最新[生物学]大规模表达序列标签测定及分析-药学医学精品资料

EST序列表达序列标签（expressed sequence tags,ESTs）是指从不同组织来源的cDNA序列。

这一概念首次由Adams等于1991年提出。

近年来由此形成的技术路线被广泛应用于基因识别、绘制基因表达图谱、寻找新基因等研究领域，并且取得了显著成效。

在通过mRNA差异显示、代表性差异分析等方法获得未知基因的cDNA部分序列后，研究者都迫切希望克隆到其全长cDNA序列，以便对该基因的功能进行研究。

克隆全长cDNA序列的传统途径是采用噬斑原位杂交的方法筛选cDNA文库，或采用PCR的方法，这些方法由于工作量大、耗时、耗材等缺点已满足不了人类基因组时代迅猛发展的要求。

而随着人类基因组计划的开展，在基因结构、定位、表达和功能研究等方面都积累了大量的数据，如何充分利用这些已有的数据资源，加速人类基因克隆研究，同时避免重复工作，节省开支，已成为一个急迫而富有挑战性的课题摆在我们面前，采用生物信息学方法延伸表达序列标签（ESTs）序列，获得基因部分乃至全长cDNAycg，将为基因克隆和表达分析提供空前的动力，并为生物信息学功能的充分发挥提供广阔的空间。

文本将就EST 技术的应用并就其在基因全长cDNA克隆上的应用作一较为详细的介绍。

1、ESTs与基因识别EST技术最常见的用途是基因识别，传统的全基因组测序并不是发现基因最有效率的方法，这一方法显得即昂贵又费时。

因为基因组中只有2%的序列编码蛋白质，因此一部分科学家支持首先对基因的转录产物进行大规模测序，即从真正编码蛋白质的mRNA出发，构建各种cDNA文库，并对库中的克隆进行大规模测序。

Adams等提出的表达序列标签的概念标志着大规模cDNA测序时代的到来。

虽然ESTs序列数据对不精确，精确度最高为97%，但实践证明EST技术可大大加速新基因的发现与研究。

Medzhitov等通过果蝇黑胃TOLL蛋白进行dbEST数据库检索，该蛋白已证实在成熟果蝇抗真菌反应中发挥重要作用，通过同源分析的方法，找到相应的人类同源EST（登录号为H48602），这为接下来研究人类TOLL同源蛋白的功能提供了很好的条件。

表达序列标签（expressed sequence tags,ESTs）是指从不同组织来源的cDNA序列。

这一概念首次由Adams等于1991年提出。

近年来由此形成的技术路线被广泛应用于基因识别、绘制基因表达图谱、寻找新基因等研究领域，并且取得了显著成效。

在通过mRNA差异显示、代表性差异分析等方法获得未知基因的cDNA部分序列后，研究者都迫切希望克隆到其全长cDNA序列，以便对该基因的功能进行研究。

克隆全长cDNA序列的传统途径是采用噬斑原位杂交的方法筛选cDNA文库，或采用PCR的方法，这些方法由于工作量大、耗时、耗材等缺点已满足不了人类基因组时代迅猛发展的要求。

而随着人类基因组计划的开展，在基因结构、定位、表达和功能研究等方面都积累了大量的数据，如何充分利用这些已有的数据资源，加速人类基因克隆研究，同时避免重复工作，节省开支，已成为一个急迫而富有挑战性的课题摆在我们面前，采用生物信息学方法延伸表达序列标签（ESTs）序列，获得基因部分乃至全长cDNAycg，将为基因克隆和表达分析提供空前的动力，并为生物信息学功能的充分发挥提供广阔的空间。

文本将就EST技术的应用并就其在基因全长cDNA克隆上的应用作一较为详细的介绍。

1、ESTs与基因识别EST技术最常见的用途是基因识别，传统的全基因组测序并不是发现基因最有效率的方法，这一方法显得即昂贵又费时。

因为基因组中只有2%的序列编码蛋白质，因此一部分科学家支持首先对基因的转录产物进行大规模测序，即从真正编码蛋白质的mRNA出发，构建各种cDNA文库，并对库中的克隆进行大规模测序。

Adams等提出的表达序列标签的概念标志着大规模cDNA测序时代的到来。

虽然ESTs序列数据对不精确，精确度最高为97%，但实践证明EST技术可大大加速新基因的发现与研究。

Medzhitov等通过果蝇黑胃TOLL蛋白进行dbEST数据库检索，该蛋白已证实在成熟果蝇抗真菌反应中发挥重要作用，通过同源分析的方法，找到相应的人类同源EST（登录号为H48602），这为接下来研究人类TOLL同源蛋白的功能提供了很好的条件。

铁皮石斛均一化全长cDNA文库的构建与序列分析目的：为了获得药用植物铁皮石斛功能基因的信息和筛选功能基因。

方法：以SMART（switching mechanism at 5′ end of RNA transcript）方式合成全长cDNA，结合DSN（duplex-specific nuclease）均一化技术，构建铁皮石斛茎组织的均一化全长cDNA 文库。

结果：该文库重组率为93.9%，文库滴度1.3×106 cfu·mL-1，插入片段平均大小1.5 kb 左右。

随机挑取163个阳性克隆进行单侧测序，通过生物信息学分析，获得150个单一序列，其中147个序列与相应的同源蛋白匹配，GO（gene ontology）分类表明这些序列参与各种生化途径。

8个序列包含了完整编码框，可判断为全长基因。

结论：成功构建了铁皮石斛茎组织均一化全长cDNA 文库，为满足铁皮石斛代谢途径等功能基因筛选和基因信息研究奠定了基础。

标签：铁皮石斛；均一化；cDNA 文库；序列分析铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo是兰科Orchidaceae石斛属多年生草本植物，具有独特的药用价值，为我国名贵中药材。

铁皮石斛以其茎入药，其主要药用成分是石斛多糖、石斛碱、石斛次碱及多种氨基酸及微量元素，有生津益胃、清热养阴及增强人体免疫活性等功效，主要分布于我国云南、广西、浙江、安徽、福建、四川等省区[1]。

铁皮石斛种子小无胚乳，自身繁殖力低，在自然条件下需与某些真菌共生才能萌发，加上人为的过度采挖，其自然资源濒临枯竭[2]。

近些年铁皮石斛的组织培养与栽培管理技术的突破性发展[3]，使得人工栽培铁皮石斛逐渐成为一个新兴产业。

由于对天然药物需求的不断增加，解决药物资源匮乏问题一直存在，从20世纪90 年代开始，药用植物功能基因的克隆呈现发展势头[4]。

通过确定药用植物的功能基因，发展药用植物的基因工程，获取药用植物的药用成分，这些都依赖药用植物的功能基因研究开发。

第 50 卷第 2 期2024年 3 月吉林大学学报（医学版）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.50 No.2Mar.2024DOI：10.13481/j.1671‐587X.20240214基于重症支气管哮喘差异表达基因及其治疗中药筛选的生物信息学分析陈丽平1,2, 韩立1, 卞华1, 庞立业1（1. 南阳理工学院河南省张仲景方药与免疫调节重点实验室，河南南阳473004；2. 河南中医药大学呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心，河南郑州450046）［摘要］目的目的：通过生物信息学方法探讨重症支气管哮喘［简称重症哮喘（SA）］的差异表达基因，分析其作用机制，并筛选潜在具有治疗作用的中药及活性成分。

方法：在高通量基因表达（GEO）数据库中选取GSE136587和GSE158752数据集，利用R软件对数据集进行差异分析获得差异表达基因，并进行蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络分析，筛选核心基因，寻找关键通路和枢纽基因。

最后将核心基因提交至Coremine数据库筛选具有潜在治疗作用的中药，并通过《中华医典》检索相关中药方剂。

结果结果：共筛选出466个差异表达基因。

通过STRING平台构建PPI网络共筛选包括25 kDa 突触关联蛋白（SNAP25）、谷氨酸离子型受体2（GRIA2）、轴突蛋白1（NRXN1）、钾电压门控通道亚家族A成员1（KCNA1）、突触囊泡蛋白 1（SYT1）和嗜铬蛋白A（CHGA）等核心靶点25个。

基因本体（GO）功能富集显示SA的生物学过程与细胞趋化性和白细胞迁移等有重要关系，京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集的通路主要涉及骨髓白细胞迁移、白细胞趋化性、细胞趋化性、白细胞迁移、对外部刺激反应的正向调节和骨髓白细胞活化等信号通路。

采用网络药理学方法基于核心靶点筛选得到具有潜在治疗SA作用的中药367种，其中人参、水牛角、全蝎和黄芪等中药涉及多个核心靶点，与SA具有高度相关性，在《中华医典》中检索具有高度相关性的中药，共得到17个潜在具有治疗效果的中药方剂。

㊀山东农业科学㊀２０２３ꎬ５５(１０):１５~２１ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２３.１０.００３收稿日期:２０２２－１２－２０基金项目:广东省基础与应用基础研究基金项目(２０２３Ａ１５１５０１０３３６ꎬ２０２１Ａ１５１５０１１２３６)ꎻ广东省普通高校重点领域专项(２０２２ＺＤＺＸ４０４７)ꎻ韶关学院重点项目(ＳＺ２０２２ＫＪ０５)ꎻ国家自然科学基金项目(３１９０１５３７)ꎻ韶关学院博士启动基金项目(９９０００６１５)ꎻ国家级大学生创新创业训练计划项目(２０２３１０５７６００９)作者简介:曾坚(１９８７ )ꎬ男ꎬ博士ꎬ副教授ꎬ从事植物基因功能研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｚｅｎｇｊｉａｎ＠ｓｇｕ.ｅｄｕ.ｃｎ通信作者:胡伟(１９８２ )ꎬ男ꎬ博士ꎬ研究员ꎬ从事植物基因分子生物学研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｈｕｗｅｉ２０１０９１６＠１２６.ｃｏｍ香蕉中ＡＢＡ醛氧化酶基因家族的鉴定及其表达分析曾坚１ꎬ周洁薇１ꎬ王舒婷１ꎬ胡伟２(１.韶关学院广东省粤北食药资源利用与保护重点实验室/英东生物与农业学院ꎬ广东韶关㊀５１２００５ꎻ２.中国热带农业科学院热带生物技术研究所ꎬ海南海口㊀５７１１０１)㊀㊀摘要:ＡＢＡ醛氧化酶(ａｂｓｃｉｓｉｃａｌｄｅｈｙｄｅｏｘｉｄａｓｅꎬＡＡＯ)在植物生长发育和对生物/非生物胁迫的响应中起着重要作用ꎮ本研究从香蕉基因组中鉴定出３个ＭａＡＡＯｓ基因ꎬ并对其遗传进化关系㊁结构域㊁理化性质及在不同组织㊁不同果实发育阶段和逆境处理下的表达情况进行了分析ꎮ结果表明ꎬ这３个ＭａＡＡＯｓ分为两个亚族ꎬ相同亚族的基因呈现出类似的结构域组成和基因结构ꎬ与系统发育树的构建结果相一致ꎮＭａＡＡＯ１基因在果实的发育和成熟阶段都表现出显著的高表达水平ꎬ暗示着其在香蕉果实发育过程中可能发挥着重要功能ꎮ另外ꎬＭａＡＡＯ１和ＭａＡＡＯ２基因可能对渗透胁迫有响应ꎬＭａＡＡＯ２基因还可能对Ｆｏｃ４病菌的侵染有响应ꎮ基于以上结果推断ＭａＡＡＯｓ基因在香蕉的生长发育调控以及逆境响应中具有重要作用ꎮ该结果不仅丰富了我们对ＭａＡＡＯｓ基因家族的认识ꎬ也为进一步揭示其在香蕉生长发育和应激响应机制方面的功能提供了线索ꎮ关键词:香蕉ꎻＡＢＡ醛氧化酶(ＡＡ０)ꎻ基因鉴定ꎻ基因表达中图分类号:Ｓ６６８.１ꎻＱ７８１㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２３)１０－００１５－０７ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＡＡＯＧｅｎｅｓｉｎＢａｎａｎａＺｅｎｇＪｉａｎ１ꎬＺｈｏｕＪｉｅｗｅｉ１ꎬＷａｎｇＳｈｕｔｉｎｇ１ꎬＨｕＷｅｉ２(１.ＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄＣｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆＦｏｏｄａｎｄＭｅｄｉｃｉｎａｌＲｅｓｏｕｒｃｅｓｉｎＮｏｒｔｈｅｒｎＲｅｇｉｏｎ/ＨｅｎｒｙＦｏｋＳｃｈｏｏｌｏｆＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬＳｈａｏｇｕａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＳｈａｏｇｕａｎ５１２００５ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＨａｉｋｏｕ５７１１０１ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ａｂｓｃｉｓｉｃａｌｄｅｈｙｄｅｏｘｉｄａｓｅ(ＡＡＯ)ｐｌａｙｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｓｉｎｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｂｉｏｔｉｃａｎｄａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｅｓ.ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｔｈｒｅｅＡＡＯｇｅｎｅｓ(ＭａＡＡＯｓ)ｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｆｒｏｍｂａｎａｎａｇｅｎｏｍｅꎬａｎｄｔｈｅｉｒｇｅｎｅｔｉｃｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐꎬｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｄｏｍａｉｎꎬｐｈｙｓｉｃａｌａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓꎬａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓꎬａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆｒｕｉｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｔａｇｅｓａｎｄｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔｒｅｓｓｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｔｈｒｅｅＭａＡＡＯｇｅｎｅｓｃｏｕｌｄｂｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｗｏｓｕｂｇｒｏｕｐｓꎬａｎｄｔｈｅｇｅｎｅｓｉｎｔｈｅｓａｍｅｇｒｏｕｐｅｘｈｉｂｉｔｅｄｓｉｍｉｌａｒｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｏｆｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｄｏｍａｉｎｓａｎｄｇｅｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓꎬｗｈｉｃｈｗｅｒｅｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅｆｉｎｄｉｎｇｓｆｒｏｍｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅａｎａｌｙｓｉｓ.ＴｈｅＭａＡＡＯ１ｇｅｎｅｄｉｓｐｌａｙｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｘ￣ｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｄｕｒｉｎｇｆｒｕｉｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｒｉｐｅｎｉｎｇｐｅｒｉｏｄｓꎬｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇｉｔｓｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｍｐｏｒｔａｎｃｅｉｎｂａｎａｎａｆｒｕｉｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ.ＦｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅꎬｂｏｔｈＭａＡＡＯ１ａｎｄＭａＡＡＯ２ｍｉｇｈｔｅｘｈｉｂｉｔｓｅｎｓｉｔｉｖｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓｔｏｏｓｍｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓꎬａｎｄｔｈｅＭａＡＡＯ２ｇｅｎｅｍｉｇｈｔｂｅｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｔｏｔｈｅｉｎｖａｓｉｏｎｏｆＦｏｃ４ｐａｔｈｏｇｅｎ.ＢａｓｅｄｏｎｔｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓꎬｉｔｗａｓｉｎｆｅｒｒｅｄｔｈａｔＭａＡＡＯｇｅｎｅｓｐｌａｙｅｄｐｉｖｏｔａｌｒｏｌｅｓｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｂａｎａｎａｇｒｏｗｔｈꎬｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｒｅｓｐｏｎｓｅｓｔｏｂｉｏｔｉｃａｎｄａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｅｓ.ＴｈｅｓｅｆｉｎｄｉｎｇｓｗｏｕｌｄｎｏｔｏｎｌｙｅｎｈａｎｃｅｏｕｒｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｏｎｔｏｔｈｅＭａＡＡＯｇｅｎｅｆａｍｉ￣ｌｙｉｎｂａｎａｎａꎬｂｕｔａｌｓｏｐｒｏｖｉｄｅａｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｕｎｒａｖｅｌｉｎｇｔｈｅｉｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆａｃｔｉｏｎｉｎｇｒｏｗｔｈꎬｄｅｖｅｌ￣ｏｐｍｅｎｔａｎｄｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅｓｏｆｂａｎａｎａ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＢａｎａｎａꎻＡｂｓｃｉｓｉｃａｌｄｅｈｙｄｅｏｘｉｄａｓｅ(ＡＡＯ)ꎻＧｅｎｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎꎻＧｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ㊀㊀脱落酸(ａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄꎬＡＢＡ)属于六种植物激素之一ꎬ１９６３年首次在脱落果实中被鉴定为生长抑制剂[１]ꎬ随后发现其在种子休眠㊁萌发㊁气孔开合㊁果实发育等多种生理过程中发挥着重要作用[２－４]ꎬ在水杨酸介导的生物胁迫以及高盐㊁干旱和寒冷等非生物胁迫中也起着关键作用[３ꎬ５]ꎮＡＢＡ的代谢过程已有相关研究综述进行了详细总结[６]ꎮＡＢＡ合成过程主要涉及玉米黄质环氧化酶(ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｅｐｏｘｉｄａｓｅꎬＺＥＰ)㊁９－顺环氧类胡萝卜素双加氧酶(９－ｃｉｓ－ｅｐｏｘｙｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｄｉｏｘｙｇｅｎ￣ａｓｅｓꎬＮＣＥＤｓ)㊁短链醇脱氢酶/还原酶(ｓｈｏｒｔ－ｃｈａｉｎｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ/ｒｅｄｕｃｔａｓｅｓꎬＳＤＲ)㊁ＡＢＡ醛氧化酶(ａｂｓｃｉｓｉｃａｌｄｅｈｙｄｅｏｘｉｄａｓｅꎬＡＡＯ)[７]ꎬ其中ＡＡＯ参与ＡＢＡ合成途径中的最后一步ꎮ虽然ＡＢＡ合成相关基因的研究比较多[８]ꎬ但关于ＡＡＯ基因的研究较少ꎬ目前只对少数几个物种如拟南芥[９]㊁水稻[１０]㊁小麦[１１]等的ＡＡＯ基因家族进行了鉴定分析ꎮ如:在拟南芥中ꎬＡｔＡＡＯ３基因的突变会导致ＡＢＡ含量降低[９]ꎻ番茄ＡＢＡ缺陷型突变体中的ＡＡＯ活性远低于野生型的[１２]ꎬ大麦中也存在类似的ＡＡＯ缺失或活性降低的现象[１３]ꎮ香蕉(Ｍｕｓａｓｓｐ.)是世界上重要的热带水果之一ꎬ也是重要的粮食作物之一[１４]ꎮ香蕉在生长过程中会遭受到低温㊁干旱㊁香蕉枯萎病等不同逆境的影响ꎬ对其产量和最终果实品质产生重要影响[１５－１６]ꎮＡＢＡ在这些过程中都扮演着重要的角色ꎬ因此ꎬ研究香蕉ＡＡＯ家族基因种类及其在不同逆境处理下的表达情况具有重要意义ꎮ本研究从香蕉基因组中鉴定得到了ＡＡＯ家族基因ꎬ并分析了它们的进化关系㊁基因结构和蛋白结构域ꎬ同时分析了其在不同组织㊁果实发育和成熟的不同阶段及对非生物/生物胁迫响应的表达模式ꎬ以期为进一步明确ＭａＡＡＯｓ基因在香蕉生长发育和胁迫反应过程中的功能提供参考ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验材料选用口味优良的香蕉品种粉蕉(ＭｕｓａＡＢＢＰｉｓａｎｇＡｗａｋꎬＦＪ)进行试验ꎮ将粉蕉组培苗种植于塑料盆中(无菌土壤)ꎬ培养于生长室(２８ħꎬ７０％湿度ꎬ光周期为１６ｈ光/８ｈ暗ꎬ光照强度为２００μｍｏｌ ｍ－２ ｓ－１)ꎮ组培苗种植取样周期为２０１５年６月 ２０１６年８月ꎮ１.２㊀试验处理与样品采集方法(１)不同组织样品采集:组培苗种植约７０天后达到五叶期ꎬ此时选取叶和根ꎻ组培苗种植约１０个月开始开花ꎬ于开花后０天(０ＤＡＦ)㊁２０ＤＡＦ和８０ＤＡＦ选取果实ꎻ组培苗种植１２~１３个月后采收ꎬ选取采收后３天(３ＤＰＨ)和６ＤＰＨ的果实ꎮ每个样本进行两次生物学重复ꎬ用于分析基因在不同组织和果实发育不同阶段的表达情况ꎮ(２)非生物胁迫处理方法及取样:分别用３００ｍｍｏｌ Ｌ－１ＮａＣｌ和２００ｍｍｏｌ Ｌ－１甘露醇灌溉五叶期香蕉幼苗ꎬ进行盐胁迫和渗透胁迫处理ꎬ处理７ｄ后取样ꎻ将五叶期香蕉幼苗置于４ħ生长室(７０％湿度ꎬ光周期为１６ｈ光/８ｈ暗ꎬ光照强度为２００μｍｏｌ ｍ－２ ｓ－１)进行冷胁迫处理ꎬ２２ｈ后取样ꎮ采集对应处理时间后的叶片样本进行非生物胁迫处理下基因的表达分析ꎮ(３)尖孢镰刀菌侵染处理及取样:将五叶期香蕉幼苗根部浸泡在Ｆ.ｏｘｙｓｐｏｒｕｍｒａｃｅ４(Ｆｏｃ４)孢子悬液(１０６个分生孢子/ｍＬ)中２ｈꎬ以浸入无菌蒸馏水(ｄｄＨ２Ｏ)中的为对照ꎻ然后移栽到装有无菌土壤的塑料盆中ꎬ在生长室中培养(２８ħꎬ７０％湿度ꎬ光周期为１６ｈ光/８ｈ暗ꎬ光照强度为２００μｍｏｌ ｍ－２ ｓ－１)ꎻ培养２ｄ后ꎬ采集根系样品进行基因表达分析ꎮ每份样本包含两个生物重复样６１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀本ꎮ１.３㊀香蕉ＡＡＯ基因家族的鉴定及系统发育分析利用拟南芥ＡｔＡＡＯｓ基因的序列构建ＨＭＭ模型ꎬ从香蕉Ａ基因组中搜索得到香蕉ＡＡＯｓ序列ꎻ利用得到的香蕉ＡＡＯｓ序列构建新的ＨＭＭ模型ꎬ利用新的ＨＭＭ模型从Ａ基因组中搜索鉴定ＭａＡＡＯｓ基因ꎮ使用保守结构域数据库(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/ｃｄｄ/)和ＰＦＡＭ数据库(ｈｔ￣ｔｐ://ｐｆａｍ.ｓａｎｇｅｒ.ａｃ.ｕｋ/)验证得到的ＭａＡＡＯｓ基因ꎮ利用下载得到的ＡｔＡＡＯｓ和水稻ＯｓＡＡＯｓ蛋白序列ꎬ以ＭＥＧＡ－Ｘ中的ＭＵＳＣＬＥ方法进行序列比对ꎬ使用Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ法构建系统发育树ꎬＢｏｏｔｓｔｒａｐ值设置为１０００ꎮ１.４㊀香蕉ＡＡＯ基因家族的蛋白质特性和序列分析通过ＥｘＰＡＳｙ数据库(ｈｔｔｐ://ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/)对分子质量和等电点等理化性质进行预测ꎮ利用ＭＥＭＥ软件和ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ数据库对蛋白结构域序列进行鉴定ꎮ采用ＧＳＤＳ数据库对基因结构进行分析(ｈｔｔｐ://ｇｓｄｓ.ｃｂｉ.ｐｋｕ.ｅｄｕ.ｃｎ/)ꎮ１.５㊀转录组分析ＲＮＡ测序中的ＲＮＡ提取㊁文库制备和测序等工作均由美吉生物技术有限公司(中国上海)完成ꎮＲＮＡ－ｓｅｑ分析样本的收集过程参考前人的研究[１７]ꎮ每个样本包含两个生物重复序列ꎮ测序平台为ＩｌｌｕｍｉｎａＧＡＩＩ(ＩｌｌｕｍｉｎａꎬＳａｎＤｉｅｇｏꎬＣＡꎬＵＳＡ)ꎮＦＡＳＴＸ(ｈｔｔｐ://ｈａｎｎｏｎｌａｂ.ｃｓｈｌ.ｅｄｕ/ｆａｓｔｘ＿ｔｏｏｌｋｉｔ/)和ＦａｓｔＱＣ(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔ￣ｉｃｓ.ｂａｂｒａｈａｍ.ａｃ.ｕｋ/ｐｒｏｊｅｃｔｓ/ｆａｓｔｑｃ/)用于删除接头序列和低质量序列ꎮ通过ＴｏｐｈａｔＶ.２.０.１０将粉蕉样本的ｃｌｅａｎｒｅａｄｓ与香蕉基因组进行比对[１８]ꎬ使用Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ进行转录组组装[１９]ꎮ基因的表达值使用ＦＰＫＭ值表示ꎮ使用ＤＥＧｓｅｑ工具鉴定差异表达基因(ＤＥＧｓ)(ｌｏｇ２－ｂａｓｅｄｆｏｌｄｃｈａｎｇｅ>１ꎻｌｏｇ２－ｂａｓｅｄｆｏｌｄｃｈａｎｇｅ<－１)ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀ＭａＡＡＯｓ基因的鉴定利用香蕉ＡＡＯ基因序列的保守结构域构建ＨＭＭ模型ꎬ从香蕉Ａ基因组中鉴定得到了３个ＭａＡＡＯｓ基因ꎬ分别命名为ＭａＡＡＯ１㊁ＭａＡＡＯ２㊁ＭａＡＡＯ３(表１)ꎬ其氨基酸残基数量分别为１３６５㊁１３９３㊁１３９９个ꎬ编码蛋白的分子量范围为１５.０５~１５.２６ｋｕꎬ等电点范围是６.５９~６.６２ꎮ为分析ＭａＡＡＯｓ的进化关系ꎬ分别下载了水稻和拟南芥ＡＡＯ基因家族的蛋白质序列(表１)ꎬ采用ＮＪ法构建了系统发育树(图１)ꎮ可见ꎬ所有ＡＡＯ蛋白可以分成两类ꎬＭａＡＡＯ２和ＭａＡＡＯ３与所有ＡｔＡＡＯｓ及大部分ＯｓＡＡＯｓ聚在一个亚类ꎬ而ＭａＡＡＯ１则与两个ＯｓＡＡＯｓ聚成一个亚类ꎮ㊀㊀表１㊀ＡＡＯ基因信息基因名基因编号基因位置氨基酸数量/个分子量/ｋｕ等电点ＭａＡＡＯ１Ｍａ０６＿ｔ２６７２０.１ｃｈｒ６:２８５８０５１０－２８６１３３３９１３６５１５.０５６.６２ＭａＡＡＯ２Ｍａ０９＿ｔ１００８０.２ｃｈｒ９:６８８３０９７－６８９５０４７１３９３１５.１９６.３７ＭａＡＡＯ３Ｍａ０９＿ｔ１０１００.１ｃｈｒ９:６８９６４８０－６９０８６５４１３９９１５.２６６.５９ＡｔＡＡＯ１ＡＴ５Ｇ２０９６０.１ｃｈｒ５:７１１６４５５－７１２２７４７１３６８１４.９６６.３４ＡｔＡＡＯ２ＡＴ３Ｇ４３６００.１ｃｈｒ３:１５５１１８３２－１５５１７５４５１３２１１４.４６５.４１ＡｔＡＡＯ３ＡＴ２Ｇ２７１５０.１ｃｈｒ２:１１６０１７２７－１１６０７１９９１３３２１４.６７６.６３ＡｔＡＡＯ４ＡＴ１Ｇ０４５８０.１ｃｈｒ１:１２５２００５－１２５７８９３１３３７１４.７３６.２８ＯｓＡＡＯＬＯＣ＿Ｏｓ０３ｇ３１５５０.１ｃｈｒ３:１７９８５５６３－１７９９８４９８１３７０１５.０２６.９９ＬＯＣ＿Ｏｓ０３ｇ３１５５０.２ｃｈｒ３:１７９８５５６３－１７９９８４９８１２７３１３.９９７.２７ＬＯＣ＿Ｏｓ０７ｇ０７０５０.２ｃｈｒ７:３４７６２８８－３４７１８３４５４８６.０３７.４７ＬＯＣ＿Ｏｓ０７ｇ０７０５０.１ｃｈｒ７:３４７６９２１－３４７１７８９６０５６.６８８.４４ＬＯＣ＿Ｏｓ０３ｇ５７６８０.１ｃｈｒ３:３２８７７２０６－３２８６９４８２１３５７１４.５３６.４５ＬＯＣ＿Ｏｓ０３ｇ５７６９０.１ｃｈｒ３:３２８８６２６６－３２８７９５６６１３５６１４.５１６.１７ＬＯＣ＿Ｏｓ１０ｇ０４８６０.１ｃｈｒ１０:２３５８７９０－２３６８７３２１３５９１４.５５６.４２ＬＯＣ＿Ｏｓ０７ｇ１８１２０.１ｃｈｒ７:１０７２４５９９－１０７３８０１９１３６６１４.８５７.２４ＬＯＣ＿Ｏｓ０７ｇ１８１５４.１ｃｈｒ７:１０７４８７４６－１０７６０８４８８４５９.２１６.６５ＬＯＣ＿Ｏｓ０７ｇ１８１５４.２ｃｈｒ７:１０７４８７４６－１０７６０８３３７２７７.９２６.７８㊀㊀注:基因名中Ｍａ代表香蕉ꎬＡｔ代表拟南芥ꎬＯｓ代表水稻ꎮ７１㊀第１０期㊀㊀㊀㊀㊀曾坚ꎬ等:香蕉中ＡＢＡ醛氧化酶基因家族的鉴定及其表达分析图１㊀ＡＡＯ家族蛋白系统进化树２.２㊀ＭａＡＡＯｓ基因家族的结构域和基因结构分析利用ＭＥＭＥ数据库从ＭａＡＡＯｓ基因中鉴定得到１０个保守结构域ꎬ并用ＩｎｔｅｒＰｒｏ数据库进行了注释ꎮ由结果(图２㊁表２)可见ꎬ３个ＭａＡＡＯｓ基因表现出类似的结构域组成ꎬ仅ＭａＡＡＯ１缺少了Ｍｏｔｉｆ８ꎻ除了Ｍｏｔｉｆ７ꎬ其余９个Ｍｏｔｉｆ都含有结构域ＩＰＲ０１６２０８ꎬ其功能被注释为醛氧化酶/黄嘌呤脱氢酶ꎮ随后对ＭａＡＡＯｓ基因结构进行分析ꎬＭａＡＡＯ２和ＭａＡＡＯ３有类似的基因结构ꎬ都有１０个内含子ꎻ而ＭａＡＡＯ１的内含子则是１４个(图３)ꎮ表明相同聚类有类似的结构域组成和基因结构ꎬ与系统发育树的分析结果相一致ꎮ图２㊀ＭａＡＡＯｓ基因结构域㊀㊀表２㊀ＭａＡＡＯｓ基因结构域的注释编号序列结构域(注释)Ｍｏｔｉｆ１ＣＬＴＬＬＣＳＩＮＦＣＳＶＩＴＳＥＧＬＧＮＳＫＤＧＦＨＰＩＨＥＲＦＡＧＦＨＡＳＱＣＧＦＣＴＰＧＭＣＭＩＰＲ０１６２０８(醛氧化酶/黄嘌呤脱氢酶)Ｍｏｔｉｆ２ＬＲＲＰＶＲＭＹＬＤＲＫＴＤＭＩＭＴＧＧＲＨＰＭＫＩＮＹＳＶＧＦＫＳＤＧＫＩＴＡＬＨＶＤＩＦＩＮＡＧＩＰＲ０１６２０８(醛氧化酶/黄嘌呤脱氢酶)Ｍｏｔｉｆ３ＥＶＥＶＤＶＬＴＧＧＴＩＩＬＲＴＤＬＩＹＤＣＧＱＳＬＮＰＡＶＤＬＧＱＩＥＧＡＦＶＱＧＩＧＦＦＭＬＥＥＩＰＲ０１６２０８(醛氧化酶/黄嘌呤脱氢酶)Ｍｏｔｉｆ４ＡＩＰＤＥＤＮＣＩＬＶＹＳＳＴＱＣＰＥＩＡＱＧＶＩＡＫＣＬＧＩＰＤＨＮＶＲＶＩＴＲＲＶＧＧＧＦＧＧＫＩＰＲ０１６２０８(醛氧化酶/黄嘌呤脱氢酶)Ｍｏｔｉｆ５ＮＳＤＧＬＶＩＳＤＧＴＷＴＹＫＩＰＴＩＤＢＩＰＫＱＦＮＶＫＬＬＫＳＧＨＨＥＫＲＶＬＳＳＫＡＳＧＥＰＰＩＰＲ０１６２０８(醛氧化酶/黄嘌呤脱氢酶)Ｍｏｔｉｆ６ＫＩＴＫＦＥＡＥＫＡＩＡＧＮＬＣＲＣＴＧＹＲＰＩＶＤＶＣＫＳＦＡＡＢＶＤＬＩＰＲ０１６２０８(醛氧化酶/黄嘌呤脱氢酶)Ｍｏｔｉｆ７ＧＤＡＰＥＹＴＬＰＡＪＩＤＥＬＡＳＳＡＤＹＬＤＲＬＥＩＩＲＨＦＮＳＣＮＫＷＲＫＲＧＩＳＬＶＰＶＶＹ无Ｍｏｔｉｆ８ＥＬＨＳＮＥＲＬＶＦＳＫＩＡＤＨＭＤＫＶＡＳＰＦＩＲＮＭＡＳＬＧＧＮＬＩＭＡＱＲＳＱＦＡＳＤＶＡＴＩＩＰＲ０１６２０８(醛氧化酶/黄嘌呤脱氢酶)Ｍｏｔｉｆ９ＹＮＷＧＡＬＳＦＤＡＲＩＣＫＴＮＦＰＴＫＳＡＭＲＧＰＧＤＶＱＧＳＦＩＡＥＳＶＩＥＨＩＰＲ０１６２０８(醛氧化酶/黄嘌呤脱氢酶)Ｍｏｔｉｆ１０ＦＴＧＰＫＬＧＣＧＥＧＧＣＧＡＣＶＶＬＬＳＴＹＤＰＶＳＧＱＶＫＥＦＩＰＲ０１６２０８(醛氧化酶/黄嘌呤脱氢酶)８１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀图３㊀ＭａＡＡＯｓ基因的结构分析２.３㊀ＭａＡＡＯｓ在粉蕉不同组织中的表达如图４Ａ所示ꎬ粉蕉根中ＭａＡＡＯ１和ＭａＡＡＯ３基因高表达(ＦＰＫＭ>５)ꎬ叶中３个ＭａＡＡＯｓ基因都表现出高表达ꎬ而果实(８０ＤＡＦ)中则只有ＭａＡＡＯ１表现出高表达ꎮ３个ＭａＡＡＯｓ基因中ꎬ只有ＭａＡＡＯ１在粉蕉根㊁叶和果实中都呈现出高表达ꎮ图４㊀ＭａＡＡＯｓ基因在香蕉不同组织(Ａ)㊁果实不同发育阶段(Ｂ)㊁不同逆境处理(Ｃ)中的表达分析２.４㊀ＭａＡＡＯｓ在粉蕉果实不同发育阶段中的表达为明确ＭａＡＡＯｓ基因在香蕉果实发育过程中的功能ꎬ对其在不同发育阶段果实中的表达情况进行了分析ꎬ结果(图４Ｂ)显示ꎬ只有ＭａＡＡＯ１在果实发育早期(０ＤＡＦ和２０ＤＡＦ)和后期(８０ＤＡＦ㊁３ＤＰＨ)中表现出高表达(ＦＰＫＭ>５)ꎬ且以３ＤＰＨ果实中的表达量最高ꎻＭａＡＡＯ２在果实发育整个阶段的表达都极低ꎻＭａＡＡＯ３在果实各发育阶段的表达水平相比ＭａＡＡＯ２要高ꎬ但除２０ＤＡＦ外均没有达到高表达ꎮ因此推测ＭａＡＡＯ１可能在果实发育过程中发挥着重要作用ꎮ２.５㊀ＭａＡＡＯｓ在不同逆境处理下的表达为分析ＭａＡＡＯｓ基因在粉蕉应对逆境胁迫中的功能ꎬ设置生物和非生物胁迫处理ꎬ分析３个ＭａＡＡＯｓ基因在粉蕉植株根中的表达情况ꎬ结果(图４Ｃ)显示ꎬ在Ｆｏｃ４处理下ꎬＭａＡＡＯ２基因表现出上调(ｌｏｇ２－ｂａｓｅｄｆｏｌｄｃｈａｎｇｅ>１)ꎻ在渗透胁迫下ꎬＭａＡＡＯ１和ＭａＡＡＯ２基因表现出上调ꎻ在冷和盐胁迫下ꎬ３个基因均未表现出明显的上调表达ꎻＭａＡＡＯ３基因在所有逆境处理中都没有表现出显著变化ꎮ３㊀讨论香蕉既是一种重要的热带和亚热带水果ꎬ也是全球１３０多个国家的主粮ꎬ但其研究进展相比其它作物要慢[２０]ꎮＡＢＡ在植物的生长发育和生物/非生物胁迫响应中起着重要作用[２１]ꎬ而ＡＡＯ是ＡＢＡ合成途径中的重要合成酶ꎬ但香蕉ＡＡＯ基因家族的情况仍不清楚ꎮ本研究从香蕉Ａ基因组中鉴定出３个ＭａＡＡＯｓ基因ꎬ保守结构域分析证明这３个基因属于ＡＡＯ家族ꎬ并根据系统发育树将其分为两个亚类ꎬ其中ＭａＡＡＯ２和ＭａＡＡＯ３聚为一类ꎮ拟南芥的ＡＡＯ基因数量是４个[９]ꎬ水稻中可能是５个[１０]ꎬ小麦中是３个[１１]ꎬ数量均较少ꎬ表明ＡＡＯ蛋白可能属于小基因家族编码的蛋白质ꎮ９１㊀第１０期㊀㊀㊀㊀㊀曾坚ꎬ等:香蕉中ＡＢＡ醛氧化酶基因家族的鉴定及其表达分析香蕉果实的发育和成熟过程决定着果实的品质和产量[１４]ꎮ研究表明ꎬＡＢＡ信号参与了果实的生长发育并影响着果实的成熟过程和最终品质ꎻ未成熟水果中的内源ＡＢＡ含量通常较低ꎬ施加外源ＡＢＡ能促进果实成熟及果肉软化ꎻ果实成熟过程中ＡＢＡ合成相关基因的表达上调导致内源ＡＢＡ大量积累[２２]ꎮ这些结果表明ＡＢＡ在水果成熟过程中发挥着重要作用ꎮ在本研究中ꎬ不同ＭａＡＡＯｓ基因在粉蕉果实不同发育阶段表现出不同的表达模式ꎬＭａＡＡＯ１基因在早期和晚期都表现出高表达ꎬ而ＭａＡＡＯ２和ＭａＡＡＯ３几乎不表达ꎻ此外ꎬＭａＡＡＯ１在粉蕉叶㊁根㊁果实中均表现出高表达ꎬ推测ＭａＡＡＯ１基因在香蕉果实发育和成熟过程中可能具有重要作用ꎮ香蕉生长过程中常会遇到干旱㊁盐㊁寒冷以及枯萎病菌感染等非生物和生物逆境ꎬ对果实品质及产量造成影响[１５－１６]ꎮ在拟南芥中ꎬＡｔＡＡＯ３和ＡｔＡＡＯ１基因表达明显受到干旱胁迫的诱导[９ꎬ２３]ꎻ在拟南芥中过表达花生ＡｈＡＡＯ２基因也能显著提高植株抵抗干旱胁迫的能力[２４]ꎮ本研究发现ꎬＭａＡＡＯ１和ＭａＡＡＯ２基因受渗透胁迫诱导上调表达ꎬ但受冷和盐胁迫的影响很小ꎻＭａＡＡＯ３基因的表达在３种胁迫下均无显著变化ꎮ表明ＭａＡＡＯ１和ＭａＡＡＯ２基因可能在香蕉响应干旱胁迫中发挥作用ꎮ香蕉的种植生产也受到香蕉枯萎病的严重影响ꎮ有研究表明ＡＢＡ能负向调控水杨酸(ＳＡ)介导的病原体反应ꎬ例如ꎬ提高植株中ＡＢＡ的含量ꎬ会显著促进细菌的生长[２５]ꎮ在本研究中ꎬ仅ＭａＡＡＯ２基因的表达显著受到Ｆｏｃ４处理的诱导ꎬ表明这个基因可能参与了响应Ｆｏｃ４侵染的过程ꎮ４㊀结论本研究从香蕉Ａ基因组中鉴定得到了３个ＭａＡＡＯｓ基因ꎬ经系统发育分析㊁蛋白结构域和基因结构分析ꎬ确定属于ＡＡＯ基因家族ꎮＭａＡＡＯｓ基因参与了香蕉的生长发育㊁果实成熟和对生物/非生物胁迫的响应等过程ꎮ其中ꎬＭａＡＡＯ１基因在果实发育早期和成熟阶段都表现出高表达ꎻＭａＡＡＯ１和ＭａＡＡＯ２基因对渗透胁迫有响应ꎻＭａＡＡＯ２基因的表达被Ｆｏｃ４诱导ꎬ可能响应该病菌的侵染ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀ＥａｇｌｅｓＣＦꎬＷａｒｅｉｎｇＰＦ.ＤｏｒｍａｎｃｙＲｅｇｕｌａｔｏｒｓｉｎｗｏｏｄｙｐｌａｎｔｓ:ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｄｏｒｍａｎｃｙｉｎＢｅｔｕｌａｐｕｂｅｓｃｅｎｓ[Ｊ].Ｎａｔｕｒｅꎬ１９６３ꎬ１９９(４８９６):８７４－８７５.[２]㊀ＣｈｅｒｎｙｓＪＴꎬＺｅｅｖａａｒｔＪＡ.Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅ９￣ｃｉｓ￣ｅｐｏｘｙ￣ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅｇｅｎｅｆａｍｉｌｙａｎｄｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆａｂ￣ｓｃｉｓｉｃａｃｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎａｖｏｃａｄｏ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２０００ꎬ１２４(１):３４３－３５３.[３]㊀ＬｅｅＳＣꎬＬｕａｎＳ.ＡＢＡｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎａｔｔｈｅｃｒｏｓｓｒｏａｄｏｆｂｉｏｔｉｃａｎｄａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌａｎｄＥｎｖｉｒｏｎ￣ｍｅｎｔꎬ２０１２ꎬ３５(１):５３－６０.[４]㊀ＹｏｓｈｉｄａＴꎬＭｏｇａｍｉＪꎬＹａｍａｇｕｃｈｉ￣ＳｈｉｎｏｚａｋｉＫ.ＡＢＡ￣ｄｅｐｅｎｄ￣ｅｎｔａｎｄＡＢＡ￣ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｓｉｇｎａｌｉｎｇｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｏｓｍｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｉｎｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１４ꎬ２１:１３３－１３９.[５]㊀ＳｈｉｎｏｚａｋｉＫꎬＹａｍａｇｕｃｈｉ￣ＳｈｉｎｏｚａｋｉＫꎬＳｅｋｉＭ.Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｎｅｔ￣ｗｏｒｋｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｔｈｅｄｒｏｕｇｈｔａｎｄｃｏｌｄｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅｓ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙꎬ２００３ꎬ６(５):４１０－４１７.[６]㊀ＺｅｅｖａａｒｔＪＡＤꎬＣｒｅｅｌｍａｎＲＡ.Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙｏｆａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄ[Ｊ].ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙꎬ１９８８ꎬ３９(１):４３９－４７３. [７]㊀ＮａｍｂａｒａＥꎬＭａｒｉｏｎ￣ＰｏｌｌＡ.Ａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｃａ￣ｔａｂｏｌｉｓｍ[Ｊ].ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙꎬ２００５ꎬ５６:１６５－１８５.[８]㊀ＣｈｅｎＫꎬＬｉＧＪꎬＢｒｅｓｓａｎＲａｙＡꎬｅｔａｌ.Ａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄｄｙｎａｍ￣ｉｃｓꎬｓｉｇｎａｌｉｎｇꎬａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｔｅｇｒａ￣ｔｉｖｅＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０２０ꎬ６２(１):２５－５４.[９]㊀ＳｅｏＭꎬＰｅｅｔｅｒｓＡＪꎬＫｏｉｗａｉＨꎬｅｔａｌ.ＴｈｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓａｌｄｅｈｙｄｅｏｘｉｄａｓｅ３(ＡＡＯ３)ｇｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔｃａｔａｌｙｚｅｓｔｈｅｆｉｎａｌｓｔｅｐｉｎａｂ￣ｓｃｉｓｉｃａｃｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｌｅａｖｅｓ[Ｊ].ＰＮＡＳꎬ２０００ꎬ９７(２３):１２９０８－１２９１３.[１０]ＢａｔｔｈＲꎬＳｉｎｇｈＫꎬＫｕｍａｒｉＳꎬｅｔａｌ.Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｐｒｏｆｉｌｉｎｇｒｅｖｅａｌｓｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｓｔａｇｅｓｐｅｃｉｆｉｃａｓｃｏｒｂａｔｅｏｘｉｄａｓｅｇｅｎｅｓｉｎｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉ￣ｅｎｃｅꎬ２０１７ꎬ８:１９８.[１１]ＣｏｌａｓｕｏｎｎｏＰꎬＭａｒｃｏｔｕｌｉＩꎬＬｏｚｉｔｏＭＬꎬｅｔａｌ.Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｌｄｅｈｙｄｅｏｘｉｄａｓｅ(ＡＯ)ｇｅｎｅｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｐｉｇｍｅｎｔｓｉｎｗｈｅａｔｇｒａｉｎ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０１７ꎬ８:８６３.[１２]ＳａｇｉＭꎬＦｌｕｈｒＲꎬＬｉｐｓＳＨ.Ａｌｄｅｈｙｄｅｏｘｉｄａｓｅａｎｄｘａｎｔｈｉｎｅｄｅ￣ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｉｎａｆｌａｃｃａｔｏｍａｔｏｍｕｔａｎｔｗｉｔｈｄｅｆｉｃｉｅｎｔａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄａｎｄｗｉｌｔｙｐｈｅｎｏｔｙｐｅ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ１９９９ꎬ１２０(２):５７１－５７８.[１３]Ｗａｌｋｅｒ￣ＳｉｍｍｏｎｓＭꎬＫｕｄｒｎａＤＡꎬＷａｒｎｅｒＲＬ.Ｒｅｄｕｃｅｄａｃｃｕ￣ｍｕｌａｔｉｏｎｏｆＡＢＡｄｕｒｉｎｇｗａｔｅｒｓｔｒｅｓｓｉｎａｍｏｌｙｂｄｅｎｕｍｃｏｆａｃｔｏｒｍｕｔａｎｔｏｆｂａｒｌｅｙ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ１９８９ꎬ９０(２):７２８－７３３.０２㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀[１４]ＨｕＷꎬＺｕｏＪꎬＨｏｕＸＷꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅａｕｘｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｆａｃｔｏｒｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎｂａｎａｎａ:ｇｅｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｅｓｄｕｒｉｎｇｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎬｒｉｐｅｎｉｎｇꎬａｎｄａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０１５ꎬ６:７４２.[１５]ＲａｓｈａｄＹＭꎬＦｅｋｒｙＷＭＥꎬＳｌｅｅｍＭＭꎬｅｔａｌ.Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｍｙ￣ｃｏｒｒｈｉｚａｌｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎｏｎｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅ￣ｓｐｏｎｓｉｖｅｆａｃｔｏｒＪＥＲＦ３ａｎｄｓｔｒｅｓｓ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｇｅｎｅｓｉｎｂａｎａｎａｐｌａｎｔｌｅｔｓｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｃｏｍｂｉｎｅｄｂｉｏｔｉｃａｎｄａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｅｓ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０２１ꎬ１２:７４２６２８. [１６]ＸｕＹꎬＬｉｕＪＨꎬＪｉａＣＨꎬｅｔａｌ.ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｂａｎａｎａａｑｕａｐｏｒｉｎｇｅｎｅＭａＰＩＰ１ꎻ１ｅｎｈａｎｃｅｓｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏｍｕｌｔｉｐｌｅａｂｉ￣ｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｅｓｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｂａｎａｎａａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｉｔｓｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０２１ꎬ１２:６９９２３０.[１７]ＸｕＹꎬＴｉｅＷＷꎬＹａｎＹꎬｅｔａｌ.ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅＢＡＨＤｆａｍｉｌｙｄｕｒｉｎｇｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎬｒｉｐｅｎｉｎｇꎬａｎｄｓｔｒｅｓｓｒｅ￣ｓｐｏｎｓｅｉｎｂａｎａｎａ[Ｊ].ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０２１ꎬ４８(２):１１２７－１１３８.[１８]ＰｏｌｌｉｅｒＪꎬＲｏｍｂａｕｔｓＳꎬＧｏｏｓｓｅｎｓＡ.ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＲＮＡ￣ＳｅｑｄａｔａｗｉｔｈＴｏｐＨａｔａｎｄＣｕｆｆｌｉｎｋｓｆｏｒｇｅｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｊａｓｍｏｎａｔｅ￣ｔｒｅａｔｅｄｐｌａｎｔｓａｎｄｐｌａｎｔｃｕｌｔｕｒｅｓ[Ｊ].ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１３ꎬ１０１１:３０５－３１５.[１９]ＴｒａｐｎｅｌｌＣꎬＲｏｂｅｒｔｓＡꎬＧｏｆｆＬꎬｅｔａｌ.ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｇｅｎｅａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＲＮＡ￣ＳｅｑｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｗｉｔｈＴｏ￣ｐＨａｔａｎｄＣｕｆｆｌｉｎｋｓ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＰｒｏｔｏｃｏｌｓꎬ２０１２ꎬ７(３):５６２－５７８.[２０]ＨｕＷꎬＷａｎｇＬＺꎬＴｉｅＷＷꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅａｎａｌｙｓｅｓｏｆｔｈｅｂＺＩＰｆａｍｉｌｙｒｅｖｅａｌｔｈｅｉｒｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎬｒｉｐｅｎｉｎｇａｎｄａｂｉｏｔｉｃｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅｉｎｂａｎａｎａ[Ｊ].ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０１６ꎬ６(１):３０２０３.[２１]ＨａｒａｋａｖａＲ.ＧｅｎｅｓｅｎｃｏｄｉｎｇｅｎｚｙｍｅｓｏｆｔｈｅｌｉｇｎｉｎｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｐａｔｈｗａｙｉｎＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ[Ｊ].ＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙꎬ２００５ꎬ２８(３):６０１－６０７.[２２]杨方威ꎬ段懿菲ꎬ冯叙桥.脱落酸的生物合成及对水果成熟的调控研究进展[Ｊ].食品科学ꎬ２０１６ꎬ３７(３):２８５－２９１. [２３]ＹｅｓｂｅｒｇｅｎｏｖａＺꎬＹａｎｇＧＨꎬＯｒｏｎＥꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｐｌａｎｔＭｏ￣ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｓａｌｄｅｈｙｄｅｏｘｉｄａｓｅａｎｄｘａｎｔｈｉｎｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｈａｖｅｄｉｓｔｉｎｃｔｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓｓｉｇｎａｔｕｒｅｓａｎｄａｒｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙｄｒｏｕｇｈｔａｎｄａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄ[Ｊ].ＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌꎬ２００５ꎬ４２(６):８６２－８７６.[２４]ＹａｎｇＬꎬＬｉａｎｇＪꎬＺｈｏｕＷꎬｅｔａｌ.ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＡｌｄｅｈｙｄｅＯｘｉｄａｓｅ２ｇｅｎｅｆｒｏｍＡｒａｃｈｉｓｈｙｐｏｇａｅａＬ.[Ｊ].ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｐｏｒｔｅｒｓꎬ２０１１ꎬ２９(３):５４４－５５３. [２５]ＦａｎＪꎬＨｉｌｌＬꎬＣｒｏｏｋｓＣꎬｅｔａｌ.Ａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄｈａｓａｋｅｙｒｏｌｅｉｎｍｏｄｕｌａｔｉｎｇｄｉｖｅｒｓｅｐｌａｎｔ￣ｐａｔｈｏｇｅｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓ￣ｉｏｌｏｇｙꎬ２００９ꎬ１５０(４):１７５０－１７６１.１２㊀第１０期㊀㊀㊀㊀㊀曾坚ꎬ等:香蕉中ＡＢＡ醛氧化酶基因家族的鉴定及其表达分析。

SAGE 技术MRNA 结合到微珠子上(Microscopic Bead and mRNA)mRNA 转录成DNA(mRNA binds to bait and is copied into DNA)用酶切开DNA的一小段(An enzyme cuts the DNA)另一个酶定在DNA末端以便切下一小段(An enzyme locks onto the DNA and cuts off a short tag),这一小段就被视为这个基因的标签两个标签连在一起(Two tags are linked together)在末端的定位分子被切掉(Enzymes cut off the "Docking Molecules")都连成一条线(Di-Tags are combined into large concatemers)DNA上所携带的遗传信息，需要通过RNA为中介体，合成出组织和正常生理功能所需要的蛋白质，这个过程被称为基因的表达。

在生物体中不同的组织和器官所表达的基因群是不一样的，我们把基因群的表达状况称为基因表达谱。

目前，高通量地研究基因表达谱的方法主要有两种，即生物芯片和基因表达串联分析（serial analysis of gene expression, SAGE）。

基因芯片所能检测的基因必须是已知的基因，放在芯片上几种基因的探针就只能检测这几种基因的表达谱；相比之下，SAGE能以远高于DNA芯片的精确度和重复性来检测在病理条件下基因表达谱的改变，而不必考虑所检测的基因是已知的还是未知的。

因此在检测疾病相关的新基因，特别是无法用基因芯片进行检测的低表达量致病基因时，SAGE是目前的最佳手段，无可取代。

SAGE技术为Genzyme公司所拥有的专利技术。

其技术简介如下：SAGE技术得以建立的理论基础首先，一段来自于任一转录本特定区域的"标签"（Tag），即长度仅9-14bp的短核苷酸序列，就已包含足够的信息以特异性地确定该转录本。

5 / GGT AAG CCT ATC CCT AAC CCT CTC CTC GGT CTC GAT TCT ACG3G K P__I P N P L L G L D ST 6 X His tagCAT CAT CAC CAT CAC CAT H H H H H HS-tag AAA GAA ACC GCT GCT GCT AAA TTC GAACGC CAG CAC A TG GAC A GCKETAAAKFERQHMDSFlag-Tag GAT TAC AAG GAT GAC GAC GAT AAGDYKDDDDKMyc-Tag GAG CAG AAA CTC ATC TCT GAA GAG GAT CTG» B TSOOS O A MU —sa«M-竺 am ^3-PPfeSb <■拥 HK Btzs anas?■ 靜Inharrwl ftMd时 如0心 .U g ifT 丽 i£務 ■因凶低=o ci e■ 曲帝 口■^) (3 “ © e 铀号強■ awHA-Tag TAC CCA TAC GAC GTC CCA GAC TAC GCTTATACAGACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAGThromb in recog ni ses the consen sus seque nee Leu-Val-Pro-Arg-Gly-SerSequenee CTG GTT CCG CGT GGA TCC重组蛋白表达技术现已经广泛应用于生物学各个具体领域。

特别是体内功能研究和蛋白质的大规模生产都需要应用重组蛋白表达载体。

:His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的 C 末端或N 末端。

当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测；二是构成独特的结构特征(结合配体) 利于纯化。

组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。

靶向编辑O⁃GlcNAc糖基化修饰的化学生物学技术
潘雅文;王贞超;沈大成
【期刊名称】《中国生物化学与分子生物学报》
【年(卷),期】2024(40)4
【摘要】糖基化修饰是最丰富和最复杂的蛋白质翻译后修饰之一。

其中,氧连-N-乙酰氨基葡萄糖基化修饰(O-GlcNAcylation)作为广泛存在于真核细胞质或线粒体的蛋白质糖修饰,影响了蛋白质性质、细胞功能和疾病状态等方面,因此,在活细胞中的靶蛋白质上进行编辑O-GlcNAc糖基化对于与其相关的功能调控至关重要。

这些在细胞靶蛋白质上操控O-GlcNAc糖基化修饰的新技术,将在很大程度上加速O-GlcNAc功能研究的发展。

本文简要介绍了近年来靶向编辑O-GlcNAc糖基化修饰化学生物学技术的研究进展,讨论了目前可用的O-GlcNAc编辑策略并进行了分析,展望了相关技术的未来发展前景。

这些技术组成了一个强大的化学生物学工具箱,并有望用于与O-GlcNAc糖基化相关疾病的诊断与治疗。

【总页数】10页(P453-462)
【作者】潘雅文;王贞超;沈大成
【作者单位】贵州大学药学院;深圳湾实验室化学生物学研究所
【正文语种】中文
【中图分类】Q503
【相关文献】
1.平分型GlcNAc糖基化修饰的生物学功能
2.蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰对tau蛋白磷酸化修饰的影响
3.O-GlcNAc转移酶介导的Kruppel样因子5 O-GlcNAc糖基化修饰调控细胞周期素D1参与结直肠癌发生、发展实验研究
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4、英文摘要及关键词要求翻译准确。

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编号：本科毕业论文题目：学院：专业：年级：姓名：指导教师：完成日期：本科生毕业论文目录示例：目录中文摘要及关键词............................................................ （页码）英文摘要及关键词............................................................ （页码）引言（综述）................................................................ （页码）一、一级标题1 ........................................................... （页码）（一）、二级标题1.1................................................... （页码）1、三级标题1.2.1.................................................... （页码）二、一级标题2 ........................................................... （页码）（一）、二级标题2.1................................................... （页码）2、三级标题2.2.1.................................................... （页码）........................................................................ （页码）结语（分析）................................................................ （页码）注释........................................................................ （页码）参考文献.................................................................... （页码）致谢........................................................................ （页码）（注：如果以外文文献翻译作为毕业论文，需附外文原文）⑵正文：要求结构严谨，逻辑严密，层次清晰，详略得当；语言、文字在符合国家标准的基础上，流畅而优美；图表、符号、公式等统一规范；⑶结语（分析）：对本文论述进行简要总结；对本文的研究进行自我评价（包括哪些问题由于什么原因还需要继续深入探讨，哪些相关问题需要另案研究等内容）。

利用系统进化分析软件对序列进行同源性分析1.0目的1.1为了保持国际上各个耐药性实验室的高检验水准，进行分子进化分析是有很重要作用的。

它不仅可以保证流行病学目的顺利实现，而且有利于发现检测阶段可能产生的潜在的交叉污染。

1.2利用此软件进行分析所得的信息对于进行艾滋病毒在人群中传播的流行病学研究具有十分重要的意义。

1.3通过对实验室之前分析的数据与当前数据进行比较，可以发现在此前实验过程中由于标本处理不当所导致的潜在的实验室污染。

1.4对于确保得到高质量的实验结果并及时发现可能出现在实验室里的问题具有重要意义。

2.0仪器设备2.1计算机一台。

2.2Windows 95以上的操作系统。

2.3BioEdit 以及MEGA 4 分析软件。

2.3.1均为免费软件，可以从互联网上下载，在计算机上进行安装。

3.0操作过程3.1局限及要求3.1.1经过序列编辑软件拼接处理后的txt文件或fasta文件均可，例如ChromasPro软件。

3.1.2可以在MEGA上分析的分子序列或距离矩阵数据。

3.1.3Mega 4软件只能将长度相等的序列转换为MEGA输出文件，因此，任何多序列文件必须通过BioEdit软件进行对齐修剪，然后才能进入通过Mega软件转换成*.meg格式进行分析。

3.1.4该数据集的大小受限于计算机上可用的物理（RAM）和虚拟内存。

3.1.5分析的序列必须包括两个或两个以上长度相同的序列，所有序列分析之前必须用MEGA软件对齐。

3.1.6核苷酸和氨基酸序列应该用英文字母连续书写，不区分大小写。

一些特殊的特殊符号，例如表示对齐缺口，碱基缺失等的符号也可以包含在序列中。

3.1.7空格和制表符经常用于数据文件中，因此会被MEGA忽略。

ASCII字符，如（.）（- ）（？），一般都作为特殊符号来表示序列中的不同碱基，分别表示第一个序列，对齐缺口及碱基缺失。

3.1.8BioEdit 软件进行序列比对3.1.9双击BioEdit图标打开BioEdit 序列对比编辑器窗口。

pGEM-T编号 载体名称北京华越洋生物VECT4770 pGEM-­‐TpGEM-­‐T载体基本信息载体名称: pGEM-­‐T质粒类型: 原核表达载体；pCR克隆载体 高拷贝/低拷贝: -­‐-­‐启动子: T7克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 2867 b p5' 测序引物及序列: T7 f orward3' 测序引物及序列: -­‐-­‐载体标签: -­‐-­‐载体抗性: 氨苄青霉素筛选标记: -­‐-­‐备注: -­‐-­‐稳定性: 瞬表达组成型: 组成型病毒/非病毒: 非病毒pGEM-­‐T载体质粒图谱和多克隆位点信息pGEM-­‐T载体序列ORIGIN1 GGGCGAATTG GGCCCGACGT CGCATGCTCC CGGCCGCCAT GGCCGCGGGA TATCACTAGT 61 GCGGCCGCCT GCAGGTCGAC CATATGGGAG AGCTCCCAAC GCGTTGGATG CATAGCTTGA 121 GTATTCTATA GTGTCACCTA AATAGCTTGG CGTAATCATG GTCATAGCTG TTTCCTGTGT 181 GAAATTGTTA TCCGCTCACA ATTCCACACA ACATACGAGC CGGAAGCATA AAGTGTAAAG 241 CCTGGGGTGC CTAATGAGTG AGCTAACTCA CATTAATTGC GTTGCGCTCA CTGCCCGCTT 301 TCCAGTCGGG AAACCTGTCG TGCCAGCTGC ATTAATGAAT CGGCCAACGC GCGGGGAGAG 361 GCGGTTTGCG TATTGGGCGC TCTTCCGCTT CCTCGCTCAC TGACTCGCTG CGCTCGGTCG 421 TTCGGCTGCG GCGAGCGGTA TCAGCTCACT CAAAGGCGGT AATACGGTTA TCCACAGAAT 481 CAGGGGATAA CGCAGGAAAG AACATGTGAG CAAAAGGCCA GCAAAAGGCC AGGAACCGTA 541 AAAAGGCCGC GTTGCTGGCG TTTTTCCATA GGCTCCGCCC CCCTGACGAG CATCACAAAA 601 ATCGACGCTC AAGTCAGAGG TGGCGAAACC CGACAGGACT ATAAAGATAC CAGGCGTTTC 661 CCCCTGGAAG CTCCCTCGTG CGCTCTCCTG TTCCGACCCT GCCGCTTACC GGATACCTGT 721 CCGCCTTTCT CCCTTCGGGA AGCGTGGCGC TTTCTCATAG CTCACGCTGT AGGTATCTCA 781 GTTCGGTGTA GGTCGTTCGC TCCAAGCTGG GCTGTGTGCA CGAACCCCCC GTTCAGCCCG 841 ACCGCTGCGC CTTATCCGGT AACTATCGTC TTGAGTCCAA CCCGGTAAGA CACGACTTAT 901 CGCCACTGGC AGCAGCCACT GGTAACAGGA TTAGCAGAGC GAGGTATGTA GGCGGTGCTA 961 CAGAGTTCTT GAAGTGGTGG CCTAACTACG GCTACACTAG AAGAACAGTA TTTGGTATCT 1021 GCGCTCTGCT GAAGCCAGTT ACCTTCGGAA AAAGAGTTGG TAGCTCTTGA TCCGGCAAAC 1081 AAACCACCGC TGGTAGCGGT GGTTTTTTTG TTTGCAAGCA GCAGATTACG CGCAGAAAAA 1141 AAGGATCTCA AGAAGATCCT TTGATCTTTT CTACGGGGTC TGACGCTCAG TGGAACGAAA 1201 ACTCACGTTA AGGGATTTTG GTCATGAGAT TATCAAAAAG GATCTTCACC TAGATCCTTT 1261 TAAATTAAAA ATGAAGTTTT AAATCAATCT AAAGTATATA TGAGTAAACT TGGTCTGACA 1321 GTTACCAATG CTTAATCAGT GAGGCACCTA TCTCAGCGAT CTGTCTATTT CGTTCATCCA 1381 TAGTTGCCTG ACTCCCCGTC GTGTAGATAA CTACGATACG GGAGGGCTTA CCATCTGGCC 1441 CCAGTGCTGC AATGATACCG CGAGACCCAC GCTCACCGGC TCCAGATTTA TCAGCAATAA1501 ACCAGCCAGC CGGAAGGGCC GAGCGCAGAA GTGGTCCTGC AACTTTATCC GCCTCCATCC 1561 AGTCTATTAA TTGTTGCCGG GAAGCTAGAG TAAGTAGTTC GCCAGTTAAT AGTTTGCGCA 1621 ACGTTGTTGC CATTGCTACA GGCATCGTGG TGTCACGCTC GTCGTTTGGT ATGGCTTCAT 1681 TCAGCTCCGG TTCCCAACGA TCAAGGCGAG TTACATGATC CCCCATGTTG TGCAAAAAAG 1741 CGGTTAGCTC CTTCGGTCCT CCGATCGTTG TCAGAAGTAA GTTGGCCGCA GTGTTATCAC 1801 TCATGGTTAT GGCAGCACTG CATAATTCTC TTACTGTCAT GCCATCCGTA AGATGCTTTT 1861 CTGTGACTGG TGAGTACTCA ACCAAGTCAT TCTGAGAATA GTGTATGCGG CGACCGAGTT 1921 GCTCTTGCCC GGCGTCAATA CGGGATAATA CCGCGCCACA TAGCAGAACT TTAAAAGTGC 1981 TCATCATTGG AAAACGTTCT TCGGGGCGAA AACTCTCAAG GATCTTACCG CTGTTGAGAT 2041 CCAGTTCGAT GTAACCCACT CGTGCACCCA ACTGATCTTC AGCATCTTTT ACTTTCACCA 2101 GCGTTTCTGG GTGAGCAAAA ACAGGAAGGC AAAATGCCGC AAAAAAGGGA ATAAGGGCGA 2161 CACGGAAATG TTGAATACTC ATACTCTTCC TTTTTCAATA TTATTGAAGC ATTTATCAGG 2221 GTTATTGTCT CATGAGCGGA TACATATTTG AATGTATTTA GAAAAATAAA CAAATAGGGG 2281 TTCCGCGCAC ATTTCCCCGA AAAGTGCCAC CTGATGCGGT GTGAAATACC GCACAGATGC 2341 GTAAGGAGAA AATACCGCAT CAGGAAATTG TAAGCGTTAA TATTTTGTTA AAATTCGCGT 2401 TAAATTTTTG TTAAATCAGC TCATTTTTTA ACCAATAGGC CGAAATCGGC AAAATCCCTT 2461 ATAAATCAAA AGAATAGACC GAGATAGGGT TGAGTGTTGT TCCAGTTTGG AACAAGAGTC 2521 CACTATTAAA GAACGTGGAC TCCAACGTCA AAGGGCGAAA AACCGTCTAT CAGGGCGATG 2581 GCCCACTACG TGAACCATCA CCCTAATCAA GTTTTTTGGG GTCGAGGTGC CGTAAAGCAC 2641 TAAATCGGAA CCCTAAAGGG AGCCCCCGAT TTAGAGCTTG ACGGGGAAAG CCGGCGAACG 2701 TGGCGAGAAA GGAAGGGAAG AAAGCGAAAG GAGCGGGCGC TAGGGCGCTG GCAAGTGTAG 2761 CGGTCACGCT GCGCGTAACC ACCACACCCG CCGCGCTTAA TGCGCCGCTA CAGGGCGCGT 2821 CCATTCGCCA TTCAGGCTGC GCAACTGTTG GGAAGGGCGA TCGGTGCGGG CCTCTTCGCT 2881 ATTACGCCAG CTGGCGAAAG GGGGATGTGC TGCAAGGCGA TTAAGTTGGG TAACGCCAGG 2941 GTTTTCCCAG TCACGACGTT GTAAAACGAC GGCCAGTGAA TTGTAATACG ACTCACTATA//其他大肠杆菌表达载体：pBV221 ptdTomato pET-52b(+) pAmCyanpDsRed-Express2 pBV220 pCold-GST pColdS-SUMOpCold TF pCold IV pCold III pCold IIpCold I pE-SUMO pCold-ProS2 pBAD102/D-TOPOpBAD202/D-TOPO pACYC184 pBAD/Thio-TOPO pBad/Myc-His CpBad/Myc-His B pBad/Myc-His A pBad/His C pBad/His BpBad/His A pBAD-TOPO pET-23b(+) pET-23a(+)pET-23c(+) pET-23(+) pET-12b(+) pET-12c(+)pET-12a(+) pET-11b(+) pET-11a(+) pET-11c(+)pBad24 pQE-82L pQE-81L pQE-80LpQE-32 pQE-9 pQE-16 pQE-31pQE-60 pQE-70 pQE-40 pET-51b(+)pET-50b(+) pET-49b(+) pET-48b(+) pET-47b(+)pET-26b(+) pET-32a(+) pET-21b(+) pET-22b(+)pET-14b pET-16b pET-15b pET-19bpET-20b(+) pET-21d(+) pET-21c(+) pET-21b(+) pET-21a(+) pET-24a(+) pET-24d(+) pET-25b(+) pET-27b(+) pET-28a(+) pET-30a(+) pET-42a(+) pET-43.1c(+) pET-43.1b(+) pET-43.1a(+) pET-44a(+) pET-44c(+) pET-46 EK/LIC pET-37b(+) pTrcHis2 C pTrcHis2 B pTrcHis2 A pET303/CT-His pET302/NT-His pRSET-CFP pRSET-EmGFP pRSET-BFP pGFPuvpET300/NT-DEST pET301/CT-DEST pGEM-T pBad43pGEX-4T-3 pGEX-5X-2 pBlueScript SK(+) pG-Tf2pG-KJE8 pGro7 pET-SUMO pSE380pET-17b pET102/D-TOPO pCDFDuet-1 pMAL-p5xpTf16 pET-28c(+) pBluescript II SK(+) pET-30b(+) pSUMO pProEX HTc pProEX HTb pProEX HTa pKD3 pKD13 pKD46 pTYB1pTYB2 pTWIN2 pBluescript II KS(-) pTYB12pMAL-p5e pACYCDuet-1 pEGM-11ZF(+) pEGM-7ZF(+) PinPoint Xa-3 PinPoint Xa-2 PinPoint Xa-1 pSP73pSP64 pTWIN1 pTYB11 pTXB1pET-5b(+) pBad/gIII C pBad/gIII B pBad/gIII A pET-5a(+) pMal-p4X pMal-p2G pkk223-3pkk232-8 pCYB1 pEZZ18 pBAD18pMAL-c5x pMal-p2E pMal-p2X pET-44 EK/LIC pET-43.1 EK/LIC pET-41 EK/LIC pMal-c4X pTrcHis BpET-31b(+) pET-3b(+) pET-41a(+) pGEX-3XpGEX-4T-2 pETDuet-1 pGEX-4T-1 pTrc99apET-28b(+) pET-His pALEX a,b,c pACYC177pBR322 pKD4 pKD20 pMXB10pEcoli-6xHN-GFPuv pKJE7 pRSET B pGEX-KGpGEX-2T pRSFDuet-1 pCOLADuet-1 pTrcHis C pTrcHis A pET-41b(+) pET-42b(+) pET-3a(+) pGEX-6P-3 pGEX-6P-2 pGEX-6P-1 pGEX-5X-3 pGEX-5X-1 pGEX-2TK pRSET A pMal-c2GpMal-c2E pMal-c2X pRSET C pQE-30pET-45b(+) pET-44b(+) pET-42c(+) pET-41c(+) pET-40b(+) pET-33b(+) pET-39b(+) pET-32 EK/LIC pET-32 Xa/LIC pET-32c(+) pET-32b(+) pET-30 Xa/LIC pET-30 EK/LIC pET-30c(+) pET-29c(+) pET-29b(+) pET-29a(+) pET-24c(+) pET-24b(+) pET-24(+)pET-23d(+) pET-11d(+) pBad33。

名词解释（红色考过）1.生物信息学：生物信息学是一门交叉科学，它包含了生物信息的获取、处理、存储、分发、分析和解释等在内的所有方面，它综合运用数学、计算机科学和生物学的各种工具，来阐明和理解大量数据所包含的生物学意义。

/生物信息学（bioinformatics）：是一门结合生物技术和信息技术从而揭示生物学中新原理的科学。

3.同一性：P42是指两序列在同一位点核苷酸或氨基酸残基完全相同的序列比例。

4.相似性：P42是指两序列间直接的数量关系，如部分相同、相似的百分比或其他一些合适的度量。

5.同源性：是指从某个祖先经趋异进化而形成的不同序列，也就是从一些数据中推断出的两个基因在进化上具有共同祖先的结论，它是质的判断。

6.序列比对（alignment）：将两个或多个序列排在一起，以达到最大一致性的过程（对于氨基酸序列是比较他们的保守性），这样评估序列间的相似性和同源性。

7.多序列比对（multiple sequence alignment）：三个或多个序列之间的比对，如果序列在同一列有相同结构位置的残基和（或）祖传的残基，则会在该位置插入空位。

8.算法（algorithm）：在计算机程序中包含的一种固定过程。

9.空位（gap）：在两条序列比对过程中需要在检测序列或目标序列中引入空位，以表示插入或删除。

10.直系同源（Orthologous）指不同种类的同源序列，他们是在物种的形成事件中从一个祖先序列独立进化而成的，可能有相似功能，也可能没有。

11.旁系同源（paralogous）是通过类似基因复制的机制产生的同源序列。

12.模块替换矩阵（BLUSUM）在替换矩阵中，每个位置的打分是在相关蛋白局部比对模块中观察到的替换的频率而获得的，每个矩阵被修改成一个特殊的进化距离。

（教材P46）13.可接受点突变（PAM）一个用于衡量蛋白质序列的进化突变程度的单位。

（教材P45）14.BLAST：基本局部相似性比对搜索工具。

㊀山东农业科学㊀２０２４ꎬ５６(４):２８~３５ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２４.０４.００４收稿日期:２０２３－１１－０８基金项目:广东省中医药局科研项目(２０２４１１７７)ꎻ广东省重点领域研发计划项目(２０２０Ｂ０２０２２１００２)作者简介:曾晴(２０００ )ꎬ女ꎬ湖南益阳人ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为中药资源开发与品质评价ꎮＥ－ｍａｉｌ:２７１９０４１４５３＠ｑｑ.ｃｏｍ通信作者:张宏意(１９７７ )ꎬ女ꎬ浙江舟山人ꎬ博士ꎬ副教授ꎬ主要从事药用植物资源与育种研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｄｒｉｚｚｌｅｚｈｙ＠１６３.ｃｏｍ广藿香ＤＸＳ基因克隆及表达分析曾晴ꎬ严雅玲ꎬ严寒静ꎬ何梦玲ꎬ张宏意(广东药科大学中药学院ꎬ广东广州㊀５１０００６)㊀㊀摘要:１－脱氧－Ｄ－木酮糖－５－磷酸合酶(ＤＸＳ)是调控萜类合成途径中ＭＥＰ途径的第一个关键酶ꎬ为探究广藿香ＤＸＳ基因参与其主要萜类成分广藿香醇合成调控的分子机制ꎬ本研究依据本课题组前期获得的转录组ＤＸＳ基因序列ꎬ以广藿香ｃＤＮＡ为模板ꎬ克隆得到ＰｃＤＸＳ基因ꎬ对其进行生物信息学分析ꎬ构建ｐＥＴ－２８ａ－ＰｃＤＸＳ原核表达载体诱导蛋白表达ꎬ并采用荧光实时定量ＰＣＲ法检测广藿香根㊁茎㊁叶㊁芽中ＤＸＳ基因表达情况ꎮ结果表明ꎬ从广藿香叶中克隆到开放阅读框全长为２１５１ｂｐ和１９０８ｂｐ的ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２基因序列ꎬ分别编码７１６㊁６３５个氨基酸ꎮ预测ＰｃＤＸＳ１蛋白分子量７８.３３ｋＤａꎬ为稳定非跨膜非分泌蛋白ꎬ主要定位于叶绿体ꎻＰｃＤＸＳ２蛋白分子量６７.９２ｋＤａꎬ为不稳定非跨膜非分泌蛋白ꎬ主要定位于叶绿体ꎮＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２均含有ＤＸＰ＿ｓｙｎｔｈａｓｅ＿Ｎ㊁Ｔｒａｎｓｋｅｔ＿ｐｙｒ和Ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ＿Ｃ结构域模块ꎬ属于ＤＸＳ超家族ꎮＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２分别与半枝莲㊁糙苏的ＤＸＳ基因序列具有较高同源性ꎮ使用异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷(ＩＰＴＧ)诱导的ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２融合蛋白主要在沉淀中表达ꎮＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２基因表达量均在根中最低ꎬＰｃＤＸＳ１基因在叶中显著高表达ꎬＰｃＤＸＳ２基因在叶㊁芽㊁茎中高表达ꎮ本研究结果可为后续深入研究ＤＸＳ基因在广藿香萜类化合物合成途径中的生物学功能及广藿香萜类代谢途径的基因调控奠定基础ꎮ关键词:广藿香ꎻ１－脱氧－Ｄ－木酮糖－５－磷酸合酶(ＤＸＳ)ꎻ基因克隆ꎻ生物信息学分析ꎻ表达分析中图分类号:Ｓ５６７.２:Ｑ７８１㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２４)０４－００２８－０８ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＤＸＳＧｅｎｅｆｒｏｍＰｏｇｏｓｔｅｍｏｎｃａｂｌｉｎ(Ｂｌａｎｃｏ)Ｂｅｎｔｈ.ＺｅｎｇＱｉｎｇꎬＹａｎＹａｌｉｎｇꎬＹａｎＨａｎｊｉｎｇꎬＨｅＭｅｎｇｌｉｎｇꎬＺｈａｎｇＨｏｎｇｙｉ(ＳｃｈｏｏｌｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＧｕａｎｇｚｈｏｕ５１０００６ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀１￣Ｄｅｏｘｙ￣Ｄ￣ｘｙｌｕｌｏｓｅ￣５￣ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ(ＤＸＳ)ｉｓｔｈｅｆｉｒｓｔｋｅｙｅｎｚｙｍｅｔｏｒｅｇｕｌａｔｅｔｈｅＭＥＰｐａｔｈｗａｙｉｎｔｈｅｔｅｒｐｅｎｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｐａｔｈｗａｙ.ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＤＸＳｇｅｎｅｐａｒｔｉｃｉ￣ｐａｔｉｎｇｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍａｉｎｔｅｒｐｅｎｏｉｄｃｏｍｐｏｎｅｎｔꎬｐａｔｃｈｏｕｌｉａｌｃｏｈｏｌꎬｉｎｐａｔｃｈｏｕｌｉ(Ｐｏｇｏｓｔｅ￣ｍｏｎｃａｂｌｉｎ)ꎬｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅＤＸＳｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｂｔａｉｎｅｄｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙｂｙｏｕｒｒｅｓｅａｒｃｈｇｒｏｕｐ.ＰｃＤＸＳｇｅｎｅｗａｓｃｌｏｎｅｄｂｙｕｓｉｎｇｐａｔｃｈｏｕｌｉｃＤＮＡａｓｔｅｍｐｌａｔｅꎬａｎｄｔｈｅｎａｎａｌｙｚｅｄｂｙｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｍｅｔｈｏｄ.ＴｈｅｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＥＴ￣２８ａ￣ＰｃＤＸＳｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｔｏｉｎｄｕｃｅｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎬａｎｄｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＤＸＳｇｅｎｅｉｎｒｏｏｔｓꎬｓｔｅｍｓꎬｌｅａｖｅｓａｎｄｂｕｄｓｏｆｐａｔｃｈｏｕｌｉ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＰｃＤＸＳ１ａｎｄＰｃＤＸＳ２ｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｉｔｈｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｌｅｎｇｔｈｏｆ２１５１ｂｐａｎｄ１９０８ｂｐｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍｌｅａｖｅｓｏｆｐａｔｃｈｏｕｌｉꎬｅｎｃｏｄｉｎｇ７１６ａｎｄ６３５ａｍｉｎｏａｃｉｄｓꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＰｃＤＸＳ１ｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｐｒｅｄｉｃｔｅｄｔｏｈａｖｅ７８.３３ｋＤａｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔꎬａｎｄｗａｓａｓｔａｂｌｅꎬｎｏｎ￣ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅａｎｄｎｏｎ￣ｓｅｃｒｅｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｐｒｉｍａｒｉｌｙｌｏｃａｌｉｚｅｄｉｎｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ.ＰｃＤＸＳ２ｐｒｏｔｅｉｎｈａｄ６７.９２ｋＤａｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔꎬｗｈｉｃｈｗａｓａｎｕｎｓｔａｂｌｅꎬｎｏｎ￣ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅａｎｄｎｏｎ￣ｓｅｃｒｅｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｍａｉｎｌｙｌｏｃａｌｉｚｅｄｉｎｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ.ＰｃＤＸＳ１ａｎｄＰｃＤＸＳ２ｃｏｎｔａｉｎｅｄＤＸＰ̠ｓｙｎｔｈａｓｅ̠ＮꎬＴｒａｎｓｋｅｔ̠ｐｙｒａｎｄＴｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ̠ＣｄｏｍａｉｎｍｏｄｕｌｅｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬｂｅｌｏｎｇｉｎｇｔｏＤＸＳｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ.ＰｃＤＸＳ１ａｎｄＰｃＤＸＳ２ｈａｄｈｉｇｈｈｏｍｏｌｏｇｙｉｎｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｗｉｔｈＤＸＳｇｅｎｅｓｏｆＳｃｕｔｅｌｌａｒｉａｂａｒｂａｔａａｎｄＰｈｌｏｍｉｓｕｍｂｒｏｓａ.ＰｃＤＸＳ１ａｎｄＰｃＤＸＳ２ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｉｓｏｐｒｏｐｙｌ￣β￣Ｄ￣ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ(ＩＰＴＧ)ｗｅｒｅｍａｉｎｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ.Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖ￣ｅｌｓｏｆＰｃＤＸＳ１ａｎｄＰｃＤＸＳ２ｇｅｎｅｓｗｅｒｅｔｈｅｌｏｗｅｓｔｉｎｒｏｏｔｓ.ＰｃＤＸＳ１ｇｅｎｅｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｌｅａｖｅｓꎬｗｈｉｌｅＰｃＤＸＳ２ｇｅｎｅｗａｓｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｈｉｇｈｅｒｉｎｌｅａｖｅｓꎬｂｕｄｓａｎｄｓｔｅｍｓｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｒｏｏｔｓ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｃｏｕｌｄｌａｙｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｉｅｓｏｎｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆＤＸＳｇｅｎｅｉｎｔｅｒｐｅｎｏｉｄｃｏｍｐｏｕｎｄｓｙｎｔｈｅｓｉｓｐａｔｈｗａｙａｎｄｇｅｎｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｔｅｒｐｅｎｏｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｐａｔｈｗａｙｉｎｐａｔｃｈｏｕｌｉ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎｃａｂｌｉｎꎻ１￣Ｄｅｏｘｙ￣Ｄ￣ｘｙｌｏｓｅ￣５￣ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ(ＤＸＳ)ꎻＧｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇꎻＢｉｏｉｎ￣ｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓꎻＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ㊀㊀广藿香[Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎｃａｂｌｉｎ(Ｂｌａｎｃｏ)Ｂｅｎｔｈ.]是唇形科刺蕊草属草本植物ꎬ原产于东南亚ꎬ引种至我国成为岭南道地药材ꎬ是一种具有重要药用价值和广泛工业生产应用价值的经济作物ꎬ具有芳香化浊㊁和中解暑的功效[１]ꎬ是藿香正气丸㊁二妙丸㊁午时茶颗粒等中成药的主要原料ꎮ已检测到广藿香地上部分含有１７４种化学成分ꎬ其中萜类最多ꎬ达６６种ꎬ另有黄酮㊁类固醇㊁吡喃酮㊁多糖等多种生物活性成分[２]ꎬ因而具有抗菌㊁抗炎㊁抗诱变㊁抗细胞凋亡㊁抗ＨｅｐＧ１９癌细胞增殖等多种药理活性[３－４]ꎮ广藿香提取物广藿香油全球年产可达２０００吨[５]ꎬ常被用于各类芳香疗法以舒缓压力㊁减轻疲劳㊁改善失眠㊁缓解焦虑等ꎬ还因气味宜人被广泛应用于香水㊁肥皂㊁化妆品等化工领域[６]ꎻ另外ꎬ在畜禽领域ꎬ广藿香提取物作为饲料添加剂也展现出巨大潜力[７]ꎮ广藿香醇是广藿香挥发油的首要成分ꎬ其生物合成途径有两条ꎬ分别是定位于细胞质的甲羟戊酸(ｍｅｖａｌｏｎａｔｅꎬＭＶＡ)途径和定位于叶绿体的甲基赤藓糖－４－磷酸(ｍｅｔｈｙｌｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ￣４￣ｐｈｏｓｐｈａｔｅꎬＭＥＰ)途径[８－９]ꎮＭＶＡ途径主要负责倍半萜㊁三萜和橄榄苦苷甾体的合成ꎬ而广藿香醇为三环倍半萜类化合物ꎬ因此在关于广藿香醇的分子调控和生物合成中ꎬ针对ＭＶＡ途径关键基因的作用已经进行了较多研究[１０]ꎮＭＥＰ途径除合成单萜㊁二萜㊁四萜还合成植物激素㊁光合色素[１１－１２]ꎮＭＶＡ和ＭＥＰ途径均可产生戊烯基焦磷酸(ＩＰＰ)及其异构体二甲基烯丙基焦磷酸(ＤＭＡＰＰ)ꎬ这两种物质是合成萜类化合物的共同前体物质ꎮ１－脱氧－Ｄ－木酮糖－５－磷酸合酶(ＤＸＳ)是ＭＥＰ途径的第一个酶ꎬ催化丙酮酸和３－磷酸甘油醛生成１－脱氧木酮糖－５－磷酸(ＤＸＰ)[１２]ꎮＤＸＳ家族可分为３个不同的亚家族 ＤＸＳ１㊁ＤＸＳ２和ＤＸＳ３ꎬ这３种类型的ＤＸＳ蛋白在保守基序组成㊁二级结构和三级结构方面具有高度相似性[１３]ꎮＤＸＳ不仅在植物萜类生物合成过程中发挥着重要调控作用ꎬ还在许多生理过程中起着重要作用ꎬ如光合作用㊁植物激素调节㊁逆境抗性和病原体防御等ꎮ过表达马尾松ＰｍＤＸＳ可以显著提高其类胡萝卜素㊁叶绿素ａ㊁叶绿素ｂ含量和ＤＸＳ活性[１４]ꎬ瞬时转化过表达天竺葵的ＧｒＤＸＳ基因能增加次生代谢物天竺葵精油中单萜和倍半萜化合物含量[１５]ꎬ提示ＤＸＳ基因在萜类生物合成途径中具有重要调控作用ꎮ迄今ꎬＤＸＳ基因已经在银杏[１６]㊁乌头[１７]㊁穿心莲[１８]㊁桔梗[１９]㊁荆芥[２０]等多种植物中完成克隆和初步研究ꎬ而从广藿香中探究ＤＸＳ基因的内容鲜见报道ꎮ本研究基于课题组前期获得的转录组数据克隆了广藿香ＤＸＳ基因ꎬ并对其进行生物信息学分析及在广藿香不同部位的表达分析ꎬ以期为今后深入研究该基因在萜类化合物代谢中的功能奠定基础ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验材料本研究所用植物材料经广东药科大学中药学院严寒静教授鉴定为唇形科刺蕊草属植物广藿香[Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎｃａｂｌｉｎ(Ｂｌａｎｃｏ)Ｂｅｎｔｈ.]ꎬ培育于广东药科大学中药学院ꎮ采集生长６个月的广藿香叶片液氮速冻ꎬ于－８０ħ超低温冰箱保存ꎬ用于ＲＮＡ提取与基因克隆ꎮ选取生长６个月状态良好的广藿香根㊁茎(第２㊁３对叶之间)㊁叶(第２对叶)㊁芽ꎬ经液氮速冻后置于－８０ħ冰箱ꎬ用于ＲＮＡ提取及组织特异性表达ｑＲＴ－ＰＣＲ分析ꎮＤＨ５α感受态细胞㊁ＢＬ２１(ＤＥ３)表达菌株㊁ｐＥＴ２８ａ原核表达载体均购自北京庄盟国际生物９２㊀第４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀曾晴ꎬ等:广藿香ＤＸＳ基因克隆及表达分析基因科技有限公司ꎮ１.２㊀试验方法１.２.１㊀ＲＮＡ提取与ｃＤＮＡ链合成㊀将广藿香叶片样品经液氮研磨后ꎬ采用天根植物总ＲＮＡ提取试剂盒提取总ＲＮＡꎬ使用超微量紫外分光光度计ＵＶ２４５０测定其浓度和纯度ꎬ用１％琼脂糖凝胶电泳检测ＲＮＡ完整性ꎮ使用ＴａＫａＲａ的ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴｒｅａｇｅｎｔＫｉｔｗｉｔｈｇＤＮＡＥｒａｓｅｒ反转录试剂盒合成ｃＤＮＡ第一链ꎮ１.２.２㊀基因克隆㊀根据课题组前期获得的转录组数据得到广藿香ＰｃＤＸＳ基因的ＣＤＳ序列ꎬ设计特异性引物(表１)ꎬ以反转录得到的ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增ꎮＰＣＲ反应体系:ｃＤＮＡ１μＬꎬ上游引物ＰｃＤＸＳ－Ｆ１μＬꎬ下游引物ＰｃＤＸＳ－Ｒ１μＬꎬＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ２５μＬ㊁ｄｄＨ２Ｏ补足至５０μＬꎮＰＣＲ反应程序:９８ħ１０ｓꎬ５５ħ５ｓꎬ７２ħ１２ｓꎬ３５个循环ꎻ７２ħ２ｍｉｎꎮＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电泳鉴定后切胶回收ꎬ并检测浓度及纯度ꎬ使用庄盟ＺＴＯＰＯ－Ｂｌｕｎｔ/ＴＡ快速克隆试剂盒进行ＴＡ克隆ꎻ转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞ꎬ经菌液ＰＣＲ鉴定ꎬ挑取阳性克隆ꎬ送广州擎科生物科技股份有限公司测序ꎮ表１㊀引物序列引物名称用途引物序列(５ᶄ－３ᶄ)ＰｃＤＸＳ１－Ｆ基因克隆ＡＴＧＧＣＴＴＣＴＧＴＴＴＣＴＴＧＣＣＡＧＡＡＣＣＰｃＤＸＳ１－ＲＴＣＡＧＡＧＣＡＴＣＡＡＴＴＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＰｃＤＸＳ２－ＦＡＴＧＡＡＡＡＡＣＣＴＣＡＣＴＧＣＴＡＡＧＧＰｃＤＸＳ２－ＲＴＴＡＧＧＡＣＡＴＴＡＴＣＴＣＴＡＧＧＧＣＣｐＥＴ－２８ａ－ＰｃＤＸＳ１－Ｆ构建原核表达载体ＧＡＣＡＧＣＡＡＡＴＧＧＧＴＣＧＣＧＧＡＡＴＧＧＣＴＴＣＴ￣ＧＴＴＴＣＴＴＧＣＣＡＧＡＡＣＣｐＥＴ－２８ａ－ＰｃＤＸＳ１－ＲＣＧＡＣＧＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＧＡＧＣＡＴ￣ＣＡＡＴＴＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＣＧｐＥＴ－２８ａ－ＰｃＤＸＳ２－ＦＧＡＣＡＧＣＡＡＡＴＧＧＧＴＣＧＣＧＧＡＡＴＧＡＡＡＡＡＣ￣ＣＴＣＡＣＴＧＣＴＡＡＧＧＡＡＣＴＧＡＡＡＣＡｐＥＴ－２８ａ－ＰｃＤＸＳ２－ＲＣＧＡＣＧＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＧＧＡＣＡＴ￣ＴＡＴＣＴＣＴＡＧＧＧＣＣＴＣＣＣＴＡＧ１８Ｓ－ＦｑＲＴ－ＰＣＲＴＣＡＡＣＣＡＴＡＡＡＣＧＡＴＧＣＣＧＡＣＣ１８Ｓ－ＲＴＴＴＣＡＧＣＣＴＴＧＣＧＡＣＣＡＴＡＣＴＣＣｑ－ＰｃＤＸＳ１－ＦＣＧＡＧＡＣＡＴＴＴＣＣＣＴＣＣＴＴＧＣｑ－ＰｃＤＸＳ１－ＲＧＡＣＣＡＣＣＡＣＡＡＣＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧｑ－ＰｃＤＸＳ２－ＦＧＴＧＡＴＴＡＴＧＡＴＴＧＣＴＴＣＧＧＴＧＣＴｑ－ＰｃＤＸＳ２－ＲＡＴＧＧＣＴＴＣＧＴＡＴＧＣＴＴＧＡＣＣＴＧ１.２.３㊀生物信息学分析㊀依照对应的生物信息学在线工具(表２)对广藿香的ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２进行序列分析ꎮ从ＮＣＢＩ上进行Ｂｌａｓｔ比对ꎬ获得ＰｃＤＸＳ同源序列ꎬ利用ＭＥＧＡ.１１邻接法构建进化树ꎬＢｏｏｔｓｔｒａｐ值设置为１０００次重复ꎮ表２㊀在线工具、用途及网址在线工具用途网址ＥｘＰＡＳｙＰｒｏｔＰａｒａｍ蛋白质理化性质分析ｈｔｔｐｓ://ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/ｐｒｏｔｐａｒａｍ/ＥｘＰＡＳｙＰｒｏｔＳｃａｌｅ疏水性分析ｈｔｔｐｓ://ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/ｐｒｏｔｓｃａｌｅ/Ｐｌａｎｔ－ｍＰＬｏｃ亚细胞定位预测ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｃｓｂｉｏ.ｓｊｔｕ.ｅｄｕ.ｃｎ/ｂｉｏｉｎｆ/ｐｌａｎｔ￣ｍｕｌｔｉ/ＤｅｅｐＴＭＨＭＭ跨膜结构预测ｈｔｔｐｓ://ｄｔｕ.ｂｉｏｌｉｂ.ｃｏｍ/ＤｅｅｐＴＭ￣ＨＭＭＳｉｇｎａｌＰ－６.０信号肽预测ｈｔｔｐｓ://ｓｅｒｖｉｃｅｓ.ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ.ｄｔｕ.ｄｋ/ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ＳｉｇｎａｌＰ￣６.０/ＮＣＢＩＣＤＳｅａｒｃｈ保守结构域分析ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ/ｃｄｄ/ｗｒｐｓｂ.ｃｇｉＳＯＰＭＡ二级结构预测ｈｔｔｐｓ://ｎｐｓａ￣ｐｒａｂｉ.ｉｂｃｐ.ｆｒ/ｃｇｉ￣ｂｉｎ/ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ.ｐｌ?ｐａｇｅ＝ｎｐｓａ％２０＿ｓｏｐｍａ.ｈｔｍｌＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ三级结构预测ｈｔｔｐｓ://ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/１.２.４㊀原核表达㊀设计ＰｃＤＸＳ基因与包含ｐＥＴ－２８ａ载体酶切位点的同源臂引物(表１)ꎬ构建ｐＥＴ－２８ａ－ＰｃＤＸＳ原核表达载体ꎮＰｃＤＸＳ基因引入ｐＥＴ－２８ａ载体同源臂反应体系为:ＴＡ－ＰｃＤＸＳ重组质粒１μＬꎬ上游引物ｐＥＴ－２８ａ－ＰｃＤＸＳ－Ｆ１μＬꎬ下游引物ｐＥＴ－２８ａ－ＰｃＤＸＳ－Ｒ１μＬꎬＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭａｘＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ２５μＬꎬｄｄＨ２Ｏ补足至５０μＬꎮＰＣＲ反应程序:９８ħ１０ｓꎬ５５ħ５ｓꎬ７２ħ１２ｓꎬ３５个循环ꎻ７２ħ２ｍｉｎꎮ采用全式金ＢａｍＨⅠ酶将ｐＥＴ－２８ａ载体进行单酶切线性化ꎮＰＣＲ产物及酶切产物经１％琼脂糖凝胶电泳鉴定后切胶回收ꎬ将产物根据庄盟ＳＥ无缝克隆和组装试剂盒连接转化ＤＨ５α感受态细胞ꎬ菌液经ＰＣＲ鉴定ꎬ挑取阳性克隆ꎬ送广州擎科生物科技股份有限公司测序ꎮ将ｐＥＴ－２８ａ－ＰｃＤＸＳ质粒转化蛋白表达菌株ＢＬ２１(ＤＥ３)ꎬ经ＰＣＲ鉴定ꎬ挑取阳性菌液摇菌后ꎬ在５ｍＬ菌液中添加异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷(ＩＰＴＧ)至浓度分别为０.２５㊁０.５㊁０.７５㊁１.０ｍｍｏｌ Ｌ－１ꎬ１６０ｒ ｍｉｎ－１摇床㊁１６ħ培养１２ｈꎬ使用细胞破碎仪(ＡＭＰ２５％ꎬ开５ｓꎬ关５ｓ)破碎２ｍｉｎꎬ离心收集上清液和沉淀ꎬ进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳检测ＰｃＤＸＳ蛋白表达情况ꎮ１.２.５㊀荧光定量ＰＣＲ表达分析㊀以转录合成的ｃＤＮＡ为模板ꎬ１８Ｓ为内参基因ꎮ根据ＰｃＤＸＳ基因的测序结果ꎬ使用Ｐｒｅｍｉｅｒ５.０设计ｑＲＴ－ＰＣＲ引物(表１)ꎮ实时荧光定量ＰＣＲ采用２０μＬ反应体系:２ˑＴＢＧｒｅｅｎＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑⅡ１０μＬꎬｃＤ￣ＮＡ１.５μＬꎬ上㊁下游引物各０.４μＬꎬｄｄＨ２Ｏ７.７μＬꎮ扩增程序:９５ħꎬ３０ｓꎻ９５ħ５ｓꎬ６０ħ３０ｓꎬ０３山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀４０个循环ꎮ每个部位进行３次生物学重复ꎬ每个样品３个技术重复ꎮ采用２－әәＣｔ法计算ＰｃＤＸＳ基因在广藿香不同组织部位根㊁茎㊁叶㊁芽中的相对表达量ꎮ采用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ９.５软件进行单向方差多重比较分析数据ꎬ利用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ作图并用字母标记法标记差异显著性ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２基因克隆提取广藿香总ＲＮＡꎬ琼脂糖凝胶电泳显示有清晰条带ꎬ经超微量紫外分光光度计ＵＶ２４５０测定浓度和纯度合格ꎬ可用于后续实验ꎮ通过使用基因特异性引物ꎬ成功克隆获得两条序列长度为２１５１ｂｐ和１９０８ｂｐ的序列(图１)ꎬ测序结果与转录组序列相似度分别高达９９.９５％和１００％ꎬ分别编码７１６个和６３５个氨基酸ꎬ命名为ＰｃＤＸＳ１和ＰｃＤＸＳ２ꎮＭ:ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻ１:ＰｃＤＸＳ１基因ＰＣＲ扩增产物ꎻ２:ＰｃＤＸＳ２基因ＰＣＲ扩增产物ꎮ图１㊀ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２基因克隆２.２㊀ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２蛋白理化性质分析经ＰｒｏｔＰａｒａｍ预测分析ꎬＰｃＤＸＳ１蛋白分子式为Ｃ３４７３Ｈ５４９６Ｎ８４０Ｏ１０３８Ｓ３９ꎬ为亲水且稳定的弱酸性蛋白ꎻＰｃＤＸＳ２蛋白分子式为Ｃ３００９Ｈ４７９０Ｎ８４０Ｏ８９９Ｓ２５ꎬ为亲水不稳定的弱酸性蛋白(表３)ꎬＰｒｏｔＳｃａｌｅ分析也表明ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２均为亲水性蛋白(图２)ꎮ两蛋白均定位在叶绿体ꎮ表３㊀ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ１蛋白理化性质蛋白氨基酸数分子量/ｋＤａ正电残基个数负电残基个数等电点亲水性总平均值(ＧＲＡＶＹ)脂肪系数不稳定系数跨膜区域信号肽ＰｃＤＸＳ１７１６７８.３３８４６６５.７８－０.０２８９２.３５３９.３５无无ＰｃＤＸＳ２６３５６７.９２７１６５６.３６－０.０４４９１.４５４２.８４无无正值表示疏水ꎻ负值表示亲水ꎮ图２㊀ＰｃＤＸＳ１(Ａ)㊁ＰｃＤＸＳ２(Ｂ)蛋白亲疏水性预测２.３㊀ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２保守结构域及二级和三级结构分析ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２蛋白保守结构域分析结果显示ꎬ两者都属于ＤＸＳ超家族ꎬ含有从Ｎ端到Ｃ端的ＤＸＰ＿ｓｙｔｈａｓｅ＿Ｎ㊁Ｔｒａｎｓｋｅｔ＿ｐｙｒ和Ｔｒａｎｓｋｅｔｏ￣ｌａｓｅ＿Ｃ结构域模块(图３)ꎮＰｃＤＸＳ１蛋白二级结构中无规则卷曲占比最高ꎬ为３９.８０％ꎬ还含有３７.８５％的α－螺旋㊁１５.９２％的折叠延伸链㊁６.４２％的β－折叠ꎻＰｃＤＸＳ２蛋白中占比最高的是α－螺旋ꎬ为４１.８９％ꎬ还含有１５.５９％的折叠延伸链㊁８.０３％的β－折叠㊁３４.４９％的无规则卷曲(图４)ꎮ通过ＳＷＩＳＳＭＯＤＥＬ构建了两蛋白的三级结构ꎬ对ＰｃＤＸＳ１蛋白ꎬ以叶绿体ＤＸＰＳ为模板ꎬ序列一致性５５.７８％ꎬＧＭＱＥ得分为０.６４(０~１范围内数值越大表明预期质量越高)ꎬＧＭＥＡＮ得分为１３㊀第４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀曾晴ꎬ等:广藿香ＤＸＳ基因克隆及表达分析０.６７(分数趋近于０反映 类似原生 的结构ꎬ低于－４.０的 ＱＭＥＡＮ 分数表示模型质量较低)ꎬ可视为获得了良好的ＰｃＤＸＳ１蛋白三级结构模型ꎮ对ＰｃＤＸＳ２蛋白ꎬ以番茄ＤＸＳ１为模板ꎬ二者的相似度高达９１.０２％ꎬＧＭＱＥ得分为０.９０ꎬ该模型可较好地预测ＰｃＤＸＳ２蛋白的三级结构(图５)ꎮ图３㊀ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２蛋白保守结构域分析结果２.４㊀ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２基因系统进化分析使用ＭＥＧＡ１１构建ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２与其他物种ＤＸＳ基因的系统发育树ꎬ结果(图６)显示ꎬＰｃＤＸＳ１与半枝莲ＤＸＳ(ＭＫ０３５０４０.１)聚为一支ꎬＰｃＤＸＳ２与糙苏ＤＸＳ(ＫＵ３１７５０８.１)聚为一支ꎬ亲缘关系较近ꎮＰｃＤＸＳ１和ＰｃＤＸＳ２之间存在系统发育距离ꎬ可能存在功能差异ꎮ蓝色表示α－螺旋ꎻ红色表示β－折叠ꎻ绿色表示β－转角ꎻ紫色表示无规则卷曲ꎮ图４㊀ＰｃＤＸＳ１(Ａ)㊁ＰｃＤＸＳ２(Ｂ)蛋白的二级结构图５㊀ＰｃＤＸＳ１(Ａ)㊁ＰｃＤＸＳ２(Ｂ)蛋白的三级结构Ｃａｍｅｌｌｉａｓｉｎｅｎｓｉｓ:山茶花ꎻＡｃｔｉｎｉｄｉａｃｈｉｎｅｎｓｉｓ:猕猴桃ꎻＰｒｕｎｅｌｌａｖｕｌｇａｒｉｓ:夏枯草ꎻＧａｒｄｅｎｉａｊａｓｍｉｎｏｉｄｅｓ:栀子ꎻＰｉｎｕｓｍａｓｓｏｎｉａｎａ:马尾松ꎻＴｈｕｊａｐｌｉｃａｔａ:北美乔柏ꎻＡｑｕｉｌａｒｉａｓｉｎｅｎｓｉｓ:土沉香ꎻＰｈｌｏｍｉｓｕｍｂｒｏｓａ:糙苏ꎻＴａｒａｘａｃｕｍｋｏｋ￣ｓａｇｈｙｚ:橡胶草ꎻＷｉｔｈａｎｉａｓｏｍｎｉｆｅｒａ:南非醉茄ꎻＳｃｕｔｅｌｌａｒｉａｂａｒｂａｔａ:半枝莲ꎻＬｙｃｉｕｍｒｕｔｈｅｎｉｃｕｍ:枸杞ꎻＰｌｅｃｔｒａｎｔｈｕｓｂａｒｂａｔｕｓ:左手香ꎮ图６㊀ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２基因系统发育进化树２３山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀２.５㊀ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２原核表达分析将ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２基因引入同源臂与ｐＥＴ－２８ａ线性化载体连接ꎬ测序分析结果同克隆序列一致ꎬ表明成功构建ｐＥＴ－２８ａ－ＰｃＤＸＳ１㊁ｐＥＴ－２８ａ－ＰｃＤＸＳ２原核表达载体ꎮＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２蛋白分子量分别为７８.３３ｋＤａ和６７.９２ｋＤａꎬ加上Ｈｉｓ标签后蛋白大小分别约为８４.６ｋＤａ和７６.１ｋＤａꎮ将重组质粒转化ＢＬ２１(ＤＥ３)菌株ꎬ挑取阳性菌在１６ħ条件下分别用０.２５㊁０.５０㊁０.７５㊁１.０ｍｍｏｌ Ｌ－１ＩＰＴＧ诱导表达１２ｈꎬ经细胞破碎仪破碎㊁离心㊁ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳检测ꎬ结果(图７)显示ꎬ在沉淀中分别有８４.６ｋＤａ和７６.１ｋＤａ的蛋白条带ꎬ说明ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２重组蛋白被成功诱导表达ꎬＰｃＤＸＳ２重组蛋白表达较少ꎬ主要在沉淀中表达ꎬＩＰＴＧ浓度变化对蛋白表达无明显影响ꎮＭ:ＢｌｕｅＰｌｕｓ®ＩＩＰｒｏｔｅｉｎＭａｒｋｅｒ(１４~１２０ｋＤａ)ꎻ１㊁３㊁５㊁７㊁９:分别为０㊁０.２５㊁０.５０㊁０.７５㊁１.００ｍｍｏｌ Ｌ－１ＩＰＴＧ诱导重组蛋白表达后的破碎菌体上清ꎻ２㊁４㊁６㊁８㊁１０:分别为０㊁０.２５㊁０.５０㊁０.７５㊁１.０ｍｍｏｌ Ｌ－１ＩＰＴＧ诱导重组蛋白表达后的破碎菌体沉淀ꎮ图７㊀ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２原核表达分析的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测结果２.６㊀ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２表达的组织特异性分析结果(图８)显示ꎬＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２在广藿香根㊁茎㊁叶㊁芽中均有表达ꎮ其中ꎬＰｃＤＸＳ１在叶中表达量最高ꎬ在芽和茎中表达量也较高ꎬ均显著高于在根中的表达量ꎻＰｃＤＸＳ２在茎㊁叶㊁芽中的表达量相当ꎬ且均显著高于在根中的表达量ꎮ柱上不同小写字母表示组织间差异显著(Ｐ<０.０５)ꎮ图８㊀ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２在广藿香不同部位中的表达差异３㊀讨论目前已从多种植物中挖掘出ＤＸＳ基因ꎬ并对其在萜类化合物生物合成过程中的功能进行了研究ꎬ但ＤＸＳ基因对广藿香萜类代谢调控的影响尚未见研究报道ꎮＤＸＳ基因家族具有较高的保守性[２１]ꎬ多含有ＤＸＰ＿ｓｙｔｈａｓｅ＿Ｎ㊁Ｔｒａｎｓｋｅｔ＿ｐｙｒ和Ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ＿Ｃ结构域模块[２２]ꎮ本研究从广藿香中克隆出两个ＤＸＳ基因(ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２)ꎬ均包含该３个保守结构域模块ꎬ符合ＤＸＳ基因家族结构特征ꎮＤＸＳ亚家族中ꎬＤＸＳ１被认为是管家基因[２３]ꎬＤＸＳ１蛋白主要在叶绿体中表达ꎬ是合成光合色素和植物激素所必需的[２４]ꎬ在植物叶片和茎的叶绿体以及果实的有色质体中大量表达[１２]ꎻＤＸＳ２蛋白位于非光合作用质体中ꎬ参与一些防御反应特异的萜类化合物的合成ꎬ优先在植物根的成熟体中表达[１２]ꎻＤＸＳ３蛋白的表达与参与胚胎后发３３㊀第４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀曾晴ꎬ等:广藿香ＤＸＳ基因克隆及表达分析育和繁殖的基因相关[２５]ꎮ本研究结果显示ꎬＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２在广藿香根㊁茎㊁叶㊁芽中均有表达ꎬ且主要在地上部表达ꎬ在根中的表达量较低ꎬ尤其ＰｃＤＸＳ１在叶中显著高表达ꎬ符合ＤＸＳ１在光合组织中活跃的特征ꎻ亚细胞定位预测显示主要定位在叶绿体ꎬ说明ＰｃＤＸＳ１和ＰｃＤＸＳ２可能在叶绿体中发挥作用ꎮ原核表达是常见的表达外源蛋白的分子生物技术ꎬ大肠杆菌(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ)具有生长周期短㊁易于培养及遗传操纵的特点ꎬ是产生重组蛋白的重要宿主ꎬ优化重组蛋白的生物合成至关重要ꎬ常通过改变菌株的培养参数增加蛋白的表达和溶解度ꎬ用于生产重组蛋白[２６－２７]ꎮ对毛果杨ＤＸＳ蛋白进行诱导表达ꎬ在沉淀物中检测到ＰｔＤＸＳ靶蛋白[２８]ꎮ陈文意等[２９]考察了２０㊁３０ħ下ꎬ０.２５ｍｍｏｌ Ｌ－１和０.５ｍｍｏｌ Ｌ－１ＩＰＴＧ诱导的广藿香Ｐｃ￣ＪＡＲ１融合蛋白表达ꎬ发现２０ħ㊁０.２５ｍｍｏｌ Ｌ－１ＩＰＴＧ诱导下表达菌诱导蛋白在沉淀中更高表达ꎬ说明温度和ＩＰＴＧ浓度影响蛋白表达ꎮ本研究利用０.２５㊁０.５㊁０.７５㊁１.０ｍｍｏｌ Ｌ－１ＩＰＴＧ诱导ＰｃＤＸＳ１㊁ＰｃＤＸＳ２重组蛋白在ＢＬ２１(ＤＥ３)中表达ꎬ结果表明两蛋白主要在沉淀中表达ꎬ表达量与ＩＰＴＧ浓度无明显关联ꎬＰｃＤＸＳ２重组蛋白在同样条件下表达量较少还可能与诱导温度和时间有关ꎮ研究发现ꎬＤＸＳ基因的表达水平一般与ＭＥＰ途径直接调控的萜类含量呈正相关ꎬ过表达薰衣草ＤＸＳ基因显著促进薰衣草精油中单萜化合物的积累[３０]ꎻ二萜类丹参酮是丹参的主要生物活性成分ꎬ丹参ＳｍＤＸＳ１和ＳｍＤＸＳ２的过表达显著增强其根系中丹参酮的积累[３１]ꎮ同时ꎬＤＸＳ基因也调控ＭＶＡ途径萜类化合物合成ꎬ其表达水平会影响ＭＶＡ途径萜类含量水平的高低ꎬ如沉默甘草ＤＸＳ基因促进了甘草毛状根中三萜类物质甘草酸的合成ꎬ而过表达ＤＸＳ基因则导致甘草酸含量下降[３２]ꎻ使用ＤＸＳ基因抑制剂氯马松(ＣＬＯ)处理檀香幼苗ꎬ倍半萜檀香醇的含量没有降低[３３]ꎮ４㊀结论本研究从广藿香中克隆得到ＰｃＤＸＳ１和ＰｃＤＸＳ２基因ꎬ其全长分别为２１５１ｂｐ和１９０８ｂｐꎬ分别编码７１６个和６３５个氨基酸ꎬ均定位于叶绿体ꎬ均为亲水性㊁非跨膜㊁非分泌蛋白ꎻＰｃＤＸＳ１蛋白为稳定蛋白ꎬＰｃＤＸＳ２蛋白为不稳定蛋白ꎬ均具有ＤＸＳ基因家族典型特征ꎮ原核表达分析发现两蛋白均受ＩＰＴＧ诱导表达ꎬ且主要在沉淀中表达ꎬ表达水平在不同ＩＰＴＧ浓度间无明显差异ꎮ两基因在广藿香根㊁茎㊁叶㊁芽中均有表达ꎬ但在根中的表达量均较低ꎬＰｃＤＸＳ１主要在叶中表达ꎬＰｃＤＸＳ２在茎㊁叶㊁芽中的表达量均较高且相当ꎮ这为深入研究ＤＸＳ基因在调控广藿香萜类化合物合成中的作用奠定基础ꎮ为此ꎬ本课题组已构建ＤＸＳ基因的过表达载体和沉默载体ꎬ期望通过进一步研究揭示其表达与广藿香有效成分积累之间的关系ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀国家药典委员会.中华人民共和国药典[Ｍ].北京:中国医药科技出版社ꎬ２０２０:４６.[２]㊀ＸｕＦＦꎬＣａｉＷꎬＭａＴꎬｅｔａｌ.Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｕｓｅｓꎬｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙꎬｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌꎬｉｎｄｕｓｔｒｉａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎꎬｐｈａｒｍａ￣ｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓａｎｄｎｅｔｗｏｒｋｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙｏｆｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎｃａｂｌｉｎ:ａｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｒｅｖｉｅｗ[Ｊ].ＴｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅꎬ２０２２ꎬ５０(３):６９１－７２１.[３]㊀ＰｅｎｇＸＪꎬＡｎｇＳꎬＺｈａｎｇＹＺꎬｅｔａｌ.ＣｈｅｍｉｃａｌｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｗｉｔｈａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅａｃｔｉｖｉｔｙｆｒｏｍＰｏｇｏｓｔｅｍｏｎｃａｂｌｉｎ(Ｂｌａｎｃｏ)Ｂｅｎｔｈ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２０２２ꎬ１０:９３８８５１. [４]㊀ＦａｔｉｍａＳꎬＦａｒｚｅｅｎＩꎬＡｓｈｒａｆＡꎬｅｔａｌ.Ａｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｒｅｖｉｅｗｏｎｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｐａｃｈｙｐｏｄｏｌ:ａｂｉｏａｃｔｉｖｅｃｏｍｐｏｕｎｄｏｆａｎａｒｏｍａｔｉｃｍｅｄｉｃｉｎａｌｐｌａｎｔＰｏｇｏｓｔｅｍｏｎｃａｂｌｉｎＢｅｎｔｈ.[Ｊ].Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓꎬ２０２３ꎬ２８(８):３４６９.[５]㊀ＶａｎＢｅｅｋＴＡꎬＪｏｕｌａｉｎＤ.ＴｈｅｅｓｓｅｎｔｉａｌｏｉｌｏｆｐａｔｃｈｏｕｌｉꎬＰｏｇ￣ｏｓｔｅｍｏｎｃａｂｌｉｎ:ａｒｅｖｉｅｗ[Ｊ].ＦｌａｖｏｕｒａｎｄＦｒａｇｒａｎｃｅＪｏｕｒｎａｌꎬ２０１８ꎬ３３(１):６－５１.[６]㊀ＳｗａｍｙＫＭꎬＳｉｎｎｉａｈＲＵ.Ａｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｒｅｖｉｅｗｏｎｔｈｅｐｈｙ￣ｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓａｎｄｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆＰｏｇ￣ｏｓｔｅｍｏｎｃａｂｌｉｎＢｅｎｔｈ.:ａｎａｒｏｍａｔｉｃｍｅｄｉｃｉｎａｌｐｌａｎｔｏｆｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ[Ｊ].Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓꎬ２０１５ꎬ２０(５):８５２１－８５４７. [７]㊀高阳ꎬ杜鑫ꎬ马雪ꎬ等.广藿香提取物在动物生产中的应用[Ｊ].黑龙江畜牧兽医ꎬ２０２３(２１):４９－５３.[８]㊀ＣｈａｐｐｅｌｌＪ.Ｔｈｅｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙｏｆｉｓｏｐｒｅ￣ｎｏｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ１９９５ꎬ１０７(１):１－６. [９]㊀ＲｏｈｍｅｒＭ.Ｔｈｅｄｉｓｃｏｖｅｒｙｏｆａｍｅｖａｌｏｎａｔｅ￣ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐａｔｈｗａｙｆｏｒｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｂａｃｔｅｒｉａꎬａｌｇａｅａｎｄｈｉｇｈｅｒｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔＲｅｐｏｒｔｓꎬ１９９９ꎬ１６(５):５６５－５７４. [１０]张婵ꎬ姚广龙ꎬ张军锋ꎬ等.广藿香百秋李醇分子调控及合成生物学研究进展[Ｊ].生物技术通报ꎬ２０２１ꎬ３７(８):５５－６４.[１１]ＡｒｅｎｄｔＰꎬＰｏｌｌｉｅｒＪꎬＣａｌｌｅｗａｅｒｔＮꎬｅｔａｌ.Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃｂｉｏｌｏｇｙｆｏｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｎａｔｕｒａｌａｎｄｎｅｗ￣ｔｏ￣ｎａｔｕｒｅｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓｉｎｐｈｏｔｏｓｙｎ￣ｔｈｅｔｉｃｏｒｇａｎｉｓｍｓ[Ｊ].ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌꎬ２０１６ꎬ８７(１):１６－３７.４３山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀[１２]ＧａｎｊｅｗａｌａＤꎬＫｕｍａｒＳꎬＬｕｔｈｒａＲ.Ａｎａｃｃｏｕｎｔｏｆｃｌｏｎｅｄｇｅｎｅｓｏｆｍｅｔｈｙｌ￣ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ￣４￣ｐｈｏｓｐｈａｔｅｐａｔｈｗａｙｏｆｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄｂｉｏｓｙｎ￣ｔｈｅｓｉｓｉｎｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＩｓｓｕｅｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙꎬ２００９ꎬ１１(ｓ１):３５－４５.[１３]ＴｉａｎＳＫꎬＷａｎｇＤＤꎬＹａｎｇＬꎬｅｔａｌ.Ａｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｒｅｖｉｅｗｏｆ１￣Ｄｅｏｘｙ￣Ｄ￣ｘｙｌｕｌｏｓｅ￣５￣ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅｉｎｔｅｒｐｅｎｏｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅ￣ｓｉｓｉｎｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＧｒｏｗｔｈＲｅｇｕｌａｔｉｏｎꎬ２０２２ꎬ９６:２２１－２３５. [１４]ＬｉＲꎬＣｈｅｎＰＺꎬＺｈｕＬＺꎬｅｔａｌ.Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅ１￣ｄｅｏｘｙ￣Ｄ￣ｘｙｌｏｓｅ￣５￣ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ(ＤＸＳ)ｇｅｎｅｒｅｌａｔ￣ｅｄｔｏｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎＰｉｎｕｓｍａｓｓｏｎｉａｎａ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ２０２１ꎬ２２(２):８４８.[１５]ＪａｄａｕｎＪＳꎬＳａｎｇｗａｎＮＳꎬＮａｒｎｏｌｉｙａＬＫꎬｅｔａｌ.Ｏｖｅｒ￣ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＤＸＳｇｅｎｅｅｎｈａｎｃｅｓｔｅｒｐｅｎｏｉｄａｌｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅａｃｃｕ￣ｍｕｌａｔｉｏｎｉｎｒｏｓｅ￣ｓｃｅｎｔｅｄｇｅｒａｎｉｕｍａｎｄＷｉｔｈａｎｉａｓｏｍｎｉｆｅｒａ:ａｃ￣ｔｉｖｅｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｏｆｐｌａｓｔｉｄｉｓｏｐｒｅｎｏｇｅｎｉｃｐａｔｈｗａｙｉｎｔｈｅｉｒｂｉｏ￣ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ[Ｊ].ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉａＰｌａｎｔａｒｕｍꎬ２０１７ꎬ１５９(４):３８１－４００. [１６]ＧｏｎｇＹＦꎬＬｉａｏＺＨꎬＧｕｏＢＨꎬｅｔａｌ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘ￣ｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆＧｉｎｋｇｏｂｉｌｏｂａＤＸＳｇｅｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇ１￣ｄｅｏｘｙ￣Ｄ￣ｘｙｌｕｌｏｓｅ５￣ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅꎬｔｈｅｆｉｒｓｔｃｏｍｍｉｔｔｅｄｅｎ￣ｚｙｍｅｏｆｔｈｅ２￣Ｃ￣ｍｅｔｈｙｌ￣Ｄ￣ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ４￣ｐｈｏｓｐｈａｔｅｐａｔｈｗａｙ[Ｊ].ＰｌａｎｔａＭｅｄｉｃａꎬ２００６ꎬ７２(４):３２９－３３５.[１７]ＳｈａｒｍａＥꎬＰａｎｄｅｙＳꎬＧａｕｒＡＫ.Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａ￣ｎａｌｙｓｉｓｏｆＤＸＳ１ｇｅｎｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＡｃｏｎｉｔｕｍｂａｌｆｏｕｒｉｉＳｔａｐｆ[Ｊ].ＡｃｔａＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉａｅＰｌａｎｔａｒｕｍꎬ２０１６ꎬ３８:２３３.[１８]ＳｒｉｎａｔｈＭꎬＳｈａｉｌａｊｉＡꎬＢｉｎｄｕＢＢＶꎬｅｔａｌ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆ１￣Ｄｅｏｘｙ￣Ｄ￣ｘｙｌｕｌｏｓｅ５￣ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ(ＤＸＳ)ｉｎＡｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓｐａｎｉｃｕｌａｔａ(Ｂｕｒｍ.ｆ)Ｎｅｅｓ[Ｊ].Ｍｏｌ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０２１ꎬ６３:１０９－１２４. [１９]董楠ꎬ余函纹ꎬ刘梦丽ꎬ等.桔梗ＤＸＳ基因的原核表达㊁亚细胞定位和酶活性分析[Ｊ].药学学报ꎬ２０２３ꎬ５８(４):１０５９－１０６８.[２０]林谷音ꎬ周佩娜ꎬ尹梦娇ꎬ等.荆芥１－脱氧－Ｄ－木酮糖－５－磷酸合成酶基因克隆及生物信息学分析[Ｊ].中草药ꎬ２０２１ꎬ５２(２):５２７－５３７.[２１]毛积鹏ꎬ黄林旺ꎬ郝静ꎬ等.植物ＤＸＳ基因的系统发育和分子进化分析[Ｊ].生物学杂志ꎬ２０２２ꎬ３９(２):２３－２８. 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网络出版时间：２０２４－０４－１２１３：５３：２６　网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｌｉｎｋ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｕｒｌｉｄ／３４．１０６５．Ｒ．２０２４０４１０．１００９．０１０ＭＥＴＴＬ３通过ｍＲＮＡｍ６Ａ甲基化促进类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖、迁移及分泌炎症因子李　娟，蒋扬青，沈瑞明，李国铨，王　敏，徐逢皇２０２４－０３－０１接收基金项目：海南省自然科学基金青年基金项目（编号：８２０ＱＮ４００）作者单位：海南医学院第一附属医院风湿免疫科，海口　５７０１０２作者简介：李　娟，女，博士，副主任医师，责任作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｃｙｈａｎ８７＠１６３．ｃｏｍ摘要　目的　探讨甲基转移酶样３（ＭＥＴＴＬ３）对类风湿关节炎（ＲＡ）滑膜成纤维细胞增殖、迁移及分泌炎症因子的作用及机制。

方法　本研究纳入类风湿关节炎及骨关节炎患者各２５例，留取滑膜组织，分别用ＲＴ ｑＰＣＲ及免疫组化法检测ＭＥＴＴＬ３表达水平，ＥＬＩＳＡ检测ＲＮＡｍ６Ａ浓度；分离培养ＲＡ滑膜成纤维细胞，分为ＮＣ组、ｈｉ ＭＥＴＴＬ３（过表达ＭＥＴ ＴＬ３）组、ｓｉ ＭＥＴＴＬ３（敲低ＭＥＴＴＬ３）组、ＳＴＭ２４５７（ＭＥＴＴＬ３抑制剂）干预组，用ＣＣＫ ８法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞凋亡、ＥＬＩＳＡ检测细胞培养上清液白介素 ６（ＩＬ ６）、白介素 １７Ａ（ＩＬ １７Ａ）、肿瘤坏死因子 κＢ活化受体配体（ＲＡＮＫＬ）、骨保护素（ＯＰＧ）的浓度。

结果　与骨关节炎滑膜组织相比，ＲＡ滑膜组织ＲＮＡｍ６Ａ表达显著增高（Ｐ＜０ ０５），ＭＥＴＴＬ３的表达显著增高（Ｐ＜０ ０５）。

过表达ＭＥＴ ＴＬ３后，滑膜成纤维细胞ｍ６Ａ表达增加，细胞增殖、迁移能力显著提高，凋亡无明显变化，分泌细胞因子ＩＬ ６、ＲＡＮＫＬ显著增加，ＯＰＧ显著减少（Ｐ＜０ ０５）。

干扰ＭＥＴＴＬ３表达后，滑膜成纤维细胞ｍ６Ａ表达减少，细胞增殖、迁移显著减低，分泌细胞因子ＩＬ ６、ＲＡＮＫＬ显著降低，ＯＰＧ显著增高（Ｐ＜０ ０５）；使用ＭＥＴＴＬ３抑制剂ＳＴＭ２４５７干预后，滑膜成纤维细胞增殖、迁移显著减低，分泌细胞因子ＩＬ ６、ＲＡＮＫＬ显著降低，ＯＰＧ显著增高（Ｐ＜０ ０５）；各组表达ＩＬ １７Ａ无显著差异。