.434，即 A 鲜脆为0.434，设所用的参比溶液用普通光度法测定时，其吸光度为686.0434.0120.1=-=s A已知b=1cm ，4105.2⨯=ε，686.0=s A ,则参比溶液的浓度s c 为1541074.2105.21686.0/-⋅⨯=⨯⨯==mol L b A c s s ε 解法二 先计算有色溶液的浓度1541048.4105.21120.1-⋅⨯=⨯⨯=mol L c 用示差法测量有色溶液，欲使其测量误差最小则测量的吸光度A 应为0.434，设所用参比溶液的浓度为s c 。
由示差法的工作原理可知，有色溶液与参比溶液两者浓度差为1541074.1105.21434.0--⋅⨯=⨯⨯=∆mol L c 则15551074.21047.11048.4----⋅⨯=⨯-⨯=∆-=mol L c c c s四、学习效果测试题及答案㈠ 选择题(1)邻菲罗林测Fe ,选择下面条件( )。
