第37卷第1期 2007年2月
工业微生物
Industrial Microbiology
Vol.37No.1
Feb.2007
基金项目:厦门市科技计划资助项目(编号:3502Z20031079);作者简介:王颖(1983～),女,硕士研究生;
3通讯作者。Tel :86-592-2183088;Fax :86-592-2184822;E 2mail :ylu @https://www.doczj.com/doc/fe11770985.html,
酿酒酵母S.cerevisiae 高密度培养条件优化研究
王 颖, 何 宁, 李清彪, 邓 旭, 卢英华3
(厦门大学化学工程与生物工程系,厦门361005)
摘 要 考察了培养基组成和培养条件对酿酒酵母S accharom yces cerevisiae 发酵的影响。以TB 培养基为初始培养基,通过正交实验设计优化培养基组成,确定了影响酵母细胞产量最主要的
因素是葡萄糖,最适培养基组成为:酪蛋白胨15g/L ,酵母粉25g/L ,葡萄糖30g/L ,KH 2PO 42.4g/L ,K 2HPO 4?3H 2O 16.34g/L 。并确定了最佳培养条件:温度30℃,转速150r/min 。采用优化
培养基及培养条件下进行发酵,菌液最高OD 600值和细胞密度分别达15.82和2.03×108/mL ,比优化前分别提高24.2%和22.0%。
关键词:酿酒酵母; 培养基; 培养条件; 正交实验 近代基因技术的进步使人们可以利用微生物大量生产高价值的生物药物及其它重组蛋白。发酵产物的多少通常与细胞密度的高低关联,因此发酵过程的首要任务通常是研究如何尽可能地达到高的细胞密度,以便提高生产率、简化下游加工、减少废水排放量、降低培养容积、生产成本及设备投资,使目的产物产生良好的成本效益[1]。
优化培养基是一种提高细胞密度的有效方法。培养基分复合培养基、半合成培养基和合成培养基三种[2]。合成培养基成分和浓度已知且可以控制,常用来获得高细胞密度;复合培养基含有提取物(如蛋白胨,酵母提取物),营养物的成分和质量可能不同,故复合培养基进行发酵过程的重复性较差。然而,复合培养基和半合成培基对促进产物生成是必要的,而且在复合培养基和半合成培基中,细胞生长往往比在合成培基中快[3]。为使细胞生长达到高密度,有必要设计一种含必需成分的平衡性营养培养基,以维持细胞生长,同时避免生长的抑制。 酿酒酵母(S accharom yces cerevisiae )作为人类利用最早的微生物,其营养成分十分丰富,含有菌体蛋白质、多种氨基酸、维生素、脂肪、食物纤维、矿物元素、微量元素及生理活性物质等[4]。由于其具有
安全、生长繁殖快、代谢周期短、容易进行大规模培养、菌体蛋白质丰富等优点,一直是基础和应用研究的主要对象,并被广泛应用于酿造、食品、医药、饲料工业等领域[5]。近年来,世界各国均在积极采用微生物发酵技术开发酵母菌市场。此外,酿酒酵母还是外源基因理想的真核生物表达系统,并与盘基网柄菌 D.discoi deum 一起,于2000年被N IH 选为
标准微生物模型系统(http ://https://www.doczj.com/doc/fe11770985.html,/sci 2ence/)。
国内外对酿酒酵母菌培养的实验研究已有了较多的报道。Raj 等采用合成培养基,可获得140g/L 的细胞干重[6]。Park 等在内置膜过滤反应器内连续培养酿酒酵母,得到13g/(L ?h )的细胞干重[7]。赵宝华等探讨了外加Ca 2+、La 3+对酿酒酵母生长的影响[8]。梅乐和等研究了酿酒酵母微囊化培养过程[9]。此外,也有不少研究集中在基因工程和固定化技术于酿酒酵母生产中的应用[10～12]。本文以TB 培养基(一种培养大肠杆菌的简单复合培养基)为基础,考察了培养基成分和浓度,以及培养条件等对酿酒酵母发酵培养的影响,并利用正交实验对培养基进行了优化,开发出了一个适合高密度培养酿酒酵母菌的简单复合培养基。
1 材料和方法
1.1 菌种
酿酒酵母(S accharom yces cerevisiae),由厦门大学生物系提供。
1.2 主要试剂
酪蛋白胨(北京陆桥技术有限责任公司产品),酵母粉(英国OXO ID公司产品),葡萄糖(上海化学试剂站分装厂产品),甘油(中国医药(集团)上海化学试剂公司产品),磷酸二氢钾(上海试剂二厂产品),磷酸氢二钾(汕头市西陇化工厂产品)。
1.3 TB培养基
于800mL蒸馏水中加入酪蛋白胨12g,酵母粉24g,甘油4g;100mL蒸馏水中加入葡萄糖20 g。100mL蒸馏水中加入KH2PO42.4g,K2HPO4?3H2O16.34g。
上述三部分各自溶解,121℃蒸汽灭菌20min,冷却后混合。该培养基作为种子培养基和正交实验优化设计的初始培养基。
1.4 培养方法
1.4.1 摇瓶种子培养
从冷冻甘油管中接种酵母细胞至装有30mL TB培养基的250mL三角瓶中培养,摇瓶转速为200r/min,温度为28℃,培养时间为30h。
1.4.2 摇瓶发酵培养
将上述种子液接入50mL/250mL锥形瓶中,控制接种量使得菌液初始细胞密度为4～6×105/ mL。摇床(28℃、150r/min)培养,每隔3至4h取样测定。
1.4.3 发酵罐分批培养
发酵罐分批培养在美国Cole2Parmer Instru2 ment Company生产的3L发酵罐中进行。在发酵罐中装入2L优化后培养基,接入种子液,控制接种量使得菌液初始细胞密度为4～6×105/mL。温度通过循环水浴控制在30℃,p H值通过自动流加1 mol/L NaOH或5%H3PO4溶液控制p H在7.5。通气速率为2L/(L?min)。搅拌转速为200r/min,当溶氧降至20%以下时,提高搅拌转速以使溶氧恢复至20%。
1.5 正交实验设计
培养基中酪蛋白胨、酵母粉、甘油以及葡萄糖4个因素的浓度对酿酒酵母生长的影响可以利用正交实验进行优化。每个因素取3个水平,采用的四因素三水平正交实验见表1。在28℃,150r/min条件下培养,测定菌液的最大OD600值。
表1 培养基正交实验因素及水平表
水平
Level
A
酪蛋白胨(g/L)
B
酵母粉(g/L)
C
甘油(g/L)
D
葡萄糖(g/L)
151500
21020210
31525420
1.6 分析方法
(1)比浊法测定菌液浓度:将培养液直接或做适
当稀释后,用722型分光光度计(厦门分析仪器厂)
以超纯水为参照测定菌液的吸光度OD600值。
(2)血球计数法测定细胞密度:培养液经适当稀
释,吸取经过适当稀释后的菌悬液,滴至血球计数
板,在显微镜下直接计数。
2 结果与讨论
2.1 发酵培养基的优化实验
通过正交实验对培养基配方进行优化,实验结
果及其极差分析见表2。
表2 正交实验结果及其极差分析
实验号A B C D OD600 11111 1.62
212227.28
313338.92
4212310.30
52231 4.32
6231210.32
7313211.22
8321312.60
93321 5.20
M117.8223.1424.5611.16
M224.9624.1922.8028.84
M329.0624.4924.4631.82
m1 5.947.718.19 3.72
m28.328.067.609.61
m29.688.168.1610.61
R 3.740.440.58 6.89
从表2的实验结果中可看出,在9次实验中以
第8号实验的OD600值最大,高达12.60,相应的水
平组合A3B2C1D3是当前最好的水平搭配。
从表2的极差分析及图1中可以看出,四个因
第1期王 颖,等:酿酒酵母S.cerevisiae高密度培养条件优化研究第37卷
素对酿酒酵母菌生长的影响顺序为葡萄糖>酪蛋白胨>甘油>酵母粉。由趋势图选择四个因素的最佳浓度:(1)酪蛋白胨(因素A )对酵母菌生长有较大的影响,其浓度越高,菌液的OD 600值也越高,故选取最高水平15g/L 。(2)酵母粉(因素B )对酵母菌生长无显著的影响,为降低成本选取最低水平,即酵母粉的加入量为15g/L 。(3)甘油(因素C )对酵母菌生长有一定的影响。由因素水平表和趋势图可以看出,培养基中不添加甘油,菌液的浓度反而更高,说明甘油不是该菌株的合适碳源,而葡萄糖作为碳源已能满足该菌株的生长需求。故甘油加入量选取最低水平0g/L ,即不加甘油。(4)葡萄糖(因素D )对酵母菌生长有显著的影响,葡萄糖浓度的增加使菌液的最大OD 600值明显增大,这主要是由于酵母以糖类物质为能源和碳源,供生命活动所需[13],因此培养基中葡萄糖的浓度是非常关键的因素,适当增加葡萄糖浓度将非常有利细胞的生长。所以选取最高水平20g/L
。
图1 菌液最大OD 600值与四个因素的关系 上述分析表明最佳培养基配方可能为A 3B 1C 1D 3。此组合不在上述9个实验组合中,因此
需和实验得出的最优组合A 3B 2C 1D 3进行比较。在28℃,150r/min 下,用A 3B 2C 1D 3和A 3B 1C 1D 3两个
培养基配方培养酿酒酵母,菌液的最大OD 600值分别为12.44和12.18,两者相差不大。从节约成本的角度考虑,选取培养基浓度较低的组合A 3B 1C 1D 3为较优组合。此外,因为葡萄糖是影响酵母生长的最主要因素,而由实验获得的优化条件中葡萄糖浓度是三个水平中的最高水平,为了全面了解其影响,需对更高葡萄糖浓度下发酵过程进行研究。因此通
过追加实验进一步探索葡萄糖浓度更高的情况,以确定最佳培养基组成。
2.2 增加葡萄糖浓度对细胞密度的影响
考察更高葡萄糖浓度下的酿酒酵母发酵过程。选取20g/L 、30g/L 、40g/L 、50g/L 四个葡萄糖浓度,其它组分浓度均采用上文确定的最佳浓度,在28℃,150r/min 下培养,测定菌液的最大OD 600值
及细胞密度,实验结果如图2所示
。
图2 葡萄糖浓度对酵母菌生长的影响 从图2可以看出,随着葡萄糖浓度的升高,酵母菌液的OD 600值和细胞密度均上升。但有实验证明当葡萄糖浓度大于50g/L 时,对酵母的发酵都有抑制作用[14]。还可看出,葡萄糖加入量在30g/L 以上时,菌液的OD 600值和细胞密度的提高幅度已经趋于平缓。因此,选取葡萄糖的加入量为30g/L 。 综合考虑培养基成本及多因素对酿酒酵母发酵
的影响,得到酿酒酵母S.cerevisiae 的最优培养基为:酪蛋白胨15g/L ,酵母粉15g/L ,葡萄糖30g/L ,KH 2PO 42.4g/L ,K 2HPO 4?3H 2O 16.34g/L 。2.3 转速对酿酒酵母生长的影响
设定摇床转速为100、150和200r/min ,考察不同转速对酿酒酵母发酵过程的影响。采用优化后的培养基,在28℃下培养,于不同发酵时间取样测细胞密度,绘制菌体生长曲线,如图3所示。 由图3可看出,转速为100r/min 时,酵母生长较快,发酵时间较短,可以在20h 结束发酵,但菌液的最大浓度较低,细菌数较少;转速为200r/min 时,酵母生长相对较慢,生长后期菌数较多,但发酵时间过长。只有转速为150r/min 时,既使酵母较
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工 业 微 生 物
第37卷
图3 不同转速下的酿酒酵母生长曲线快生长,又能得到较高的菌浓度。2.4 温度对酿酒酵母生长的影响
采用优化的培养基配方,转速150r/min ,分别在25℃、30℃、35℃、40℃摇床培养。不同发酵时间取样测细胞密度,绘制菌体生长曲线,如图
4所示。
图4 不同温度下的酿酒酵母生长曲线 30℃和35℃酵母生长较快,进入生长稳定期的时间明显短,稳定期的菌液浓度高;25℃能达到较高的菌液浓度,但生长速度慢,发酵时间长,大约需要60h 才进入稳定期;如果温度过高,在40℃时酵母的生长速度与稳定期菌液浓度都明显下降。在30或35℃,酵母的生长速度和菌体浓度均达到较
佳水平,但35℃比30℃的经济成本更高,于生产不利。综合考虑后,选择30℃作为酵母的最适培养温度。
2.5 优化前后培养效果对比
通过上述优化实验,得到了酿酒酵母S.cere 2
visiae 的最适培养基配方(表3)及最佳培养条件。
在优化的发酵条件下,酿酒酵母的增产效果显著(表4)。在摇瓶培养中,其稳定期菌液的OD 600值和细
胞密度分别高达14.81和2.03×108/mL ,比优化前分别提高了24.2%和22.0%。
表3 优化前后培养基及培养条件的对比
培养条件酪蛋白胨g/L 酵母粉g/L 葡萄糖
g/L 缓冲液
g/L
温度℃转速
r/min
优化前122420KH 2PO 4 2.428150优化后
15
25
30
K 2HPO 4?3H 2O 16.34
30
150
表4 优化前后培养效果对比
培养效果OD 600细胞密度/mL -1
优化前
11.92 1.66×108优化后14.81 2.02×108提高幅度
24.2%
22.0%
2.6 发酵罐分批培养
图5 3L 自动发酵罐分批培养酿酒酵母的细
胞密度、OD 600、葡萄糖浓度变化曲线
利用优化培养基,在3L 发酵罐上培养酿酒酵母,结果见图5。在发酵罐中,酿酒酵母的生长速度较快,6h 进入对数生长期,20h 就达稳定期,最大细胞密度为1.88×108/mL ,最大光密度OD 600达到了16.71。葡萄糖的变化趋势与菌液浓度相对应,从20h 开始,葡萄糖浓度已降至1.0g/L 以下,此后酵母细
胞已不能利用葡萄糖。由图中还可以看到在葡萄糖被耗尽后,酵母菌也随之停止生长,但在经过短暂的停滞平台后,又继续生长,其整个过程表现为二阶段生长曲线。第一阶段是利用葡萄糖的发酵性生长期,葡萄糖消耗完之后,酵母利用发酵形成的乙醇为碳源,进入氧化性生长期的第二阶段。在稳定期,酵母
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王 颖,等:酿酒酵母S.cerevisiae 高密度培养条件优化研究
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细胞合成利用乙醇进行有氧代谢所需要的酶类[13]。 由实验结果可看出,葡萄糖在较短的时间内便被耗尽,此后细胞因缺乏碳源而生长抑制。若单纯提高初始葡萄糖浓度则会产生葡萄糖效应(Crabtree 效应),导致乙醇堆积,抑制细胞生长。可采用流加葡萄糖的方式,这样不仅可以防止葡萄糖浓度积累到毒性水平,也不会使细胞处于饥饿状态。此外,如能提供良好的氧环境使其进入有氧代谢,也能产生较快的比生长速率,所得到的酵母产量会比较高
[13]
。常用的方法是提高通气量和搅拌速度
[14]
。
3 结论
在摇瓶培养中考察了培养基组成,培养条件对酿酒酵母S.cerevisiae 发酵的影响。结果表明,最适培养基组成为:酪蛋白胨15g/L ,酵母粉25g/L ,葡萄糖30g/L ,KH 2PO 42.4g/L ,K 2HPO 4?3H 2O 16.34g/L 。
最佳培养条件为转速150r/min ,温度30℃。采用优化后的培养基及培养条件,菌液的OD 600值和细胞密度分别比优化前提高了24.2%和22.0%。
参考
文
献
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Optimization of high cell density cultivation conditions
of Saccha romyces cerevisiae
WAN G Y ing ,HE Ning ,L I Qing 2biao ,DEN G Xu ,LU Y ing 2hua
(Department of Chemical and Biochemical Engineering ,Xiamen University ,Xiamen 361005)
Abstract The effects of medium compositions and culture conditions on the growth of S accharomyces cerevisiae were investigated.Based on the TB medium ,medium com ponents were optimized by means of orthogonal experiments ,and the results showed that the m ost im portant component influencing the cell density was glucose ,and the optimized medium per liter containing 15g casein peptone ,25g yeast extract ,30g glucose ,2.4g KH 2PO 4,and 16.34g K 2HPO 4?3H 2O.Cultured at 30
℃,150r/min ,the maximum optical density at 600nm (OD 600)and the cell density could reach 15.82and 2.023×108/mL ,
which were increased by 24.2%and 22.0%com pared with that of the control ,res pectively.
K ey w ords S accharomyces cerevisiae ;high cell density cultivation ;medium ;culture conditions ;orthogonal experiment
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酵母菌的培养和观察 目的认识酵母菌的形态特征，了解培养酵母菌的方法。 实验前的思考人类认识和利用酵母菌的历史悠久，早在史前时期，先人们就学会酿酒。约在6000年前，就发明发面的方法。直到十九世纪有了显微镜，人们才窥探到醉母菌的真面目。对酵母菌做纯系培养分类研究的是与巴斯德同时代的丹麦人汉斯，他是为寻求酿造高品质啤酒的途径才去深入研究酵母菌的。 材料器具甜酒酿汁液，新鲜酵母，豆芽；显微镜，载玻片，盖玻皮，玻璃棒，镊子，滴管，吸水纸，酒精灯，石棉网，火柴，漏斗架，玻璃斗，量杯，三角烧瓶，烧杯，天平，量筒，棉絮；蔗糖，乳酸，碘液。 步骤 1．观察酵母菌 （1）用滴管从甜酒酿的汁液中吸取一滴汁液，滴在载玻片上，用针摊开，盖上盖玻片，在低倍镜下就能清楚地看到甜酒酿的汁液中悬浮着无数酵母菌。再换高倍镜仔细观察一个酵母菌，可以看到酵母菌是椭圆形的单个细胞，细胞中有许多小颗粒，也有几个大的液泡（图示）。有的酵母菌的一端长出大小不同的突起，这是酵母菌的芽体。芽体成长脱落，就成为新的个体，有的芽体在从母体脱落前又长出突起。这种繁殖方法叫出芽繁殖。 （2）在盖玻片一边加一滴碘液，从另一边用吸水纸把染液引入盖玻片下。不久就能看到被染成棕褐色的细胞核和变成蓝紫色的淀粉粒。 2．培养酵母菌 （1）用蔗糖液培养在盛有100毫升的三角烧瓶里加5克蔗糖，煮沸。等到溶液稍稍冷却，加一小块鲜酵母，用玻璃棒搅拌均匀；再用棉絮塞紧瓶口。然后把烧瓶放在25～30℃的温暖地方，数小时后就可见到溶液里有气泡产生，并散发出酒味。这是因为酵母菌正在把糖分解成乙醇和二氧化碳。 （2）二三天后吸取溶液在显微镜下观察，就可看到已培养出大量酵母菌。
146种培养基配方 ——2009年2月1日星期日by尛森蟲1. Acetobacter Medium (醋酸菌培养基) Glucose (葡萄糖) 100g Yeasst extract (酵母膏) 10g CaCO3 20g Agar (琼脂) 15g Distilled water (蒸馏水) 1000ml Adjust (调) pH to 6.8 适用范围：恶臭醋酸杆菌混浊变种 2. Nutrient Agar (营养肉汁琼脂) Pepton (蛋白胨) 5g Beef extract (牛肉膏) 30g NaCl 5g Agar (琼脂) 15g Distilled water (蒸馏水) Adjust (调) pH to 7.0-7.2 [Note]：When cultivation of Bacillus，5mg of to MnSO4.H2O may be added . It is favorable to promote spore formation . 适用范围：产气气杆菌、粪产碱杆菌、蜡状芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌蕈状变种、地衣形芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、尘埃芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌深黑变种、苏云金芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种(青虫菌)、苏云金芽孢杆菌戈尔斯德变种、苏云金芽孢杆菌猝倒亚种、产氨短杆菌、黄色短杆菌、谷氨酸棒状杆菌、北京棒杆菌、大肠埃希氏菌(大肠杆菌)、铜绿假单胞菌(绿脓杆菌)、凸形假单胞杆菌、荧光假单胞菌、弯曲假单胞菌、恶臭假单胞菌、假单胞杆菌、藤黄八叠球菌、亚黄八叠球菌、尿素八叠球菌、金黄色葡萄球菌、运动发酵单孢菌 3. Azotobacter Medium (固氮菌培养基) KH2PO4 0.2g K2HPO4 0.8g MgSO4.7H2O 0.2g CaSO4.2H2O0.1ｇ Na2MoO4.2H2O Trace(微量) Yeast axtract(酵母膏) 0.5g Mannitol(甘露醇) 20g FeCl3 Tract(微量) Distilled water (蒸馏水) 1000ml Agar (琼脂) 15g Adjust (调) pH to 7.2 适用范围：固氮菌、胶质芽孢杆菌 4. Corn Meal Medium (玉米粉培养基) Maize flour (玉米粉) 5g Peptone (蛋白胨) 0.1g Glucose (葡萄糖) 1g Tap water (自来水) 1000ml [Note]:Boil the mixture in autoclave at 121℃for 1 hr. distribute the medium into 18ⅹ18 mm tubes , each contains 10 ml of the li quid , then autoclave at 121℃for 1 hr . again (15磅蒸煮1小时,分装入18ⅹ18毫米试管,每管深度达6厘米。15磅再次灭菌15小时。) 5. Lactic-bacteria Medium I (乳酸菌培养基I ) Yeast extract (酵母膏) 7.5g Peptone (蛋白胨) 7.5g Glucose (葡萄糖) 10g KH2PO4 2g Tomato juice (西红柿汁) 100ml Tween (吐温) 80 0.5ml Distilled water (蒸馏水) 900ml pH 7.0 适用范围：植物乳杆菌(胚芽乳杆菌)、嗜热乳酸链球菌 6. Lactic-bacteria Midium Ⅱ(乳酸菌培养基Ⅱ) Lacto-casein peptone (乳酪蛋白胨) 10g Beef extract (蛋白胨) 10g Yeast extract (酵母膏) 5g Glucose (葡萄糖) 5g Tween (吐温) 80 1g K2HPO4 2g Na-acetate (醋酸钠) 5g Diamine citrate (柠檬酸二胺) 2g MgSO4.7H2O 0.2g MnSO4.H2O 0.05g Distilled water (蒸馏水) 1000m pH 6.5-6.8 适用范围：植物乳杆菌(胚芽乳杆菌) 7. Peotone Glucose Yeast extract Medium PGY (蛋白胨、酵母膏、葡萄糖培养基)
常用抗生素 氨苄青霉素（ampicillin）（100mg/ml） 溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 羧苄青霉素（carbenicillin）（50mg/ml） 溶解0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 甲氧西林（methicillin）（100mg/ml） 溶解1g甲氧西林钠于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以37.5ug/ml终浓度与100ug/ml氨苄青霉素一起添加于生长培养基。 卡那霉素（kanamycin）（10mg/ml） 溶解100mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 氯霉素（chloramphenicol）（25mg/ml） 溶解250mg氯霉素足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以12.5ug/ml～25ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 链霉素（streptomycin）（50mg/ml） 溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 萘啶酮酸（nalidixic acid）（5mg/ml） 溶解50mg萘啶酮酸钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以15ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 四环素（tetracyyline）（10mg/ml） 溶解100mg四环素盐酸盐于足量的水中，或者将无碱的四环素溶于无水乙醇，定容至10ml。分装成小份用铝箔包裹装液管以免溶液见光，于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 常用培养基 LB培养基 将下列组分溶解在0.9L水中： 蛋白胨10g 酵母提取物5g 氯化钠10g 如果需要用1N NaOH（～1ml）调整pH至7.0，再补足水至1L。注：琼脂平板需添加琼脂粉12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉7g/L。(实验室一般都不调PH) SOB培养基 将下列组分溶解在0.9L水中： 蛋白胨20g 酵母提取物5g 氯化钠0.5g 1 mol/L 氯化钾2.5ml
毕赤酵母表达的培养基配制［5］ 2.1 LB（Luria－Bertani）培养基： Trypton l％ Y east Extract 0.5％ NaCl l％ PH 7.0 制作平板时加入2％琼脂粉。121℃高压灭菌20min。可于室温保存。用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / ml。 2.2 LLB（Low Salt LB）培养基： Trypton l％ Y east Extract 0.5％ NaCl 0.5％ PH 7.0 制作平板时加入2％琼脂粉。121℃高压灭菌20min。可于室温保存数月。用于培养pPICZαA 原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2周。 2.3 YPD （又称YEPD） Y east Extract Peptone Dextrose Medium，（Y east Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基） Trypton 2% dextrose (glucose) 2% +agar 2% +Zeocin 100 μg/ml 液体YPD培养基可常温保存；琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。加入Zeocin 100ug / ml，成为YPDZ培养基，可以4℃条件下保存1～2周。 2.4 YPDS + Zeocin 培养基（Y east Extract Peptone Dextrose Medium）： yeast extract 1% peptone 2% dextrose (glucose) 2% sorbitol （山梨醇）1 M +agar 2% + Zeocin 100 μg/ml 不管是液体YPDS培养基，还是YPDS + Zeocin 培养基，都必须存放4℃条件下，有效期1～2周。 2.5 MGY Minimal Glycerol Medium （最小甘油培养基） （34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素）。将800ml灭菌水、100ml的10*YNB母液、2ml 的500*B母液和100ml的10*GY母液混匀即可，4℃保存，保存期为2个月。 2.6 MGYH Minimal Glycerol Medium + Histidine （最小甘油培养基+ 0.004%组氨酸） 在1000ml的MGY培养基中加入10ml的100*H母液混匀，4℃保存，保存期为2个月。2.7 RD Regeneration Dextrose Medium （葡萄糖再生培养基） （含有：1mol/L的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10-5%生物素；0.005%氨基酸） 1. 将186g的山梨醇定容至700ml，高压灭菌；
酵母菌、霉菌常用培养基得配制 一、目得要求 了解合成培养基、半合成培养基与天然培养基得配制原理、学习与掌握麦芽汁培养基、马铃薯葡萄糖培养基、豆芽汁葡萄糖培养基与察氏培养基得配制方法。 二、基本原理 麦芽汁培养基与马铃薯葡萄糖培养基被广泛用于培养酵母菌与霉菌。马铃薯葡萄糖培养基有时也可用于培养放线菌。豆芽汁葡萄糖培养基也就是培养酵母菌及霉菌得一种优良培养基。察氏培养基主要用于培养霉菌观察形态用。麦芽汁培养基为天然培养基,马铃薯葡萄糖培养基与豆芽汁葡萄糖培养基二者均为半合成培养基,而察氏培养基则为合成培养基。培养基配方中出现得自然pH系指培养基不经酸、碱调节而自然呈现得ｐH。 三、实验材料 (一)药品 葡萄搪、蔗糖、NaN03、K2HＰ０4、KCl、ＭｇSO4·７H2O,ＦｅＳ04、琼脂。(二)仪器 天平、高压蒸汽灭菌锅。 (三)玻璃器皿 移液管、试管、锥形瓶、烧杯、量筒、培养皿、玻璃漏斗等。 (四)其她物品 药匙、ｐH试纸、称量纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管盖、牛皮纸、报纸、新鲜麦芽汁、黄豆芽、马铃薯等。 四、实验内容 (一)麦芽汁培养基得配制 １、培养基成分 新鲜麦芽汁一般为1０—15波林、 2.配制方法
(1)用水将大麦或小麦洗净,用水浸泡６—1２h,置于15℃阴凉处发芽,上盖纱布,每日早、中、晚淋水一次,待麦芽伸长至麦粒得两倍时,让其停止发芽,晒干或烘干,研磨成麦芽粉,贮存备用。 (２)取一份麦芽粉加四份水,在６5℃水浴锅中保温3-4h,使其自行糖化,直至糖化完全(检查方法就是取0。5mｌ得糖化液,加２滴碘液,如无蓝色出现,即表示糖化完全)。 (3)糖化液用4-6层纱布过滤,滤液如仍混浊,可用鸡蛋清澄清(用一个鸡蛋清,加水20m1,调匀至生泡沫,倒入糖化液中,搅拌煮沸,再过滤)、 (4)用波美比重计检测糖化液中糖浓度,将滤液用水稀释到１0—15波林,调ｐH 至6、4。如当地有啤酒厂,可用未经发酵,未加酒花得新鲜麦芽汁,加水稀释到1０—1５波林后使用。 (5)如配固体麦芽汁培养基时,加入2%琼脂,加热融化,补充失水。 (６)分装、加塞、包扎、 (7)高压蒸汽灭菌100 Pa灭菌20 ｍｉｎ。 (二)马铃薯葡萄糖培养基得配制 1、培养基成分 马铃薯20ｇ 葡萄糖 2 g 琼脂1、5—２g 水100mｌ自然ｐH 2.配制方法 (1)配制２0％马铃薯浸汁取去皮马铃薯200g,切成小块,加水１000m１。80℃浸泡lh,用纱布过滤,然后补足失水至所需体积、10０Pａ灭菌２0 min。即成20％马铃薯浸汁,贮存备用、
酵母菌的培养技术 一.酵母菌的培养基的配方 1.麦芽汁培养基的配制 培养基成分:新鲜麦芽汁一般为10-15波林。 配制方法:(1)用水将大麦或小麦洗净，用水浸泡6-12h，置于15℃阴凉处发芽，上盖纱布，每日早、中、晚淋水一次，待麦芽伸长至麦粒的两倍时，让其停止发芽，晒干或烘干，研磨成麦芽粉，贮存备用。 (2)取一份麦芽粉加四份水，在65℃水浴锅中保温3-4h，使其自行糖化，直至糖化完全(检查方法是取0.5ml的糖化液，加2滴碘液，如无蓝色出现，即表示糖化完全) (3) 糖化液用4-6层纱布过滤，滤液如仍混浊，可用鸡蛋清澄清(用一个鸡蛋清，加水20 m1，调匀至生泡沫，倒入糖化液中，搅拌煮沸，再过滤)。 (4)用波美比重计检测糖化液中糖浓度，将滤液用水稀释到10-15波林，调pH至6.4。如当地有啤酒厂，可用未经发酵，未加酒花的新鲜麦芽汁，加水稀释到10-15波林后使用。 (5)如配固体麦芽汁培养基时，加入2％琼脂，加热融化，补充失水。 (6)分装、加塞、包扎。 (7)高压蒸汽灭菌100 Pa灭菌20 min。 2.马铃薯葡萄糖培养基的配制 培养基成分:马铃薯20g 葡萄糖2 g 琼脂1.5-2g 水100ml 自然pH 配制方法:(1)配制20％马铃薯浸汁取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000m1。80℃浸泡lh用纱布过滤，然后补足失水至所需体积。100 Pa灭菌20 min。即成20％马铃薯浸汁，贮存备用。 （2)配制时，按每100 m1马铃薯浸汁加入2g葡萄糖，加热煮沸后加入2g琼脂，继续加热融化并补足失水。 (3)分装、加塞、包扎。 (4)高压蒸汽灭菌100 Pa灭菌20 min。 3.豆芽汁葡萄糖培养基的配制
酵母菌、霉菌常用培养基的配制 一、目的要求 了解合成培养基、半合成培养基和天然培养基的配制原理。 学习和掌握麦芽汁培养基、马铃薯葡萄糖培养基、豆芽汁葡萄糖培养基和察氏培养基的配制方法。 二、基本原理 麦芽汁培养基和马铃薯葡萄糖培养基被广泛用于培养酵母菌和霉菌。马铃薯葡萄糖培养基有时也可用于培养放线菌。豆芽汁葡萄糖培养基也是培养酵母菌及霉菌的一种优良培养基。察氏培养基主要用于培养霉菌观察形态用。麦芽汁培养基为天然培养基，马铃薯葡萄糖培养基和豆芽汁葡萄糖培养基二者均为半合成培养基，而察氏培养基则为合成培养基。培养基配方中出现的自然pH系指培养基不经酸、碱调节而自然呈现的pH。 三、实验材料 (一)药品 葡萄搪、蔗糖、NaN03、K2HP04、KCl、MgSO4·7H2O，FeS04、琼脂。 (二)仪器 天平、高压蒸汽灭菌锅。 (三)玻璃器皿 移液管、试管、锥形瓶、烧杯、量筒、培养皿、玻璃漏斗等。 (四)其他物品 药匙、pH试纸、称量纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管盖、牛皮纸、报纸、新鲜麦芽汁、黄豆芽、马铃薯等。 四、实验内容 (一)麦芽汁培养基的配制
1．培养基成分 新鲜麦芽汁一般为10-15波林。 2．配制方法 (1)用水将大麦或小麦洗净，用水浸泡6-12h，置于15℃阴凉处发芽，上盖纱布，每日早、中、晚淋水一次，待麦芽伸长至麦粒的两倍时，让其停止发芽，晒干或烘干，研磨成麦芽粉，贮存备用。 (2)取一份麦芽粉加四份水，在65℃水浴锅中保温3-4h，使其自行糖化，直至糖化完全(检查方法是取0.5ml的糖化液，加2滴碘液，如无蓝色出现，即表示糖化完全)。 (3) 糖化液用4-6层纱布过滤，滤液如仍混浊，可用鸡蛋清澄清(用一个鸡蛋清，加水20 m1，调匀至生泡沫，倒入糖化液中，搅拌煮沸，再过滤)。 (4)用波美比重计检测糖化液中糖浓度，将滤液用水稀释到10-15波林，调pH 至6．4。如当地有啤酒厂，可用未经发酵，未加酒花的新鲜麦芽汁，加水稀释到10-15波林后使用。 (5)如配固体麦芽汁培养基时，加入2％琼脂，加热融化，补充失水。 (6)分装、加塞、包扎。 (7)高压蒸汽灭菌100 Pa灭菌20 min。 （二)马铃薯葡萄糖培养基的配制 1、培养基成分 马铃薯20g 葡萄糖 2 g 琼脂 1.5-2g 水100ml 自然pH
酵母菌的分离筛选方法 酵母菌多数为腐生，一般生长在含糖较高，偏酸的环境中，在通气条 件下，液体培养比霉菌快。菌落与细菌相似，较大而厚，多数不透明， 菌落光滑湿润粘稠，乳白色，少数干皱，边缘整齐，呈红色或粉红色， 圆形椭圆卵形，液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。 含高糖浓度（45%），分离蜂蜜酵母，球拟酵母属等嗜高渗透压的酵母。 1.培养基： 1.1葡萄糖50g/L 尿素1g/L （NH4）2SO41g/L KH2PO4 2.5g/L Na2HPO40.5g/L MgSO41g/L FeSO4 0.1g/L 酵母膏 0.5g/L 孟加 拉红 0.03g/L PH4.5-5.0 （富集用） ★1.2乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基：马铃薯200g/L 葡萄糖（霉菌用 蔗糖）20g/L 乳酸5ml马铃薯去皮切片200g，加水煮沸30min，纱 布过滤，补足蒸馏水1L，PH自然。（去掉乳酸可用于酵母菌和霉菌培 养用）（富集用） ★1.3麦芽汁培养基：1：4水60-65℃水浴3-4小时，4-6层纱布过 滤，可加一个蛋清加水20mL调均生泡沫，倒入糖化液中，煮沸过滤， 10-15波林，氯霉素0.1g/L PH6.0-6.4 121℃ 20min （分离保存用）灭菌后加入300u/ml硫酸链霉素（集菌用） ★1.4虎红（孟加拉红）培养基：蛋白胨5.0g/L 葡萄糖10g/L KH2PO41.0g/L MgSO40.5g/L 孟加拉红0.033g/L 氯霉素0.1g/L 琼 脂15g/L PH自然
（分离纯化用） ★1.5 豆芽汁培养基：黄豆芽100g/L 葡萄糖50g/L PH自然。100g 黄豆芽，加水煮沸30min，纱布过滤，补足蒸馏水1L 1.6察氏培养基：主要培养霉菌观察形态用 蔗糖30g/L 硝酸钠3g/L 磷酸氢二钾1g/L 氯化钾0.5g/L 硫酸镁0.5g/L 硫酸亚铁0.01g/L 琼脂15-20g/L 121℃ 20min PH自然一般分离黄酒酵母酒精酵母使用曲汁培养基，啤酒酵母用酒花麦汁培养基，葡萄酒酵母用葡萄汁培养基。 2.集菌：研究酵母菌生态和某种基物或样品中的酵母菌区系，一般不进行集菌，以免改变其中不同种类数量间的对比，将样品制成菌悬液按常规法分离。若从样品中分离特定种类时先集菌。集菌发酵力强菌株，加酸性含糖的培养基，酸性豆汁，必要时注入高浓度的酒精（13-17%），霉菌在液体中形成菌丝体，酵母不形成菌丝，25-28℃2-3d，遇到菌丝体用接种环挑去烧掉，去掉上清液，取沉淀酵母一至两环移植另一液体培养基中，集菌连续两至三次才能完成，要配合镜检。 实例：将待分离的样品10g（ml）放入90ml无菌水或生理盐水/150ml 三角瓶（玻璃珠），摇床振荡20-30min，取上清液接种于酸性培养液（乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基酸性麦芽汁或酸性豆芽汁）25-28℃2-3d，培养过程中若出现菌丝体跳出烧掉，集菌连续两至三次，培养液变成混浊，产生菌膜和沉淀物。镜检：美兰染液染色，活菌可还原美兰染液，菌体无色。
146种常用培养基配方 THE COMPOSITION OF MEDIA 培养基及成分 1. Acetobacter Medium (醋酸菌培养基) Glucose (葡萄糖) 100g Yeasst extract (酵母膏) 10g CaCO3 20g Agar (琼脂) 15g Distilled water (蒸馏水) 1000ml Adjust (调) pH to 6.8 适用范围：恶臭醋酸杆菌混浊变种 2. Nutrient Agar (营养肉汁琼脂) Pepton (蛋白胨) 5g Beef extract (牛肉膏) 30g NaCl 5g Agar (琼脂) 15g Distilled water (蒸馏水) Adjust (调) pH to 7.0-7.2 [Note]：When cultivation of Bacillus，5mg of to MnSO4.H2O may be added . It is favorable to promote spore formation . 适用范围：产气气杆菌、粪产碱杆菌、蜡状芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌蕈状变种、地衣形芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、尘埃芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌深黑变种、苏云金芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种（青虫菌）、苏云金芽孢杆菌戈尔斯德变种、苏云金芽孢杆菌猝倒亚种、产氨短杆菌、黄色短杆菌、谷氨酸棒状杆菌、北京棒杆菌、大肠埃希氏菌（大肠杆菌）、铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）、凸形假单胞杆菌、荧光假单胞菌、弯曲假单胞菌、恶臭假单胞菌、假单胞杆菌、藤黄八叠球菌、亚黄八叠球菌、尿素八叠球菌、金黄色葡萄球菌、运动发酵单孢菌 3. Azotobacter Medium (固氮菌培养基) KH2PO4 0.2g K2HPO4 0.8g MgSO4.7H2O 0.2g CaSO4.2H2O 0.1g Na2MoO4.2H2O Trace(微量) Yeast axtract(酵母膏) 0.5g Mannitol(甘露醇) 20g FeCl3 Tract(微量) Distilled water (蒸馏水) 1000ml Agar (琼脂) 15g Adjust (调) pH to 7.2 适用范围：固氮菌、胶质芽孢杆菌 4. Corn Meal Medium (玉米粉培养基) Maize flour (玉米粉) 5g Peptone (蛋白胨) 0.1g Glucose (葡萄糖) 1g Tap water (自来水) 1000ml
微生物学大实验 实验指导 编者： 生物技术教研室 2007.3
目录 实验一酵母菌的培养与分离‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥2 实验二酵母菌的鉴定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥7 实验三酵母菌耐受能力的测定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥19 实验四酵母菌发酵工艺条件的优化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥22 实验五耐高温酵母菌株的诱变选育‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥24 实验六酿酒酵母细胞固定化与酒精发酵‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥27
耐高温酒精酵母菌的选育及发酵条件的研究 实验一酵母菌的培养与分离 一、实验目的 学习培养和分离酵母菌的技术和方法 二、基本原理 大多数酵母菌为腐生，其生活最适pH为4.5－6，常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。酵母菌生长迅速，易于分离培养，在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长得快。 利用酵母菌喜欢酸性环境的特点，常用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液（这样做的好处是酸性培养条件则可抑制细菌的生长），然后在固体培养基上用划线法分离之。 三、实验主要内容和要求 （一）本次实验的方案由同学们自己制定，实验包括： 1．马铃薯葡萄糖培养基, 乳酸马铃薯葡萄糖培养液的配制。 2.菌株的筛选,根据一定的生产目的并从特定的样品筛选出高产酒精的适宜的酵母菌株。 3.酵母菌的分离,要求接种一次, 28-30℃，培养24小时，转接一次，28-30℃，培养24小时，并用镜检的方法独立判定所分离菌株是否为酵母菌。 4.用划线分离法对酵母菌进行纯化，要求每组挑取单个菌落，连续划线分离4代，镜下为单一纯菌株，每组扩繁10支斜面菌种，备用。 四、实验的准备 1、甘蔗、成熟葡萄或苹果等果皮、0.1%美蓝染液、1ml的无菌吸管、无菌培养皿等。 2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基： 原料：马铃薯（200克）、葡萄糖（20克）、琼脂（15-20克）、蒸馏水（1000ml）。 配制方法： （1）先将马铃薯去皮，切片，称200克并加蒸馏水1000ml，煮沸半小时，用纱布过滤，补足蒸馏水量至1000ml ，制成20%的马铃薯汁。 （2）在20%的马铃薯汁中加入琼脂，煮沸溶化，补足水分并在115℃条件下高压灭菌20分种。 （3）加入葡萄糖，制成培养酵母菌的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
1．营养肉汤 成分：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH7.4。 制法：按上述成分混合，溶解后校正pH，121℃高压灭菌15min。 2．营养琼脂培养基 成分：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂17g，蒸馏水1000mL，pH7.2。 制法：将除琼脂外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH，加入琼脂，分装于烧瓶内，121℃，15min高压灭菌备用。 3．MRS培养基 成分：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，K2HPO4 2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄 （琼脂15~20g），蒸馏水1000mL。糖20g，吐温80 1mL，MgSO4 .7H2O 0.58g，MnSO4 4H2O 0.25g， 制法：将以上成分加入到蒸馏水中，加热使完全溶解，调pH至6.2~6.4，分装于三角瓶中，121℃,灭菌15min。 4．脱脂乳培养基 成分：牛奶，蒸馏水。 制法：将适量的牛奶加热煮沸20~30min，过夜冷却，脂肪即可上浮。除去上层乳脂即得脱脂乳。将脱脂乳盛在试管及三角瓶中，封口后置于灭菌锅中在108℃条件下蒸汽灭菌10~15min，即得脱脂乳培养基。 5．培养基A 成分：蛋白胨10.0g，酵母提取物1.0g，葡萄糖10.0g，NaCL5.0g，琼脂15.0g，水1000mL。制法：将以上成分加入到蒸馏水中，加热使完全溶解，调pH至7.0~7.2，分装于三角瓶中，121℃，灭菌15min。 6．PTYG培养基 成分：胰胨Tryptone（Oxoid）5g，大豆蛋白胨5g，酵母粉（Oxoid）10g，葡萄糖10g，吐温80 0 1mL，琼脂15~20g，L-半胱氨酸盐酸盐0.05g，盐溶液4mL。 制法：将以上成分加入到蒸馏水中，加热使完全溶解，调pH至6.8~7.0，分装于三角瓶中，115℃灭菌30min。 盐溶液制备：无水氯化钙0.2g，K2HPO4 1.0g，KH2PO4 1.0g，MgSO4 。7H2O 0.48g，NaCO3
安琪生香活性干酵母说明书 安琪牌生香活性干酵母适合于各种白酒的生产，其主要作用是增酯增香，改善白酒质量。对减曲、加安琪酿酒高活性干酵母和糖化酶工艺尤其显著效果。 生香活性干酵母的复水活化 1．自来水活化 用10-15倍33-35℃的温水，加入生香活性干酵母溶解活化30分钟，即可投入使用。活化时间控制在30分钟以内。 2．含糖液活化 配2.5%的糖液，用量为干酵母量的20-30倍，调温至35℃，将酵母溶解于活化液中，在33-35℃下活化10小时左右使用，采用此种活化方法可适当减少生香活性干酵母的用量。 用生香活性干酵母培养固体香醅 1．固体培养基 玉米面或高粱粉10%，麸皮40%，鲜酒糟50%，当酒糟较软塌时，使用5-10%的稻壳（鲜酒糟用量减少至40-45%），加水25%，拌匀，上甑，常压蒸1小时，出甑冷却至40℃左右，加糖化酶活化液，每吨配料用5万单位糖化酶1.5公斤。用酒尾调酸度至0.9-1.0，酒精度15-2.0%。 2．接种 生香活性干酵母的接种量为吨配料2.0公斤，将所需的活性干酵母按上述方法活化好后立即接种。接种时，料醅的温度以30-35℃为宜，接种后要求料醅的水份含量为50-52%。 3．堆积培养 接种后28-30℃堆积培养，培养期间通过翻堆提供新鲜空气和调节温度，最高温度一般不得超过34℃。培养12小时后，用塑料布将香醅盖住，隔绝空气培养，利于产酯和控制温度，培养24小时左右香醅成熟，应及时使用。 使用方法 一．清香型 1．香醅串蒸法： 将培养成熟的香醅与出池酒醅混合,装于甑的上部进行串香蒸酒,香醅的用量则视香醅及酒醅中酯的含量而定，一般为酒醅量的5-10%。此法适用于发酵周期较短(7天以内)的白酒。 2．生香活性干酵母入池发酵法： 生香活性干酵母的使用量为每吨原粮2公斤左右,按上述方法活化好后,与其它糖化发酵剂(曲粉、糖化酶液、酒精活性干酵母活化液等)混合、再与粮醅混合，入池发酵。此法适用于发酵周期较长（2周以上）的白酒生产。 3．香醅入池发酵法： 为了弥补串香法口感上的不足，对于发酵周期不长（2周以内）的白酒生产，可先用生香活性干酵母培养香醅，然后香醅与粮醅混匀后入池发酵，香醅用量为粮醅的 5-10%。 4．生产高浓度酯香的调香酒： 使用专门的老窖，全部采用生香活性干酵母（用量为原粮的0.4%左右）和优质大曲粉，并采用较长的发酵周期，从而生产出高浓度酯香的调味酒，用来勾兑中、低档白酒。也可将酯量较高的优质酒醅与发酵周期较短的酒醅一起串蒸。以提高白酒质量。二．浓香型
毕赤酵母常用培养基与载体 一、毕赤酵母表达常用载体： 典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE 电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。得到产量高的表达菌株。另一种在转化前将多个表达盒拷贝插入到单个载体中，而后再通过交换整合到受体染色体上。表达蛋白纯化方法：酵母系统表达的蛋白一般都具有活性，所以都采用较温和的纯化方式来纯化目的蛋白，分泌型表达的蛋白有利于纯化，可用硫酸铵沉淀，然后用离子交换，凝胶过滤层析，疏水层析等方法进一步纯化。具体的方法和操作应按所处理的目的蛋白的性质选择。 二．毕赤酵母表达的培养基配制和用途 2.1 LB（Luria－Bertani）培养基： Trypton l％ Yeast Extract 0.5％ NaCl l％ PH 7.0 制作平板时加入 2％琼脂粉。121℃高压灭菌 20min。可于室温保存。用于培养pPICZ αA原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / ml。 2.2 LLB（Low Salt LB）培养基： Trypton l％ Yeast Extract 0.5％
146种培养基配方 146种培养基配方 THE COMPOSITION OF MEDIA 培养基及成分 1. Acetobacter Medium (醋酸菌培养基) Glucose (葡萄糖) 100g Yeasst extract (酵母膏) 10g CaCO3 20g Agar (琼脂) 15g Distilled water (蒸馏水) 1000ml Adjust (调) pH to 6.8 适用范围：恶臭醋酸杆菌混浊变种 2. Nutrient Agar (营养肉汁琼脂) Pepton (蛋白胨) 5g Beef extract (牛肉膏) 30g NaCl 5g Agar (琼脂) 15g Distilled water (蒸馏水) Adjust (调) pH to 7.0-7.2 [Note]：When cultivation of Bacillus，5mg of to MnSO4.H2O may be added . It is favorable to promote spore formation . 适用范围：产气气杆菌、粪产碱杆菌、蜡状芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌蕈状变种、地衣形芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、尘埃芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌深黑变种、苏云金芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种（青虫菌）、苏云金芽孢杆菌戈尔斯德变种、苏云金芽孢杆菌猝倒亚种、产氨短杆菌、黄色短杆菌、谷氨酸棒状杆菌、北京棒杆菌、大肠埃希氏菌（大肠杆菌）、铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）、凸形假单胞杆菌、荧光假单胞菌、弯曲假单胞菌、恶臭假单胞菌、假单胞杆菌、藤黄八叠球菌、亚黄八叠球菌、尿素八叠球菌、金黄色葡萄球菌、运动发酵单孢菌 3. Azotobacter Medium (固氮菌培养基) KH2PO4 0.2g K2HPO4 0.8g MgSO4.7H2O 0.2g CaSO4.2H2O0.1ｇ Ｎa2MoO4.2H2O Trace(微量) Yeast axtract(酵母膏) 0.5g Mannitol(甘露醇) 20g FeCl3 Tract(微量) Distilled water (蒸馏水) 1000ml Agar (琼脂) 15g Adjust (调) pH to 7.2 适用范围：固氮菌、胶质芽孢杆菌 文章来自：医药园(https://www.doczj.com/doc/fe11770985.html,) 4. Corn Meal Medium (玉米粉培养基) Maize flour (玉米粉) 5g Peptone (蛋白胨) 0.1g Glucose (葡萄糖) 1g Tap water (自来水) 1000ml [Note]:Boil the mixture in autoclave at 121℃for 1 hr. distribute the medium into 18ⅹ18 mm tubes , each contains 10 ml of the liquid , then autoclave at 121℃for 1 hr . again (15磅蒸煮1小时,分装入18ⅹ18毫米试管,每管深度达6厘米。15磅再次灭菌15小时。) 5. Lactic-bacteria Medium I (乳酸菌培养基I ) Yeast extract (酵母膏) 7.5g Peptone (蛋白胨) 7.5g Glucose (葡萄糖) 10g KH2PO4 2g Tomato juice (西红柿汁) 100ml Tween (吐温) 80 0.5ml
酿酒产品知识题库 入门基础题 一安琪超酒的性能优势较安琪高酒有哪些？使用领域？标准名称以及规格？ 1 繁殖能力强，减少培养过程染菌机会 2 主发酵迅猛，耗糖速度快 3 后酵充分，降低残还原糖 应用在淀粉质原料生产酒精，适合进行浓醪发酵。 安琪超级酿酒酵母 5公斤×2/件 二酿酒曲对照土曲、酵母糖化酶工艺酿酒的优势： 对比土曲：出酒率高，性能稳定，有产品单项指标的检测保证酿酒曲质量 对比酵母糖化酶工艺：由于有多种酶系复合而成，所以使用酿酒曲酿造的酒口感好 三中国已经批准的燃料乙醇企业有哪几家？使用燃料乙醇的省份有哪几个？ 河南天冠燃料乙醇安徽丰原燃料乙醇吉林燃料乙醇黑龙江华润燃料乙醇 黑龙江、吉林、辽宁、山东、安徽、江苏、河北、湖北、河南。 四简单分析酒精生产过程中酒母培养不好的因素： 1酵母用量配比，培养时间长短； 接种量过小，导致培养时间长，酵母衰老 2 酒母醪的制备 稀释糖化醪 3 通风情况； 通微风，让醪液翻滚 4 营养盐的添加； 分次分时添加，或者是酒母罐和发酵管分量添加 5 其他因素如清液回配等 酒母使用周期缩短，与酒母培养质量相关。尤其是当醪液中积累了过多的抑制酵母生长的因素，包括清液中的盐离子，有机酸，以及液糖化过程中添加的盐离子
五酒精生产发酵结束后，残糖指标较高的原因： 显性原因：残糖高，经常会考虑是糖化和发酵的原因，即糖化酶和酵母的原因； 1、细胞数分析发酵前期和后期细胞数、活细胞率以及死亡率的情况 2、酵母耗糖率根据锤度的变化判断 3、糖化酶的用量和作用时间浓醪发酵糖化酶的用量一般在120－150u/g，根据工艺的不同糖化时间从30min－2hr不等。当糖化酶的用量和作用时间无法满足生产的需要时，会导致糖化与发酵的不匹配，因此我们要关注糖化的效率。 4、糖化的效率糖化和发酵是一个协同的过程。在发酵中，糖化酶继续作用，并且直到发酵后期，仍然存在后糖化，只有当淀粉糊精转化为糖，糖被酵母利用转化为酒精的过程是最协调的，当糖化酶的作用超过酵母利用糖的能力的时候，过剩的还原糖会引起底物抑制，导致酵母发酵能力下降；当糖化酶的作用过慢，发酵前期体现出酵母耗糖快，但是后期糖化完成后，酵母能力已经衰弱，从而导致成熟醪的残还原糖偏高。 六酒精生产结束后，酸度过高的原因 酸度以及挥发酸的变化 酸度与挥发酸的变化主要是由于生产中污染杂菌造成。由于杂菌的生长，必然会影响到酵母的生产与发酵，在观察生产指标的时候，需要注意酸度和挥发酸的变化！ 七酿酒酵母生产工艺流程 酵母斜面菌种→ F瓶→卡氏罐→纯种培养→种子发酵→分离→纯化→商品发酵→分离→过滤→造粒→干燥→包装→检验→成品 八当醪液的DS小于30%，发酵温度需控制的温度范围； 液化醪的DS小于30%，发酵温度需控制的温度范围为30-37度。 九安琪耐高温酿酒高活性干酵母最适作用温度范围？有效作用温度范围？ 最适作用温度为30-32度，有效作用温度为25-42度。 十最适作用PH值范围？有效PH值范围？最低可以耐到多少？ 最适作用PH值为4.1-4.5；有效PH为3.5-6.0；最低可以耐到3.5。
(一)麦芽汁培养基的配制 1．培养基成分 新鲜麦芽汁一般为10-15波林。 2．配制方法 (1)用水将大麦或小麦洗净，用水浸泡6-12h，置于15℃阴凉处发芽，上盖纱布，每日早、中、晚淋水一次，待麦芽伸长至麦粒的两倍时，让其停止发芽，晒干或烘干，研磨成麦芽粉，贮存备用。 (2)取一份麦芽粉加四份水，在65℃水浴锅中保温3-4h，使其自行糖化，直至糖化完全(检查方法是取0.5ml的糖化液，加2滴碘液，如无蓝色出现，即表示糖化完全)。 (3) 糖化液用4-6层纱布过滤，滤液如仍混浊，可用鸡蛋清澄清(用一个鸡蛋清，加水20 m1，调匀至生泡沫，倒入糖化液中，搅拌煮沸，再过滤)。 (4)用波美比重计检测糖化液中糖浓度，将滤液用水稀释到10-15波林，调pH至6．4。如当地有啤酒厂，可用未经发酵，未加酒花的新鲜麦芽汁，加水稀释到10-15波林后使用。 (5)如配固体麦芽汁培养基时，加入2％琼脂，加热融化，补充失水。 (6)分装、加塞、包扎。 (7)高压蒸汽灭菌100 Pa灭菌20 min。 （二)马铃薯葡萄糖培养基的配制 1、培养基成分 马铃薯20g 葡萄糖 2 g 琼脂 1.5-2g 水100ml 自然pH 2．配制方法 (1)配制20％马铃薯浸汁取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000m1。80℃浸泡lh，用纱布过滤，然后补足失水至所需体积。100 Pa灭菌20 min。即成20％马铃薯浸汁，贮存备用。 （2)配制时，按每100 m1马铃薯浸汁加入2g葡萄糖，加热煮沸后加入2g琼脂，继续加热融化并补足失水。 (3)分装、加塞、包扎。 (4)高压蒸汽灭菌100 Pa灭菌20 min。 (三)豆芽汁葡萄糟培养基的配制 1．培养基成分 黄豆芽10g 葡萄糖5g 琼脂 1.5-2g 水100ml 自然pH 2．配制方法 (1)称新鲜黄豆芽10g，置于烧杯中，再加入100 m1水，小火煮沸30 min，用纱布过滤，补足失水，即制成10％豆芽汁。
酵母菌的分离纯化、固定化和酒精发酵 第一部分酵母菌的分离纯化 一、实验目的 应用酵母菌的生理生化和生态学的特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。 二、实验原理 酵母菌常见于含糖份比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为4.5-6.0.酵母菌生长迅速，容易分离培养。在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长快，利用酸性条件则可以抑制细菌的生长。因此常用酸性液体培养基获得酵母菌的加富培养，然后在固体培养基上划线分离纯化。 三、器材和用品 1、甘蔗、苹果皮、葡萄皮、果园土、菜园土等。 2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200g（煮开10min后过滤取汁），葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH自然。分装三角瓶；试管斜面1支/组 3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：配方同上，不加琼脂加乳酸，按1000ml培养基加入5ml乳酸，pH为5.5左右，再分装试管9ml2支/组。 4、无菌吸管3支/组、无菌培养皿、100ml无菌水1瓶/组、涂棒、美兰染液、显微镜、接种环等。 四、实验方法 1、接种：取果皮（不需冲洗）或土壤5克，加入到100ml无菌水中，充分搅拌后，用无菌吸管取1ml接入到9ml乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h，可见培养液变浑浊。 2、加富培养：用无菌吸管取上述培养液1m l，注入另1管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h。 3、镜检：用无菌操作法用接种环取少量菌液置于载玻片上，中央滴一滴美兰染液，混合均匀后制成水浸片，在高倍镜下观察酵母菌的形态及出芽方式，并可根据菌体是否染色来区分酵母菌的死活细胞，因活细胞使美兰染液还原，故菌体不着色。 4、涂皿：用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用无菌吸管取0.1ml 加富培养液到平板中，用涂棒涂匀后培养24h。 5、分离纯化：用接种环挑取单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后