绿色荧光蛋白(ＧFP）基因的克隆、表达和粗提取
南方医科大学
2０11预防医学（卫生检验检疫)
摘要
目的：研究绿色荧光蛋白(greｅn ｆluoresceｎt proteiｎ,GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。方法：从Ｅ.cｏli DＨ5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒ｐＥGFＰ-Ｎ3和质粒ｐET－2８a。然后用质粒ＤＮA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。再用限制性内切酶BａmHＩ和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳,用以确定已经提取了GFP基因。将含有ＧFＰ基因的质粒转化到感受态细胞E．coli BL-21中,用LB培养基对转化后的E.coｌｉ进行扩大培养。用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术,为进一步的实验奠定基础。
关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取
目录
1 前言 ................................................... 错误!未定义书签。
2 实验目的............................................... 错误!未定义书签。
3 实验设备?错误!未定义书签。
4 材料及试剂?错误!未定义书签。
5 实验操作步骤?错误!未定义书签。
5.１操作流程?错误!未定义书签。
5．2质粒DNA的分离与纯化 ........................................................................................... 错误!未定义书签。
5.2.1 质粒的培养 ............................................................................................................. 错误!未定义书签。
5.２.2 质粒的DNA的碱提取法?错误!未定义书签。
5.2.3 质粒ＤNA的鉴定与纯化?错误!未定义书签。
５.3酶切及连接?错误!未定义书签。
5.3.1 双酶切?错误!未定义书签。
５．3.2 回收酶切产物(采用DNA回收试剂盒进行回收) ............................................ 错误!未定义书签。
5.3.３连接?错误!未定义书签。
５.４大肠杆菌感受态细胞的制备及转化........................................................................... 错误!未定义书签。
５.4．1 LB（Luria－Bertａin)液体和固体培养基的配制（参考附录)?错误!未定义书签。
５.４．2.感受态细胞的制备（CaCｌ2法)?错误!未定义书签。
５．4.3 转化涂板 ............................................................................................................ 错误!未定义书签。
５．5GFP蛋白的诱导表达................................................................................................. 错误!未定义书签。
5.６绿色荧光蛋白的粗提取 ............................................................................................... 错误!未定义书签。参考文献.............................................. 错误!未定义书签。
附录?错误!未定义书签。
１ＬＢ培养基的配制：?错误!未定义书签。
2.溶液Ⅰ?错误!未定义书签。
3.溶液Ⅱ?错误!未定义书签。
4.溶液Ⅲ（100ML) ............................................................................................................... 错误!未定义书签。5．DN ASＥ－ＦＲＥＥRＮASＥＡ?错误!未定义书签。
6.TE缓冲液（ＰH8．0）?错误!未定义书签。
7．2０×ＴBE ....................................................................................................................... 错误!未定义书签。
8.ＧＥNE F INＤER-溴酚蓝上样缓冲液?错误!未定义书签。
9．PＥGFP-Ｎ3质粒全图谱?错误!未定义书签。
10.ＰET－２8A质粒全图谱 ................................................................................................. 错误!未定义书签。
1前言
绿色荧光蛋白（green ｆlｕorｅscentｐｒoｔeｉｎ，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。1962 年，下村
修等分离纯化了水母中发光蛋白水母素，并发现一种绿色的荧光蛋白。1974 年,他们分离得到了这个蛋白，当时称绿色蛋白,以后称绿色荧光蛋白（GFP）[1］
ＧFP 作为一种新的报告基因,其优点在于①荧光强度高，稳定性高;②GFP 分子量小，易于融合,适用于多种转化方式，对受体无毒害,安全可靠；③不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光,尤其适用于体内的即时检测;④GFP 不具有种属依赖性,在多种原核和真核生物细胞中都表达;⑤通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域［ 2～3]。采用GFP 作为标记基因,可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记,为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段[ ４、５ ]。采用基因工程手段生产GFP标记的方法,可建立一种简便、快速的免疫诊断技术[６］。
质粒转化进入大肠杆菌(Escherｉｃｈia coli)感受态细胞是分子克隆的关键步骤[7］,是基因克隆以及DNA文库构建等研究中一项重要的常规操作。目前,感受态细胞的制备主法,该方法操作简单、容易掌握、重复性好、转化率高,可广泛应用于一要采用ＣａＣl
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般的实验室。其原理是Ca２+ 破坏细胞膜上的脂质阵列,并与膜上多聚羟基丁酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物以利于外源ＤNA的渗入[８]。
大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点[9]。而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统,表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的３0%,因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统[１0]。大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统,大肠杆菌由于遗传背景清楚、易操作,以及有大量可供选择的克隆或表达载体,使之成为人们克隆表达外源基因的主要菌株[1１］。
随着科研的进展，构建出了多种具有不同特点的表达载体和工程菌株,以满足表达不同性质、要求的目的基因的需要。在原核细胞中表达蛋白质的载体常用启动子有T7启动子、Trｐ启动子－色氨酸启动子、Tａc启动子、Ｔ7噬菌体中基因10 的启动子及Lac 启动子等。Lac启动子受分解代谢系统活化蛋白和cＡMP的正调控和阻遏物的负调控,当
加入乳糖或某些类似物IPTG可与阻遏蛋白形成复合物，使阻遏蛋白构型改变,阻遏蛋白不再能与操纵基因结合,从而使结构基因表达。根据原核生物基因表达特点选择载体进行目的基因克隆，然后转入相应的菌种中表达目的蛋白质[12]。
研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a－GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内,通过酶切及用ＩＰＴG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。
2 实验目的
学会绿色荧光蛋白基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达整个过程中的每一步,掌握其方法。本实验是通过基因工程手段对目的基因ＥGＦP进行克隆，并进行EGFP表达载体的构建,并在大肠杆菌中诱导表达，获得ＧＦP蛋白。
①学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法
②学会常用的DNA琼脂糖凝胶电泳技术
③学会用限制性内切酶切割ＤNA
④学会用琼脂糖凝胶中回收DNA片段
⑤学会ＤＮＡ片段的体外连接技术
法制备大肠杆菌感受态细胞
⑥学会用CaCl
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⑦学会用质粒DNA转化感受态受体菌的基本操作技术
⑧学会用酶切法筛选重组质粒转化成功的克隆菌
⑨了解外源基因在原核细胞中表达的特点和IPTG诱导表达的方法
⑩学习SDS-PAGＥ胶的基本灌制方法和用SDS-PAGE检测表达蛋白
3 实验设备
恒温培养箱,超净台，恒温摇床，制冰机,台式离心机，核酸电泳仪，小型混合器,冰箱，蓝盾可见光透射仪，移液器、电泳槽、振荡器、制冰机、凝胶成像仪,水浴锅，高压灭菌锅、振荡培养箱，手持式紫外灯。
4 材料及试剂
B ａｍＨ I ；Not Ｉ(10Ｕ/μL)；T4 l ｉgase;L Ｂ培养基;溶液Ⅰ；溶液Ⅱ;溶液Ⅲ;TE 缓冲液；20×T ＢE;G ｅn ｅFinder-溴酚蓝上样缓冲液。
５ 实验操作步骤
5．1 操作流程
质粒
提取
质粒 提取
酶切 回收
酶切 回收
转化
导
诱
5.2 质粒DNA的分离与纯化
5.2.1 质粒的培养
1)在含有pEGFP－Ｎ3质粒的DＨ5α平板上菌落上挑取菌种，置于含有5ｍL LＢ培养基的试管中。摇晃过夜。
2）有pＥT-28a质粒的平板上挑取单菌落于另外一个试管中,同样摇荡培养过夜。
５.2.２质粒的DNA的碱提取法
1)取1．5ｍl ＤH5α培养液倒入１．５mL eｐpendorf 管（微量离心管）中, 13000rpm 离心1ｍin。
2）重复１。
3)弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。
４)菌体沉淀重悬浮于１０0μL溶液Ⅰ中(需剧烈振荡)，室温下放置1０ｍin。
5)加入新配制的溶液Ⅱ20０μl, 盖紧管口,快速温和颠倒eｐpeｎdorf 管5次，以混匀内容物（千万不要振荡),冰浴５ｍin。
6)加入150μL预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管,温和振荡3次，使沉淀混匀，冰浴中15分钟，1３00０rｐm离心5mｉn。
７)上清液移入干净eppendoｒｆ管中,加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1),振荡混匀, 13000rpm离心２miｎ。
8)将水相移入干净eppｅndorｆ管中,加入等体积的氯仿／异戊醇(２４：１）振荡混匀, １３000ｒpｍ离心２mｉn。
9）将水相移入干净ｅppｅndorf 管中,加入2 倍体积的无水乙醇,振荡混匀后,置于室温下2min,然后１３00０rpｍ离心5ｍin。
1０）弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1mＬ 70％乙醇洗沉淀一次, 振荡混匀后,13000rpｍ离心5mｉn。
11）吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽,室温干燥。
12)将沉淀溶于３0μＬ TE缓冲液(pH8．0,含20μg／ｍL RNaseA)中,保存在－20℃冰箱中。
１3）按照同样的流程和方法将pＥT－2８ａ的质粒也提出来,保存在-2０℃冰箱中。5．２．3 质粒DNA的鉴定与纯化
1)１％琼脂糖凝胶的配制
①加20ml １×ＴBE缓冲液于三角瓶中,
②精确称取0.2ｇ琼脂糖加到三角瓶中，于微波炉中加热至完全熔化,
③冷却至60℃左右,
2)琼脂糖凝胶电泳
①轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中,静置冷却30分钟以上,
②将胶板除去封胶带，放入电泳缓冲液(ＴBE)中，使电泳缓冲液刚好没过凝胶约1mm,轻轻拔除梳子,
③取5μl质粒DNA及2μl ＧenｅFiｎdｅr混匀上样
④50-100v约电泳0．5-１小时
⑤蓝盾可见光透射仪观察结果。
3)回收产物
①用干净的刀片将需要的DNＡ条带从凝胶上切下来，称取重量。
②以0．１ｇ凝胶对应300μL的体积加入PN。
③50℃水浴放置1０miｎ，期间不断温和上下翻动离心管至胶完全融解。
④将上一步得到的溶液加入到一个吸附柱中，吸附柱再放入收集管,13000rpm离心60ｓ,弃掉废液。
⑤加入800μL漂洗液PW，130０0rpｍ离心60s,弃掉废液。
⑥加入5０0μＬ漂洗液PW，１3000rｐm离心6０s，弃掉废液。
⑦将离心吸附柱放回收集管，1３000rpm离心2miｎ。
⑧取出吸附柱,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间位置加入适量洗脱缓冲液Ｅ
B 30μL,洗脱缓冲液先在65℃水浴预热,室温放置２ｍｉn,13０00rｐｍ离心1min，然后将离心的溶液重新加回离心吸附柱中，１300０rpm离心1ｍin。
⑨置于－2０℃保存。
5.3 酶切及连接
5.3.１双酶切
按如下双酶切体系(30μL)混合:
表１双酶切体系的配制
反应物(μL) pEGＦP-N3 pET-28a
质粒1８１8
ＢamH Ｉ 2 2
Not I 2 2
10×buｆｆer K 3 3
０．1%BSＡ缓冲液 3 ３
灭菌双蒸水至 30uｌ体系
1)离心１0s，混匀。
2)37℃水浴酶切3－４h。
3)配制1.0%(M／Ｖ)普通琼脂糖凝胶30mｌ。
4)适当放置冷却,45℃左右倒于电泳胶板上，插好梳子。
5)待凝胶凝固好以后，拨下梳子。
6)酶切样品中加入5μl溴酚蓝-GeｎeFｉnｄｅr混合液混匀，上样。
7)１×TＢE Buｆfer,8０V(3-4V/cm)下电泳３０mｉｎ。
8)荧光激发器观察质粒ＤＮA条带的酶切情况，并照像。
5.3.2回收酶切产物（采用ＤＮＡ回收试剂盒进行回收)
1)配3０mＬ 1%进口琼脂糖凝胶,尽量长一些（用粗梳子），对酶切产物进行电泳分离；
2)将酶切产物全部加入加样孔中
3)跑胶，观察结果，并且拍照。
4)用干净的刀片将需要的DNA条带从凝胶上切下来，称取重量。
5)以0．１g凝胶对应３00μL的体积加入PN。
6)50℃水浴放置１0miｎ,期间不断温和上下翻动离心管至胶完全融解。
7)将上一步得到的溶液加入到一个吸附柱中,吸附柱再放入收集管，13000ｒpｍ离心６
０s,弃掉废液。
8)加入800μL漂洗液ＰW，130０0rpｍ离心60ｓ，弃掉废液。
9)加入５０0μL漂洗液PＷ,13000ｒpｍ离心60s，弃掉废液。
10)将离心吸附柱放回收集管,13000rpm离心２ｍｉn。
11)取出吸附柱,放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间位置加入适量洗脱缓冲液E
Ｂ 3０μＬ,洗脱缓冲液先在65℃水浴预热,室温放置2ｍin,1３000rｐm离心1min，然后将离心的溶液重新加回离心吸附柱中，13000ｒpｍ离心1mｉn。
12)置于-20℃保存。
5.3.3 连接
按照连接体系进行，16℃连接过夜。
表2 连接体系
反应物体积/μL
5
回收纯化的pＥT－２8ａ
质粒
gｆp基因片段１2
Ｔ4连接酶 1
缓冲液(１0×) ２
5.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
５.4．1 LB(Luria-Ｂeｒtａin）液体和固体培养基的配制(参考附录)
氨苄青霉素和卡那霉素等抗生素不抗热,如果培养基温度过高,容易导致抗生素失效，
应使培养基降温至60℃左右后，再加入抗生素。但也不应使培养基的温度过低，否则容易出现气泡。７５ｍ
m 直径的培养皿约需15ml 培养基。
5．４.２．感受态细胞的制备 (CaC ｌ2法)
1) 挑一大肠杆菌单菌落放入3ｍl LB 液体培养基（含K ａn +）,37℃培养过夜。
2) 活化大肠杆菌：取3m ｌ新鲜的ＬB 液体培养基加入５0-15０μl 的过夜菌,培养2-3
个小时。
3) 将昨夜摇出来的ＤＨ５α或BL21培养液转入离心管中,冰上放置１0min,然后于4℃
下4０００rpm 离心5ｍin 。
4) 弃去上清,用预冷的0.1ｍｏl/L 的ＣaCl 2溶液600μL 轻轻悬浮细胞,冰上放置20m
ｉn, ４℃下4000rpm 离心５m ｉn 。
5) 弃去上清,加入300μＬ预冷的0.1ｍｏl/L 的CaCl ２ 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置
5min,即成感受态细胞悬液，可-8０℃长期保存。
5.4.3 转化涂板
1) 取２个无菌离心管，分别加入100μL BL21感受态细胞悬液，第1管加5μl 无菌水，
第2管加入质粒D ＮＡ溶液５μl,轻轻摇匀,冰上放置30min 。
2) 42℃水浴中热激90s ，热激后迅速置于冰上冷却5min 。
3) 分别向管中加入10０μL LB 液体培养基,混匀后在３7℃振荡培养30min 。
4) 从管1中取50μL 涂布于含抗生素和不含抗生素的平板上,从管2中取50μL 和10０
μＬ涂布于含抗生素的平板上。正面向上放置约１0分钟,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,３7℃培养20小时。