SDS-PAGE和Western blotting法测脊髓细胞内Caspase-3【前言】
1.关于SDS-PAGE（十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳）：
?发展历程：SDS-PAGE技术，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠），以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术，最初由Shapiro于1967年建立。1969年由Weber和Osborn进一步完善，他们在凝胶系统和样品液中加入十二烷基磺酸钠（SDS）以后，对经过处理的蛋白质组分能够更好地分离。1970年，Laemmli首次使用了三羟甲基氨基甲烷（Tris）—甘氨酸缓冲体系，并对SDS-PAGE 方法进行了改进，这一缓冲系统以后被普遍采用。此后，Fling和Gregerso在Laemmli方法的基础上进一步改进，在电泳后增加了凝胶固定这一步骤，可固定一些低分子量的蛋白质，并将样品中蛋白的电泳结果与标准蛋白电泳结果进行比较，可对被分离的蛋白质依据分子量进行定性分析，并可根据谱带的强度，借助光密度仪进行定量分析。
?基本原理：SDS-PAGE技术中，SDS是一种阴离子去污剂，SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SD S分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物（一种形似“雪茄烟”的长椭圆棒，其短轴长度相等），这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异和结构差异，由于SD S与蛋白质的结合是和蛋白的分子量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子量大小。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (简称Acr)和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂过硫酸铵（AP）,N, N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶。SDS-PAGE以此为支持物进行电泳，一般采用的是不连续缓冲系统，不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。该体系2种孔径的凝胶（浓缩胶、分离胶）、2种缓冲体系（Tris-Hcl、Tris-甘氨酸）、3种p H值（电泳缓冲液pH=8.3,浓缩胶pH=6.8，分离胶pH=8.9）形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩与分离的主要因素。样品进入浓缩胶（孔径较大），由于氯离子和少量甘氨酸根离子形成的高电场作用，蛋白被浓缩至一个狭窄的区带。进入分离胶（孔径较小），由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质容易通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质受到较大的阻力而滞后，这样蛋白质在电泳过程中就被分离。
2.关于Western blotting（蛋白质印迹法）：它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。SDS-PAGE与West ern blotting 方法结合，可用来确定蛋白分子量大小，检测不同蛋白分子的相对含量，也广泛应用于检测蛋白水平的表达，检测蛋白纯度等。
3.关于Caspase-3： Caspase-3 是Caspase 家族的一员,是哺乳动物细胞凋亡的关键酶。Caspases家族是近年来发现的一组存在于胞质溶胶中、结构上相关的半胱氨酸蛋白酶，它们的一个重要共同点是特异地断开天冬氨酸残基后的肽键。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。其最主要的底物是多聚(ADP-核糖)聚合酶PARP(po ly(ADP-ribose) polymerase)，该酶与DNA修复、基因完整性监护有关。
【实验目的】
掌握SDS-PAGE和Western blotting法的原理，熟悉实验操作步骤、用途及结果分析，了解实验动物组织的处理及细胞凋亡蛋白Caspase家族。
【材料与方法】
1.1材料：TOCP染毒母鸡和正常母鸡脊髓组织；TritonX-100，Tris，盐酸,氯化钾，氯化镁，氯化钠，EGTA，DTT，蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂；一抗兔抗鼠caspase-3多克隆抗体、二抗羊抗兔IgG,显色试剂ECL，标准蛋白，丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺（TEMED），甘氨酸，β-巯基乙醇，过硫酸铵，溴酚蓝，正丁醇，甘油，吐温20（Tween20）,脱脂奶粉，丽春红S，PVDF膜，X感光胶片等
1.2仪器：DY89-Ⅱ电动玻璃匀浆机，多功能冷冻水平离心机，超速离心机，超低温冰箱，电子天平，摇床，DYY-7B转移电泳仪，DYYⅢ28A垂直电泳槽，DYY Ⅲ48B转移电泳槽，WD-9405A型脱色摇床，多功能数字图像分析仪，粤华牌X 光摄影暗盒，移液器，Eppendorf管，电源等。
2.1 组织的处理：取适量脊髓组织，用剪刀剪成碎末，加入适量预冷的匀浆缓冲液，采用电动玻璃匀浆器冰浴中匀浆，2000rpm上下匀浆2次，然后将匀浆液转移至离心管中，在冰浴中放置30min。4℃ 100,000g离心60min,小心吸取上清，转移至Eppendorf管中，作为组织上清样品备用（TOCP染毒与正常母鸡脊髓组织同样处理）。
2.2 SDS-PAGE
2.2.1 电泳试剂的配制：①交联剂：丙烯酰胺29.2g, 甲叉双丙烯酰胺，0.8g加水至100ml,4℃避光保存。②分离胶缓冲液（1.5M,pH8.8,Tris-HCl）：Tris(三羟甲基氨基甲烷，为碱性)18.15g，1mol/lHCl 24ml，加水至100ml，4℃保存一个月。配制后用pH试纸测试pH为8.8。③浓缩胶缓冲液（0.5 M,pH6.8Tris-HCl）：Tris 6.057g,1M HCl 48ml,加水至100ml。配制后用pH试纸测试pH为6.8。④10%SDS(十二烷基硫酸钠)SDS 10g，加水至100ml。⑤上样缓冲液（3×SDS，-20℃分装保存）用于消化蛋白使其一级结构暴露。至少1：4稀释样品，100℃煮5min。浓缩胶缓冲液1.0ml, SDS(10%)1.6ml，β-巯基乙醇（β-ME）0.4ml，50%甘油 (纯甘油0.4,水0.4) 0.4ml， 1%溴酚兰(4℃ store) 0.4 ml，双蒸水
3.8ml。⑥过硫酸胺(APS)，现用现配，用量少，APS0.1g加水1ml,可放置一周。⑦5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液Tris 30.3g，甘氨酸188g，SDS10g蒸馏水溶解至2000ml, 临用前稀释5倍。⑧10×TBS:Tris60.57g,Nacl 87.66g,浓 HCL33ml,加 H2O至1000ml 调pH至7.4。⑨TBST：10×PBS 100 ml，加0.5ml Tween-20 (0.5%)，加水至1000ml，调pH至8.0。⑩转印缓冲液：Tris 3.033g , Gly1
4.42g, 甲醇200ml, 加水至1000ml 用2次。（或 Tris 12g , Gly 57.6g ,甲醇800ml, 加水至4000ml）。
2.2.2分离胶与浓缩胶的配制方法：
表1 分离胶和浓缩胶的配制方法
组成成分7.5%分离胶10%分离胶4%浓缩胶
30%Arc-Bis(ml) 3.75 5.00 1.33
3.75 3.75 ___
分离胶缓冲液
（ml）
浓缩胶缓冲液
___ ___ 2.5 （ml）
10%SDS(ul) 150 150 100
10%APS(ul) 75 100 100
TEMED(ul) 10-20 10-20 10-20
双蒸水（ml）7.28 6.03 6
【实验步骤】
1、准备玻璃板：将玻璃板超声振洗后用蒸馏水煮玻璃板，进一步去除表面的胶，胶皮条60~70℃水洗。酒精棉球擦洗，一定要保证有两个面干净消毒，朝里对放，晾干。
2、酒精棉球擦洗橡皮套内侧，擦净12孔Teflon梳子，组装玻璃板。
3、1%琼脂糖封边，先封未插入橡皮套一侧，翻转玻璃板，封另一侧。
4、将组装好的玻璃板放入电泳槽中，矮板朝向负极，对角线拧紧。
5、配置15ml 10%的分离胶，用大枪头直接将分离胶灌注至离矮板上缘约3cm(距离梳齿下缘，2cm)加1ml水饱和的正丁醇然后聚合约20分钟，凝胶面与正丁醇界面间出现一条折光线时，表示聚合完成。
6、高板侧垂直倾去正丁醇，用滤纸条吸干残留的正丁醇。配制4%浓缩胶10ml。
7、先插上梳子，再拧紧，用枪头从孔大的一侧加浓缩胶，用吸管从玻璃板上缘加满孔，（梳孔下有气泡时刻倾斜电泳槽赶出）不时补加至聚合好。聚合20分钟后拔掉梳子，在孔中倒入电泳缓冲液，用5ml塑料注射器针头扶直胶孔。
8、准备样品及标准分子量蛋白（上样量约50ug蛋白，或40 ul，可试验）：样品与上样缓冲液、蒸馏水混合，置于薄泡沫上于沸水中煮5分钟，取出冷却至室温。
9、上样：上样前，用注射器吸出孔中的电泳缓冲液，用微量注射器加样。上样完后，先在样品上加少量电泳缓冲液，以免大量加进缓冲液时冲乱样品表面。如有空置的加样孔，须加等体积的上样缓冲液，以防相邻泳道样品的扩散。两边的两个孔跑胶时容易拖尾，最好不用。
10、电泳：小心加入电泳缓冲液，移除所有气泡（电泳缓冲液Tris 3.03g Gly 14.4g SDS 1g,加水至1000ml）。连好线路，接通电源，调电压至电流为40mA（电压>200V），溴酚兰电泳至底端，停止电泳。
11、瓷盘中提前泡好硝酸纤维素薄膜，滤纸，30分钟以上。电泳到达终点时，关掉开关，回收电泳缓冲液，打开电泳槽，取出玻璃板，拆开橡皮套，轻轻掰开玻璃板，用注射器切去浓缩胶，在一侧切去一个角作为标记，切去兰色带以下的胶。
12、组装三明治膜（水下操做，尽量用手，不用镊子，防止弄破胶、滤纸和硝纤膜）:平铺塑料格框，加海绵垫（提前用手赶走气泡，避免导电不好），放三张处理好的8×10cm的滤纸（要一张一张的放，尽量赶走气泡，对齐），放已处理好的硝酸纤维素膜（从负极向正极转印，故应靠近正极；从一角切去小角以方便辨认加样顺序及正反）；小心放上凝胶,再放上两张滤纸,放一海绵垫,最后夹紧塑料
格框. (+)海绵垫-3张滤纸-硝酸纤维素膜-凝胶-3张滤纸-海绵垫(-)
13、将三明治膜置于转膜盒中（硝纤膜向胶）倒入1升转印缓冲液，转印3小时，要求稳压100v（所分析目标蛋白＞100KD时用140v）.
14、打开冷凝循环水，进水管接正极侧，打开电源，恒压，持续3小时。（转印结束后，回收缓冲液）。
●杂交
15、拆开三明治，取出硝纤膜，放入塑料盒中，倒入少许的丽春红染液，随即到出，看膜上是否有条带（为非特异性条带），如没有条带则不用再加抗体。
16、先用双蒸水冲洗膜，然后用PBS冲洗条带直至洗去红色为止.
17、用3％脱脂奶粉封闭缓冲液50毫升封闭，震摇30分钟，以减少非特异性蛋白着色。脱脂奶粉封闭缓冲液：3g脱脂奶粉＋PBST至100ml，混匀，现用现配。
18、加5ul一抗于10ml封闭缓冲液中（1：2000稀释），充分混匀，倒入装有硝纤膜的塑料盒中，充分浸泡硝纤膜，盖上盖，4℃过夜。
19、取出硝纤膜，放入塑料盒中，用PBST 50ml振荡洗涤5～10分钟，3次。
20、加2ul二抗（1：5000稀释）与10ml封闭缓冲液中充分混匀,加入硝纤膜,充分浸泡室温2小时.
21、取出硝纤膜，放入塑料盒中，用PBST 50ml振荡洗涤，5～10min ,3次。
●曝光
22．取出硝纤膜放入13ml的发光液（l A、B液各6.5-7.5mL）中，用1ml 枪头反复浇硝纤膜约5分钟，取出硝纤膜，吸干过多液体，保鲜膜包裹硝纤膜，置于曝光盒中曝光，显影、定影。
23、曝光胶片，用水充分洗涤，凉干后扫描图像保存备进一步分析。
扫描：打开Photoshop file import Twain32点击preview预览，scan 对预览区域扫描。用多功能数字图像分析仪Kodak Digital Science ID软件或用Image-Pro Plus软件进行定量分析。
【预期结果】
?与标准蛋白相比，TOCP染毒组和正常组母鸡脊髓样品在32KD 处均出现条带。?TOCP染毒组脊髓样品在32KD处出现条带颜色浅，定量分析显示相对含量低；正常组在同分子量处条带颜色深，定量分析显示相对含量高。
?TOCP染毒组样品在17KD、12KD分子量处出现条带，并可知其相对含量。提示TOCP可激活脊髓细胞内的Caspase-3原酶，引起细胞凋亡。