慢病毒实验操作步骤
一、Waymouth 培养液配置（含血清和不含血清的培养液均已配好）
Waymouth MB 752/1 培养基1.4g、0.00253g 丙酮酸钠、0.3g 胎牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、加dddH2O定容至80ml，用7.6%NaHCO3滴定调至PH 7.0-7.2 。加双抗：青霉素100IU/ml、链霉素100IU/ml，用补至100ml，无菌过滤后分装4oC 保存备用，即为不含FBS的培养液。将上述液体加入10ml 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)，即10%FBS Waymouth培养液，4oC 保存备用。
二、Polybrene稀释分装：（-20℃保存）感染添加剂，显著提高感染效率。储存液浓度为10mg/ml，共20μl；使用浓度为5-10μg/ml。用D-hanks、PBS或培养基进行稀释100倍（即100μg/ml，10×工作液）：
20μl Polybrene储存液加入1980μl PBS稀释至总体积2ml ，分装10管，-20℃保存，每管200μl，100μg/ml。使用时在每孔600μl培养液里约加入60μl分装的10×Polybrene工作液即可。
三、在无菌条件下，取3日龄KM小鼠卵巢组织。
四、1)取标本后在24 孔板中按以前的培养方法进行卵巢组织培养；
2)36h后，将卵巢组织转移到600μl 无血清培养液的培养孔中；
3）取1μl 23692（滴度为8×108TU/ml）的重组腺病毒浓缩液及60μl 10×Polybrene 工作液加入每个培养孔中混合，轻轻晃动混匀（阴性对照组加入1μl 阴性对照病毒）；
盖上培养板盖子，用70%乙醇擦洗培养板外侧及超净工作台，放入孵育箱中37℃孵育。
（注意此过程不要有病毒液体溅出及沾染）
沾染过病毒液体的枪头用保鲜膜包好，装入垃圾袋中，包埋处理?
4）培养24h后，把培养板中的卵巢转至含血清的新鲜培养液的培养孔中继续培养，使总培养天数为8天。
废弃培养液培养板用保鲜膜包好，装入垃圾袋中，包埋处理?
5）培养至8天后荧光显微镜下观察病毒感染情况（勿打开培养板盖），收集卵巢标本，攒足一定的量做Realtime PCR检测干扰效应。
实验材料准备：枪，枪盒，枪头（提前灭菌好），取卵巢的器械（提前灭菌好），小培养皿，24孔培养板，明胶海绵，封口膜，1.5ml离心管、离心管盒、离心管架；70%乙醇和84消毒液（提前以1：20比率稀释后分别用喷壶盛装），1%SDS（提前配好）；防护工作衣、24层医用口罩，一次性手术衣、手套、帽子，保鲜膜，垃圾袋。
《《影响溶解快慢的因素》实验报告》 实验名称：影响溶解快慢的因素。 实验目标： 1.知道可溶解的固体物质在水中溶解的快慢与物体的颗粒大小（面积的大 小）、水的温度、水是否被搅动等因素有关。 2.亲历控制单个变量进行对比实验的活动过程。 3.体验探究影响溶解快慢因素的乐趣，感悟科学就在身边，要做爱科学的有心人。 实验材料：2个透明玻璃杯①号和②号、1根筷子、1个水槽（内盛冷水）、热水1壶、食盐、方糖、溶解快与慢实验记录表。 实验内容： 1．溶解的快慢可能跟物体的颗粒大小（面积的大小）有关。 2．溶解的快慢可能跟水的温度有关。 3．溶解的快慢可能跟水是否被搅拌有关。 4．综合运用第三种方法的效果是否会更好。 提出问题：物体溶解的快慢与哪些因素有关呢？ 实验步骤： 实验一：溶解的快慢可能跟物体的颗粒大小（面积的大小）有关。 1.实验猜测 ①物体的颗粒大（面积的大小），溶解慢；物体的颗粒小，溶解快。 ②溶解的快慢跟物体的颗粒大小（面积的大小）无关。 2.实验方法与设计 ①在两只形状大小相同、水量相等的玻璃杯中放入两块大小不一的方糖。 ②仔细观察方糖在水中的溶解速度并将相关数据记录在记录表单中。 3.实验条件 A：相同因素：①玻璃杯的形状大小。②水量的多少。③两杯水的温度。 ④投放方糖时要同时同步同高度。 B：不同因素：两块方糖的大小不同（物质颗粒粗细不同）。 4.实验操作（边操作边记录，见附表1） 5.实验结论 物体颗粒越粗（面积大）溶解速度越慢，物体颗粒越细（面积小）溶解速度越快。 实验二：溶解的快慢可能跟水的温度有关。 1.实验猜测 ①玻璃杯中水的温度越高溶解速度越快。 ②溶解速度快慢跟水的温度高低无关。 2.实验方法与设计 ①在两只形状大小相同，水量相等但水温不同的玻璃杯中放入两块形状大小质量完全相同的方糖。 ②仔细观察方糖在水中的溶解状况并将相关数据记录在记录表中。 3.实验条件 A：相同因素：①玻璃杯的形状大小。②水量的多少。③两块方糖的大小。 ④投放方糖时要同时同步同高度。⑤实验室内的温度要一致。
一、包装细胞293T 细胞的培养 一、293T 细胞的冻存 1. 随着传代的次数增加，293T 细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行冻存。 2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's 液洗去残留的培养基。 4. 加入0.25% 的胰酶，消化10-20s 后倒去。 5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。 6. 细胞计数。 7. 将细胞离心，1000rpm ，2min 。 8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70% 完全培养基+20%FBS+10% DMSO ）重悬细胞，密度为3X 10 6个/ml。 10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。 二、293T 细胞的传代 1. 当细胞生长至汇合率达到80~90% 需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。 2. 消化细胞，方法同上。 3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为 3 X10 5个/ml。 4. 分到10cm 培养皿中，10ml/ 皿。 三、293T 细胞的复苏 1. 当细胞传代次数过多（超过50 代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。 2. 打开水浴锅，设置温度为40 C。 3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min 内使细胞溶液完全溶解。 4. 将1ml 细胞溶液加入9 ml 完全培养基中并混匀后转入10cm 培养皿。 5. 放回37 C、3%CO 2和95%相对湿度的培养箱中培养。 6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入10ml 新鲜培养基。 二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定 1. 所用病毒检测引物为WPRE 特异引物，序列如下 只供学习与交流
慢病毒包装实验的要点： 1：良好的293FT细胞状态是转染成功的首要因素，细胞代数不宜超过30代； 2：细胞铺板需均匀，避免细胞成团，影响转染效率；尽量多的细胞转入质粒，产生的病毒就越多； 3：细胞换液和共转染时，动作要轻柔避免细胞漂浮。尽量少的细胞死亡，产生的病毒就越多； 实验前要准备的试剂、耗材和仪器； 试剂准备：10%灭活胎牛血清+90%DMEM配好的完全培养基,0.25%胰酶，PBS,TRL转染试剂，包装质粒，目的质粒，无血清培养基。 耗材准备：10cm细胞培养皿，6孔细胞培养板，吸头规格1ml、200ul、10ul，10ml移液管，离心管规格15ml、5ml、1.5ml，0.22um PVDF滤膜和10ml无菌注射器，试管架。仪器准备：倒置荧光显微镜，普通光学倒置显微镜，电动移液器，吸引器，移液枪，二级生物安全柜，二氧化碳细胞培养箱。 第一天：上午（病毒包装质粒共转染前，293FT细胞复苏后至少让其传代两次以上，293FT 细胞能成倍的增长，确定细胞状态好）； 实验前准备： 安全柜开紫外灯照30分钟； 把培养基和试剂放置常温； 消化细胞： 从37 5%的co2细胞培养箱拿出细胞状态良好的293FT细胞，吸出原培养基，加入PBS 1ml略洗之后吸出，加入1ml胰酶消化1-2min，轻轻拍打培养皿，再加入3ml新鲜培养基终止消化，将培养皿中的细胞转移至15ml离心管内离心1000r /5min,吸出上清液，加入10ml PBS 吹打混匀后，离心1000r /5min, 吸出上清液。 细胞铺板： 在10cm细胞培养皿上标记细胞名称、细胞代数、时间和操作人，将计数好大约2.5×106个293FT细胞吸入15ml离心管，再加入完全培养基至10ml充分混匀，然后把混匀的293FT细胞移入10cm培养皿）。放置培养箱中培养48h。 插入铺板后图片
慢病毒载体包装构建过程 原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。 概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。 辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括：慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。 慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 基本原理：慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。
包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。 载体成分：与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。 为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。 一、实验流程（1和2为并列步骤） 1.慢病毒过表达质粒载体的构建 设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。 2.慢病毒干扰质粒载体的构建 合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体 3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含
慢病毒生产及使用操作手册 一、实验流程 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。以下容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。 二、实验材料 （一）慢病毒载体、包装细胞和菌株 该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pHBLV TM系列质粒。 1、载体信息（见附录） 2、细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。 三、包装细胞293T细胞的培养 （一）293T细胞的冻存 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基； 2、加入0.25%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。 3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入3mL 37 ℃预热的10％DMEM，用10mL 移液管进行吹打，较大力吹打6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取50ul 混匀后的细胞于1.5mL eppendorf 管中，加入450ul 10％DMEM，即为10 倍稀释，混匀，取10ul 细胞于计数板中计数。计数板上共4 大格，每大格16 小格。计数时，4 大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10 倍稀释），即为实际n万/mL 细胞浓度。
教科版四年级科学上册实验报告单 （1）实验名称：室内外温度的测量与比较 实验器材：温度计、线、笔 实验步骤： 1、取一支温度计，用线拴好。 2、将温度计悬挂，（离地面米左右，不能靠拢，在室外注意通风，阳光不能直射温度计）。 3、读数。 4、记录并比较。 实验结果：室内外温度存在差距，通过对大气温度的测量，可以了解当地的气温。 （2）实验名称：气温的测量 实验器材：温度计 实验步骤： 1、选择两个地点：阳光下和背阴处来测量它们的温度； 2、测量一天中，清晨、商务、中午、下午、傍晚的气温。 实验结果：1、阳光下的温度高，背阴处的温度低，说明测量气温时应该选择背阴的地方。2、一天中，中午的时候气温最高，清晨的时候气温最低；还发现在一天中的气温时从低到高，在从高到低的规律变化的。 （3）实验名称：用简易雨量器测量降水量 实验器材：温度计 实验步骤： 1、用喷水壶模拟降水，记录好时间。 2、把雨量器改在水平桌面，读出刻度 3、换算成24小时，核对雨量等级。 实验结果：根据24小时内测的降水量，对照等级表，确定了下雨的等级。 （4）实验名称：观察食盐、沙在水中的状态 实验器材：烧杯2个、搅拌棒2根、沙、食盐、水。 实验步骤： 1、取一小匙食盐，放入盛水的烧杯内，用搅拌棒轻轻搅拌。你有什么发现 2、取一小匙淘洗干净的沙，放入盛水的烧杯内，用搅拌棒轻轻搅拌。你有什么发现 3、比较食盐和沙在水中的状态。 实验结果：食盐在水中溶解了，沙在水中没有溶解。 （5）实验名称：观察面粉在水中溶解了吗 实验器材：烧杯1个、搅拌棒1根、面粉、水。 实验步骤： 1、取一小匙面粉，放入盛水的烧杯内，用搅拌棒轻轻搅拌。 2、你发现了什么
教科版四年级上册科学实验报告单含实验目的及实验现象
教科版四年级科学上册实验报告单 （1）实验名称：室内外温度的测量与比较 实验器材：温度计、线、笔 实验步骤： 1、取一支温度计，用线拴好。 2、将温度计悬挂，（离地面1.5米左右，不能靠拢，在室外注意通风，阳光不能直射温度计）。 3、读数。 4、记录并比较。 实验结果：室内外温度存在差距，通过对大气温度的测量，可以了解当地的气温。 （2）实验名称：气温的测量 实验器材：温度计 实验步骤： 1、选择两个地点：阳光下和背阴处来测量它们的温度； 2、测量一天中，清晨、商务、中午、下午、傍晚的气温。 实验结果：1、阳光下的温度高，背阴处的温度低，说明测量气温时应该选择背阴的地方。2、一天中，中午的时候气温最高，清晨的时候气温最低；还发现在一天中的气温时从低到高，在从高到低的规律变化的。 （3）实验名称：用简易雨量器测量降水量 实验器材：温度计 实验步骤： 1、用喷水壶模拟降水，记录好时间。 2、把雨量器改在水平桌面，读出刻度 3、换算成24小时，核对雨量等级。 实验结果：根据24小时内测的降水量，对照等级表，确定了下雨的等级。 （4）实验名称：观察食盐、沙在水中的状态 实验器材：烧杯2个、搅拌棒2根、沙、食盐、水。 实验步骤： 1、取一小匙食盐，放入盛水的烧杯内，用搅拌棒轻轻搅拌。你有什么发现？ 2、取一小匙淘洗干净的沙，放入盛水的烧杯内，用搅拌棒轻轻搅拌。你有什么发现？ 3、比较食盐和沙在水中的状态。 实验结果：食盐在水中溶解了，沙在水中没有溶解。 （5）实验名称：观察面粉在水中溶解了吗 实验器材：烧杯1个、搅拌棒1根、面粉、水。 实验步骤： 1、取一小匙面粉，放入盛水的烧杯内，用搅拌棒轻轻搅拌。 2、你发现了什么？
Clontech-Lenti-X? Lentiviral Expression Systems User ManualProtocol No. PT5135-1慢病毒包装操作说明 A.用Lenti-X HTX Packaging System生产慢病毒悬浮物为了获得最高效价的病毒悬液，用Lenti-X 293T细胞系，严格尊守以下说明，尤其尊守（1）培养体系和培养量（2）DNA的量和转染质量（3）无四环素血清（4）孵育时间。 所有的Xfect?转染成份，量和条件最好用Lenti-XVectors，Lenti-XHTX包装混合物，Lenti-X293T细胞。 用10cm组织培养板并确保血清无四环素，四环素污染的血清对表达包装成份是有害的。 所有的实验步骤均在无菌组织培养器血中完成。 包装病毒需要有微生物安全等级2的生物安全柜中进行，注意重组的假性慢病毒包装颗粒能够感染人。 6 1.转染24小时前，在10cm培养板接种4-5×10个293T细胞，添加10ml的生长培养基。 在37℃，5%CO2℃条件下过夜。 在进行第7步前确保培养血有80-90%的覆盖率。 2.充分混均Xfect Polymer。 3.每个转染样品需准备两个离心管，按顺序添加如下试剂Tube 1(Plasmid DNA) Tube 2(Polymer)557μlXfectReaction Buffer 592.5μl Xfect ReactionBuffer36μl Lenti-X HTX Packaging Mix 7.5μl Xfect Polymer7μl Lenti-X Vector DNA(1μg/μl)600μl 总量600μl 总量注意： Xfect Polymer不要在室温下搁置长于30min
实用指导（二）：慢病毒感染贴壁细胞实验步骤 和元生物|2016-03-1513:51 慢病毒慢病毒（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒(HIV)的病毒载体，基因组为RNA，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂。 以24孔为例： 第一天：准备细胞将状态良好的目的细胞接种到24孔板中，细胞计数后，进行铺板，每孔加入500ul培养基。保证第二天感染病毒时融合效率达到30-40%。通常，24孔板内以 5-8*10^4cells/孔的密度铺板。 第二天：病毒感染，换液1计算病毒加药量 选择合适MOI值，进行病毒感染。 加药量计算方法：（细胞数×MOI值/病毒原液滴度）×10^3=病毒加药量（μl）。 2弃去部分培养基 将每组中加入的病毒及感染增强剂的体积去掉，保证加入病毒和感染增强剂后，每孔中仍保持500ul的液体量。 3加入慢病毒加药量计算方法
（细胞数×MOI值/病毒原液滴度）×10^3=病毒加药量（μl），培养基的总量必须充分覆盖住细胞。 4添加感染增强剂polybrene,保证终浓度为5ug/ml Polybrene是一种聚阳离子，可以中和电荷以促进假病毒外壳与细胞膜的作用。Polybrene 最佳浓度因不同细胞株而异并应根据经验而定（通常范围为2-10μg/ml）。过长时间暴露于Polybrene（>12小时）可对某些细胞产生毒性作用。 5病毒感染8~12小时后，观察细胞状态。 如细胞状态差，尽快换新鲜培养基；如细胞状态良好，可以在24小时内换液，但不宜超过24小时。弃去培养基后每孔加入500μl新鲜的完全培养基。5%CO2培养箱培养。 第五天：观察荧光表达情况病毒感染细胞72h后，在荧光显微镜下观察细胞，估计慢病毒感染目的细胞的效率。若荧光弱，可到96h后观察。如果96h仍无荧光，即感染实验失败。
病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 1.1慢病毒 1.1.1原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方 面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1.1.2特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1.1.3慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 1.2、腺病毒 1.2.1 原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 1.2.2特点 1）几乎可以感染所有类型的细胞 2）可以获得复制缺陷型(E1 和E3 缺失) 的腺病毒 3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。 4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 1.2.3腺病毒包装简要流程 1）构建表达siRNA/miRNA 的腺病毒载体 2）采用PacI消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4）将病毒粗提液感染293A 细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。 1.3、慢病毒和腺病毒的比较
一、包装细胞293T细胞的培养 一、293T细胞的冻存 1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行冻存。 2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。 4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。 5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。 6. 细胞计数。 7.将细胞离心，1000rpm，2min。 8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。 10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。 二、293T细胞的传代 1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。 2. 消化细胞，方法同上。 3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为3×105个/ml。 4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。 三、293T细胞的复苏 1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。 2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。 3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。 4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。 5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。 6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。 二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定 1. 所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下
四年级科学《溶解的快与慢》教学设计 教学目标 （一）科学知识： 会溶解的固体物质在水中溶解的快慢与物体颗粒大小（即物体表面积的大小）、水的温度以及混合液体是否被搅动等因素有关。 （二）过程与方法： 引导学生经历“问题—假设—验证—证实”科学探究过程和控制单个变量进行对比实验的过程。 （三）情感态度与价值观： 培养学生与同学合作进行研究活动，敢于发表自己的意见，并能注意倾听他人的意见。 教学重难点 重点：通过对比实验，使学生理解加快溶解的方法。 难点：对比实验过程中，各种变量与不变量的控制。 一、创设情境、引出问题： 引导语：有一天，老师的喉咙特别难受，老师的朋友就告诉我说可以泡一杯盐水喝喝，老师把盐倒进水中时，发现溶解的特别慢。同学们有什么方法可以让老师马上可以喝到盐水？ 二、设计探究方案： 1、班上交流：怎样让一杯盐溶解得快？ 2、交流后教师板书：（搅拌，加热……） 3、这只是你们的猜测，我们还要想办法来验证你们的猜测，你觉得我们应该怎么来研究呢？先来研究“搅拌”可以加快溶解的实验。质疑：你们怎么证明搅拌的比不搅拌的快呢？（引
出对比实验ppt课件）。 4、小组讨论并汇报“搅拌”实验步骤及应注意的事项，完成实验记录单。 （一个搅拌，一个不搅拌；放入的糖应该一样多；烧杯里的水一样多；放入糖的时间应该一样，水的温度也应该一样） 5、小组讨论并汇报“加热”实验步骤及应注意的事项，完成实验记录单。 让学生自由举手发言，来完整描述“加热”可以加快溶解实验的步骤及应注意的事项。 三、学生分组探究搅拌、加热加快溶解的实验： 1、学生选择实验分组探究。 2、温馨提示： （1）、我们的实验器材是玻璃制品，在做实验中有的小组要用到热水，请同学们一定要注意安全； （2）、小组内部要明确分工，实验中一定要仔细观察、认真思考并填好实验报告单，需要热水的小组请耐心等待，老师马上给你们送来。 3、教师巡回指导。 4、汇报实验结果 我们小组选择的实验是：（）能否加快白糖的溶解。 我们通过实验发现了（）现象，证明了（）能加快白糖的溶解。 5、教师小结：同学们通过实验发现了搅拌比不搅拌、热水比冷水能加快白糖的溶解。 四、加快水果糖溶解的研究 1、这里有一颗水果糖，怎样使这颗水果糖快速地溶解在这100ml的水中呢？ 2、分组讨论并汇报：（搅拌加热切碎碾碎并搅拌再加热） 3、“搅拌”与“加热”都可以加快溶解，由于时间关系我们就不再做了，我们来研究第三种方法能不能加快溶解。 4、小组讨论并汇报“切碎”实验步骤及应注意的事项，完成实验记录单。 5、学生实验并汇报实验结果（在实验中我们发现，切碎并搅拌再加热可以溶解得更快。） 五、小结 1、通过这堂课的学习，我们学到了什么？ 2、你知道了哪些方法可以加快溶解？溶解的快与慢与哪些因素有关？
慢病毒感染细胞实验方法
一、实验概述 培养生长状态良好的目的细胞，根据慢病毒感染预实验结果设计各组实验条件，进行正式感染。若为荧光标记的慢病毒感染，参照预实验确定的感染时间点，于荧光显微镜下观察GFP表达情况，荧光率达70-80％左右，细胞汇合度达80%左右，收集细胞进入下游实验。若为抗性基因（如Puromycin）标记的慢病毒感染，感染48 h-72h后，使用抗生素筛选48h，收集细胞汇合度70%-80%左右的生长状态良好的细胞进行下游实验。 二、实验材料 1.主要试剂 试剂名称试剂来源cat.No. 胎牛血清Ausbian VS500T DMEM Corning 10-013-CVR 胰酶生工生物工程（上海）股份有限公司T0458-50G Puromycin Clontech 631305 D-Hanks 上海吉凯基因技术有限公司配制 2.主要仪器 仪器名称仪器来源cat.No. 荧光显微镜奥林帕斯IX71 CO2培养箱日本三洋SANYO MCO-175 倒置显微镜上海蔡康光学仪器有限公司XDS-100 离心机赛默飞世尔科技(中国)有限公司Fresco 21 生物安全柜上海振样创空气净化设备有限公司Bio 1200-Ⅱ-A2 三、实验步骤 1．准备目的细胞 （1）从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻。（2）完全解冻后，1300 rpm，离心3 min，75%酒精擦拭冻存管消毒后，移至生物安全柜。 （3）吸去冻存液上清，加入1 mL新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3 mL完全培养基的6-cm dish 中，轻轻晃匀后置于37℃、5% CO2培养箱。（4）24 h后更换一次培养液继续培养，待细胞汇合度达80%左右传代培养，保持细胞良好的生长状态。
此文档收集于网络，如有侵权，请联系网站删除 慢病毒包装实验的要点： 1：良好的293FT细胞状态是转染成功的首要因素，细胞代数不宜超过30代； 2：细胞铺板需均匀，避免细胞成团，影响转染效率；尽量多的细胞转入质粒，产生的病毒就越多； 3：细胞换液和共转染时，动作要轻柔避免细胞漂浮。尽量少的细胞死亡，产生的病毒就越多； 实验前要准备的试剂、耗材和仪器； 试剂准备：10%灭活胎牛血清+90%DMEM配好的完全培养基,0.25%胰酶，PBS,TRL 转染试剂，包装质粒，目的质粒，无血清培养基。 耗材准备：10cm细胞培养皿，6孔细胞培养板，吸头规格1ml、200ul、10ul，10ml移液管，离心管规格15ml、5ml、1.5ml，0.22um PVDF滤膜和10ml无菌注射器，试管架。 仪器准备：倒置荧光显微镜，普通光学倒置显微镜，电动移液器，吸引器，移液枪，二级生物安全柜，二氧化碳细胞培养箱。 第一天：上午（病毒包装质粒共转染前，293FT细胞复苏后至少让其传代两次以上，293FT 细胞能成倍的增长，确定细胞状态好）； 实验前准备： 安全柜开紫外灯照30分钟； 把培养基和试剂放置常温； 消化细胞： 从37 5%的co2细胞培养箱拿出细胞状态良好的293FT细胞，吸出原培养基，加入PBS 1ml略洗之后吸出，加入1ml胰酶消化1-2min，轻轻拍打培养皿，再加入3ml新鲜培养基终止消化，将培养皿中的细胞转移至15ml离心管内离心1000r /5min,吸出上清液，加入10ml PBS吹打混匀后，离心1000r /5min, 吸出上清液。 细胞铺板： 在10cm细胞培养皿上标记细胞名称、细胞代数、时间和操作人，将计数好大约2.5×106个293FT细胞吸入15ml离心管，再加入完全培养基至10ml充分混匀，然后把混匀的293FT细胞移入10cm培养皿）。放置培养箱中培养48h。 插入铺板后图片 刚铺板后 铺板1天后 第三天：上午 细胞转染： 细胞铺板48h后，从培养箱取出293FT细胞，倒置显微镜观察，细胞密度达90%左右； 吸出原有培养基，沿皿壁缓慢加入8ml完全培养基，放置于培养箱中，待转染。 取出2个1.5ml的离心管，一份加入142ul的无血清培养基和58ulTRL转染试剂，吹打混匀。另一份加入包装质粒18ul、目的质粒10ul和无血清培养基总体积200ul充分混匀。 将2个离心管液体吹打混匀，室温静置20分钟 精品文档
慢病毒包装系统简介及应用 一、慢病毒包装简介及其用途 慢病毒（Lentivirus ）载体是以HIV-1 （人类免疫缺陷I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi 的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA 半衰期短，体外合成siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA 的载体，然后转移到细胞内转录siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA ，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA 表达载体中，是由RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA 合成的，这是因为RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA 不会带poly A 尾。当RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续4 个或5 个T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物3' 端形成1~4 个U 。U6 和H1 RNA 启动子是两种RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA 和～50ntRNA 茎环结构（stem loop ）。在siRNA 表达载体中，构成siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体包含位于RNA 聚合酶Ⅲ启动子和4 ～5 T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ' 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA 。构建载体前通常要通过合成siRNA 的方法，寻找高效的siRNA ，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA 表达载体。 慢病毒载体（Lentiviral vector ）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA 的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA ，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 二、这一系统的目的，主要是为了解决以下问题： 1. 对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi，cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。 2. 进行稳转细胞株的筛选； 3. 为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液； 在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。
慢病毒使用操作手册 一、慢病毒的储存与稀释: 1. 病毒的储存：收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口） ①病毒可以存放于-80℃6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，建议在使用前需要重新滴定病毒滴度 ②反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融,建议收到病毒后按照每次的使用量进行分装。 2. 病毒的稀释：如果需要稀释病毒，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)。混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完) 分装后使用。 二、慢病毒用于体外（In Vitro）实验： 感染培养原代细胞和建系细胞。慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，在使用慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）。 慢病毒感染目的细胞预实验 1. 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项： ①测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。 ②在进行慢病毒感染实验时，可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。 ③一般慢病毒单位为TU/ml，即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。如：病毒滴度为>1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X108个具有生物活性的慢病毒颗粒。 2. 以24孔培养板为例，进行目的细胞和HEK293T 细胞的感染预实验实验前按照不同的MOI设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。 第一天，准备细胞：在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种3~5X104个目的细胞，铺板时细胞的融合率为50%左右，每孔培养基体积为100 μl；进行病毒感染时细胞的融合度约为70%左右。 第二天，准备病毒：取出4℃保存的病毒，使用台式离心机离心20 秒（使病毒完全悬于离心管底部即可）；如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根据实验室的实际情况将按照MOI准确计算好的慢病毒稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含
一、简介 慢病毒( Lentivirus )载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷I 型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi 的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA 半衰期短，体外合成siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA 的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA ，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。慢病毒载体能够产生表达shRNA 的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA ，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒作为siRNA 的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。 在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶川启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶川有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA 聚合酶川遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3'端形成1~4个U。 U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶川依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达?21ntRNA 和?50ntRNA 茎环结构(stem loop )。在 siRNA 表达载体中，构成siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状RNA (small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶川启动子和4?5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可 折叠成具有1~4个U 3 '突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前 通常要通过合成siRNA 的方法，寻找高效的siRNA ，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA 表达载体(筛选)。 二、实验流程(大致的简单过程) 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的
慢病毒感染步骤 包装细胞系：293FT 生长培养基：DMEM+10%HI FBS+1%P/S+0.5mg/mlG418 4mM L-Glu, 0.1mM MEM Non-Essential Amino Acids, 1mM MEM丙酮酸盐 慢病毒培养基：DMEM+10%HI FBS（无抗生素） 4mM L-Glu, 0.1mM MEM Non-Essential Amino Acids, 1mM MEM丙酮酸盐 目的细胞培养基：DMEM 或者其他培养基+10%FBS，不含抗生素。 转染过程： 第一天：准备DNA-lipofectamine 2000复合物 a.准备一个5ml EP管，各加入1ug pLP 1 , pLP 2，pLP/SVG以及1ug的慢病毒表达质粒，在50ul(250ul)的OPTI-MEM培养基里面。 b. 准备一个5ml EP管，加入10ul(6ul) lipofectamine 2000,在50ul(250ul) OPTI-MEM培养基里面.(轻轻混匀，室温放置5min) c.将步骤a和步骤b轻轻混匀 d.室温放置20min,使其充分形成脂质体复合物，可能会出现浑浊，但是不影响转染 e.在形成脂质体复合物的过程中，消化，计数293FT，将细胞稀释在慢病毒培养基中，调整至1.2x106/ml。 f.在6孔板中，加入DNA-脂质体复合物100ul（500ul）以及慢病毒培养基0.9ml g.添加0.9ml细胞悬液（大约1x106）至6孔板中。轻轻混匀，37℃培养过夜。 第二天 换液，将培养液（含脂质体）换掉，加入慢病毒培养基2ml,培养48h,观察细胞融合状况。注意：换液动作一定要轻，换液不用PBS洗 第三天 将待转染的细胞（BE2-C，SHEP1）用不含抗生素培养基培养，并用合适的浓度，等到第二天大约在30%的密度 第四天 a.收293FT细胞产生的病毒上清液，用0.45um的微孔滤膜过滤，然后再向293FT细胞里 面加入慢病毒培养基 b.感染细胞，加入1ml的慢病毒培养基以及1ml的病毒液，终浓度为4ug/ml polyberne c.剩下的病毒液用1.5ml的离心管于-80℃保存，可以保存一年，当用的时候需要融化的时 候，室温溶解比37℃溶解要好。 第五或者第六天：第二次感染（重复第四天的操作） 第六或者第七天：将细胞放置于新鲜的目的细胞培养基中培养 第七天或者第八天：药物选择
A.make Lenti-vector construct (pRNAivector for knock down) Design shRNA specific to target gene,clone annealed shRNA to selected lenti-vector and give priority to BamHI/SmaI as enzyme digestion sites. B.Packing virusin 293T cell: (In general case packing in 6-well,if in12-well plate, reduce all to 1/2；when demand is high, packing in 10cm plate.) 1.Mix the following plasmids in a 1.5 ml eppendorf tube for transfection. 6-well:1.5 μgLenti-vector + 1.5 μg packing plasmids = 3 μg total 5:3:2 (PMDL =0.75 μg, VSVG=0.45 μg, REV=0.3 μg) add125μlOPTI-MEM, mix well. 10cm:5 μgLenti-vector + 10 μg packing plasmids = 15 μg total 5:3:2 (PMDL =5 μg, VSVG=3 μg, REV=2 μg) add 500μl OPTI-MEM, mix well. 2.Mix 5ul Lipo in 125μl OPTI-MEM(6well) or mix 15ul Lipofectamin2000 in 500μl OPTI-MEM(10cm), incubate for 5 min. 3.Mixthe Lipo mixture with plasmids mixture, incubate for 20 min. 4.During the incubation time, change fresh medium to 293T cell. 5.Add transfection mixture to the well, mix well, and move back to 37C incubator quickly. 6.Harvest virus after 36h and add medium for the second harvest after another 36h ,and cells in supernatants all need remove by 0.45um syringe.View the GFP for package efficiency before harvest. (virus can be stored at 4C forone week, otherwise, aliquot virus and store at -80C for further use) C.Infection: 7.Seed cells that need to be infected in a 6-well or 12-well plate. The best cell density is 40-70%, depending on the different applications. 8.For 6-well plate:1.5ml virus + 1.5ml fresh medium 9.Add 10 μg/ml polybrene(1000×), mix medium and polybrene to the wellfirst,then add virus mix well,spin for 30 min at 1500g at 37C. 10.12-24 h later, change medium.