分析化学-高效液相色谱法

简述高效液相色谱法中流动相的要求高效液相色谱法（High-performance liquid chromatography，HPLC）是一种用于分离和分析化学、生物和制药样品的色谱技术。

在高效液相色谱过程中，流动相的选择和性能对分析的准确性和分离效果有着重要的影响。

下面将详细介绍高效液相色谱法中流动相的要求。

1.基础流动相特性：流动相应具有一定的极性和溶解性能。

常用的流动相包括水和有机溶剂，如甲醇、乙醇和乙腈等。

流动相的选择应考虑到待分离组分的性质和分析目的，要保证样品能够溶解并很好的分离。

常用的流动相配比为水/有机溶剂（如乙腈）的比例，比如常见的70:30、50:50等。

2.pH值调节：根据待分离物和色谱柱的性质，适当调节流动相的pH值可以改变待分离物的电离状态，从而影响它们在色谱柱上的分配行为。

比如，对于具有酸性基团的分析物，可以通过酸或碱的加入来调节流动相的pH值，以影响它们与色谱固定相之间的相互作用。

3.离子强度调节：有些样品中可能存在电解质，其离子强度会对分离产生影响。

在这种情况下，可以通过添加相应的盐来调节流动相的离子强度，以改变分析物与色谱固定相的相互作用。

常用的盐有甲酸铵、硫酸铵、三氟乙酸等。

4.流速控制：流动相的流速也对色谱分离的效果有着重要的影响。

流速过快可能导致分离不充分，流速过慢则会增加分析时间。

流速的选择需根据待分离物的性质、色谱柱的尺寸和色谱仪的性能等因素综合考虑。

5.除气和过滤：流动相中的气泡和杂质会影响液相的流动性和检测信号的稳定性。

因此，在使用前应对流动相进行除气处理，以减小气泡对色谱分离的干扰。

同时，对流动相进行过滤处理，可以去除其中的固体颗粒和微生物等。

通常使用0.45μm的滤膜进行过滤。

6.流动相稳定性：流动相应具有良好的稳定性，以保证分析结果的准确性和重复性。

一般来说，流动相中的溶液成分要充分溶解，不发生相分离和析出现象。

所以，流动相的配制要求严格，要遵循相应的配方和混合方法，并在使用前进行充分的搅拌和均匀。

高效液相色谱和超高效液相色谱高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）和超高效液相色谱（Ultra High Performance Liquid Chromatography，UHPLC），是现代分析化学中常用的分离技术。

它们可以对复杂的混合物进行分离和定量分析，广泛应用于药物分析、食品分析、环境分析、生物分析等领域。

本文将从原理、仪器、方法和应用等方面，介绍高效液相色谱和超高效液相色谱的基本知识。

一、原理高效液相色谱和超高效液相色谱的原理基本相同，都是利用样品在流动相中的分配系数差异，通过固定相和流动相的作用，将混合物中的化合物分离出来。

不同的是，超高效液相色谱采用了更小的颗粒固定相，使得流动相可以更快地通过固定相，从而提高了分离效率和分离速度。

在高效液相色谱和超高效液相色谱中，样品首先被注入流动相中，然后通过固定相的柱子。

固定相通常是一种多孔的固体材料，如硅胶、C18等。

样品中的化合物在流动相中的分配系数不同，因此在通过固定相时，会被分离出来。

分离出来的化合物，会在检测器中被检测到，从而实现分离和定量分析。

二、仪器高效液相色谱和超高效液相色谱的仪器基本相同，主要由注射器、流动相泵、柱子、检测器和计算机控制系统等组成。

（一）注射器注射器是将样品引入流动相中的关键部分。

常用的注射器有手动注射器和自动进样器。

手动注射器通常用于小样品量的分析，而自动进样器可以实现高精度、高效率的样品进样。

（二）流动相泵流动相泵是将流动相送入柱子中的装置。

其主要功能是控制流动相的流速和流量，并确保流动相的稳定性。

常用的流动相泵有恒压流量泵和梯度流量泵。

恒压流量泵可以保持恒定的流量，适用于等浓度的流动相。

梯度流量泵可以实现不同浓度的流动相混合，从而实现更好的分离效果。

（三）柱子柱子是高效液相色谱和超高效液相色谱的核心部分，用于固定相的分离。

常用的柱子材料有硅胶、C18、C8等。

什么是HPLC（高效液相色谱）？简史和一些定义液相色谱(LC)是俄国植物学家Mikhail S. Tswett在20世纪初定义的概念。

他当时专注于使用填充有颗粒的柱子分离用溶剂从植物中提取的化合物[叶色素]，这是液相色谱史上的先驱性研究。

Tswett用颗粒填充开放式玻璃柱。

他发现粉状白垩[碳酸钙]和氧化铝这两种特殊材料对分离有用。

他将样品[均质化植物叶子的溶剂提取物]倒入柱中，使样品通过颗粒床。

然后使纯溶剂通过。

当样品在重力作用下穿过柱子时，可以观察到样品分成了不同颜色的谱带，这是因为某些组分的移动速度快于其他组分。

他将这些不同颜色的分离谱带与样品中最初包含的不同化合物联系起来。

根据各种化合物对颗粒的化学吸引力强度不同，对这些化合物进行了分析分离。

对颗粒有更强吸引的化合物移动速度减慢，而对溶剂有更强吸引的其他化合物移动速度较快。

该过程可以描述如下：样品中包含的化合物在称为流动相的移动溶剂与称为固定相的颗粒之间以不同的方式分布或分配。

这导致各种化合物以不同的速度移动，从而引起化合物的分离。

Tswett创造了色谱(chromatography)[来自希腊词chroma（意思是颜色）和graph（意思是书写）的组合，即“彩色的书写”）]一词来描述其色彩斑斓的实验。

[有趣的是，俄语名字Tswett的意思是颜色。

]目前，各种形式的液相色谱已成为分析化学领域的一种强大工具。

液相色谱(LC)技术液相色谱可使用平面技术[技术1和2]或柱技术[技术3]来实施。

柱液相色谱的功能更为强大，并且具有更高的样品容量。

在所有情况下，样品都必须先溶解在液体中，然后输送到色谱装置之上或色谱装置内部。

技术1.将样品以点状形式上样到固定在玻璃板表面上的色谱颗粒[固定相]薄层上，然后使液流流过该薄层。

板的底部边缘置于溶剂中。

当溶剂[流动相]扩散至干燥颗粒层并沿玻璃板向上移动时，通过毛细管作用产生液流。

这种技术被称为薄层色谱或TLC。

HPLC，即高效液相色谱法，是一种在分析化学、有机化学、生物化学等领域有着广泛应用的技术。

在使用HPLC进行实验时，需要注意以下事项：流动相的纯度：流动相必须是高纯度的，以保证色谱柱和检测器的性能。

如果流动相中含有杂质，可能会堵塞色谱柱，影响分离效果。

流动相的脱气：流动相在使用前需要进行脱气处理，以避免在实验过程中产生气泡，干扰实验结果。

样品处理：对于复杂的样品，需要进行适当的预处理，如提取、浓缩、纯化等，以去除干扰物质，提高分离效果。

色谱柱的清洗和维护：色谱柱是HPLC的核心部件，需要定期清洗和维护，以保证其性能和使用寿命。

检测器的选择：根据实验需求选择合适的检测器，如紫外检测器、荧光检测器等。

实验条件的选择：根据实验需求选择合适的实验条件，如流速、流动相组成、柱温等。

数据的记录和处理：实验过程中需要记录详细的实验数据，并采用适当的软件进行数据处理和分析。

总之，使用HPLC进行实验需要注意细节，严格遵守实验操作规程，以保证实验结果的准确性和可靠性。

高效液相色谱法(HPLC)一．概述色谱法是一种应用范围相当广泛的分离分析技术，它已有近百年的发展史。

二十世纪五、六十年代石油及石油化工的突起促使了GC技术大发展，而七、八十年代生命科学、生化、制药工业的发展推动了HPLC的迅速发展。

目前除分析化学外，生物化学，石油化学，有机化学，无机化学等学科都普遍采用色谱技术。

现代高效液相色谱仪，以其高效，快速和自动化等特点成为当代分析仪器中发展最快的仪器。

HPLC已成为操作方便、准确、快速并能解决困难分离问题的强有力的分析手段。

1．HPLC的特点（1）适用范围广已知有机物中仅20%不经预先化学处理，可用GC分析；而其余80%有机物可用HPLC分析。

HPLC适于分离生物、医学大分子和离子化合物，不稳定的天然产物，种类繁多的其它高分子及不稳定化合物。

（2）流动相及固定均与样品分子作用，而GC仅固定相与样品分子作用。

（3）具有独特性能的柱填料（固定相）种类较多，具有多种分离方式，适于各种化合物分析。

（4）分离温度较低，提高了分离效率。

（5）具有一些独特的检测器：电化学，示差折光，可见紫外吸收及荧光检测器等。

（6）样品易回收。

2．HPLC分类按分离机理分为四类：吸附色谱（液固）：通过试样组分对活性固体表面吸附亲合力的不同实现分离。

对具有不同官能团的化合物和异构体有较高选择性，早期应用较多，现在大多可用正相键合相色谱替代，常用硅胶柱。

分配色谱：不同溶质分子按其在固定相和流动相中分配系数不同得到分离。

现代分配色谱即化学键合相色谱，是将各种不同的有机基团通过化学反应键合到硅胶表面，具有很好的化学稳定性和热稳定性。

大部分分离问题都可用键合相色谱解决。

离子交换色谱：以离子交换剂为固定相，试样中电离组分与交换剂基体相反电荷的离解部位亲合力不同而分离。

用于分离无机或有机离子。

固定相为阴（阳）离子交换树脂，流动相为电解质溶液。

分子排阻色谱：按物质分子量大小进行分离。

不仅对高聚物，对分子量差别较大的低聚物或小分子化合物也可进行分离。

高效液相色谱测定法
高效液相色谱测定法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分离和定量技术，可
以用于分离和测定复杂的混合物。

它基于物质在流动相（溶剂）和固定相（色谱柱上的填料）之间的相互作用的差异，利用流动相的流动将待测样品分离成不同的组分。

通过分析组分的保留时间和色谱峰的峰面积或峰高，可以定量不同组分的含量或浓度。

高效液相色谱测定法具有分离效率高、分析速度快、灵敏度高、重复性好等优点，因此在许多分析领域得到广泛应用。

它可以应用于生物医药、环境监测、食品安全等多个领域，用于分析和监测有机化合物、无机化合物、药物、天然产物、食品成分等。

高效液相色谱测定法的基本步骤包括：样品预处理、制备流动相、样品进样、流动相流动、色谱柱分离、检测器检测、结果处理等。

根据样品的性质和分析要求，可以选择不同的检测器，如紫外检测器（UV）、荧光检测器、质谱检测器等。

需要注意的是，高效液相色谱测定法在操作过程中需要注意样品制备和仪器条件的优化，以提高分离效果和分析结果的准确性。

此外，也需要注意流动相成分的选择、色谱柱的使用寿命等因素对分离效果的影响。

HPLC原理及基本操作HPLC（高效液相色谱法）是一种广泛应用于分析化学和制药工业中的分离技术。

它基于液相色谱法，通过将样品溶解在流动相中，并通过固定填料进行分离和分析。

1.样品的溶解：样品通常是固体或液体，在HPLC中需要将其溶解在流动相中。

流动相可以是水、有机溶剂或它们的混合物。

2.固定相填料的选择：HPLC中的填料通常是高度吸附性和具有大表面积的细小颗粒。

这些颗粒被填充在色谱柱中，提供了分离和分析的平台。

3.流动相选择：流动相的选择取决于样品的性质和目标分析的目的。

流动相的成分和配比可以根据需要进行调整，以改变分离效果和分辨率。

4.注射样品：将样品通过注射器引入HPLC系统，注射器将样品推入色谱柱中。

5.流动相的微量泵：流动相的微量泵非常重要，它通过控制流动相的流速将样品推过填料。

6.色谱分离：样品在填料中根据其亲水性（亲水性成分被保留在固定相上，疏水性成分则被推至溶剂流动相）进行分离。

固定相越亲水，则与样品中的亲水性成分相互作用越强；固定相越疏水，则与样品中的疏水性成分相互作用越强。

7.检测器：色谱柱的末端通常装有检测器，用于检测样品溶液中目标化合物的浓度。

8.数据处理：使用计算机系统分析检测器输出的图形数据，然后计算和解释结果。

HPLC基本操作：1.准备样品：将样品溶解在适当的溶剂中。

2.准备色谱柱：将填料装入色谱柱中，并使其适当压实。

3.连接色谱柱：将装有填料的色谱柱连接至HPLC系统。

4.设置流动相：根据需要设置流动相的组成和配比，通过微量泵提供流动相。

5.设置检测器：根据需要设置检测器，选择适合目标化合物的检测方法。

6.注射样品：使用自动或手动注射器将样品引入HPLC系统。

7.运行分析：通过微量泵控制流速，运行HPLC系统使样品通过色谱柱，分离和分析目标化合物。

8.数据处理：使用计算机系统分析检测器输出的图形数据，进行峰面积计算、峰高定量等数据处理。

9.结果解释：根据分析结果解释样品中的目标化合物的存在和浓度。