考点2 体外受精、胚胎移植、胚胎分割与胚胎干细胞(5年11考)
(2013山东卷、江苏卷、福建卷，2012山东卷、浙江卷……)
1．体外受精
(1)精子、卵子的获取与培养
获取方法
获能方法
卵子
促性腺激素处理后冲取卵子 直接从输卵管中冲出能(能，不能)直接与获能精子在体外受精
在活体或屠宰体的卵巢内直接采集
人工培养到减Ⅱ中期时，才可受精 精子 假阴道法
培养法和化学诱导法(在一定浓度的肝素或钙离子载体A23187溶液中获能)
手握法 电刺激法
(2)受精：获能的精子和成熟的卵子可以在获能溶液或专用的受精溶液中完成受精作用。 2．胚胎的早期培养
(1)培养液成分?????
两盐：无机盐、有机盐
两素：维生素、激素
两酸：氨基酸、核苷酸
天然成分：血清
(2)胚胎处理：当胚胎发育到适宜的阶段时，可将其取出向受体移植，或冷冻保存。
3．胚胎移植
(1)胚胎来源：转基因、核移植、体外受精、体内受精
(2)实质：产生胚胎的供体和孕育胚胎的受体共同繁育后代的过程
(3)地位：胚胎移植是胚胎工程中最后一道程序，移植的胚胎必须在原肠胚之前，不能(能，不能)直接移植受精卵。
(4)意义：充分发挥雌性优良个体的繁殖潜能。 (5)生理
基础?????
移入：动物发情排卵后，在一段时间内同种动
物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的收集：早期胚胎处于游离状态
存活：受体对移入子宫的外来胚胎基本上不
发生免疫排斥反应
保留遗传特性：供体胚胎的遗传特性在孕育 过程中不受任何影响
4．胚胎分割
(1)理论基础：细胞的全能性。
(2)所需仪器设备：实体显微镜和显微操作仪。
(3)
基本程序：选择发育良好、形态正常的桑椹胚或囊胚，移入盛有操作液的培养皿中，然后用分割针或分割刀进行分割。
(4)囊胚期分割要求：内细胞团均等分割，以免影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。 (5)意义：加快繁殖速度。 5．胚胎干细胞
(1)来源：是由早期胚胎或原始性腺中分离出来的。 (2)特点????
?
①形态：体积小、细胞核大、核仁明显②功能：具有发育的全能性
③体外培养：可增殖而不发生分化
(3)应用????
?
①治疗人类某些顽症②培育人造组织器官
③研究体外细胞分化的理想材料
6．试管动物、克隆动物及转基因动物的生产流程比较 (1)试管动物生产流程
(2)克隆动物的培育流程
(3)转基因动物的生产流程
7．克隆动物、试管动物与转基因动物遗传特性比较
项目克隆动物试管动物转基因动物
概念用核移植的方法获得的动
物
用体外受精的方法获得
的动物
由被转入了目的基因的受
精卵发育成的动物
技术核移植体外受精DNA重组技术
生殖方式无性繁殖有性生殖
有性生殖或保持原生殖方
式
遗传特性主要与供核个体相同具备双亲的遗传性状
具备原受精卵及被转入的
目的基因两方的遗传特异
性
相同点三者均涉及早期胚胎培养、胚胎移植等技术，且移植所选胚胎一般是桑椹胚或囊胚
期的胚胎。
(1)试管动物生殖实质是正常的有性生殖，只不过受精、早期胚胎发育在试管中(体外)进行。
(2)克隆动物生殖的实质是无性生殖，依赖动物细胞核(高度分化的体细胞的细胞核)具有全能性；特有的操作程序是核移植！
思维激活
判断正误
(1)冲卵含义是冲出早期胚胎，不是冲出卵子()。
(2)胚胎移植的供体和受体必须是同一种群()。
(3)胚胎移植是胚胎工程中最后一道程序，移植的胚胎一般在原肠胚之前，也可直接移植受精卵()。
(4)转基因动物的培育不涉及胚胎移植()。
(5)克隆动物，也称试管动物，其实质是无性生殖()。
(6)体外受精后获得的受精卵需要立即移入母体子宫进行妊娠，以保证成活率()。
答案(1)√(2)×(3)×(4)×(5)×(6)×
思考感悟
在胚胎移植时下列①～④中哪一项没有必要进行？
①对供体动物和受体动物进行免疫检查，防止发生免疫排斥反应
②用激素对供体动物做超数排卵处理
③对供体、受体动物进行选择，并用激素进行同期发情处理
④冲卵后，对胚胎进行质量检查
提示①胚胎移植时，经同期发情处理后，受体对移入子宫的外来胚胎基本不发生免疫排斥反应，故①不必进行。
干细胞研究及应用
1．(2013·山东理综，35)科学家通过诱导黑鼠体细胞去分化获得诱导性多能干细胞(iPS)，继而利用iPS细胞培育出与黑鼠遗传特性相同的克隆鼠，流程如下：
(1)从黑鼠体内获得体细胞后，对其进行的初次培养称为____________，培养的细胞在贴壁生长至铺满培养皿底时停止分裂，这种现象称为________。
(2)图中2－细胞胚胎可用人工方法从灰鼠输卵管内获得，该过程称为________，也可从灰鼠体内取出卵子，通过________后进行早期胚胎培养获得。
(3)图中重组囊胚通过________技术移入白鼠子宫内继续发育，暂不移入的胚胎可使用________方法保存。
(4)小鼠胚胎干细胞(ES)可由囊胚的________分离培养获得。iPS与ES细胞同样具有发育全能性，有望在对人类iPS细胞进行定向________后用于疾病的细胞治疗。
解析本题考查动物细胞培养、体外受精、胚胎移植、干细胞培养的有关操作和知识。(1)原代培养指将动物组织用酶处理成单个细胞后进行的初次培养。接触抑制指贴壁的细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖的现象。
(2)将早期胚胎从母鼠子宫中吸取出来的方法叫冲卵。(3)暂不进行胚胎移植的胚胎可放入－196 ℃的液氮中冷冻保存。(4)胚胎干细胞简称ES或EK细胞，是由早期胚胎或原始性腺分离出来的一类细胞，iPS与ES细胞一样，可通过诱导定向分化修补某些功能异常细胞来治疗疾病。
答案(1)原代培养接触抑制(2)冲卵体外受精
(3) 胚胎移植冷冻(或低温)(4)内细胞团细胞诱导分化
题后归纳
干细胞类型及培养过程(1)类型
类别
来源或举例特点
全能干细胞桑椹胚或囊胚及以前能发育成完整个体
多能干细胞(胚胎干细胞) 内细胞团细胞、原始性腺细胞
分离
能分化出动物体内的任何组
织
专能干细胞(成体干细胞) 骨髓干细胞、皮肤生发层细胞能分化出特定的组织
系就是饲养层细胞。
(3)培养过程
胚胎工程及其应用
2．(山东理综，35)胚胎工程是一项综合性的动物繁育技术，可在畜牧业和制药业等领域发挥重要作用。下图是通过胚胎工程培育试管牛的过程。
(1)从良种母牛采集的卵母细胞，都需要进行体外培养，其目的是________；从良种公牛采集的精子需________后才能进行受精作用。
(2)在体外培养受精卵时，除了给予一定量的O2以维持细胞呼吸外，还需要提供________气体以维持________。
(3)图中过程A称为________，它在胚胎工程中的意义在于________。
(4)研制能够产生人类白细胞介素的牛乳腺生物反应器，需将目的基因导入牛受精卵，最常用的导入方法是________；获得转基因母牛后，如果________，即说明目的基因已经表达。解析(1)人工采集的卵母细胞要在体外培养成熟后才能与获能的精子完成受精作用，同理，在体外受精前，要对精子进行获能处理。(2)体外培养受精卵所需气体主要有O2和CO2，O2是细胞代谢必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。(3)将早期胚胎移入受体母牛子宫
的过程称为胚胎移植，意义在于可以充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力。(4)基因工程中将目的基因导入动物细胞最常用的方法是显微注射法；获得的基因表达产物即母牛的乳汁中含有人类白细胞介素说明目的基因已经表达。
答案 (1)使卵母细胞成熟(或使卵母细胞获得受精能力) 获能 (2)CO 2 培养液(基)的pH (3)胚胎移植 提高优良母畜的繁殖率 (4)显微注射法 牛奶中含有人类白细胞介素(或牛乳腺细胞已合成人类白细胞介素) 题后反思
1．胚胎移植的几个关键环节
(1)胚胎移植是胚胎工程中的最后一道程序，移植的胚胎必须在原肠胚之前，不能直接移植受精卵。
(2)移植胚胎来源及生殖方式
?????
核移植――→早期胚胎培养无性繁殖
体外受精
――→早期胚胎培养
有性生殖体内受精―
→冲卵―→移植―→有性生殖基因工程―→转入目的基因的受精卵――→早期胚胎培养
胚胎移植―→转基因动物
(3)胚胎移植的供体和受体必须是同种生物，同一物种的动物才有可能具有相同的生理特征。 (4)两次检查：①收集胚胎检查；②移植后是否妊娠检查。
(5)冲卵含义：冲出早期胚胎，不是冲出卵子。 2．胚胎移植的生理学基础
生理学基础
意义
哺乳动物在发情排卵后的最初一段时期，不论是否妊娠，同种动物的供、受体生殖器官
的生理变化相同
为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环
境
早期胚胎形成后，在一定时间内不会与母体子宫建立组织上的联系，而是处于游离状态 为胚胎的收集提供了可能
受体对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免
疫排斥反应
为胚胎在受体内的存活提供了可能
供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但供体胚胎的遗传特性在孕育过程
中不受任何影响
为移植后胚胎的继续发育提供了营养等方面
的保障
胚胎干细胞的体外诱导分化模型马宗源 李祺福(厦门大学生命科学学院福建厦门361005) 胚胎干细胞是具有全能性及无限制的自我更新与分化能力的一类特殊的细胞群体,它能通过祖细胞为中介,分化为各种类型的体细胞,可重演体内干细胞的分化过程。自80年代从小鼠囊胚的内细胞团分离到胚胎干细胞并建系到现在已建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞、造血细胞等体外分化体系。将胚胎干细胞体外分化成为可利用的分化模型,无论从组织结构、细胞及分子水平都体现了体内分化过程的体外重演,再加上胚胎干细胞系具有体系简单,影响因子少,可控制,便于研究等特点,因此可用于研究早期胚胎发育和细胞分化调控;可成为器官移植和修复器官的细胞来源;还可用于新型药物筛选。 1 胚胎干细胞的生物学特性 胚胎干细胞具有与早期胚胎相似的结构特征,具有较高的核质比和整倍体核型。体外培养的细胞紧密堆积,呈克隆状生长,具有发育分化的多潜能性和无限制的自我更新能力,碱性磷酸酶染色呈阳性,具有高的端粒酶活性,早期胚胎细胞均表达胚胎阶段特异性抗原SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、T RA-1-81、T R A-1-60等;表达种系转录因子OCT-4,并且可将O CT-4基因作为细胞多能性的一个标志;白介素6型细胞因子家族参与维持调节胚胎干细胞未分化状态。 胚胎干细胞建系的过程中要解决的问题在于体外不断增殖的过程中保持未分化的状态,但是细胞如何维持其未分化状态的机理并不清楚。研究发现主要是通过膜上的特异受体蛋白gp130来发挥作用,细胞因子受体蛋白g p130可激活JA N U S、酪氨酸激酶,JA K-ST A T、M EK/M A P K等信号途径,而JAK/ST A T3和M EK/ ERK信号途径则处于相对平衡的状态。另外,一些未知的膜结合分子也参与胚胎干细胞的增殖与分化。分离纯化及鉴定调节细胞的自我更新及分化的未知分子已成为研究的热点。 2 胚胎干细胞为基础的分化模型 胚胎干细胞要维持其未分化的状态,需要在胚胎饲养层中加入分化抑制因子。一旦改变了维持胚胎干细胞未分化状态的条件,胚胎干细胞首先形成胚胎小体,胚胎小体有外中内三胚层,继续分化可形成多种类型的细胞。在体外分化培养时,可自发形成有节律性跳动的心肌细胞,同时还形成骨骼肌、神经细胞、上皮细胞等。由于体外胚胎细胞可重演体内胚胎细胞的发育过程,并且基因的表达时相与体内的胚胎发育过程是相似的,在这一过程中加入外源的诱导分化因子并与相关的调控基因结合,可使胚胎干细胞分化为各种类型的细胞。现在已初步建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞和造血细胞等体外分化模型。 2.1 神经细胞 体外培养胚胎干细胞可模拟从未定型细胞向功能性神经元转化的过程,并且其基因的表达时相与体内的胚胎发育过程相似。在分化的早期表达N FL、N F M基因,后期则表达N eur ocan基因。维甲酸及神经生长因子可诱导胚胎干细胞定向分化为神经细胞,是常用的诱导分化物,它能上调神经元特异基因的表达,同时下调中胚层基因的表达。将神经元特异的SOX2基因转进胚胎干细胞,再经维甲酸诱导,可表达90%以上的具有神经元标志的神经细胞。可能是外源基因和维甲酸同时拮抗分化抑制因子的作用,阻碍细胞向其他的方向分化,迫使其向神经元的方向分化。维甲酸能诱导胚胎干细胞分化为C-氨基丁酸能和多巴胺能神经元,而维甲酸分别结合无血清培养基和含胎牛血清的培养基培养胚胎干细胞后发现,采用无血清培养时,几乎检测不到分化的多巴胺能神经元的存在;但在有血清培养时,却能检测到大量的多巴胺神经元。这暗示血清中的某些未知的因子和维甲酸共同起到定向诱导分化 化为特定组织细胞,将这些细胞回输体内,从而达到长期治疗的目的。干细胞的医学应用还包括体外克隆人体器官,然而这比体内移植干细胞要复杂的多。相信随着研究的不断深入,来自人体干细胞的器官应用于临床治疗已为期不远。干细胞研究与应用不仅在疾病治疗方面有着极其诱人的前景,而且将对克隆动物,转基因动物生产,发育生物学,新药物的开发与药效、毒性评估等领域产生极其重要的影响。 参考文献 1 Th omson J A,Itsk ovitz-Eldor J os eph,Shapiro S S,et al. Em bryonic s tem cell lin es d erived from human b las tocysts.S cience,1998,282:1145—1147. 2 Sh amb lott M J,Axelman J,W ang S,et al.Derivation of Plurip otent stem cells from cultured human primordial germ cell.Proc Natl Acad S ci U SA,1998,95:13726—13731. 3 Jack son K A,M i T,Goodell M A.Hematopoietic potential of s tem cells isolated from murie s keletal mus cle.Proc Natl Acad Sci USA,1999,96:14482— 14486. 4 裴雪涛.干细胞研究现状与展望.高技术通讯,2001, (6):93—95. (BH)
人胚胎干细胞研究的临床意义 [关键词] 人胚胎干 健康讯: 吕广秀 20XX14上海市解放军第85医院儿科1998年11月，美国James和John Gearhart领导的2个科学小组分别发表论文阐述如何利用囊胚和原始的胚胎生殖细胞培养出可能的人全能型胚胎干细胞（ES cells）和胚胎生殖细胞系（EG cells）［1，2］。ES细胞最引人关注的2条特征是:ES细胞能在体外条件下生长，在原始的去分化条件下能够无限地分裂;同时在体外培养的所有时间内都能保持胚胎来源细胞的一个关键性特征—全能性，即发育成成体中各种细胞的能力。ES细胞的应用前景十分令人鼓舞。胚胎干细胞可以作为研究人类胚胎发育、出生缺陷及胚胎瘤等疾病的新的手段;可以用于至今为止尚未进行的关于的方法;制造人类疾病模型以利用于基础研究、药物开发和毒理学研究，如果克隆技术可以从患者自体组织中获得干细胞，则它们可解决用于治疗退行性疾病的组织短缺以及结束在移植治疗中使用免疫抑制剂;另外干细胞还可以用来作为基因治疗的一种新的基因运载系统。总之，其前景十分广泛。 1 胚胎干细胞的一般定义特征考虑到ES或EG细胞的特性，可以认为有一些表型是所有的ES细胞都应该具有的，其他一些特点可能是属于从不同种属或不同组织中分离出来的某种特定全能性细胞所特有，或表现出在胚胎发育过程中某个特定阶段所具有的特征。一般认为全能性干细胞所应具有的特征如下:（1）来源于一个全能性的细胞群体;（2）具有正常的细胞核型;（3）具永生性，在胚胎状态下能无限制的分裂;（4）培养的细胞株在体外或在畸胎瘤中能自发分化成胚胎外组织（extraembryonic tissues）和分属所有3种胚层的体细胞。但到目前为止，所有已培养成功的哺乳动物细胞中，除小鼠外，灵长类动物ES细胞只满足上述4条标准的前3条。一些研究人员将ES细胞的定义限定为那些能分化成包括生殖细胞在内的所有的细胞。但出于伦理上的原因，来源于人的ES细胞不可能进行试验以验证是否满足这一标准。因此，如果来源于人的细胞能满足其他3条关于ES细胞的一般定义，我们就认为它属于ES细胞。需要指出的是，要从体外培养或畸胎瘤试验验证一个ES细胞能否分化成所有组织类型的细胞是十分困难的，因为不论在体外培养条件下或畸胎瘤中，一些组织都是十分罕见的。 2 胚胎干细胞的最新研究James Thomson和同事于1998年报道利用治疗不孕症所遗弃的囊胚分离出ES细胞。他们所使用的技术与分离小鼠ES细胞相似:将可能
高二生物选修三导学案使用时间: 2014年3月25日编制:高海乐杨建磊张双双 审核: 包科领导: 班级：小组：姓名：评价： 专题三胚胎工程 3．2体内受精、早期胚胎培养和胚胎移植 【学习目标】 1.熟练掌握体外受精、胚胎移植的过程，能正确理解胚胎移植的生理学基础。 2.自主学习，合作探究，学会应用试管动物技术解决实际问题。 3.全力以赴，感受生物科技发展带给人类的贡献。 【学习重难点】 重点：1.体外受精的主要步骤 2.胚胎移植的过程和生理学基础 难点：1.精卵的采集与培养 2.胚胎移植的生理学基础 【使用说明及学法指导】 1.先通读教材，划出重点，然后再完成导学案，并把不明白的问题标出来，再翻阅课本，解决问题。 有些问题需要认真思考和总结，切忌抄课本和资料。 2.A层完成掌握学案，并完成课后题的相关内容。B层掌握好学案的内容，C层完成好学案。 预习案 1.勾画并记忆试管动物技术的概念，写出体外受精的三步聚？ 2.结合课本，写出收集卵母细胞和精子的方法各有哪些？ 3.在体外使精子获能的主要方法有哪两种?受精时的外界培养液有哪两种？ 4．早期胚胎培养的目的及培养液的成分？ 5.勾画并记忆胚胎移植的概念及进行胚胎移植的原因；写出胚胎工程的最后一道工序？ 6. 在课本中勾画并记忆胚胎移植中供体牛和受体牛各自的作用。写出胚胎移植的意义是什么？ 7.胚胎移植的生理学基础是什么？ 8.同期发情处理、超数排卵采用的激素分别是什么？冲卵指的是什么？
巩固训练 （A/B/C层）1．下列关于精子的说法，不正确的是( ) A．精子的发生从初情期开始 B．它与卵细胞的受精发生在子宫内 C．精细胞变形为精子时保留的细胞器主要是线粒体 D．精细胞变形为精子时细胞内的一些物质最后脱落 （A/B/C层）2．下列有关卵子的产生说法中，正确的是（） A．哺乳动物卵泡的形成是在初情期 B．排出成熟卵子细胞的过程即为排卵 C．卵子形成时的分裂过程均在卵巢内完成 D．卵子产生中的减数第二次分裂是在精子和卵子的结合过程中完成的 （A/B/C层）3．在受精作用过程中，体现受精实质的是（） A．同类生物的精子和卵细胞互相识别B．精子的头部进入卵细胞 C．卵细胞膜增厚形成受精卵膜D．雄原核与雌原核互相融合 （A/B/C层）4．2009年2月2日，山东省干细胞工程技术研究中心的科学家宣布成功克隆出5枚符合国际公认技术鉴定指标的人类囊胚。该课题首席专家称他们掌握此项技术不是为了制造克隆人，而是进行人类治疗性克隆研究。下列有关囊胚和桑椹胚的说法中，不正确的是（） A．桑椹胚的各细胞结构功能基本相同 B．囊胚期细胞出现了细胞分化，但遗传物质未发生改变 C．囊胚期细胞分化是由遗传物质突变引起的 D．囊胚期内细胞团和滋养层细胞差异不是复制水平上的差异，而是转录水平上的差异引起的 （A/B层）5.下图是某种动物发育的几个阶段，下列有关叙述不正确的是（） A．在由2～11的过程中，可能发生细胞的增殖和衰亡 B．在1～11的过程中细胞的全能性逐渐减小 C．图示细胞的增殖方式是有丝分裂 D．细胞分化过程从2开始
胚胎干细胞体外诱导分化综述 摘要：由于胚胎干细胞具有自我更新、高度增值和多向分化的潜能，因此，自20世纪90年代开始，对胚胎干细胞的研究成为生物学领域和医药工程领域研究的一个焦点。本文从胚胎干细胞的分离、体外诱导胚胎干细胞的原理和定向分化的机制、胚胎干细胞体外诱导的方法、定向分化的细胞、应用前景和研究存在的问题对胚胎干细胞进行综述。 关键词：胚胎干细胞；体外培养；诱导分化；应用 干细胞是一种具有多分化潜能和自我更新功能的早期未分化细胞。在特定条件下，它可以 分化成不同的功能细胞，形成多种组织和器官，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。前者指早期胚胎的多能干细胞，后者是存在于胎儿和成体不同的组织内的多潜能干细胞这些细胞具有自我复制能力，并产生不同种类的具有特定表型和功能的成熟细胞的能力，能够维持机体功能的稳定，发挥生理性的细胞更新和修复组织损伤作用[4,9,10]。 胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC)是从着床前胚胎内内细胞团(inner cell mass,ICM)或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞[1]。它能在体外长期不断自我更新,并保持多向分化潜能,可以分化为内、中、外三个胚层的几乎所有类型细胞。自1981年Evans和Kauffman[2,8]用不同的方法首次成功分离得到小鼠胚胎干细胞以来,小鼠胚胎干细胞成为近20年来人们用来研究发育分化、基因表达调控、基因治疗等最理想的模型，并且有大量研究表明小鼠胚胎干细胞可以在体外被诱导分化为绝大多数类型的成体细胞.1998年Thomson等首次成功分离并建立人胚胎干细胞系。自此，人胚胎干细胞不但提供了一个研究人类自身发育分化的良好机会,而且如果人胚胎干细胞能像小鼠胚胎干细胞一样可以在体外诱导形成各种成体细胞,那么利用这些诱导分化形成的成熟细胞将有可能进行细胞和组织替代治疗, 包括糖尿病、帕金森病、早老性痴呆、心血管疾病和肿瘤等多种目前临床上难以治愈的疾病。 1 胚胎干细胞的分离 自Thomson成功分离并建立人胚胎干细胞系后，多年以来，人们研究出很多胚胎干细胞的 分离方法，在这里主要介绍三种： 1.1 分离自胚胎内细胞团 内细胞团又称胚细胞（embryoblast）,是一团于哺乳动物初期胚胎中的一个细胞团块。从早期胚胎内细胞团（inner cell mass,ICM）分离是获得胚胎干细胞的主要途径。由于不同动物的胚胎发育存在差异，因此应注意取材时间。可通过免疫外科手术法、机械剥离法、组织培 养法等方法除去胚胎滋养层细胞获得囊胚内细胞团（ICM）细胞进行体外分化抑制培养。 1.2分离自原始生殖细胞
人胚胎干细胞的研究发展 摘要：叙述了人胚胎干细胞（hES细胞）的研究现状，并对hES 细胞的研究进展及其应用前景等全面综述。 关键词：人，胚胎干细胞，原始生殖细胞，全能性，多功能性干细胞(Stemcell)是一类具有自我更新能力的多潜能细胞，即干细胞保持未定向分化状态和具有增殖能力，在合适的条件下或给予合适的信号，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，又称其为“万用细胞”。干细胞来源于胚胎、胎儿组织和成年组织。根据发育阶段，干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。1998 年Thomson等第一次从胚胎中分离培养了人体胚胎干细胞(hES C)，并随后发现它能分化为体内几乎所有的细胞后，由此掀起全球范围内的hESC研究热潮。 人胚胎干细胞的生理意义：人胚胎干细胞最有价值的应用是用来修复甚至替换已丧失功能的组织和器官，因为它具有发育分化成所有类型组织细胞的能力。任何导致丧失正常细胞的疾病都可以通过移植由胚胎干细胞分化而来的特异组织细胞来治疗，如用神经细胞治疗神经变性疾病（帕金森综合征、亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默病等），用造血干细胞重建造血功能，用胰岛细胞治疗糖尿病，用心肌细胞修复已坏死的心肌等。 1 人胚胎干细胞的来源 胚胎干细胞来源于着床前的囊胚内细胞团或早期胚胎的原始生殖细胞是一大类未分化的二倍体全能干细胞，具有无限增殖、自我更新
和多向分化的潜能。 2 人胚胎干细胞的生物学特性 (1)具有分化的多潜能性，在体外可诱导分化出属于三个胚层的分化细胞; (2)具有种系传递功能; (3)具有长期的未分化增殖能力，细胞不仅能分化成各种器官组织，而且能增殖生成新的保持同种性状的ES 细胞; (4)易于进行基因改造操作; (5)保留了正常的二倍体的性质且核型正常; (6)胚胎干细胞端粒酶活性呈阳性,具有维持端粒长度,保持干细胞增殖能力的重要作用。 3 人胚胎干细胞的培养 (1) 常规培养液常用的基础培养基有改良伊格尔培养基(MEM)α、达氏修正依氏培养基(DMEM)、组织培养基(TCM)199、F12 等合成培养基，以DMEM应用最为普遍。它的主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和一些其他辅助物质。 (2) 无血清培养基血清中含有许多未知的成分和一些分化诱导因子，不利与ESC未分化状态的维持。为此人们尝试使用无血清培养液、化学合成培养液’进行ESC的培养，加入刺激细胞生长的激素、细胞因子等，实验表明ESC增殖旺盛，且能保持未分化状态，并认为无血清培养基优于血清培养基。但也有学者认为含血清培养液更利于胚胎干细胞向中胚层细胞分化,是因为血清中富含中胚层诱导因子,
不孕症病人体外受精与胚胎移植的护理 Ｎｕｒｓｉｎｇ ｃａｒｅ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ 陈向红，陈玉珍，陈惠仪，蒙顺好，阙文清 Ｃｈｅｎ Ｘｉａｎｇｈｏｎｇ，Ｃｈｅｎ Ｙｕｚｈｅｎ，Ｃｈｅｎ Ｈｕｉｙｉ，ｅｔ ａｌ （Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｓｕｎ Ｙａｔ－ｓｅｎ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｓｕｎ Ｙａｔ－ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５１０１２０Ｃｈｉｎａ） 摘要：［目的］探讨整体护理干预对不孕症病人体外受精与胚胎移植（ＩＶＦ－ＥＴ）治疗的影响。［方法］将２０１１年１月—２０１１年１０月接受ＩＶＦ－ＥＴ治疗的１ ４６１例病人随机分为护理干预组和对照组，对照组给予常规护理，护理干预组实施整体护理，比较两组病人的术后妊娠率。［结果］护理干预组病人的妊娠率明显高于对照组（Ｐ＜０．０１）。［结论］不孕症病人采用ＩＶＦ－ＥＴ结合整体护理，可有效提高妊娠成功率。 关键词：不孕症；体外受精；胚胎移植；护理Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｐｒｏｂｅ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｈｏｌｉｓｔｉｃ ｎｕｒｓｉｎｇ ｉｎｔｅｒ－ｖｅｎｔｉｏｎ ｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏ ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＩＶＦ－ＥＴ）ｆｏｒ ｐａ－ｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｆｏｒｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄａｔａ ｏｆ ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ １４６１ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｈｏ ａｃｃｅｐｔｅｄ ＩＶＦ－ＥＴ ｉｎ ａｆｆｉｌｉ－ａｔｅｄ Ｓｕｎ Ｙａｔ－ｓｅｎ ｍｅｍｏｒｉａｌ ｈｏｓｐｉｔａｌ ｆｒｏｍ Ｊａｎ．ｉｎ ２０１１ｔｏ Ｏｃｔ．ｉｎ ２０１１．Ａｌｌｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｎｕｒｓｉｎｇ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐｒａｎｄｏｍｌｙ，ａｎｄ ｔｈｅ ｐｏｓｔ－ｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ｒａｔｅ ｗａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｂｅｔｗｅｅｎｂｏｔｈ ｇｒｏｕｐｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ｒａｔｅ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｉｎ ｎｕｒｓｉｎｇ ｉｎｔｅｒｖｅｎ－ｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＩＶＦ－ＥＴ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｔｏ ｈｏｌｉｓｔｉｃ ｎｕｒｓｉｎｇ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ ｃａｎ ｅｆ－ｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｓｕｃｃｅｓｓ ｒａｔｅ ｏｆ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ；ｖｉｔｒｏ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ；ｅｍｂｒｙｏ ｔｒａｎｓｆｅｒ；ｎｕｒｓｉｎｇ 中图分类号：Ｒ４７３．７１ 文献标识码：Ｂ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４－４７４８．２０１２．０９．００１ 文章编号：１６７４－４７４８（２０１２）３Ｃ－０７６９－０２ 体外受精与胚胎移植（ＩＶＦ－ＥＴ）是一项高、精、尖的助孕技术，是近年来治疗不孕症的主要手段之一，首先取出不孕夫妇女方的卵子和男方的精子，精子经过密度梯度离心加上游法洗涤，并于卵子取出３ｈ～４ｈ后加进培养皿中进行体外受精并培养成胚胎，４８ｈ～７２ｈ后再将胚胎植入母体宫腔内以达到妊娠目的［１］。我国育龄女性中约有１０％患有不孕症，不孕原因包括输卵管性不孕、免疫性不孕、子宫内膜异位症及多囊卵巢综合征等，男性病人有弱精、少精症［２］，其有效治疗手段均可选择ＩＶＦ－ＥＴ，但研究发现配合整体护理干预可以明显提高病人术后的妊娠率，因此值得深入研究。本组回顾了２０１１年１月－２０１１年１０月在我院接受ＩＶＦ－ＥＴ治疗的１ ４６１例病人的临床资料，探讨整体护理干预对不孕症病人ＩＶＦ－ＥＴ治疗的影响。 １ 资料与方法 １．１ 一般资料 本组１ ４６１例接受ＩＶＦ－ＥＴ治疗的不孕症病人，经诊断女方宫腔形态均正常，年龄２２岁～４３岁（３０．８岁±５．５岁），男方年龄２４岁～４７岁（３４．１岁±４．９岁）；不孕年限２年～２１年（９．３年±５．５年）；原发性不孕６５９例，继发性不孕８０２例；不孕原因：输卵管不孕５１６例，排卵障碍２７例，男方因素２１７例，子宫内膜异位４４例，原因不明６２例；双方因素４２５例，多重因素１７０例。随机分为护理干预组７３０例和对照组７３１例，两组病人在性别、不孕年限及不孕因素等方面均无统计学意义（Ｐ＞０．０５），具有可比性。 １．２ 方法 １．２．１ 治疗方法 根据病人个体情况制订治疗方案，本中心常用的方案有：长方案、短方案、微刺激方案、拮抗剂方案及超长方案。实施短方案、微刺激方案、拮抗剂方案的病人于月经周期１ｄ～３ｄ使用降调节药物和促排卵药物；超长方案适合子宫内膜异位症的病人，需要治疗一段时间后才进入试管婴儿周期；实施长方案的病人在其月经周期２０ｄ左右使用降调节的药物，然后于下次月经３ｄ～５ｄ加用促排卵药物，连续使用１０ｄ左右，每次使用的剂量是根据病人的卵巢功能来决定的，待卵泡成熟，加用绒毛膜促性腺激素促卵泡最后成熟，３４ｈ～３６ｈ后经阴道在Ｂ超监测下穿刺取卵。取男方精子做精液优化处理后，与卵子行体外受精，在体外培养４８ｈ～７２ｈ后，再将胚胎植入到母体宫腔内，并于术后２周检查病人妊娠是否成功。 １．２．２ 护理方法 对照组实施常规护理，护理干预组实施整体护理，具体方法有如下。①健康教育：围术期实施一对一的健康教育；每天下午由专人组织病人上课，初期以自愿为原则，以后规定进入周期治疗的病人都必须听课；为进入周期的病人派发一些文字资料，由护理人员交代不同阶段注意事项，态度亲切；教育内容包括不孕症、ＩＶＦ－ＥＴ的相关知识，检查治疗的目的、方法，试管婴儿流程，费用介绍、成功率，手术过程示意，预期结果、注意事项，如何配合治疗等；为病人提供相关报刊、书籍或健康教育手册［３］，同时告知病人可电话咨询任何相关问题。②心理护理：护理人员需重视病人的心理变化情况，主动关心病人，耐心听取病人主诉，并予以适当的心理疏导；耐心告知病人治疗的良好预后，以安抚病人的不良情绪；鼓励病人多与他人交流，以分散注意力。③围术期护理：取卵前要详细告知病人取卵过程及注意事项，包括用药及注射情况、饮食情况、术前排尿及阴道灌洗方法等。态度亲切热情，耐心解答病人疑问，以安抚病人紧张等负面情绪。取卵时，护理人员全程陪同，指导病人正确的体位和减轻疼痛的方法，术前可采用镇痛或麻醉止痛来减轻病人术中的疼痛。取卵后，告知病人手术情况，取卵的数目，有无阴道塞纱，定时为病人测量血压，肌肉注射黄体酮或绒毛膜促性腺激素，并告知下次回院时间及做好胚胎移植的准备。胚胎移植时，嘱咐病人适量饮水至膀胱中度充盈时进行，同样，在移植
细胞的原代培养 点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园 一、原代细胞培养原理 原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。 ? 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养 ? 掌握无菌操作技术 ? 了解小鼠解剖操作技术 ? 了解原代细胞培养的一般方法与步骤 ?了解培养细胞的消化分散 ? 了解倒置显微镜的使用 二、实验材料 ? 实验动物：孕鼠或新生小鼠 ? 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清） 0.25%胰蛋白酶 平衡盐溶液 70%乙醇 ?器材：灭菌镊子、剪刀若干把 灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个 吸管若干支 酒精灯 原代细胞培养方法 三、胰酶消化法 （1）胰酶消化法操作步骤——取材 a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。 c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。 d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。 e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。 f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。 （2）胰酶消化法操作步骤——切割 a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。 b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。 c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。 （3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养 a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 c. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 d. 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。 e. 加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 f. 加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。 e. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。 （4）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养
二、重难点提示 重点：1. 胚胎分割的过程 2. 胚胎干细胞的特点和应用 难点：胚胎干细胞的特点和应用
【随堂练习】 1. 胚胎分割是一种现代生物技术，关于这一技术的叙述正确的是（） A. 胚胎分割可以将早期胚胎任意分割成多份 B. 胚胎分割技术可以获得同卵双胎或多胎 C. 胚胎分割技术属于有性生殖，不属于克隆 D. 胚胎分割技术可以分割任意时期的胚胎 思路分析：在胚胎分割时要将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育，所以不能将早期胚胎任意分割成多份；胚胎分割移植可以看作无性生殖；胚胎分割一般要在桑椹胚或囊胚时期进行。 答案：B 2. 北京市某医院接生了一名婴儿，医院为他保留了脐带血，如果后来他患了胰岛素依赖型糖尿病，就可以通过脐带血中的干细胞为其治疗。关于这个实例说法正确的是（） A. 用干细胞培育出人体需要的器官来治疗疾病，需要激发细胞的所有全能性 B. 用脐带血干细胞能治疗这个孩子的所有疾病 C. 如果要移植用他的干细胞培育出的器官，需要用到细胞培养技术 D. 如果要移植用他的干细胞培养出的器官，应该长期给他使用免疫抑制药物 思路分析：用脐带血干细胞培养出人体需要的器官用来治疗疾病，不需要激发细胞的所有全能性。脐带血干细胞不能治疗所有疾病，如意外伤害、毒药伤害等。脐带血干细胞最大的优点就是自体移植不会有免疫排斥反应，因而不需要给他使用免疫抑制药物。 答案：C 例题1 利用胚胎干细胞治疗肝衰竭，实现此过程的最重要原因是（） A. 细胞生长 B. 细胞特化 C. 细胞分化 D. 细胞增殖 思路分析：胚胎干细胞具有发育的全能性，可以被诱导分化形成新的组织细胞，移植胚胎干细胞可使坏死或退化的部位得以修复并恢复正常功能，因此利用胚胎干细胞治疗肝衰竭主要是利用其分化特性而实现的。 答案：C 例题2 如图为经过体外受精和胚胎分割移植培育优质奶牛的过程，请回答下列问题： （1）A细胞是____________，在进行体外受精前要对精子进行____________处理。 （2）进行胚胎分割时，应选择发育到____________时期的胚胎进行操作。 （3）②指的是____________。 （4）通过胚胎分割产生的两个或多个个体具有相同遗传性状的根本原因是
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/fe17699930.html, 胚胎干细胞的定向诱导分化及应用前景 作者：王士珍李雪甫陈培 来源：《科技视界》2012年第23期 【摘要】胚胎干细胞（embryonic stem cell, ES细胞)主要来自于胚胎发育早期囊胚中内细胞群(inner cell mass, ICM), 具有无限增殖、自我更新和多向分化的特性。理论上可以诱导分化为机体中200多种细胞，可作为细胞移植、组织替代, 甚至器官克隆的细胞供体，为将来治疗人类诸多难治性疾病提供细胞来源。本文简述了胚胎干细胞的诱导分化方法、定向分化的一些细胞种类以及应用前景。 【关键词】胚胎干细胞；诱导；分化 ES细胞是由囊胚的内细胞群或胎儿的原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)经体外抑制分化培养而获得的一种具有多向分化潜能的细胞。英国剑桥大学的Evans等[1]于1981年首次建立了小鼠胚胎干细胞系。Thomson等[2]于1998年利用临床上体外受精的胚胎，采用免疫法分离出内细胞群，首次成功分离出人胚胎干细胞系。同年，Sham blott等[2]以STO作为饲养层首次建立了人胚胎生殖细胞(hEGC)系。一般情况下，可将胚胎干细胞和胚胎生殖细胞统称 为胚胎干细胞。饲养层或白血病抑制因子（LIF）是ES细胞体外培养过程中保持未分化状态的必要条件。当培养条件有轻微改变时，例如在培养液中添加某些诱导分化因子（维甲酸RA、DMSO等），ES细胞就会发生分化；另外，如果把脱离饲养层的ES细胞进行悬浮培养，会发育成大小不一的拟胚体（embryoid boby, EB）,然后可诱导EB向不同类型细胞分化。至今，已从ES细胞诱导分化出心肌细胞、骨细胞、软骨细胞、肝细胞、造血细胞、脂肪细胞、胰岛素细胞、神经细胞、内皮细胞等。这些诱导后的细胞有望为器官移植、损伤器官的修复提供原材料，具有十分广阔的临床应用前景。所以，近年来有关胚胎干细胞的定向分化研究已成为全世界研究的热点。 1诱导ES细胞定向分化的方法 目前，通常针对人们设想要得到的终末靶细胞，而采用不同的诱导分化方法，使ES细胞最终定向分化为目的细胞。最常用的诱导方法一般包括以下四种：化学试剂诱导法、细胞因子诱导法、共培养诱导法以及转基因诱导法等。 1.1化学试剂诱导法 维甲酸（retinoic acid，RA）是体内维生素A的代谢中间产物，主要影响骨的生长和促进上皮细胞增生、分化、角质溶解等代谢作用。Schuldiner等[3]用一定浓度的RA（10-6M）诱导人ES细胞向神经细胞分化。实验证实：产生的神经细胞比未用RA处理的对照组增加了22%。目前，RA诱导ES细胞分化为神经细胞的机制还没有完全弄清楚。一般认为RA进入细胞后，最先与细胞质中维甲酸结合蛋白 (cellular RA binding protein，CRABP)形成复合物，然
简述干细胞的形态特征及其研究进展 干细胞是一类具有自我复制能力的原始的未分化细胞，是形成哺乳类各组织器官的原始的多潜能的细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。干细胞在形态上具有共性，通常呈圆形或椭圆形，细胞体积小，核相对较大，细胞核多为常染色质，并具有较高的端粒酶活性。根据它所处的发育阶段可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。 胚胎干细胞的发育等级较高，是全能干细胞，而成体干细胞的发育等级较低，是多能干细胞或单能干细胞。干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响。目前人类胚胎干细胞已可成功地在体外培养。 干细胞的形态特征： 干细胞具有自我更新复制的能力，能够产生高度分化的功能细胞。 1 胚胎干细胞：胚胎干细胞当受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团的 细胞即为胚胎干细胞。具有全能性，可以自我更新并具有分化为体内所有组织的能力。进一步说，胚胎干细胞是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。 2 成体干细胞：成年动物的许多组织和器官，比如表皮和造血系统，具 有修复和再生的能力。成体干细胞在其中起着关键的作用。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。 3 造血干细胞：造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，它主要存在 于骨髓、外周血、脐带血中。造血干细胞的移植是治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病以及多发性和转移性恶性肿瘤疾病的最有效方法。 4 神经干细胞:理论上讲，任何一种中枢神经系统疾病都可归结为神经 干细胞功能的紊乱。脑和脊髓由于血脑屏障的存在使之在干细胞移植到中枢神经系统后不会产生免疫排斥反应。除此之外，神经干细胞的功能还可延伸到药物检测方面，对判断药物有效性、毒性有一定的作用。 5 肌肉干细胞:可发育分化为成肌细胞，可互相融合成为多核的肌纤维，形成骨骼肌最基本的结构。
胚胎干细胞的定向诱导分化及应用前景 【摘要】胚胎干细胞（embryonic stem cell, ES细胞)主要来自于胚胎发育早期囊胚中内细胞群(inner cell mass, ICM), 具有无限增殖、自我更新和多向分化的特性。理论上可以诱导分化为机体中200多种细胞，可作为细胞移植、组织替代, 甚至器官克隆的细胞供体，为将来治疗人类诸多难治性疾病提供细胞来源。本文简述了胚胎干细胞的诱导分化方法、定向分化的一些细胞种类以及应用前景。 【关键词】胚胎干细胞；诱导；分化 ES细胞是由囊胚的内细胞群或胎儿的原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)经体外抑制分化培养而获得的一种具有多向分化潜能的细胞。英国剑桥大学的Evans等[1]于1981年首次建立了小鼠胚胎干细胞系。Thomson等[2]于1998年利用临床上体外受精的胚胎，采用免疫法分离出内细胞群，首次成功分离出人胚胎干细胞系。同年，Sham blott等[2]以STO作为饲养层首次建立了人胚胎生殖细胞(hEGC)系。一般情况下，可将胚胎干细胞和胚胎生殖细胞统称为胚胎干细胞。饲养层或白血病抑制因子（LIF）是ES细胞体外培养过程中保持未分化状态的必要条件。当培养条件有轻微改变时，例如在培养液中添加某些诱导分化因子（维甲酸RA、DMSO等），ES细胞就会发生分化；另外，如果把脱离饲养层的ES细胞进行悬浮培养，会发育成大小不一的拟胚体（embryoid boby, EB）,然后可诱导EB向不同类型细胞分化。至今，已从ES细胞诱导分化出心肌细胞、骨细胞、软骨细胞、肝细胞、造血细胞、脂肪细胞、胰岛素细胞、神经细胞、内皮细胞等。这些诱导后的细胞有望为器官移植、损伤器官的修复提供原材料，具有十分广阔的临床应用前景。所以，近年来有关胚胎干细胞的定向分化研究已成为全世界研究的热点。 1诱导ES细胞定向分化的方法 目前，通常针对人们设想要得到的终末靶细胞，而采用不同的诱导分化方法，使ES细胞最终定向分化为目的细胞。最常用的诱导方法一般包括以下四种：化学试剂诱导法、细胞因子诱导法、共培养诱导法以及转基因诱导法等。 1.1化学试剂诱导法 维甲酸（retinoic acid，RA）是体内维生素A的代谢中间产物，主要影响骨的生长和促进上皮细胞增生、分化、角质溶解等代谢作用。Schuldiner等[3]用一定浓度的RA（10-6M）诱导人ES细胞向神经细胞分化。实验证实：产生的神经细胞比未用RA处理的对照组增加了22%。目前，RA诱导ES细胞分化为神经细胞的机制还没有完全弄清楚。一般认为RA进入细胞后，最先与细胞质中维甲酸结合蛋白(cellular RA binding protein，CRABP)形成复合物，然后复合物进入细胞核内，与染色质上的受体结合，从而调控一系列基因的表达，使细胞的表型发生转变。二甲基亚砜（DMSO）是一种含硫的有机化合物，不仅能用于细胞的常规冻存，而且还是一种常用的细胞分化诱导剂，能够诱导ES细胞分化为骨骼肌细胞、心肌细胞等，其作用机制主要是影响c-myc基因表达，降低细胞的内源性聚腺苷二磷酸核苷表达水平。也有研究证明，DMSO能使细胞内储存的钙释放出来，而细胞内钙离子浓度升高在诱导细胞分化中可能起着重要作用。除了RA、DMSO外，还有β-磷酸甘油、维生素C(VC)、地塞米松、维生素K3(VK3)以及2，5-羟基维生素D3等化学试剂，也能诱导ES细胞定向分化为特定类型细
胚胎干细胞的起源和同一性 摘要 胚胎干细胞在生物研究方面应用广泛，也作为研究哺乳动物早期发育的模型，但是它们精确的起源却是备受争议。传统上认为它们来源于植入前的胚胎，但这暗示着形成胚胎干细胞的细胞可能已经有发育为原始生殖细胞命运倾向的外胚层细胞产生，它通过原始生殖细胞系形成胚胎干细胞。根据最近的研究发现我们提出胚胎干细胞可以直接来源于早期的外胚层细胞，这些胚胎干细胞可以通过不同培养条件形成的两条不同路径出现。 关键词：细胞，胚胎干细胞，同一性 简介 多能性是小鼠胚胎内细胞团形成外胚层的首要要求。在合适的培养条件下，内细胞团细胞可以在体外以胚胎干细胞的形式增殖。这些细胞保持有重新进入一个胚胎（形成嵌合体）的能力，使这些细胞发育为成体的所有组织，包括生殖细胞系和俗称为幼稚多能细胞。多能干细胞最初来源于小鼠睾丸的畸胎瘤。由于畸胎瘤相对其他组织而言在生殖细胞系中更常见可以推断这些畸胎瘤起源于干细胞；小鼠的睾丸瘤一般在出生后形成；在胎儿的睾丸小管中可以清晰的观察到初期的瘤。随后发现多能性细胞系很难与胚胎干细胞区分开来，这些胚胎干细胞来源于体外发育的小鼠重新编程的胚胎的原始生殖细胞。因此，捕获幼稚多能细胞的机会之窗在发育过程中打开两次：第一次在早期的外胚层而第二次在干细胞系。
胚胎生殖细胞与胚胎干细胞的相似之处强烈暗示着胚胎干细胞可能来源于那些已经有发育为原始生殖细胞倾向的外胚层细胞。也有假说称是原始生殖细胞促进培养植入前和植入后发育阶段的胚胎形成外植体。在这个假说中，我们依据近来的发现猜想胚胎干细胞可能通过两条途径得到外植体：直接来源于新形成的外胚层，它处于幼稚多能状态；或者培养在进行遗传重编程的特定原始生殖细胞，使它们重获多能性（图1）。 图1.幼稚多能细胞来源在一定条件下分离小鼠的胚胎干细胞、胚胎生殖细胞和原始生殖细胞。（A）体内发育过程。在囊胚后期的早期外胚层（红色）出现幼稚多能细胞系和受精后8.5天的原始生殖细胞（黄色）（B）体外培养到囊胚期的另一条产生幼稚多能细胞的途径。红心代表早期外胚层分离胚胎干细胞的路径；黄心代表通过形成原始生殖细胞而发育为胚胎干细胞的较长的路径。灰色箭头代表长期培养可能会得到胚胎干细胞或胚胎生殖细胞的假说。图示大小不代表真实比例。 幼稚多能性的出现 哺乳动物受精后产生一个发育为完整的胚胎的受精卵和形成胚外世系。受精卵经过几轮的卵裂之后产生均等的卵裂球，但是在囊胚
体外受精—胚胎移植及其衍生技术临床操作规程第一节不孕症的诊断 一对夫妇在没有采取避孕措施的情况下，有规律性生活1年而未能自然妊娠，即诊断为不孕症（WHO，1995）。首诊时详细询问并记录患者的不孕时间、既往性生活史、既往妊娠史、既往检查及结果、遗传病史、家族史，了解患者是否可能暴露于毒性物质,夫妇双方有无酗酒、吸烟、非处方镇静剂的使用、吸毒等，详细询问可能影响生育能力的疾病史，包括糖尿病、内分泌疾病、自身免疫性疾病，了解月经周期、经量、经期、是否痛经等，询问患者性生活的频率,了解有无性功能障碍，并根据情况建议不孕症夫妇接受以下检查,以明确不孕症病因。 1、女方因素 （1）月经第2~5天，抽血检查性激素水平：FSH、LH、E2、PRL、T。 （2）月经干净3~7天，输卵管碘油造影检查或腹腔镜检查。 （3）阴道B超自然周期排卵监测，至卵泡破裂。 （4）黄体中期（监测排卵后1周）抽血检查孕激素水平。 （5）必要时宫腔镜检查了解子宫腔内病变。 （6）抗精子抗体。 2、男方因素 （1）精液常规分析，结果异常需复查1~2次 （2）按Kruger严格形态标准进行精子形态分析 （3）连续3次精液离心检查均未发现精子者建议行以下检查： 经直肠精囊、前列腺彩超（TURS） 染色体核型分析 性激素：FSH LH T PRL E2 睾丸/附睾穿刺，了解睾丸/附睾中是否有成熟活动精子 （4）抗精子抗体
第二节体外受精与胚胎移植的适应症与禁忌症 一、体外受精与胚胎移植的适应症： 1、女方各种因素导致的配子运输障碍。 2、排卵障碍。 3、子宫内膜异位症。 4、男方少、弱精子症。 5、不明原因的不育。 6、免疫性不孕。 二、体外受精与胚胎移植禁忌症： （1）如有下列情况之一者，不得实施体外受精-胚胎移植及其衍生技术 ①男女任何一方患有严重的精神疾患、泌尿生殖系统急性感染、性传播疾病； ②患有《母婴保健法》规定的不宜生育的、目前无法进行胚胎植入前遗传学诊断的遗传性疾病； ③任何一方具有吸毒等严重不良嗜好； ④任何一方接触致畸量射线、毒物、药物并处于作用期； （2）女方子宫不具备妊娠功能或严重躯体疾病不能承受妊娠。 第三节体外受精与胚胎移植助孕前常规检查 1、全身体格检查：血压、脉搏、身高、体重（BMI）、皮肤粘膜、心脏、肺脏、乳房、肝脏、脾脏、肾脏、脊柱、四肢等。 2、女性生殖系统检查：有无生殖道畸形、分泌物异常，宫颈有无糜烂，子宫大小、质地、位置、活动度，附件有无包块及其大小。 3、实验室检查： 女方检查项目男方检查项目 血常规血型（ABO Rh）尿常规血型（ABO Rh） 白带常规细胞涂片或阴道镜精液常规 支原体衣原体淋球菌支原体衣原体淋球菌
第二节胚胎干细胞的研究及其应用 学习目标 1.理解干细胞的概念与分类。 2.掌握胚胎干细胞来源、特点及分离途径与方法。 3.举例说明胚胎干细胞的应用。 4.了解胚胎干细胞的研究进展及其所面临的各种挑战。 学习重、难点 学习重点 1.理解干细胞的概念。 2.简述胚胎干细胞的特点及其研究进展。 学习难点 简述胚胎干细胞的特点及其研究进展。 知识要点梳理 一、胚胎干细胞及其研究进展 1.干细胞的概念：是动物（包括人）胚胎及某些器官中具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞。 2.干细胞作用：具有重建、修复病损或衰老组织、器官功能。 3.干细胞分类 （1）专能干细胞：只能分化成一种类型或功能密切相关的两种类型的细胞，如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌细胞。（2）多能干细胞：具有分化成多种细胞或组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，如造血干细胞等。（3）全能干细胞：可以分化为全身的多种细胞，并进一步形成机体的所有组织、器官。 二、胚胎干细胞的应用 1.如果科学家最终能够成功诱导和调控胚胎干细胞的分化与增殖，将会给胚胎干细胞的基础研究和临床应用带来积极的影响。 2.在研究新药对各种细胞的药理和毒理试验中，提供了材料，大大减少了新药研究所需动物的数量，从而降低了成本。 3.胚胎干细胞研究为细胞或组织移植提供无免疫原性的材料，用于疾病治疗等，给人类带来全新的医疗手段。
4.通过胚胎干细胞，结合基因工程等还可以在试管中改良并创造动物新品种，培育出生长快、抗病力强、高产的家畜品种等。 三、胚胎干细胞研究面临的挑战 1.胚胎干细胞的应用给法律、伦理、国家和社会安全带来的冲击是空前的。 2.胚胎干细胞在体内或者是体外都具有自我分化的潜能，极易分化成其他细胞，对培养条件的优化仍需要进一步研究。 3.对胚胎干细胞向不同组织细胞定向分化的条件还不清楚。 4.创造一种“万能供者”细胞，需要破坏或改变细胞中的许多基因，其可行性仍不清楚。