课时课题：专题三 3.2体外受精和早期胚胎培养
课型：新授课课时：1课时
梯度训练：
☆必做题
1．超数排卵的做法正确的是（）
A．口服促性腺激素 B．注射促性腺激素
C．口服或注射促性腺激素 D．以上方法均不正确
2．采集的卵母细胞都要在体外经人工培养成熟后，才能与获能的精子受精，以下原因不正确的是（）
A．卵子从输卵管中冲出也要经历类似精子获能的过程
B．动物排出的卵子成熟程度不同
C．体外人工培养至减数第二次分裂中期时，才算成熟
D．冲出的卵子还需要培养一段时间由小变大
3．从活体动物的卵巢中直接采卵时，不正确的方法是（）
A. 超声波探测仪
B. 内窥镜
C. 腹腔镜
D. 阴道镜
4.体外受精的场所是（）
A.在水溶液中
B.在盐溶液中
C. 在获能溶液或专用的受精溶液中
D.在酒精溶液中
5.关于试管动物技术的概念叙述正确的是( )
A. 通过人工操作使卵子和精子在体外条件下成熟和受精，并通过培养发育为早期胚胎后，再经过移植产生后代的技术
B .通过人工操作使卵子和精子在体内成熟，在体外受精，并通过培养发育为早期胚胎后，再经过移植产生后代的技术
C. 通过人工操作使卵子和精子在体外条件下成熟和受精，并将受精卵移植产生后代的技术
D. 通过人工操作使卵子和精子在体内成熟，在体外受精，并将受精卵移植产生后代的技术
6.发展试管动物技术具有重要意义，下列关于这方面叙述错误的（）
A．试管动物技术可解决动物生育率低的问题
B．试管动物技术可以更多、更有效地利用动物卵细胞
C．试管动物技术可以通过普通家畜繁育良种家畜
D．试管动物技术不能实现家畜的快速繁殖
☆选做题
7．下图是“试管牛”工厂化生产的技术流程图，据图回答问题：
(1)根据___________(填标号)判断，此种繁殖方式是____________生殖，此技术的意义在于____________________________________________________________________。
(2)①过程中通常每个卵巢平均可采集____________枚可用的卵母细胞，最终可能产下________头犊牛。
(3)②过程通常采用____________法。
(4)④过程一般要经历哪几个时期：________________________________________。
答案：(1) ③有性快速大量繁殖良种牛，提高经济效益
(2)10 1～2 (3)化学诱导 (4)受精卵、卵裂期、桑椹胚期、囊胚期
板书设计：
3.2 体外受精和早期胚胎培养
一、试管动物技术
二、体外受精
1.卵母细胞的采集和培养
2．精子细胞的采集和获能
3.体外受精过程
三、胚胎的早期培养
1．培养液成分 2.目的 3.胚胎移植的时间
教学反思:
本节教材是在哺乳动物体内受精和胚胎发育的理论基础上，着重简述哺乳动物体外受精和胚胎早期培养的技术方法。主要采用探究式的学习方法，以“试管牛”为例，创设出一种新的学习情景，让学生以胚胎工程学家的身份出现，亲历其境地去思考和探究“体外受精和早期胚胎培养”的过程，领悟其探究的方法，以达到激发兴趣、培养能力、获取知识的目的。教学设计上，课堂活动形式多样，如分组讨论、回答问题和绘制表格等，使得每个学生都能参与到课堂中来，体现了面向全体学生的新课程理念。
胚胎干细胞的体外诱导分化模型马宗源 李祺福(厦门大学生命科学学院福建厦门361005) 胚胎干细胞是具有全能性及无限制的自我更新与分化能力的一类特殊的细胞群体,它能通过祖细胞为中介,分化为各种类型的体细胞,可重演体内干细胞的分化过程。自80年代从小鼠囊胚的内细胞团分离到胚胎干细胞并建系到现在已建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞、造血细胞等体外分化体系。将胚胎干细胞体外分化成为可利用的分化模型,无论从组织结构、细胞及分子水平都体现了体内分化过程的体外重演,再加上胚胎干细胞系具有体系简单,影响因子少,可控制,便于研究等特点,因此可用于研究早期胚胎发育和细胞分化调控;可成为器官移植和修复器官的细胞来源;还可用于新型药物筛选。 1 胚胎干细胞的生物学特性 胚胎干细胞具有与早期胚胎相似的结构特征,具有较高的核质比和整倍体核型。体外培养的细胞紧密堆积,呈克隆状生长,具有发育分化的多潜能性和无限制的自我更新能力,碱性磷酸酶染色呈阳性,具有高的端粒酶活性,早期胚胎细胞均表达胚胎阶段特异性抗原SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、T RA-1-81、T R A-1-60等;表达种系转录因子OCT-4,并且可将O CT-4基因作为细胞多能性的一个标志;白介素6型细胞因子家族参与维持调节胚胎干细胞未分化状态。 胚胎干细胞建系的过程中要解决的问题在于体外不断增殖的过程中保持未分化的状态,但是细胞如何维持其未分化状态的机理并不清楚。研究发现主要是通过膜上的特异受体蛋白gp130来发挥作用,细胞因子受体蛋白g p130可激活JA N U S、酪氨酸激酶,JA K-ST A T、M EK/M A P K等信号途径,而JAK/ST A T3和M EK/ ERK信号途径则处于相对平衡的状态。另外,一些未知的膜结合分子也参与胚胎干细胞的增殖与分化。分离纯化及鉴定调节细胞的自我更新及分化的未知分子已成为研究的热点。 2 胚胎干细胞为基础的分化模型 胚胎干细胞要维持其未分化的状态,需要在胚胎饲养层中加入分化抑制因子。一旦改变了维持胚胎干细胞未分化状态的条件,胚胎干细胞首先形成胚胎小体,胚胎小体有外中内三胚层,继续分化可形成多种类型的细胞。在体外分化培养时,可自发形成有节律性跳动的心肌细胞,同时还形成骨骼肌、神经细胞、上皮细胞等。由于体外胚胎细胞可重演体内胚胎细胞的发育过程,并且基因的表达时相与体内的胚胎发育过程是相似的,在这一过程中加入外源的诱导分化因子并与相关的调控基因结合,可使胚胎干细胞分化为各种类型的细胞。现在已初步建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞和造血细胞等体外分化模型。 2.1 神经细胞 体外培养胚胎干细胞可模拟从未定型细胞向功能性神经元转化的过程,并且其基因的表达时相与体内的胚胎发育过程相似。在分化的早期表达N FL、N F M基因,后期则表达N eur ocan基因。维甲酸及神经生长因子可诱导胚胎干细胞定向分化为神经细胞,是常用的诱导分化物,它能上调神经元特异基因的表达,同时下调中胚层基因的表达。将神经元特异的SOX2基因转进胚胎干细胞,再经维甲酸诱导,可表达90%以上的具有神经元标志的神经细胞。可能是外源基因和维甲酸同时拮抗分化抑制因子的作用,阻碍细胞向其他的方向分化,迫使其向神经元的方向分化。维甲酸能诱导胚胎干细胞分化为C-氨基丁酸能和多巴胺能神经元,而维甲酸分别结合无血清培养基和含胎牛血清的培养基培养胚胎干细胞后发现,采用无血清培养时,几乎检测不到分化的多巴胺能神经元的存在;但在有血清培养时,却能检测到大量的多巴胺神经元。这暗示血清中的某些未知的因子和维甲酸共同起到定向诱导分化 化为特定组织细胞,将这些细胞回输体内,从而达到长期治疗的目的。干细胞的医学应用还包括体外克隆人体器官,然而这比体内移植干细胞要复杂的多。相信随着研究的不断深入,来自人体干细胞的器官应用于临床治疗已为期不远。干细胞研究与应用不仅在疾病治疗方面有着极其诱人的前景,而且将对克隆动物,转基因动物生产,发育生物学,新药物的开发与药效、毒性评估等领域产生极其重要的影响。 参考文献 1 Th omson J A,Itsk ovitz-Eldor J os eph,Shapiro S S,et al. Em bryonic s tem cell lin es d erived from human b las tocysts.S cience,1998,282:1145—1147. 2 Sh amb lott M J,Axelman J,W ang S,et al.Derivation of Plurip otent stem cells from cultured human primordial germ cell.Proc Natl Acad S ci U SA,1998,95:13726—13731. 3 Jack son K A,M i T,Goodell M A.Hematopoietic potential of s tem cells isolated from murie s keletal mus cle.Proc Natl Acad Sci USA,1999,96:14482— 14486. 4 裴雪涛.干细胞研究现状与展望.高技术通讯,2001, (6):93—95. (BH)
胚胎干细胞体外诱导分化综述 摘要：由于胚胎干细胞具有自我更新、高度增值和多向分化的潜能，因此，自20世纪90年代开始，对胚胎干细胞的研究成为生物学领域和医药工程领域研究的一个焦点。本文从胚胎干细胞的分离、体外诱导胚胎干细胞的原理和定向分化的机制、胚胎干细胞体外诱导的方法、定向分化的细胞、应用前景和研究存在的问题对胚胎干细胞进行综述。 关键词：胚胎干细胞；体外培养；诱导分化；应用 干细胞是一种具有多分化潜能和自我更新功能的早期未分化细胞。在特定条件下，它可以 分化成不同的功能细胞，形成多种组织和器官，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。前者指早期胚胎的多能干细胞，后者是存在于胎儿和成体不同的组织内的多潜能干细胞这些细胞具有自我复制能力，并产生不同种类的具有特定表型和功能的成熟细胞的能力，能够维持机体功能的稳定，发挥生理性的细胞更新和修复组织损伤作用[4,9,10]。 胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC)是从着床前胚胎内内细胞团(inner cell mass,ICM)或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞[1]。它能在体外长期不断自我更新,并保持多向分化潜能,可以分化为内、中、外三个胚层的几乎所有类型细胞。自1981年Evans和Kauffman[2,8]用不同的方法首次成功分离得到小鼠胚胎干细胞以来,小鼠胚胎干细胞成为近20年来人们用来研究发育分化、基因表达调控、基因治疗等最理想的模型，并且有大量研究表明小鼠胚胎干细胞可以在体外被诱导分化为绝大多数类型的成体细胞.1998年Thomson等首次成功分离并建立人胚胎干细胞系。自此，人胚胎干细胞不但提供了一个研究人类自身发育分化的良好机会,而且如果人胚胎干细胞能像小鼠胚胎干细胞一样可以在体外诱导形成各种成体细胞,那么利用这些诱导分化形成的成熟细胞将有可能进行细胞和组织替代治疗, 包括糖尿病、帕金森病、早老性痴呆、心血管疾病和肿瘤等多种目前临床上难以治愈的疾病。 1 胚胎干细胞的分离 自Thomson成功分离并建立人胚胎干细胞系后，多年以来，人们研究出很多胚胎干细胞的 分离方法，在这里主要介绍三种： 1.1 分离自胚胎内细胞团 内细胞团又称胚细胞（embryoblast）,是一团于哺乳动物初期胚胎中的一个细胞团块。从早期胚胎内细胞团（inner cell mass,ICM）分离是获得胚胎干细胞的主要途径。由于不同动物的胚胎发育存在差异，因此应注意取材时间。可通过免疫外科手术法、机械剥离法、组织培 养法等方法除去胚胎滋养层细胞获得囊胚内细胞团（ICM）细胞进行体外分化抑制培养。 1.2分离自原始生殖细胞
钙离子载体对牛精子体外受精及胚胎发育的影响 彭礼繁１，罗光彬?，（１．沈阳农业大学动物胚胎工程实验室，辽宁沈阳李东全－，陈自洪ｚ，石德顺ｚ １１０１６ｌ；２．广西大学动物繁殖研究所，广西南宁５３０００５） 摘要：在牛精子获能液中添加不同浓度的钙离子载体，应用体外培养技术对牛精子体外获能及早期胚胎发育作了研究。通过对顶体反应、超激活、活率和早期胚胎发育率的观察，筛选出获能液中最适的钙离子载体浓度，作用时间及其有利于早期胚胎发育的最佳浓度。结果表明：钙离子载体在诱导牛精子获能上存在一个浓度一时间阅值，其最佳浓度和时间组合是Ｏ．１ｕＭ处理２ｍｉｎ或者０．１５ｕＭ处理Ｏ。５ｍｉｎ，此时的囊胚率最高；钙离子载体的添加不能诱导牛精子获能的发生． 关键词：钙离子载体；牛；精子；体外受精；胚胎发育 中图分类号：Ｓ８１４．４文献标识码：Ａ文章编号：１００５—８５６７（２００８）０４一００３５一０４ 目前，学术界对Ｃａｚ＋在精子获能中的作用存在争议。有人认为获能过程中精子细胞内ｃａ２＋浓度不变，但多数学者认为精子细胞内的ｃａｚ‘嶂衣度增加。Ｂａｌｄｉ等【－１证实人精子在获能前２ｈ，细胞内Ｃａ２＋浓度从７０ＩｌＭ增至２５０ｐＭ。Ｃｒｏｓｓ认为Ｃａ２＋在精子获能中的作用是通过刺激腺苷酸环化酶（ＡＣ）的合成来增加环腺苷酸（ｃＡＭＰ）的合成幽，而ｗａｓｃｏ则认为Ｃａｚ＋能通过ｃＡ＾ＩＰ酶来降解ｃＡＭＰ合成［３］。此外Ｂａｋｅｒ等认为细胞内Ｃａ２＋的增加会抑制细胞内ＡＴＰ的利用，从而妨碍ＰＴＰ团。Ｃａｚ＋在精子获能中的分歧，原因可能在于对顶体反应中Ｃａ２＋作用的认识不同，以及研究Ｃａ２＋作用和相关事件的复杂性。自从Ｙａｎａｇｉｍａｃｈｉ等发现Ｃａｚ＋对精子顶体反应起重要作用，同时证明ＩＡ（ＩｎｖｉｔｒｏＡｒｔｉｆｉｃｉｔｉｏｎ）能诱导精子获能促使顶体反应的发生后，Ｃａｚ＋载体在获能中的作用引起了关注网。目前，Ｃａ斗载体在牛（Ｆｕｋｕｄａ等，１９９０；Ｊａｎｕｓｋａｕｓｋａｓ等，２０００）、羊（张嘉保等，１９９０）、猪（Ａｔｓｕｓｈｉ等，２００４）和水牛（Ａｂｄｕｌ等，２００５）的精子体外获能中，均获得成功。但是由于钙离子载体．Ａ２３１８７作用剧烈，处理时间过长或浓度过高，会导致精子死亡。目前，在牛精子获能中钙离子载体的添加量还不是很清楚，为此我们进行了钙离子载体对牛精子体外受精及其早期胚胎发育的影响试验，筛选出获能液中最适的钙离子载体浓度及其有利于牛早期胚胎发育的最佳浓度，从而为牛胚胎体外生产商品化奠定基础。 １材料与方法 １．１材料 １．１．１主要仪器荧光显微镜、生物显微镜附显收稿日期：２００８一０４—２４相系统、Ｃ０。培养箱、倒置显微镜及显微操作系统等来自于沈阳农业大学动物胚胎工程实验室。１．１．２主要试剂ＴＣＭ一１９９、Ｄ—ＰＢＳ、钙离子载体－Ａ２３１８７、Ｂ０（体外获能液）等均购于ｓｉｇｌｎａ公司。１．１．３试验材料采集与保存牛卵巢采自沈阳市于洪区金氏牛羊屠宰场，在牛宰后３０ｍｉｎ内采集卵巢，保存在３５℃左右的装有灭菌生理盐水的保温瓶中，生理盐水中添加Ｏ．２ｍｇ／ｍＬ青霉素和０．２ｍｇ／ｍＬ链霉素，２ｈ内带回实验室。牛冷冻精液购自辽宁省肉牛繁育中心，０．２５ＩｎＬ／管。 １．２方法 １－２．１卵泡卵母细胞的采集和成熟培养按文献［１蛐３介绍的方法进行。 １．２．２成熟卵母细胞的体外受精（肝素受精法）成熟培养后，把卵母细胞先用洗涤液洗３次，再用处理好的精液洗涤１次，移入覆盖于石蜡油下的微滴中进行获能（受精）处理。精液处理方法：细管冻精于３９℃温水中解冻后，检查其活率。活率合格后，置于灭菌离心管中，加入精子洗涤液，混匀后ｌ５００ｒ／ｍ离心５ｍｉｎ，弃上清液（两次）。然后加入获能（受精）液，再ｌ０００ｒ／ｍ离心ｌｍｉｎ，弃去沉淀。最后再加入获能液，１５００ｒ／ｍ离心５ｍｉｎ，弃上清液，用获能液调整精子浓度到１×１０６个／ｍＬ。１．２．３成熟卵母细胞的体外受精（钙离子载体受精法）细管冻精于３９℃温水解冻后，检查其活率，活率合格后，置于灭菌离心管中，加入精子洗涤液，混匀后１５００ｒ／ｍ离心５ｍｉｎ，弃去上清液（两次）。最后再加入获能液，准确计时，计时结束后，马上加入等体积的钙离子载体阻断剂，并充分 万方数据
细胞的原代培养 点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园 一、原代细胞培养原理 原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。 ? 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养 ? 掌握无菌操作技术 ? 了解小鼠解剖操作技术 ? 了解原代细胞培养的一般方法与步骤 ?了解培养细胞的消化分散 ? 了解倒置显微镜的使用 二、实验材料 ? 实验动物：孕鼠或新生小鼠 ? 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清） 0.25%胰蛋白酶 平衡盐溶液 70%乙醇 ?器材：灭菌镊子、剪刀若干把 灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个 吸管若干支 酒精灯 原代细胞培养方法 三、胰酶消化法 （1）胰酶消化法操作步骤——取材 a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。 c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。 d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。 e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。 f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。 （2）胰酶消化法操作步骤——切割 a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。 b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。 c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。 （3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养 a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 c. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 d. 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。 e. 加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 f. 加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。 e. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。 （4）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养
作者姓名：吴侠 论文题目：牛胚胎发育过程组蛋白修饰及克隆胚胎表观遗传重编程的作者简介：吴侠，男，1980年09月出生，2003年07月师从于内蒙古大学旭日干教授，于2008年07月获博士（硕士）学位。 随着十年前第一只体细胞克隆哺乳动物的诞生，近年来，体细胞核移植技术已经在其他物种中得到实现，且体细胞核移植技术已经越过了种属的界限。但就目前的技术水平而言，体细胞克隆胚胎怀孕率低、出生后胎儿异常的问题依然没有解决，这些问题的存在严重制约了体细胞克隆技术的广泛应用。许多研究证实，供体细胞核在受体卵母细胞中的不完全或异常表观遗传重编程是导致克隆胚胎发育异常的重要原因。基因组DNA甲基化、组蛋白的共价修饰是重要的表观遗传修饰，二者具有复杂而广泛的生物学功能。正常生殖细胞发生及胚胎发育过程，染色体要经历广泛的DNA甲基化、去甲基化，核小体核心组蛋白也要通过各种共价修饰调节染色体功能，从而完成遗传信息的传递和调控胚胎的发育。目前，对于克隆胚胎重编程机理的研究还处于初级阶段，虽然证实克隆胚胎存在DNA甲基化的异常，但是组蛋白共价修饰是否也存在异常，还不是很清楚。为了深入探讨克隆胚胎组蛋白修饰的重编程，进而改善克隆效率，阐明胚胎的发育机理，本研究探讨了牛卵母细胞体外成熟、体外受精及胚胎体外发育过程中组蛋白修饰的动态变化，比较了体外受精胚胎与克隆胚胎早期发育过程中组蛋白修饰的差异。使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂对供体细胞及受体卵母细胞进行了处理，检测了药物对供、受体表观遗传修饰，以及克隆胚胎发育的影响，并对处理后供体核在去核卵母细胞中组蛋白修饰的重编程进行了分析。 1. 牛卵母细胞减数分裂、体外受精及胚胎体外发育过程中组蛋白修饰动态变化的研究 本研究探讨了组蛋白H3、H4不同甲基化、乙酰化修饰位点在牛卵母细胞成熟、体外受精及胚胎体外发育不同阶段的动态变化。结果显示，组蛋白H3、H4甲基化，乙酰化具有明显的阶段性变化。牛卵母细胞成熟过程不同组蛋白不同修饰位
榆林市苏州中学 年级 高二 学科生物 学期二 编写人：张瑞 审核人： 审批人： 授课教师： 班级： 小组： 姓名： 日期4.23 课时编号17 体内受精和早期胚胎发育 (二) 【学习目标】 ．1.简述哺乳动物的受精过程。 2．简述哺乳动物的胚胎发育过程及其主要特点。 【学习重点】 1.受精过程。 2.早期胚胎发育过程及主要特点 【学习难点】 早期胚胎发育过程及主要特点 受精作用 1．场所： 。 2．过程： （1）准备阶段： ①准备阶段1 精子 ； 精子必须在 发生相应生理反应后，才获得受精能力。 ②准备阶段2 卵子的准备 在（ ）内达到 期时，卵子才具备与精子受精的能力。 （2）受精阶段 ①精子穿越 和 首先发生 反应，是顶体内的 释放出来，直接溶解卵丘细胞间的物质，穿越放射冠。 穿过放射冠的精子立即与 接触， 随后将透明带溶出一条孔道，精子借自身 穿越透明带。 精子触及卵黄膜的瞬间，会产生阻止后来的精子进入透明带的生理反应，这个反应叫 做 反应，它是防止多精入卵受精的第一道屏障。 ②精子进入 卵黄膜表面有大量的 ，能抱合精子，随后，精子外膜与卵黄膜融合，精子入卵。精子入卵后，卵黄膜会立即产生一种生理反应，拒绝其他精子再进入卵内，这种生理反应称 作 作用，这是防止多精入卵受精的第二道屏障。 ③ 形成 a ．雄原核的形成：精子 脱离，并且原有的 破裂，随后，精子形成一个比 原来精子还 的核，叫做雄原核。 b ．雌原核的形成：精子入卵后，卵子被激活，完成 分裂，排出 后， 形成雌原核，雌原核一般略 于雄原核。 ④配子结合 胚胎发育 一、 探究问题 1. 发生受精的部位在哪？描述受精的各个阶段的特征？ 2,受精卵发育的部位在哪里？受精卵形成早期胚胎经历哪些阶段，每一阶段有什么特点？ 二、 课堂检测
胚胎干细胞体外培养 (一)胚胎干细胞的来源 目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。其中囊胚的ICM最为常用。 (二)胚胎干细胞的分离 1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。以PGCs取ES细胞时：小鼠取1 2.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或1 3.5～1 4.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。 2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。 从囊胚分离ICM的方法主要有三种： (1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。 (2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。Evans和Kaufman采用这种方法第一个建立了小鼠ESCs系。 (3)显微外科学方法：小鼠受精后3～4天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出ICM细胞进行培养。 由于免疫外科学方法需要特殊的试剂去除透明带和滋养层，易对内细胞群造成损伤，而显微外科学方法需要专门的仪器设备，且对人员的技术水平要求较高，均难以推广应用。组织培养法将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落。 (三)胚胎干细胞的培养和建系 ESCs的分离培养和建系是其得以应用的前提。ESCs建系的原理是：将分离获取的ICM 或PGCs与饲养层共同培养，使之增殖而又保持其未分化状态，这样代代相传从而使ESCs
体外受精和早期胚胎培养教学设计 学习目标： 1、简述哺乳动物体外受精技术的主要操作步骤。 2、简述哺乳动物胚胎的早期培养方法。 3、认同体外受精在家畜快速繁殖中的重要意义。 学习重难点： 重点：（1）体外受精在家畜快速繁殖中的重要意义。 （2）哺乳动物体外受精技术的主要操作步骤。 难点：哺乳动物体外受精技术的主要操作步骤。 学习过程： 【知识回顾】 回顾体内受精和早期胚胎发育的知识内容，思考哺乳动物体内胚胎的形成需要经过哪些过程？ 那么，哺乳动物体外胚胎的发育需要完成哪些环节？ 胚胎工程专家就是根据这几个环节来研究哺乳动物体外受精和早期胚胎培养方法的。 【自主探究】 一. 什么是试管动物技术？ 此技术是克隆吗？ 试管动物技术可以实现良种动物的快速大量繁殖。这项技术中首先要做的是体外受精和早期胚胎的培养。 二.体外受精 哺乳动物体外受精主要包括____________、_____________、______等几个主要步骤。 体外受精技术的理论基础是胚胎发育学，基本原理是人工模拟体内环境，包括营养、温度、pH等，使初级卵母细胞成熟，同时使精子获能，最终完成受精。 1.体外受精技术操作的对象是（） A．生殖细胞 B．受精卵 C．早期胚胎细胞 D. A,B,C都是 1.卵母细胞的采集和培养 （1）采集方法一：用处理，使其超数排卵，从中冲取卵子（针 对实验动物如__________、____________，以及家畜猪、羊等） 方法二：从屠宰母畜卵巢中采集，或借助________、内窥镜或等工具，直接从活体动物的中吸取______________（针对大家畜或大型动物，如牛） (2)卵母细胞的培养： 用方法一得到的卵子______与____________的精子在体外受精，用方法二采集的卵母细胞在体外人工培养成熟 例2．体外受精常用的采卵方法有 ①用促性腺素处理后，从输卵管冲取卵子②化学诱导法③电刺激法④从活体动物卵巢吸取卵母细胞 A．①② B．②③ C．①④ D．③④ 2. 精子的采集： 方法有、手握法和电刺激法等 3.精子的 ____ ： 方法有培养法（通过获能培养液）、法（通过肝素或钙离子载体A23187溶液等化学药物诱导精子获能,针对_______________等家畜的精子）
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤 一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态 培养基 细胞复苏 冻存细胞 明胶包被 细胞传代 体外分化 培养基 包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片） 体外分化方法 注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol 和培养基。 一般培养--维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed 细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。 培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml 该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。 贮存液 DMEM(高糖) 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST LIF
胚胎干细胞自我更新的信号转导途径和 体外培养系统的研究进展 朱江 汪燕 刁永书 【摘 要】 目的 综述近年来有关胚胎干细胞(em b ryon ic stem cell,ESC)自我更新相关的信号转导途径及体外培养系统的研究进展。 方法 广泛查阅近年有关ESC自我更新相关的信号转导途径及体外培养研究的文献,并进行综述。 结果 阐明有关ESC体外自我更新和多向分化潜能的分子机制,有助于改善ESC体外培养系统条件,是ESC成功应用于临床的基础。 结论 有关ESC实现自我更新及多向分化潜能的分子信号尚需更多研究,ESC培养体系有待于进一步完善和发展。 【关键词】 胚胎干细胞 自我更新 信号转导 培养系统 中图分类号:R318.04 R321.1 文献标识码:A SEL F-RENE W AL SIGNAL ING PATH W AY AND CUL TURE S Y STE M IN V ITR O OF E M BR YON I C STE M CELL S ZH U J iang,W A N G Y an,D IA O Y ong shu.Cancer Cen ter of W est Ch ina H osp ita l,Cen ter of R ep rod uctive M ed icine, W est Ch ina S econd U n iversity H osp ita l,S ichuan U n iversity,Cheng d u S ichuan,610041,P.R.Ch ina.E2m a il:z huj iang1 @m edm a il.co https://www.doczj.com/doc/f119043387.html, Corresp ond ing au thor:ZH U J iang,E2m a il:z huj iang1@m edm a il.co https://www.doczj.com/doc/f119043387.html, 【Abstract】 Objective To review the latest developm en t of the research on the self2renw al signaling pathw ay and cu ltu re system in v itro of the em b ryon ic stem cells(ESC s). M ethods T he recen t articles abou t the self2renew al signaling pathw ay and cu ltu re system in v itro of the ESC s w ere ex ten sively review ed. Results U nderstanding of the mo lecu lar m echan is m of the self2renew al in v itro and p lu ri po tency of the ESC s w as con sidered i m po rtan t fo r develop ing i m p roved m ethods of deriving,cu ltu ring and differen tiating these cells in to the cells that cou ld be successfu lly u sed in the clin ical p ractice. Conclusion A fu rther research is needed to elucidate the self2renew al signaling pathw ay and the p lu ri po tency of the ESC s and the cu ltu re system in v itro fo r the hum an ESC s rem ain s to be fu rther i m p roved and developed. 【Key words】 Em b ryon ic stem cells Self2renew al Signaling pathw ay Cu ltu re system 胚胎干细胞(em b ryon ic stem cell,ESC)主要来自囊胚内细胞团或从胎儿生殖嵴分离得到的原生殖细胞以及体细胞核,转移至去核卵母细胞后培育出来,具有两个最显著的特征:自我更新和多向分化潜能。ESC 不但成为研究早期胚胎发生、细胞组织分化、基因表达调控等发育生物学事件的一个理想模型,更重要的是人ESC(hum an ESC,hESC)可为临床上细胞移植、组织替代和器官克隆提供新的细胞来源,为多种难治性疾病的治疗带来希望。目前,从胚胎或成人组织(器官)分离培养功能细胞在技术上已经十分成熟,制约临床应用的主要因素——体外大规模扩增技术在成体干细胞也部分得到解决[1],已有不少临床应用的报道,如自体骨髓间充质干细胞促进缺血肢体重建血循环在临床上有获得成功的报道[2,3]。由于ESC具有分 作者单位:四川大学华西医院肿瘤中心(成都,610041) 通讯作者:朱江,主治医师,研究方向:肿瘤干细胞,E2m ail: zhujiang1@m edm https://www.doczj.com/doc/f119043387.html, 化全能性,较成体干细胞具有更广阔的临床应用前景,保持ESC体外无限增殖不分化状态是其临床应用的前提条件。研究表明,ESC的自我更新同时受到细胞生长环境和内源性调节因子的控制。近年来ESC自我更新机制和定向分化条件的研究是干细胞研究的热点,也是ESC得以临床广泛应用的前提。现就ESC自我更新相关的信号转导途径及体外培养系统作一综述。 1 ESC自我更新相关的信号转导途径 很多研究表明,多条信号转导通路和多种转录调节因子均参与ESC体内外自我更新及不分化状态的维持,阐述如下。 1.1 白血病抑制因子(leukem ia inh ib ito r facto r, L IF)2L IF受体(L IF recep to r,L IFR)2细胞因子亚单位(glycop ro tein130,gp130)2蛋白酪氨酸激酶(janu s k inase,JA K)2信号传导子及转录激活子3(signal tran sducer and activato r of tran scri p ti on3,STA T3)途径
胚胎干细胞的培养及其影响因素 前言 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）是一种高度未分化的、具有发育多潜能性的细胞，可在体外培养扩增、遗传操作，在适当条件下可诱导分化为多种组织细胞，还可与受体胚胎发生嵌合，形成嵌合体，为细胞分化、胚胎发育、肿瘤发生、药物鉴定等方面的深入研究提供了理想的细胞模型，为组织工程、细胞移植、基因治疗等开创了取之不尽、用之不竭的细胞资源。 1981年Evans 和Kaufman 将延迟着床的小鼠囊胚接种在经丝裂霉素C处理的STO（一种已建系的鼠胚成纤维细胞）上，获得了增殖而未分化的内细胞（inner cell mass,ICM ），后经传代克隆，第一个建立了小鼠ES细胞系［1］。 由于小鼠的胚胎干细胞较易发生分化，昆明种属更是如此，成功分离和克隆胚胎干细胞的关键是一方面要促进其分裂增殖，一方面要最大限度抑制其分化。体外生长的细胞直接生长在培养液中，培养液是细胞分离培养中重要的因素[9]。胚胎干细胞对体外培养环境的要求更为严格，其很小的变化都会影响胚胎干细胞的增殖和分化。本课题研究了三种不同培养液对小鼠胚胎干细胞生长的影响，为今后胚胎干细胞建系工作提供一定参考依据。 研究内容与方法 1. 材料 1.1 实验动物 昆明白小鼠。 1.2 主要试剂：PMSG;HCG;DMEM培养液；、无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液；杜氏磷酸盐缓冲液（PBS液）；0.25% 胰酶-ETDA混合液；丝裂酶素C（Mitomycine,Sigma）；胎牛血清（FCS，浙江生物制品厂）；新生牛血清（NBS，天津生物制品厂）；白血病抑制因 子；干细胞生长因子；牛胰岛素。[2] 2 小鼠胎儿成纤维细胞的原代培养[3][4][5] 2.1 胚胎的获取 昆明雌性小鼠选择阴道口粘膜色淡红、略湿润的性成熟母鼠，孕马血清（PMSG）16：00腹腔注射10U，48小时后腹腔注射HCG10U，即与雄鼠按1：1合笼交配。次日10：00观察母鼠阴道栓有无，阴道口见阴栓（乳白色或淡黄色蜡状物）即记为妊娠0.5 d，并做标记，同时雌雄分笼喂养。选妊娠11.5-16.5D母鼠进行胎儿成纤维细胞饲养层的制备；将妊娠3.5天孕鼠断颈处死，取出子宫，用含5%NBS的PBS液从子宫角冲出胚胎[6]。 2.2 组织原代培养 2.2.1 改良组织块法[7] (1）在离心管剪碎组织中，加0. 25%胰蛋白酶-0. 02%EDTA，按1 mL/6胎鼠加入，轻柔吹打30S。 （2）用2倍以上成纤维细胞培养液终止，室温静置5 min，弃上清液，尽量减少组织中消化酶的剩余量。 （3）再加MEF培养液（2.5 mL/胎），吹打混匀组织块。 （4）培养瓶提前用MEF培养液湿润整个瓶底，弃多余汇集的培养液。 （5）将含有组织块的悬液均匀滴入瓶底，组织悬液随即均匀平铺于培养瓶底，不会出现组织块悬浮于培养液滴中现象。 （6）后置于37 ℃、5%CO2、100%RH培养箱中培养； （7）6小时后，将瓶底轻轻翻转平置，避免组织块脱落随培养液流动，后向组织块贴壁的
3.2体外受精和早期胚胎发育 【预习目标】 1、说出哺乳动物体外受精技术的主要操作步骤 2、说出哺乳动物胚胎的早期培养方法。 【自主学习】 1．基本步骤 2．卵母细胞的采集和培养 方法：用______________处理，再从_______中冲取卵子。 处理：可直接与______________在体外受精。 方法： 处理：在体外______________后，才能与获能的精子受精。 3．精子的采集和获能 (1)收集精子的方法： (2)精子体外获能的方法： 4．体外受精 获能的精子和培养成熟的卵子，一般都可在___________或专用的___________中完成受精过程。 二、胚胎的早期培养 1．哺乳动物胚胎的培养液成分 2．胚胎早期培养的目的 (1)精子和卵细胞在体外受精后，应将受精卵移入发育培养液中继续培养，以检查______________________和______________________。 (2)当胚胎发育到适宜的阶段时，进行___________或___________。 3．胚胎移植的时间 (1)牛、羊一般在___________或___________进行移植。 (2)人的体外受精胚胎，即试管胚胎，可在_________________移植。 （1）实验动物（小 鼠、兔、羊等） （2）大型动物（牛等）
【提出疑惑】 同学们，通过你的自主学习，你还有哪些疑惑，请把它写在下面。 3.2体外受精和早期胚胎发育 【学习目标】 1、用的自己的语言说出体外受精在家畜快速繁殖中的重要意义。 2、能自己说出哺乳动物体外受精技术的主要操作步骤。 【合作探究】 1．说出试管动物的培育过程。 【训练】据哺乳动物体外受精的过程回答以下问题： (1)体外受精的过程主要包括__________________、____________________及受精等几个步骤。 (2)精子采集的方法主要有__________________、_______________和________________。获能的方法有__________________和__________________。 (3)请用一个流程图表示体外受精过程。 3.2体外受精和早期胚胎发育 【课后作业】 1．体外受精技术和克隆动物的生殖方式是() A．前者属于有性生殖，后者属于无性生殖 B．二者都属于有性生殖 C．二者都属于无性生殖 D．前者属于无性生殖，后者属于有性生殖
课时训练9体内受精和早期胚胎发育 1.以下有关人类卵子发生的说法正确的是()。 A.哺乳动物卵泡的形成是在初情期 B.排卵是指排出成熟的卵泡 C.排卵实质上排出的是初级卵母细胞 D.排卵实质上排出的是次级卵母细胞 2.下列能正确表示高等动物胚胎发育顺序的是()。 A.受精卵→卵裂→囊胚→原肠胚→组织器官的分化 B.卵→卵裂→原肠胚→组织器官的分化 C.受精卵→囊胚→原肠胚→幼体 D.受精卵→卵裂→桑椹胚→囊胚→原肠胚→组织器官的分化 3.下图表示蛙的受精卵发育至囊胚过程中,DNA总量、每个细胞体积、所有细胞体积之和、有机物总量的变化趋势(横坐标为发育时间)。其中正确的是()。 A.①② B.①③ C.②④ D.③④ 4.次级卵母细胞的分裂完成于()。 A.排卵前,在卵巢内 B.受精前,在输卵管内 C.排卵后,在腹腔内 D.受精过程中,在输卵管内 5.精子变形时,线粒体集中在尾的基部的意义是()。 A.释放顶体酶发生透明带反应 B.产生能量促进精子运动 C.有利于质基因进入受精卵 D.受细胞核的挤压形成 6.判断卵子是否受精的重要标志是()。 A.在卵细胞膜和透明带的间隙可以观察到两个极体 B.精子穿越放射冠和透明带 C.精子进入卵细胞膜 D.雄原核和雌原核的形成 7.下列最能表现细胞全能性的细胞是()。 A.桑椹胚期细胞 B.囊胚期细胞 C.外胚层细胞 D.滋养层细胞
8.下列有关哺乳动物精子和卵子的发生以及受精作用的叙述中,正确的是()。 A.采集到的精子和卵子相遇即可发生受精作用 B.排卵就是排出成熟卵子的过程 C.卵子形成时的分裂过程均在卵巢内完成 D.受精作用完成的标志是在卵细胞膜和透明带之间观察到两个极体 9.下列关于受精过程的叙述,错误的是()。 A.获能后的精子与卵子相遇后,释放顶体酶进入放射冠 B.透明带反应是防止多精入卵的第一道屏障 C.精子与卵细胞膜相互融合,精子入卵 D.雄原核形成的同时,卵子完成减数第二次分裂 10.下列关于高等哺乳动物受精与胚胎发育的叙述,正确的是()。 A.绝大多数精卵细胞的识别具有物种特异性 B.卵裂球细胞的体积随分裂次数增加而不断增大 C.囊胚的滋养层细胞具有发育全能性 D.原肠胚发育分化形成内外两个胚层 11.下列关于哺乳动物早期胚胎发育的说法正确的是()。 A.卵裂期细胞经过了细胞分裂,不再分化 B.原肠胚细胞属于全能细胞 C.囊胚腔先于原肠腔出现 D.桑椹胚开始进行孵化 1．下列不属于胚胎工程技术的是（）A．体外受精 B．胚胎分割、胚胎移植 C．胚胎干细胞培养 D．转基因鲤鱼的培育 2．卵子的成熟部位和受精部位正确的是（）A．卵巢卵巢 B．卵巢输卵管 C．输卵管输卵管 D．输卵管子宫 3．精子与卵子结合过程中穿越的两道屏障是（） ①顶体反应②透明带反应③卵细胞膜反应④精子穿越放射冠 A．①② B．②③ C．③④ D．②④ 4．以下说法不正确的是（）A．雄性动物从初情期开始产生精子 B．1个精原细胞可形成4个精子 C．对多数家畜来说，精子在睾丸内形成时间为两个月左右 D．动物体型大的产生的精子多且大 5．关于精子的描述，哪一项是错误的？（）A．由精子细胞变态形成 B．精子一旦形成，便具有了运动能力 C．精子头侧面观呈梨形 D．精子是处于最后发育阶段的生精细胞 6．桑椹胚是指（）A．含有一个充满液体的腔 B．总体积大于受精卵