几种抗原修复方法研究

临床与实验病理学杂志Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｅｘｐ　Ｐａｔｈｏｌ　２０１１　Ｄｅｃ；２７（１２）　。１２７１・　

・专家论坛・　

基于抗原修复技术的定量免疫组化：从实验、假说到　

研究计划　

石善溶　

关键词：抗原修复；定量；免疫组织化学　

中图分类号：Ｒ　４４６．８　文献标识码：Ａ　

文章编号：１００１—７３９９（２０１１）１２—１２７１—０５　

在人类历史上，自然科学的发展总是和新技术的发明密　

不可分。以形态学为例，１７世纪，光学显微镜的发明使人们　

认识到细胞的存在。随后一系列的组织固定、包埋以及切片　

染色技术的研发，导致组织病理学的产生　。１８９３年德国　

外科医师ＦｅＭｉｎａｎｄ　Ｂｌｕｍ偶然发现作为消毒剂的甲醛可以　

用于固定人体组织，自此甲醛固定石蜡包埋组织就成为常规　

生物组织标本的制备方法　沿用至今，成为国际通用的组织　

病理学经典方法。所有病理学的诊断原则和形态学标准均　

建立在甲醛石蜡组织加ＨＥ染色切片的基础上，是临床肿瘤　

诊断的最重要依据。　

随着化学、物理学、免疫学以及分子生物学的飞速进步，　

一系列新技术被用于组织病理学，不断刷新形态学的面貌。　

在所有新技术中，免疫组化是最重要和最具影响力的一种特　

殊染色方法，被誉为病理学的“棕色革命”。从技术开发史　

来看，免疫组化经历了７０多年不断的改进后才广泛地用于　

今日的诊断病理学。Ｊａｇｉｒｄａｒ　指出在免疫组化发展史上几　

次重大的突破：首先是单克隆抗体以及以酶标抗体法为基础　

的高敏感ＡＢＣ试剂问世；继而加热抗原修复技术（ｈｅａｔ—ｉｎ—　

ｄｕｅｅｄ—ａｎｔｉｇｅｎｅ　ｒｅｔｒｉｖａｌ，ＡＲ）于１９９１年发明，成为免疫组化发　展史上重要的里程碑。Ｇｏｗｎｌ４　强调说，所有己发表的有关　

免疫组化用于石蜡切片的文献都必须划分为两个时代：ＡＲ　

前和ＡＲ后时代，１９９１年首篇ＡＲ论文的发表就是这两个时　代的分水岭　Ｊ。　

免疫组化在形态学和临床病理学方面的广泛应用为医　

学开辟了崭新的局面。数以万计的文献从外科病理诊断的　

病理学研究中免疫组化方法优化策略

在病理学研究中，免疫组化方法是一种常用的实验技术，用于检测生物组织和细胞中特定蛋白质的表达情况。本文将介绍病理学研究中免疫组化方法的优化策略，以提高实验的准确性和可重复性。

免疫组化方法的优化从以下几个方面入手。首先是抗体的选择。抗体的选择应根据实验目的和所需检测的靶蛋白质来确定。在选择抗体时，要注意其抗原特异性、亲和力和稳定性。现今市场上有许多供应商提供各种抗体，研究人员可以通过文献调研和试验验证选择合适的抗体。

其次是适当的样本处理。样本处理是提高免疫组化实验可靠性的关键环节。细胞或组织样本采集后需立即进行固定，通常使用4%的甲醛固定样本。固定时间和温度的选择也是影响结果的重要因素。固定时间过短或过长，都会影响抗原特异性和形态学结构的保留。

后续处理涉及到脱水、清洁、渗透和包埋等步骤。脱水是将固定的样本逐渐浸泡于浓度逐渐升高的乙醇中，以去除水分。清洁步骤是移除固定样本表面的蜡块、油脂等污染物，以保证免疫反应的发生。渗透使用的溶剂需要与制备蜡块相同，以免在包埋过程中出现蜡破裂现象。包埋是将样本浸入熔蜡中，在蜡中形成固态块，以方便组织切片。

接下来是抗原的修复处理。一些蛋白质在固定和包埋过程中会发生降解和破坏，从而影响其免疫反应性。因此，需要进行抗原的修复处理。常用的修复方法包括热水浴法、微波炉法和酶解法等。这些方法能够恢复抗原的免疫活性，提高抗体的结合效果。

免疫反应是免疫组化实验的核心步骤。在进行免疫反应时，必须控制好反应温度、时间和抗体浓度等因素。温度过高或时间过长可能导致非特异性结合增加，产生错误的结果。抗体浓度的选择要通过实验验证确定，过高的抗体浓度可能会造成非特异性背景。

免疫反应后，需要进行信号检测。常用的信号检测方法包括酶标法、荧光标记和放射免疫测定法等。不同的检测方法有其各自的优缺点，研究人员可以根据实验需要和设备条件选择合适的检测方法。

最后是结果的分析和解释。在免疫组化实验中，结果的正确解读至关重要。分析结果时应结合文献资料和实际情况，排除假阳性和假阴性的可能性。结果的解释要综合考虑实验的条件、抗体的特异性和细胞组织的结构等因素，提高研究的可靠性和可重复性。

免疫组化是融合了免疫学原理（抗原抗体特异性结合）和组织学技术（组织的取材、固定、包埋、切片、脱蜡、水化等），通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素)显色，来对组织（细胞）内抗原进行定位、定性及定量的研究(主要是定位)。样本是细胞或组织，要在显微镜下观察结果，可能出现膜阳性、质阳性和核阳性。elisa（酶联免疫吸附试验） 用到了免疫学原理和化学反应显色，待测的样品多是血清、血浆、尿液、细胞或组织培养上清液，因而没有用到组织包埋、切片等技术，这是与免疫组化的主要区别，操作上 开始需要将抗原或抗体结合到固相载体表面，从而使后来形成的抗原-抗体-酶-底物复合物粘附在载体上，这就是“吸附”的含义。

免疫组化和elisa所用到的原理 大致相同，只是因为所检测的样品不同，从而在操作方法上有所不同。Elisa多用于定量分析，其灵敏度非常高。

western bolt 先要进行SDS-PAGE，然后将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载体上，而后利用抗原-抗体-标记物显色来检测样品，可以用于定性和半定量。

免疫学三大工具，免疫组化、Western、ELISA，分别用于定位，定性和定量。以下western和Elisa的区别不是原创，是找的资料。

western blotting 可以看到特异性的条带，但是定量比较烦

elisa可以直接读出浓度，但是如果抗体有非特异性结合，那得到的数值就不可信。

WB只能半定量,但是可以检测细胞膜蛋白,这点ELISA做不到

ELISA可用定量方法检测蛋白,也就是说可以观察不同浓度刺激物对目的蛋白的影响

WB所检测的一般是抗原，

而Elisa抗原抗体都可以检测。

WB所检测的抗原可以知道其分子量的大小，或是否是多聚体、降解产物等，一句话，WB可以确定所用抗体是与那种蛋白起作用的；而Elisa无能为力，一锅端了。

WB所适用的一抗一般是线性位点的，

ELISA线性或构象型抗体都可以使用。

冰冻切片免疫组化染色步骤

引言

冰冻切片免疫组化染色是一种常用的实验方法，用于研究细胞和组织的分子表达。它结合了冷冻样本的切片技术和免疫组织化学染色的原理，能够可视化特定分子在组织中的位置，从而帮助我们理解生物过程和疾病机制。本文将介绍冰冻切片免疫组化染色的步骤和注意事项。

步骤一：样本制备

1. 收集组织样本，根据需要进行切割和处理。

2. 快速冷冻组织样本，可用液氮或乙醚等方法冷冻，并保存在低温环境中。

步骤二：切片制备

1. 取出冷冻样本，将其置于切片机或切片冷冻器中。

2. 进行组织切片，通常厚度为5-10微米，利用切片刀或者切片冷冻器的微调装置。

3. 将切片收集在清洁的载玻片上，可以使用专门的载玻片来增强切片与载玻片间的附着力。

步骤三：固定和脱水

1. 将载玻片上的切片放入4%的中性缓冲福尔马林缓冲液中固定细胞和蛋白质。

2. 固定15-30分钟后，用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将福尔马林去除。

3. 将切片脱水，使用逐渐浓度的乙醇和脱水溶液，如70%乙醇、95%乙醇和100%乙醇。

步骤四：抗原修复

1. 对于有些抗原，如细胞核抗原，需要进行抗原修复。这可以通过热、酸或酶消化等方法进行。

2. 一种常用的抗原修复方法是将切片置于高温或高压下进行热诱导抗原修复。 步骤五：阻断和孵育

1. 使用蛋白质阻断剂，如牛血清蛋白、BSA等，在切片上进行孵育，以防止非特异性结合。

2. 孵育时间通常为30分钟至1小时。

步骤六：一抗孵育

1. 加入一抗，即特异性抗体，与切片上的靶分子结合。

2. 一抗浓度和孵育时间根据实验需要和抗体质量进行优化。

步骤七：洗涤

1. 使用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将未结合的一抗去除。

2. 洗涤时间和次数根据实验要求和抗体特性进行优化。

步骤八：二抗孵育

1. 加入荧光标记的二抗，与一抗结合形成复合物。

2. 二抗可以识别一抗的种类，常见的二抗有荧光标记的抗鼠IgG、抗兔IgG等。