PCR purification kit

ReagentsThe Multiplexing Sample Preparation Oligonucleotide K it 96 samples/kit PE-400-10011. Index PE Adapter Oligo Mix, part # 10057112. PCR Primer InPE 1.0, part # 10057123. PCR Primer InPE 2.0, part # 10057134. PCR Primer Index 1, part # 10057145. PCR Primer Index 2, part # 10057156. PCR Primer Index 3, part # 10057167. PCR Primer Index 4, part # 10057178. PCR Primer Index 5, part # 10057189. PCR Primer Index 6, part # 100571910. PCR Primer Index 7, part # 100572011. PCR Primer Index 8, part # 100572112. PCR Primer Index 9, part # 100572213. PCR Primer Index 10, part # 100572314. PCR Primer Index 11, part # 100572415. PCR Primer Index 12, part # 1005725Paired End DNA Sample Prep Kit 10 sample/kit PE-102-1001 Klenow EnzymeKlenow BufferKlenow FragmentT4 DNA Ligase BufferT4 DNA PolymeraseDNA LigaseDNA Ligase Buffer 2*Phusion DNA PolymeraseTE Buffer10 mM dNTP Mix1 mM dATP, diluted from dATP vialT4 PNKNebulization BufferNebulizersUltra Pure WaterMultiplexing Sequencing Primers and PhiX Control Kit, 100 flow cell lanesIndex sequencing primer 120ul part # 1005726Multiplex Rd2 sequencing primer 120ul part # 1005727Mutiplex PhiX control 15ul part # 1005728NaOH 30ml part # 0801-1005TE buffer 20ml part # 1006425Wash buffer 37ml part # 0801-1002Hyb buffer 12ml part # 1000166Paired-End Cluster Generation Kit, v418- and 36-Cycle Illumina Sequencing Kits v4User-suppliedPurified DNA (1–5 μg, 5 μg recommended)DNA should be as intact as possible, with an OD260/280 ratio of 1.8–2.0 Compressed air of at least 32 psiClamp (1 per nebulizer)PVC tubing• Fisher Scientific, catalog # 14-176-102• Nalgene Labware, catalog # 8007-0060QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, part # 28704)MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN, part # 28004)QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, part # 28104)Certified low range ultra agarose (BIO-RAD, part # 161-3106)Low molecular weight DNA ladder (NEB, part # N3233L)DNase/RNase-Free distilled water50X TAE bufferEthidium bromideLoading bufferDisposable scalpels 切胶刀片User-SuppliedLens cleaning tissue(4) 125 ml Nalgene bottles (ThermoFisher Scientific, catalog # 2019-0125) (3) 50 ml conical tubesMilliQ water or laboratory grade water (for washing the Paired-End Module)雾化1.取出喷雾器拧开蓝色的盖子2.戴手套取下vinyl tubing，沿着中央的雾化管滑下。

用QIAquick PCR Purification Kit行酶切产物回收或PCR产物回收，具体步骤如下：
①30μl酶切后产物加入150μl Buffer PB中，混合后密切观察颜色变化，若为黄色，则继续下步操作。

②把QIAquick吸附柱（QIAquick column）放入2ml采集管（collection tub）。

③把①中的所得溶液放入QIAquick吸附柱中，13,000rpm 离心1min。

④0.75 ml Buffer PE加入QIAquick吸附柱中漂洗，
13,000rpm离心1min。

弃掉废液，并把QIAquick吸附柱放入2ml 收集管中。

⑤再次以13,000rpm离心1min，尽量除去漂洗液，并再次把QIAquick吸附柱放入2ml收集管中。

⑥取出QIAquick吸附柱，放入一个干净的1.5ml微量离心管中。

⑦在吸附柱的中间部位加50 μl Buffer EB (10 mMTris•Cl, pH
8.5)，温室放置1min，
⑧再次以13,000rpm离心1min后取上清液，-20度保存备用。

pcr材料PCR材料是实验室中进行聚合酶链式反应（PCR）的重要组成部分。

PCR是一种革命性的分子生物学技术，可以扩增特定的DNA片段，并产生大量的目标DNA。

PCR材料主要分为试剂盒、DNA模板、引物、聚合酶和缓冲液等。

1. 试剂盒：PCR试剂盒是用于PCR反应的集成化试剂盒。

它通常包括核苷酸dNTPs（脱氧核苷三磷酸）、聚合酶、缓冲液、镁离子和其他辅助试剂。

这些试剂通过精确的浓度和配比来确保PCR反应能够成功进行。

2. DNA模板：DNA模板是PCR反应中用于扩增的起始材料。

它可以是从细菌、动物、植物或人体组织中提取的DNA。

DNA模板可以是基因、基因组、cDNA或已经扩增并纯化的DNA片段。

3. 引物：引物是PCR反应中用于扩增目标DNA片段的两端序列特异性的短DNA片段。

它们是由设计师根据目标DNA序列设计的，并且它们在PCR过程中特异性地与模板DNA结合，从而指导DNA扩增。

引物分为前向引物和反向引物，通常由从5’到3’方向读取的序列组成。

4. 聚合酶：PCR反应需要一种特殊的酶来合成新的DNA链。

这种酶被称为热稳定DNA聚合酶，最常用的是来自Thermus aquaticus的Taq聚合酶。

热稳定DNA聚合酶可以在PCR反应温度的变化下保持其活性，并引导新的DNA链合成。

5. 缓冲液：PCR反应中的缓冲液可以维持反应的pH值，抵抗反应条件变化而产生的酸碱变化。

它通常包含Tris-HCl缓冲盐和KCl盐，以提供合适的离子强度和有效的碱液中和能力，从而确保PCR反应的正确进行。

此外，还有一些辅助试剂，如镁离子、葡萄糖、BSA（牛血清白蛋白）和二甲基亚砜（DMSO），它们被用于优化PCR反应的特定条件，例如增加酶活性、提高引物与模板的结合亲和力或减少反应中的非特异性产物。

综上所述，PCR材料包括试剂盒、DNA模板、引物、聚合酶和缓冲液等，这些材料的配比和浓度对于PCR反应的成功与否至关重要。

AxyPrep PCR清洁试剂盒本试剂盒适合从PCR、酶促反应、测序反应的反应液中提取多至8 μg DNA（大于75bp），回收率为70-90%。

纯化的DNA不含引物、酶蛋白及单核苷酸。

一、试剂盒组成、贮存、稳定性Cat. No. AP-PCR-4 AP-PCR-50 AP-PCR-250制备次数 4 preps 50 preps 250 prepsPCR制备管 4 50 2501.5 ml离心管 4 50 2502 ml离心管 4 50 250Buffer PCR-A 2 ml 20 ml 100 mlBuffer W2 concentrate 2.4 ml 24 ml 2×72 mlEluent 1 ml 5 ml 25 ml说明书 1 1 1Buffer PCR-A：DNA结合溶液。

室温密闭贮存。

Buffer W2 concentrate：去盐液。

使用前，按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇（可用100%乙醇或95%无水乙醇），混合均匀，室温密闭贮存。

Eluent：2.5 mM Tris-HCl，pH8.5，室温密闭贮存。

二、注意事项1. Buffer PCR-A含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，谨防吸入口鼻。

若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。

2. DNA分子呈酸性，建议在2.5 mM Tris-HCl，pH8.5洗脱液中保存。

三、实验准备1. 准备无核酸和核酸酶污染的Tip头、离心管。

2. 第一次使用前，Buffer W2 concentrate按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。

3. 使用前，检查Buffer PCR-A是否出现沉淀，若出现沉淀，应于65°C温浴加热至沉淀完全溶解并冷却至室温后再使用。

4. 将Eluent或去离子水加热至65°C，有利于提高洗脱效率。

四、操作步骤用户可以选择负压法或离心法。

QIAquick® PCR Purification KitThe QIAquick PCR Purification Kit (cat. nos. 28104 and 28106) can be stored at room temperature (15–25°C) for up to 12 months.For more information, please refer to the QIAquick Spin Handbook, March 2008, which can be found at: /handbooks.For technical assistance, please call toll-free 00800-22-44-6000, or find regional phone numbers at /contact.Notes before startingAdd ethanol (96–100%) to Buffer PE before use (see bottle label for volume).All centrifugation steps are carried out at 17,900 x g (13,000 rpm) in a conventional table-top microcentrifuge at room temperature.Add 1:250 volume pH indicator I to Buffer PB. The yellow color of Buffer PB with pH indicator I indicates a pH of ≤7.5. If the purified PCR product is to be used in sensitive microarray applications, it may be beneficial to use Buffer PB withoutthe addition of pH indicator I. Do not add pH indicator I to buffer aliquots.1.Add 5 volumes Buffer PB to 1 volume of the PCR reaction and mix. If the color ofthe mixture is orange or violet, add 10 μl 3 M sodium acetate, pH 5.0, and mix.The color of the mixture will turn yellow.2.Place a QIAquick column in S a provided 2 ml collection tube or intoz a vacuum manifold. For details on how to set up a vacuum manifold, refer to the QIAquick Spin Handbook.3.To bind DNA, apply the sample to the QIAquick column and S centrifuge for30–60 s or z apply vacuum to the manifold until all the samples have passedthrough the column. S Discard flow-through and place the QIAquick columnback in the same tube.October 20104.To wash, add 0.75 ml Buffer PE to the QIAquick column S centrifuge for30–60 s or z apply vacuum. S Discard flow-through and place the QIAquick column back in the same tube.5.Centrifuge the QIAquick column once more in the provided 2 ml collection tubefor 1 min to remove residual wash buffer.6.Place each QIAquick column in a clean 1.5 ml microcentrifuge tube.7.To elute DNA, add 50 μl Buffer EB (10 mM Tris·Cl, pH 8.5) or water (pH 7.0–8.5) to the center of the QIAquick membrane and centrifuge the column for1 min. For increased DNA concentration, add 30 μl elution buffer to the centerof the QIAquick membrane, let the column stand for 1 min, and then centrifuge.8.If the purified DNA is to be analyzed on a gel, add 1 volume of Loading Dye to5 volumes of purified DNA. Mix the solution by pipetting up and down beforeloading the gel.For up-to-date licensing information and product-specific Array disclaimers, see the respective QIAGEN kit handbook or usermanual.Trademarks: QIAGEN®, QIAquick® (QIAGEN Group). 1063920 10/2010© 2010 QIAGEN, all rights reserved.。

微生物多样性建库流程3.1操作流程3.2试剂和仪器PCR的酶：Phusion（NEB)切胶后纯化: MinElute® PCR Purification Kit磁珠纯化：VAHTSTM DNA Clean BeadsQubit检测: Quant-iTTMds DNA HS Reagent and HS Buffer Qubit® assay tubes仪器名称生产厂家型号微型离心机TIANGEN 1795 卧式冷藏冷冻转换柜海尔BC/BD-629HK 4°C冰箱海尔HYC-360振荡器SI G560E96 well PCR 仪AB 990224孔离心机EPPENDORF 5424EQ7667513.3流程3.3.1目标区域PCR(50ul体系)试剂名称用量基因组DNA 40-60 ng*Vn F（10μM) 1.5μl*Vn R（10μM) 1.5 μlQ5 High-Fidelity DNA Polymerase 0.2 μlHigh GC Enhancer 10 μlBμffer10 μldNTP 1 μlddH2O 补至总体系50μl按上表配置反应试剂：因为目前是以检测报告中的PCR预实验结果来判定样品合格标准，所以请建库人员根据反应条件：95℃5min95℃1min50℃1min 15 cycles72℃1min72℃7min4℃∞3.1.2目标区域PCR产物纯化样品与磁珠按照1:1.5混匀后进行磁珠筛选片段，35ul洗脱。

向3.1中的PCR产物中加入60μl的AMPure XP 磁珠，混匀室温5min后，置于磁力架上5min，去上清；加入200μl的80%乙醇清洗磁珠，室温30s后弃上清，重复此步骤一次；置磁力架上干燥3min，用37μl ddH2O重悬磁珠，室温孵育2min，置于磁力架上2min，吸取35μl上清至新的PCR管中。

3.1.3 Solexa PCR试剂名称用量目的区域PCR纯化产物10μl★MPPI-a（10μM) 1μl★MPPI-b（10μM) 1μl2×Phμsion HF MM20μlddH2O 8μlTotal 40μl注：★根据index上机安排进行选择。

文中如未特别指出，PCR程序均为：95℃预变性5',95℃变性30",60℃退火30", 72℃延伸1'30" (短片段30"), 30个循环后延伸10min。

1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物。

1.1.1载体构建及鉴定1．PCR产物的纯化参见安比奥生物科技公司的Puprep PCR Purification Kit 说明书。

2. 载体构建（Gateway技术）pDONR201是一种attP供体载体，用于BP反应构建入门载体，包含抗kan和抗cm筛选标记，并且含有ccdB基因，ccdB基因编码干扰大肠杆菌DNA促旋酶的一种蛋白，从而抑制标准大肠杆菌宿主的生长。

当目的载体和入门克隆发生重组时，ccdB基因被目的基因取代。

携带有ccdB基因的未反应载体或保留有ccdB基因副产品的细胞将不会生长。

GatewayN-GFP一种attR目的载体通过LR反应构建目的基因的表达载体（图3.3），含有35S组成型强启动子、抗氨苄青霉素基因和抗除草剂筛选标记基因Bar，还含有绿色荧光蛋白报告基因GFP。

表达载体Gatewaypleela（图2.2）含有35S组成型强启动子、抗氨苄青霉素基因和抗除草剂筛选标记基因Bar，通过LR反应构建目的基因的表达载体。

图2.2 pDONR201的结构BP反应体系(att B x att P → att L x att R )att B-PCR产物40-100 fmol,25-50ngpDONR™75ng5x BP Clonase™- buffer 1 μlTE Buffer (pH 8.0) or H2O to 4.5μlBP Clonase™0 .5μlTotal 5μl反应体系放于25°C下温育2h。

反应后，加2 μl 2 μg/μl的Proteinase K在37°C下处理10 min，再将BP产物（入门载体）加2μl转入大肠杆菌DH5α，在含kan的LB 板上筛选，克隆并保存入门载体。

PCR产物纯化试剂盒（离心柱型）GK2051 50次GK2052 100次一、试剂盒组成Components GK2051 (50次）GK2052 (100次)DNA Recovery Column 50个100个2-ml Collection Tube 50个100个Binding Solution 25ml 50 mlWash Solution (1)12ml 24 mlElution Buffer (2)10ml 20mlProtocol 1 copy 1 copy二.产品特点1. 应用范围广：去除PCR反应体系以及各种反应体系(如酶切体系,连接体系等)中的dNTPs，多余的引物，缓冲体系和酶等，也可用作DNA的浓缩和纯化。

2. 快速简便、节省时间：无需酚-氯仿抽提，不含乙醇沉淀步骤，整个纯化过程约需 15min。

三.注意事项1.如果PCR反应体系含有非常多的非特异性条带，建议使用Gel Recovery Column柱式胶回收试剂盒(GK2041/2042)。

2.该试剂盒不能去除PCR反应体系中的双链DNA模板以及长度大于50bp的单链引物。

四.实验准备1.首次使用前，必须在Wash Solution瓶中加入4倍体积的无水乙醇，充分混匀后使用。

每次使用后将瓶盖盖紧，以保持Wash Solution中的乙醇含量。

如果发现Wash Solution由于运输或保管不当造成体积严重不准，请用量筒定容后再加入4倍体积的无水乙醇。

2.Elution Buffer为2.5mMTris-HCl（pH8.5）。

TE（pH8.0）或者去离子水（pH>7.0）均可以使用，但是DNA的洗脱效率通常要低20%左右。

五.操作步骤1. PCR反应结束后，从PCR反应管中将反应液移至干净的1.5ml离心管中，加入5倍体积的BindingSolution ，上下颠倒混匀。

注意：一般情况下采用50-100ul的PCR反应液进行PCR产物纯化，如果欲纯化的PCR反应液体积不足50ul，请加入灭菌的双蓁水补足到50ul。

pcr试剂盒生产工艺PCR试剂盒是用于聚合酶链反应（PCR）的试剂，其中包含PCR反应所需的各种材料和试剂。

现今PCR试剂盒常见的产品包括PCR Master Mix、PCR标准物质、PCR探针、PCR酶、模板DNA等。

以下将介绍PCR试剂盒的生产工艺。

1. 原材料准备：根据产品的需求，准备PCR试剂盒所需的原材料，包括PCR反应条件中的缓冲液、dNTPs、MgCl2等，以及其他辅助试剂如PCR酶、探针等。

同时，检查原材料是否符合要求，如检测dNTPs的纯度、PCR酶的活性等。

2. 缓冲液配制：将所需的缓冲液配制好，一般采用称量法或浓度法进行配制，并严格控制缓冲液的pH值和溶液浓度。

在配制过程中需要注意杂质的混入，因此需要使用纯净的试剂和洁净的容器。

3. PCR酶生产：PCR试剂盒中最关键的部分是PCR酶。

PCR酶一般是通过基因工程技术从热稳定酶的产生菌株中得到，然后经过清除杂质、纯化和浓缩等步骤得到纯净的PCR酶。

生产过程中需要注意PCR酶的保存条件和使用条件，以确保酶的活性和稳定性。

4. 校正反应条件：根据产品要求，进行PCR反应条件的确定和校正。

这包括PCR反应的温度、时间、循环次数等参数的优化，并通过实验进行验证。

如需添加PCR探针，则需要进行探针的序列设计和验证，以及PCR反应条件的优化和验证。

5. 产品包装：将生产好的PCR试剂盒进行包装，一般采用密封袋或密封管进行包装。

在包装过程中需要注意卫生和无菌条件，以确保产品的质量和稳定性。

6. 质量控制：对生产好的PCR试剂盒进行质量控制，包括外观检查、产品标签检查、产品成分和浓度检查等。

同时进行PCR反应的性能验证，如PCR的灵敏度、特异性等，以确保产品质量符合要求。

7. 产品存储和运输：将生产好的PCR试剂盒进行适当的存储和运输。

一般来说，PCR试剂盒需要存放在低温条件下，避免光照和震动。

在运输过程中，需要采取适当的包装和保护措施，以避免产品的损坏和污染。

DNA回收从样本到结果8.1PCR回收8.2胶回收8.3酶促反应物回收8.4染料终止子去除DNA 样本回收技术确保成功的下游应用，如新一代测序。

高通量测序对于包括全基因组测序、再测序、转录子图谱和基因调控研究等一系列应用至关重要。

QIAGEN DNA 回收技术确保您的成功 ——从样本到结果。

/PG/DNACleanup手动方法■自动化方法■手动与自动方法兼容■8.0回收试剂盒选择指南3648.1PCR 回收/PG/PCRcleanupPCR DNA 回收，最小洗脱体积■离心柱方式 ■MinElute PCR Purification Kit 36696孔板方式■MinElute 96 UF PCR Purification Kit367PCR DNA 回收，标准洗脱体积■离心柱方式 ■QIAquick PCR Purification Kit 36896孔板方式■QIAquick 96 PCR Purification Kits3698.2胶回收/PG/gelextractionDNA 胶回收，最小洗脱体积■70 bp – 4 kb DNA 片段■MinElute Gel Extraction Kit 370DNA 胶回收，标准洗脱体积■70 bp – 10 kb DNA 片段■QIAquick Gel Extraction Kit 37140 bp – 50 kb DNA 片段■QIAEX II Gel Extraction Kit3728.3酶促反应物回收/PG/rxncleanupDNA 回收，最小洗脱体积■离心柱方式■MinElute Reaction Cleanup Kit 373去除核苷酸 ，标准洗脱体积■离心柱方式■QIAquick Nucleotide Removal Kit 374手动方法■自动化方法■手动与自动方法兼容■8.4染料终止子去除/PG/dyeremoval测序反应DNA 回收■离心柱方式和96孔板方式■DyeEx Kits375QIAGEN 的DNA 回收技术仅用于分子生物学研究。

pcr 试剂和耗材质检内容PCR（聚合酶链反应）是一种重要的基因分析技术，在基因工程、医学诊断、疾病研究和法医学等领域广泛应用。

为了确保PCR实验的准确性和重复性，选择合适的试剂和耗材至关重要。

下面将介绍PCR试剂和耗材的质检内容。

1. 批次检查：首先，需要检查PCR试剂和耗材的批次信息，包括生产厂商、生产日期、有效期等内容。

每个批次的试剂和耗材性能可能会有差异，因此需要确保使用的是同一个批次的试剂和耗材，以保证结果的一致性。

2. 试剂质量评估：PCR试剂包括引物、探针、Taq酶、dNTPs 等。

可以通过以下方式进行质量评估：- 引物和探针：使用质谱仪检测引物和探针的纯度和分子量，确保它们的质量符合要求。

- Taq酶：可通过加热步骤激活Taq酶，然后进行扩增反应，观察扩增结果，确保Taq酶活性高，不会出现假阴性或假阳性结果。

- dNTPs：可以进行dNTPs的浓度检测，确保其浓度符合实验要求。

3. 耗材质量评估：PCR耗材包括PCR管、试管、PCR板、吸头等。

以下是耗材的质量评估方法：- 无菌检测：使用无菌技术检测PCR耗材是否有细菌或其他微生物污染，确保实验结果的准确性。

- 材料检测：例如，使用熔点试验检测PCR管的熔点是否符合要求，使用红外线光谱仪检测PCR管的材料成分是否符合要求等。

- 耐温性能：对PCR耗材进行耐温性能测试，包括在不同的温度下进行加热周期，观察PCR耗材是否能够耐受高温，是否发生变形或裂纹。

4. 质量控制：对PCR试剂和耗材进行一些质量控制措施可以保证实验的准确性和可靠性。

例如：- 引物和探针的设计：确保引物和探针的序列与目标基因完全匹配，可通过测序验证引物和探针的特异性。

- 核酸污染检测：使用质量控制方法检测试剂和耗材是否有核酸污染，以避免假阳性结果。

- 防污染措施：使用无菌技术操作PCR试剂和耗材，避免外源性 DNA 的污染。

5. 数据分析和结果验证：PCR实验完成后，需要对实验结果进行数据分析和结果验证，确保结果的准确性和可靠性。

本仪器一次最多可处理32个样本，并且设置了多个缺省程序。

如果您对NPA-32有兴趣，请致电Bioflux 技术服务部门。

注意事项：由于方法上的特殊性OD数值可能高于预期而不能真实反映纯化效果，请结合电泳结果综合进行评价.如果有任何问题,请致电Bioflux 技术服务部门。

附录ⅢFAQQ1: MagaBio核酸纯化系统与其它具有相同应用的已面世的磁珠产品有何不同? A:I. 大多数以磁珠为基础的核酸产品使用的是硅磁性颗粒/微粒子，它们对核酸的结合能力低下。

II. 它们对核酸的亲和力有限，因为在洗涤过程中需要使用有机溶剂比如乙醇。

III. 有些产品需要两种洗涤液。

IV. 其它类型的以磁珠为基础的核酸纯化方法依赖于抗体反应或其它的生物基质，需要加热以使结合物失活将核酸释放出来，而且由于需要免疫化学反应，它们的应用范围有限。

Q2: MagaBio磁珠粒子的结合能力是多少?A: 在有结合液而无任何离液盐或是去污剂的情况下，1 mg的MagaBio磁珠粒子可以结合500 µg的小牛胸腺DNA。

Q3: MagaBio核酸纯化系统需要使用有机溶剂吗？A: 不需要，MagaBio核酸纯化试剂盒的试剂对环境是无害的。

Q4:使用MagaBio全血基因组DNA纯化试剂盒的预期产量是多少?A:使用 MagaBio全血基因组DNA纯化试剂盒和200 µl 新鲜血液，预期可以获得5～12 µg (25～60 µg/ml)的DNA。

Q5: MagaBio全血基因组DNA纯化试剂盒纯化的DNA片段大小是多少?A: 这与应用有关。

使用MagaBio全血基因组DNA纯化试剂盒从血液样品中纯化的DNA大小大于20kb。

Q6: MagaBio全血基因组DNA纯化试剂盒纯化得到的DNA可以冷冻保存吗？A: 可以。

在-20°C中储存2年以后不会观察有明显的DNA损失。

Q7: MagaBio核酸纯化的操作过程中需要对洗脱液加热吗？A: 不需要。

酵母菌落PCR方法酵母菌落PCR方法，酵母菌落PCR方法，涉及提取DNA方法、PCR方法问：很郁闷，最近在做电转毕赤酵母，但是转化完了没有合适的筛选方法，如果提基组的话费时费钱，而且由我这个电转的几率十分低，也就有1%-10%，所以想用菌落PCR 方法筛选，但酵母菌破壁很困难，如果处理不好的话基组释放不出来，就没有阳性结果了。

查了一些资料说用反复冻融法，是不是直接挑单菌落就行了呢？还有说用蜗牛酶帮助消化的，这个我倒不是很清楚，所以请各位大虾们帮帮忙，在实在是被这个伤透脑筋了！求助十万火急！！！！！！！答：蜗牛酶提取DNA以后作PCR效果很稳定酵母DNA的提取1、x新鲜的菌中加入150ul（200ul）bufferiI25(30)ul蜗牛酶（30mg/ml），37度，10Min（可以30min水浴，中间隔5分钟，振荡一次，避免细胞沉到管底。

2、离心10000rmp，10min，去上清，沉淀中加入bufferII250ul3、加入25ul，10%SDS。

65度，30min水浴。

4、加入25ul 5mol/lKAC，冰浴60分钟（4度冰箱放置就可以）5、12000rmp，15min，取上清，在上清中加入2-3倍积的无水乙醇，混匀放置－20度一小时（可过夜，取出后不振荡，直接离心）6、12000rmp，15min，弃上清。

7、150ul，bufferIII溶液沉淀，12000rmp，15min8、将上清溶液转到干净的离心管中，加入6ul（10ug/ul），ran酶，37度，30min9、加入等积异丙醇，4度静止10min，10000rmp，5min，溶50ulbufferIII中10、如果有蛋白质可以使用酚氯仿抽提11、bufferI：0.9mol/l 山梨醇，0.1mol/l EDTA12、bufferII：50mmol/l Tris，20mmol/l EDTA13、bufferIII：10mmol/l tris，1mol/l EDTA14、筛选AD/BD可以直接使用抗生素筛选的方法酵母菌落PCR1、酵母质粒和基组DNAPCR模版的备取对数生长期酵母菌株 1.5ml，13000r/min，离心15s，去上清，双蒸水洗涤一次，13000r/min 离心15s，沉淀悬浮200ulTE缓冲液中，在沸水上煮1-10min，冰浴10min，13000r/min，离心5min，将上清液储存－20度取1ul用PCR2、从板上调取长势良好的菌落少许，悬浮含20ul无菌水的0.5ml eppendofff离心管中（离心管中央预先用注射器针头扎一个小孔，放置盖子受热膨胀）水浴煮沸0.2.5.10min3、利用微波炉快速备酵母治理以及菌落取直大3mm的酵母干菌落，至EP管中盖上盖子，在微波炉中加热，加入30ulTE振荡，13000r/min，离心2-5min，上清储存浴－20度，取1ul来作PCR真菌DNA的提取方法改良1、酵母活化后加入YEPD培养基，25-28度培养16-24小时，收集菌2、取少许新鲜的菌，加入0.6ml缓冲液I（0.9mol/l 山梨醇，0.1mol/l EDTA）1ml。