核酸外切酶exonuclease
核酸外切酶是一类能从多核苷酸链的一端开始按序催化水解3、5-磷酸二酯键，降解核苷酸的酶。其水解的最终产物是单个的核苷酸（DNA为dNTP，RNA为NTP）。按作用的特性差异可以将其分为单链的核酸外切酶和双链的核酸外切酶。
核酸内切酶endonuclease
核酸内切酶是在核酸水解酶中，水解DNA分子链内部磷酸二酯键生成寡/寡聚核苷酸的酶。限制性核酸酶在原核和真核细胞中都有发现，按其性质可分为三大类。所谓Ⅰ型的酶要求DNA分子上有特定的识别顺序，但是切点却不在此识别顺序之中，而与之有一定距离。在反应中,它还要求有ATP和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。酶由不同的α，β，γ亚基组成。全酶兼有限制性内切酶的活性和甲基化酶的活性。Ⅲ型的酶与Ⅰ型的酶有相似特征，只是切点距识别顺序距离是严格的。Ⅱ型的酶，可说是独立的限制性核酸内切酶。因为，它并不兼有甲基化酶的活性。它切断DNA时不需ATP,也不需SAM。它的切点是严格的，而且就在识别顺序之中。所认知的位置多为短的回文序列，下面对Ⅱ型酶作进一步的介绍。常用的限制性核酸酶有EcoRⅠ,HindⅢ,AluⅠ,HaeⅢ等。
EcoRⅠ来自Escherichia coli RY13之酶Ⅰ
HindⅢ来自Haemophilius influenzae Rd之酶Ⅲ
AluⅠ来自Arthrobacter luteus之酶Ⅰ
HaeⅢ来自Haemophilus aegyptius之酶Ⅲ
这些酶的识别顺序多数是4或6个碱基对。有的酶要5或7个甚至更长的识别顺序。识别顺序短的在DNA分子上出现的几率多，酶可把DNA分子切成较多的小片段。识别顺序长的则往往只切出少数大片段。这些酶切片段统称为限制性片段。根据不同限制性核酸酶在某DNA分子上的切点分布，可以绘出该DNA分子的“限制性图谱”即“酶切图谱”，也称“物理图谱”。限制性图谱可以反映出一个DNA片段或基因结构的基本特征。
这些酶的识别顺序大都具有180°旋转对称的特征。切点绝大多数都在识别顺序之内。切口有时是平头的,即双链的切点位置相同。如AluⅠ和HaeⅢ。有时切口可带有一个短的单链末端，如EcoRⅠ和HindⅢ。
核酸外切酶的作用：从核酸链的一端逐个水解下核苷酸。
限制性核酸内切酶的作用：识别特定的核苷酸序列，并在DNA分子内部的一定位点切割DNA 。
第一型限制酶
同时具有修饰（modification）及认知切割（restriction）的作用；另有认知（recognize)DNA上特定碱基序列的能力，通常其切割位（cleavage site）距离认知位（recognition site）可达数千个碱基之远。例如：Eco B、Eco K。
第二型限制酶
只具有认知切割的作用，修饰作用由其他酵素进行。所认知的位置多为短的回文序列（palindrome sequence）；所剪切的碱基序列通常即为所认知的序列。是遗传工程上，实用性较高的限制酶种类。例如：Eco RI、HindⅢ。
Ⅱ型（type Ⅱ）限制与修饰系统所占的比例最大，达93% 。Ⅱ型酶相对来说最简单，它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割DNA ，产生带3'- 羟基和5'- 磷酸基团的DNA 产物，需Mg2+ 的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需SAM 。识别序列主要为4-6bp ，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列，切割位置因酶而异，有些是隔开的。
Ⅱs 型（type Ⅱs）限制与修饰系统，占5% ，与Ⅱ型具有相似的辅因子要求，但识别位点是非对称，也是非间断的，长度为4-7bp ，切割位点可能在识别位点一侧的20bp 范围内。
在Ⅱ型限制酶中还有一类特殊的类型，该酶只切割双链DNA 中的一条链，造成一个切口，这类限制酶也称切口酶（nicking enzyme），如N.Bst NBI 。
第三型限制酶
与第一型限制酶类似，同时具有修饰及认知切割的作用。可认知短的不对称序列，切割位与认知序列约距24-26个碱基对。例如：Eco PI、HinfⅢ。
限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（一般4-8bp），并在此处切割DNA双链的核酸内切酶。主要存在于原核生物，是原核生物自我保护的一种机制。它的作用包含两类,一种是对外的,限制作用,指一定类型的细菌可以通过限制性核酸内切酶的作用,破坏入侵的外源DNA,使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制。另一种是对内的，修饰作用，指在特定位置发生甲基化，可免遭自身限制性酶的破坏。 限制性核酸内切酶的发现是在本世纪中期，Arber等人对λ噬菌体在大肠杆菌不同菌株上的平板培养效应的研究为基础，发现了原核生物体内存在着寄主控制的限制和修饰系统。实验是：在K株或B株大肠杆菌上生长繁殖的噬菌体λ（K）或λ（B），再次感染原寄主菌体的成斑率为1，而感染新的寄主菌株的成斑率则分别为10-4和4*10-4所以说受到了限制。在 20 世纪 60 年代，噬菌体学家阐明了宿主限制和修饰现象的生化机制。该研究工作在 Me-selson 和 Yuan（1968）纯化得到了大肠杆菌 K12 的限制性内切酶时达到高峰。因为这个内切酶可以把未修饰的 DNA 切割成大的分离片段，人们认为它一定识别一个靶序列。从而提供了对 DNA 进行可控操作的前景。但不幸的是，K12 内切酶不具备人们希望的性质。虽然它确实是结合到一定的区域序列上，切割却在几千个碱基对以外“随机”发生的（Yuan 等，1980）。经过大量努力后，终于在1970 年取得了突破，人们发现了在流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）中存在一种酶，其作用更加简单（Kelly & Smith，1970；Smith & W ilcox，1970），即这个酶可以识别双链 DNA 分子中的一个特定靶序列，并在该序列之内切断多聚核苷酸链，从而产生长度和序列一定的分离片段。突破性的进展始于 Hamilton Smith 的发现，他从嗜血流感细菌（Haemophilus influenzae）菌株 Rd中找到了一种限制性内切酶（Smith & Wilcox，1970），并阐明了它在噬菌体 T7 DNA 中切割的核苷酸序列（Kelly & Smith，1970）。这个酶现在命名为 Hind Ⅱ。嗜血流感细菌还具有另一个Ⅱ型的限制酶 Hind Ⅲ，而且含量很大。幸运的是，Hind Ⅲ不切割T7 DNA，因此 Hind Ⅱ制剂中可能混有的 Hind Ⅲ将不产生任何问题（Old 等，1975）。在发现 HindⅡ后不久，又分离到其他几个Ⅱ型的限制性内切酶，并分析了它们的性质，EcoRⅠ是其中最重要的一个（Hedgepeth 等，1972）。它们随即迅速用于最初的重组 DNA 实验中。
限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶（ restriction endonucleases ），简称限制酶，是一类能识别和切割双链 DNA 分子中的某些特定核苷酸序列的核酸水解酶，主要从细菌中分离得到。根据结构和功能特性，把限制酶分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。Ⅰ型限制酶的切点不固定，很难形成稳定的、特异性切割末端；Ⅲ型限制酶对 DNA 链的识别序列是非对称的，不产生特异性的 DNA 片段，故基因工程实验中基本不用Ⅰ型和Ⅲ型限制酶。 Ⅱ型限制酶的主要作用是切割 DNA 分子，在 DNA 重组、构建新质粒、建立 DNA 的限制性酶切图谱、 DNA 的分子杂交、制备 DNA 的放射性探针、构建基因文库等方面起到重要作用，是基因工程重要的工具酶。 Ⅱ型限制性核酸内切酶的特点是：一般能识别和切割 4~8 个碱基对的核苷酸序列；大多数识别序列具有回文结构。 Ⅱ型限制性核酸内切酶的切割方式有三种：切割产生 5 ' 突出的粘性末端（ sticky ends ）；切割产生 3 ' 突出的粘性末端；切割产生平头末端（ blunt ends ）。 Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用根据酶的功能特性、大小及反应时所需的辅助因子，限制性内切酶可分为两大类，即I类酶和Ⅱ酶。最早从大肠杆菌中发现的EcoK、EcoB就属于I类酶。反应过程中除需Mg2+外，还需要S-腺苷-L甲硫氨酸、ATP；在DNA分子上没有特异性的酶解片断，这是I、Ⅱ类酶之间最明显的差异。因此，I类酶作为DNA的分析工具价值不大。Ⅱ类酶有EcoR I、BamH I、Hind Ⅱ、Hind Ⅲ等。反应只需Mg2+；最重要的是在所识别的特定碱基顺序上有特异性的切点，因而DNA分子经过Ⅱ类酶作用后，可产生特异性的酶解片断，这些片断可用凝胶电泳法进行分离、鉴别。 限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNA。 每种限制酶特异识别专一DNA序列，并在切割位点将其准确切割。 限制酶是基因工程用来切割目的基因的酶，DNA复制不需要。 DNA复制需要的是解旋酶和DNA聚合酶。 根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型 第一型限制酶：同时具有修饰（modification）及认知切割（restriction）的作用；另有认知（recognize)DNA上特定碱基序列的能力，通常其切割位（cleavage site）距离认知位（recognition site）可达数千个碱基之远。例如：EcoB、EcoK。 第二型限制酶：只具有认知切割的作用，修饰作用由其他酵素进行。所认知的位置多为短的回文序列（palindrome sequence）；所剪切的碱基序列通常即为所认知的序列。是遗传工程上，实用性较高的限制酶种类。例如：EcoRI、HindⅢ。 第三型限制酶：与第一型限制酶类似，同时具有修饰及认知切割的作用。可认知短的不对称序列，切割位与认知序列约距24-26个碱基对。例如：EcoPI、HinfⅢ。 甲基化（DNA methylation） DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一，大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。
限制性内切酶考点盘查 限制性内切酶是基因工程中最难把握的知识点，高考中对这种酶的考察特别重视，我们有必要对相关的知识先进行归纳，才有利于解答试题。 1 限制性核酸内切酶的基本知识 ①来源及化学本质:主要是从原核生物中分离纯化出来的。化学本质为蛋白质。 ②作用：催化作用，可用于DNA的切割获取目的基因和载体的切割，切割的化学键为磷酸二酯键。 ③作用特点：特异性,即限制酶可识别特定的脱氧核苷酸序列,切割特定位点。 ④切割方式：错位切--产生两个相同的黏性末端，平切--形成平末端。如果是错位切则将一个基因从DNA分子上切割下来,需要破坏4个磷酸二酯键,同时产生4个黏性末端，增加4个游离的磷酸基团。 2 限制性核酸内切酶的难点解析 2.1 目的基因切割要点归纳 ①要把目的基因切割下来需要在目的基因的两边都进行切割，但绝对不可以破坏目的基因的结构。 ②切割目的基因的酶可以用同一种限制酶，也可以用两种不同的限制酶。 ③切割产生的末端有三种情况：都是平末端、都是粘性末端、一
边是粘性末端，一边是平末端。 2.2 质粒切割要点归纳 ①质粒的切割可以切一个切口，也可以切两个切口。如果是一个切口，则连接时可能会产生一些我们不需要的连接物(如自身环化等)；如果是两个切口则质粒会丢失一段DNA片段，但可以控制连接物就是我们需要的目的基因和质粒的连接。切割时注意不要破坏了载体上的标记基因（至少保留有一个标记基因）、终止子、启动子、复制原点等。 ②切割质粒的酶可以用同一种限制酶，也可以用两种不同的限制酶。 ③切割产生的末端有三种情况：都是平末端，都是粘性末端，一边是粘性末端，一边是平末端。 2.3 限制性核酸内切酶的说明 不同的酶识别序列一般不同，但也有识别序列相同的。如果识别序列相同，切割点也相同则切割产生的粘性末端一样。一种酶的识别序列中可能包含另外一种酶的识别序列，切割时可以产生相同的粘性末端。不同的酶识别的序列一般不同，但有时也可能相同，这时切割产生的粘性末端也相同。 2.4 酶切割后的DNA片段的连接 如果是用一种限制性内切酶切割质粒表达载体和目的基因,不可以防止载体和目的基因的自身环化,两个DNA片段连接产物有：目的基因—目的基因；目的基因—载体；载体—载体。这些
不同限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割 ——限制性核酸内切酶EcoRI对pUC19-P35S:ARF8切割 摘要：【目的】为加深对限制性核酸内切酶和质粒DNA的酶切关系的认识，采用限制性核酸内切酶EcoRI对质粒DNA进行切割，从而验证不同限制性核酸内切酶对质粒DNA具有不同的切割结果。【方法】采用限制性内切酶EcoRI对pUC19-P35S:ARF8进行切割，再用0.8%琼脂糖凝胶电泳加以分离，得到电泳图谱，对照分子量标样加以鉴定。【结果】经琼脂糖凝胶电泳后，结果获得两条分子量不同的DNA带。【结论】结果表明，用不同限制性核酸内切酶对质粒DNA 进行切割，可将质粒DNA切割成不同长度的DNA片段。 关键词：限制性内切酶EcoRI 质粒DNA 凝胶电泳酶切图谱 引言：没有限制性核酸内切酶的发现和应用，就没有分子生物学的兴旺发展，在基因工程和分子生物学中，限制性核酸内切酶起着其足轻重的作用。限制性核酸内切酶均来源于原核生物，用于抗击外来DNA的入侵。限制性核酸内切酶，能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA的酶，既是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。因此研究限制性核酸内切酶对质粒DNA的切割具有重要的意义。 材料和方法： 1．材料
1.1 重组质粒pUC19-P35S:ARF8由广州大学生命科学学院生化楼分子生物学实 验室构建 1.2 限制性内切酶：EcoRI购自TaKaRa等生物工程公司 1.3 琼脂糖：进口分装 2．设备 2.1 DYY-6C型电泳仪购自北京市六一仪器厂 2.2 0.1-2.5ul、0.5-10ul、5-50ul移液枪购自北京市六一仪器厂 2.3 ECFOII手掌型离心机购自碧云天生物技术研究所 2.4 EDC-810基因扩增仪、微波炉、凝胶成像系统等。 3．试剂 3.1 5 x TBE电泳缓冲液 3.2 6 x 电泳载样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液，贮存于4℃； 3.3 溴化乙锭溶液母液：将EB配臵成10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储 于室温； 3.4 DNA分子量标准：从小到大为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。4．操作步骤 4.1 DNA酶切反应 4.11 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管编号，用微量移液枪分别加入DNA 1ug和相应的限制核酸内切酶反应10 x 缓冲液2ul，再加入重蒸水使总体积为19ul，将管内溶液混匀后加入1ul酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，使溶液 集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键，要防止错加，漏加。使 用限制性核酸内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。
酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶 发布: 2010-05-24 20:19| 来源:生物吧| 编辑:刘浩| 查看: 161 次 本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如AccI，AflIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，EcoRI，HaeIII，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，PacI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII，SalI，ScaI，SmaI，SpeI，SphI，StuI，XbaI，XhoI，XmaI， 为什么要添加保护碱基？ 在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。 其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。 该如何添加保护碱基？ 添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。 添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。 实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1μg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2, 5 mMDTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。20%的PAGE（7M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。 本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
【推荐】限制性内切酶的特点有哪些-范文word版 本文部分内容来自网络整理，本司不为其真实性负责，如有异议或侵权请及时联系，本司将立即删除！ == 本文为word格式，下载后可方便编辑和修改！ == 限制性内切酶的特点有哪些 限制性核酸内切酶是可以识别特定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位 的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。下面是小编 给大家整理的限制性内切酶的特点，希望能帮到大家! 限制性内切酶的特点 1、识别位点的DNA序列呈二重旋转对称(即具有迥文结构); 2、切割DNA均产生含5’-磷酸和3’-羟基的末端; 3、错位切割产生具有5’-或3’-突出的粘性末端;而沿对称轴切割双链DNA产生平头末端，也称钝性末端。 4、少数不同的限制酶可识别和切割相同的位点，这些酶称为同切酶，如MboI Ⅰ和 Sau3A。 限制性内切酶的分类性质 根据酶的功能特性、大小及反应时所需的辅助因子，限制性内切酶可分为 两大类，即I类酶和Ⅱ酶。最早从大肠杆菌中发现的EcoK、EcoB就属于I类酶。其分子量较大;反应过程中除需Mg2+外，还需要S-腺苷-L甲硫氨酸、ATP;在DNA分子上没有特异性的酶解片断，这是I、Ⅱ类酶之间最明显的差异。因此， I类酶作为DNA的分析工具价值不大。Ⅱ类酶有EcoR I、BamH I、Hind Ⅱ、Hind Ⅲ等。其分子量小于105道尔顿;反应只需Mg2+;最重要的是在所识别的 特定碱基顺序上有特异性的切点，因而DNA分子经过Ⅱ类酶作用后，可产生特 异性的酶解片断，这些片断可用凝胶电泳法进行分离、鉴别。 限制性内切酶识别DNA序列中的回文序列。有些酶的切割位点在回文的一 侧(如EcoR I、BamH I、Hind等)，因而可形成粘性末端，另一些Ⅱ类酶如Alu I、BsuR I、Bal I、Hal Ⅲ、HPa I、Sma I等，切割位点在回文序列中间，形 成平整末端。Alu I的切割位点如下： 5'-A G^C T-3' 3'-T C^G A-5'
限制性核酸内切酶百科名片
其3′→5′外切酶活性使双链DNA分子产生出单链区，经过这种修饰的DNA 再配合使用Klenow酶，同时加进带放射性同位素的核苷酸，便可以制备特异性的放射性探针。 核酸内切酶 核酸内切酶（endonuclease）在核酸水解酶中，为可水解分子链内部磷酸二酯键生成寡核苷酸的酶，与核酸外切酶相对应。从对底物的特异性来看，可分为DNaseⅠ、DNaseⅡ等仅分解DNA的酶；脾脏RNase、RNaseT1等仅分解RNA的酶。如链孢霉（Neurospora）的核酸酶就是既分解DNA又分解RNA的酶。一般来说，大都不具碱基特异性，但也有诸如脾脏RNase、RNaseT1等或限制性内切酶那种能够识别并切断特定的碱基或碱基序列的酶。[1] 寡核苷酸，是一类只有20个以下碱基对的短链核苷酸的总称（包括脱氧核糖核 酸DNA或核糖核酸RNA内的核苷酸），寡核苷酸可以很容易地和它们的互补对链接，所以常用来作为探针确定DNA或RNA的结构，经常用于基因芯片、电泳、荧光原位杂交等过程中。 RNA聚合酶 科技名词定义 中文名称：RNA聚合酶 英文名称：RNA polymerase 定义1：以一条DNA链或RNA链为模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；酶（二级学科） 定义2：以一条DNA链或RNA链为模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。 所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞遗传（二级学科）
定义3：以DNA或RNA为模板合成RNA的酶。 所属学科：遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 RNA聚合酶（RNA polymerase）:以一条DNA链或RNA为模板催化由核苷-5′-三磷酸合成RNA的酶。是催化以DNA为模板（template）、三磷酸核糖核苷为底物、通过磷酸二酯键而聚合的合成RNA的酶。因为在细胞内与基因DNA的遗传信息转录为RNA有关，所以也称转录酶。 逆转录酶 科技名词定义 中文名称：逆转录酶 英文名称：reverse transcriptase 其他名称：依赖于RNA的DNA聚合酶(RNA-dependent DNA polymerase,RNA指导的DNA聚合酶 (RNA-directed DNA polymerase) 定义：编号：EC 2.7.7.49。以RNA为模板催化脱氧核苷-5′-三磷酸合成DNA的酶。在逆转录病毒及其他某些病毒中发现有此类酶。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；酶（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布
第三章限制性内切核酸酶 一、填空题 1. 严格地说限制性内切核酸酶(restriction endonuclease)是指已被证明是的酶。基因工程中把 那些具有识别的内切核酸酶统称为限制性内切核酸酶。 2.年Luria和Human在T偶数噬菌体对大肠杆菌感染实验中首次发现了细菌的现象。 3.1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种限制酶，能够特异性的切割DNA， 这个酶后来被命名为，这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核酸酶。 4.通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可 以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的。 5.Ⅱ类限制性内切核酸酶分子量较小．一般在20~40kDa，通常由——亚基所组成。它们的作用底物 为双链DNA，极少数Ⅱ类酶也可作用于单链DNA，或DNA／RNA杂合双链；这类酶的专一性强，它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求，而且对更远的碱基也有要求，因此，Ⅱ类酶既具有专一性，也具有专一性，一般在识别序列内切割。切割的方式有，产生末端的DNA片段或的DNA片段。作用时需要——作辅助因子，但不需要和 6.完全的回文序列具有两个基本的特点，就是：和 7.Ⅱ类限制性内切核酸酶一般识别个碱基，也有识别多序列的限制性内切核酸酶；根据对限制性内切核酸酶识别序列的分析，限制性内切核酸酶识别序列具有倾向，即它们在识别序列中含量较高。 8.EcoK是I类限制性内切核酸酶，分子组成是_______ 分子量是300kDa.在这些亚基中，α亚基具有 作用；β亚基具有的活性;γ亚基的作用则是， 9.个体之间DNA限制性片段长度的差异叫 10.限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自，第二、三两个字母取自，第四个字母则用表示。 11.限制性内切核酸酶AcyI识别的序列是5’-GRCGYG-3’，，其中R，Y 12.在酶切反应管加完各种反应物后，需要离心2秒钟，其目的是和 13.部分酶切可采取的措施有：(1)(2)(3)等。 14.第一个分离的限制性内切核酸酶是；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是 15.限制性内切核酸酶BsuRI和HaeⅢ的来源不同，但识别的序列都是,它们属于。 16.由于DNA是由4种碱基组成的，所以任何限制性内切核酸酶的切割频率的理沦值应该是· 17.SalI和NotI都是哺乳动物中识别序列稀有的酶，在哺乳动物基因组的5kb片段中，找到NotI切点 的概率是。 18.部分酶切是指控制反应条件，使得酶在DNA序列上的识别位点只有部分得到切割，它的理论依据 是。 19.Ⅰ类限制酶识别DNA的位点和切割的DNA位点是不同的．切割位点的识别结合有两种模型，一种是，另一种是。 20.限制性内切核酸酶通常保存在浓度的甘油溶液中。 二、判断题 1.限制与修饰现象是宿主的一种保护体系，它足通过对外源DNA的修饰和对自身DNA的限制实现的。 2.限制性内切核酸酶在DNA中的识别／切割位点的二级／三级结构也影响酶切效率, 一般来说， 完全切割质粒或病毒DNA，要比切割线状DNA需要更多的酶，最高的需要20倍， 3.如果限制性内切核酸酶的识别位点位于DNA分子的末端，那么接近末端的程度也影响切割，如 HpaII和MboI要求识别序列之前至少有一个碱基对存在才能切割。 4.能够产生防御病毒侵染的限制性内切核酸酶的细菌，其本身的基因组中没有被该核酸酶识别的序列。 5.限制性图谱与限制性片段长度多态性(RFLP)图谱的最显著的区别在于前者是一个物理图谱而后者
《实用内科学》限制性核酸内切酶 1953年Watson 和Crick 发现了DNA 双螺旋结构，并揭示了DNA 自我复制的机制，为分子生物学树立了里程碑，使人们开始用分子生物学的语言来解释人类的遗传现象。1961年Mar mur 和Doty 发现了DNA 分子的复性规律并建立了核酸分子杂交技术；1966年Nirenberg，Crick 和Ochoa 等破译了人类的遗传密码，并提出了遗传信息的中心法则；1968年Arber 等发现了DNA 限制性内切酶；1972年Boyer，Cohen 和Berg 成功地建立了DNA 无性繁殖技术；1975年Sanger 和Gilbert 建立了DNA 分子中核苷酸顺序分析法。在上述基础理论和基本技术的基础上建立的重组DNA‐基因工程技术，已成为分子生物学的核心技术，并已渗透到生命科学的各个领域，在医学领域尤为突出，不仅研制了多种多样的疫苗、药物和诊断试剂用于防病治病，而且揭示了许多疾病的发病机制都与特定基因的结构和功能、基因表达及其调控有关。而今，RNA 干涉和表观遗传学的发现，使现代分子生物学深刻地促进着医学的发展。 重组DNA 技术 重组DNA 技术（recombinant DNA technology）主要包括：限制性核酸内切酶等工具酶的应用、基因的无性繁殖、核酸分子杂交和DNA 分子的核苷酸序列分析。 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶多数从大肠杆菌中制备，能识别DNA 分子内部特异的对称顺序［通常为4～8个碱基对（base pair，bp；千碱基对kbp，简写kb）］，对称部位的一条链旋转180°，则两条链顺序完全相同。限制性核酸内切酶水解切断每条链的一个3′，5′‐磷酸二酯键，形成5′‐PO4末端和3′‐OH 末端。有的限制性核酸内切酶在不同的平面上切割DNA 的两条单链，其切割点在旋转对称轴上，切割后两条单链末端不在同一平面上，使每条链上都留下一段（约2～6个核苷酸）伸出来的单链，这段单链的顺序很有规律，不论哪一条，从5′→3′端读去，结构相同，因为DNA 是逆行排列碱基互补的双链，所以这两段单链的碱基彼此互补，可再次形成氢键，使DNA 重新环化。这种限制性核酸内切酶切下的末端称为黏性末端。有的限制性核酸内切酶在同一平面上切割DNA 的双链，切割后，两条单链的末端在同一平面上，称钝性末端（或平头末端）（表2‐1‐1）。钝性末端不能自行环化。无论黏性末端或钝性末端均必须在连接酶催化下才能在两个末端之间再次形成磷酸二酯键，使DNA 片段真正稳定地连接起来（图2‐1‐1）。 表2‐1‐1 限制性核酸内切酶切点及切割后末端结构
解读《限制性核酸内切酶应用的考点例析》 我们知道限制性核酸内切酶（限制酶）是指能识别DNA中特定碱基顺序，并在特定位点切割双链DNA的核酸内切酶。它在生物学中应用相当广泛，是基因工程中的工具酶，用来构建重组DNA分子，对于遗传性疾病的基因定位和基因诊断的研究也具有重要的应用价值。下面我们以问题的形式简要地了解它在这些方面的应用。 1。限制酶的特点 例1．下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（） A．GAATTC B．GGGGCCCC C．CTGCAG D．CTAAATC CTTAAG CCCCGGGG GACGTC GATTTAG 解析：限制酶识别的各种序具有回文对称的特点。所谓回文对称序列就是当以不同的方向分别阅读DNA的两条互补链时，DNA的两条链上的碱基序列相同。如A中的DNA分子，其中一条链从左向右阅读碱基序列是GAA TTC，另一条互补链从右向左阅读碱基序列也是GAATTC。 答案：D 例2．限制酶HindⅢ酶切DNA的识别序列是AAGCTT，限制酶HpaⅡ酶切DNA的识别序列是CCGG。假定DNA分子中A、T、G、C所含的比例相等，那么，限制酶HindⅢ酶切割双链DNA的概率是，酶切位点间的平均距离约kb（千碱基）；限制酶HpaⅡ酶切割双链DNA的概率是，酶切位点间的平均距离约kb。 解析：因为限制酶识别序列具有回文对称序列的特点，这两个序列在相应的互补链上又会呈现，因此我们只需考虑DNA的一条链即可。六碱基长HindⅢ识别序列AAGCTT出现的概率是（1/4）6或1/4096，因此HindⅢ酶切位点之间的平均距离大约为4 kb。同样的道理，4碱基长的HpaⅡ酶识别序列CCGG出现的概率是（1/4）4或1/256，因此HpaⅡ酶切位点的平均距离大约为0.25 kb。 2．黏性末端与限制酶类型的关系 例3．用同一种限制酶处理会产生相同的黏性末端，但用不同的限制酶处理也可能产生相同的黏性末端。下列所示的四个黏性末端是由（）种限制酶作用产生的。 解析：不同的限制酶的识别序列和切割位点不同。要判断题中的4个黏性末端是由几种限制酶作用下产生的，不光要看共有几种黏性末端，更重要的是要看作用产生这些黏性末端的限制酶的识别序列和切割位点是否相同。经过分析，题中4幅图所示的黏性末端应该分别是由4种限制酶作用产生的，这4种酶的识别序列及切割位点依次是：G↓AATTC，C↓AA TTG，G↓TTAAC，C↓TTAAG。 答案：4 3．限制酶图谱分析 例4．一线性DNA分子分别用限制酶HindⅢ和SmaⅠ消化，然后用这两种酶混合消化，得到如下片段： HindⅢ 2.5 kb，5.0 kb SmaⅠ 2.0 kb，5.5 kb HindⅢ和SmaⅠ 2.5 kb，3.0 kb，2.0 kb （1）画出此丝性DNA分子的限制酶图谱。 （2）两酶混合消化的片段再用限制酶EcoRⅠ消化，结果导致凝胶上3.0 kb的片段消失，产
第二章限制性内切核酸酶 一、填空题 1．严格地说限制性内切核酸酶(restriction endonuclease)是指已被证明是的酶。基因工程中把那些具有识别的内切核酸酶统称为限制性内切核酸酶。2．年Luria和Human在T偶数噬菌体对大肠杆菌感染实验中首次发现了细菌的现象。 3．1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种限制酶，能够特异性的切割DNA，这个酶后来被命名为，这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核酸酶。 4．通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的。5．Ⅱ类限制性内切核酸酶分子量较小．一般在20~40kDa，通常由亚基所组成。它们的作用底物为双链DNA，极少数Ⅱ类酶也可作用于单链DNA，或DNA／RNA杂合双链。这类酶的专一性强，它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求，而且对更远的碱基也有要求，因此，Ⅱ类酶既具有专一性，也具有专一性，一般在识别序列内切割。切割的方式有，产生末端的DNA片段或的DNA 片段。作用时需要作辅助因子，但不需要和。6．完全的回文序列具有两个基本的特点，就是：(1) (2) 。 7．Ⅱ类限制性内切核酸酶一般识别个碱基，也有识别多序列的限制性内切核酸酶。根据对限制性内切核酸酶识别序列的分析，限制性内切核酸酶识别序列具有倾向，即它们在识别序列中含量较高。 8．EcoK是I类限制性内切核酸酶，分子组成是α2β2 γ，分子量300kDa。在这些亚基中，o亚基具有作用；β亚基具有的活性；γ亚基的作用则是。 9．个体之间DNA限制性片段长度的差异叫。10．限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自，第二、第三两个字母取自，第四个字母则用表示。11．限制性内切核酸酶Acy I识别的序列是5’—GRCGYG-3’，其中R ，Y 。12．在酶切反应管加完各种反应物后，需要离心2秒钟，其目的是和。13．部分酶切可采取的措施有：(1) (2) (3) 等。14．第一个分离的限制性内切核酸酶是；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是。 15．限制性内切核酸酶BsuRI和HaeⅢ的来源不同，但识别的序列都是，它们属于。 16．由于DNA是由4种碱基组成的，所以任何限制性内切核酸酶的切割频率的理论值应该是。 17．Sal I和Not I都是哺乳动物中识别序列稀有的酶，在哺乳动物基因组的5kb片段中，找到NotI切点的概率是。 18．部分酶切是指控制反应条件，使得酶在DNA序列上的识别位点只有部分得到切割，它的理论依据是。 19．I类限制酶识别DNA的位点和切割的DNA位点是不同的，切割位点的识别结合有两种模型，一种是，另一种是。20．限制性内切核酸酶通常保存在浓度的甘油溶液中。
限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶：是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一 类内切酶。 限制性核酸内切酶的分类： 根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一 型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。 第一型限制酶 同时具有修饰(modification)及认知切割(restriction)的作用；另有认知(recognize)DNA上特定 碱基序列的能力，通常其切割位(cleavage site)距离认知位(recognition site)可达数千个碱基之远,并不能准确定位切割位点，所以并不常用。例如：EcoB、EcoK。 第二型限制酶 只具有认知切割的作用，修饰作用由其他酵素进行。所认知的位置多为短的回文序列(palindrome sequence)；所剪切的碱基序列通常即为所认知的序列。是遗传工程上，实用性较 高的限制酶种类。例如：EcoRI、HindIII。 第三型限制酶 与第一型限制酶类似，同时具有修饰及认知切割的作用。可认知短的不对称序列，切割位与 认知序列约距24-26个碱基对，并不能准确定位切割位点，所以并不常用。例如： EcoPI、HinfIII。 限制酶在遗传学方面的应用： 1、在甚因工程方面 利用能产生“粘性末端”的限制酶, 进行DNA的体外重组, 是较为方便的, 只要用同一 限制酶处理不同来源的DNA, 由于所产生的水解片段具有相同的粘性末端, 可以彼此“粘合”,再经连接酶处理, 就成为重组DNA分子了. 目前, 基因工程上, 限制酶主要应用于以下两方面 ? （1）目的基因与载体的重组 细菌细胞中的限制酶能水解外源DNA , 因此必须通过适当的载体(质粒或噬菌体)的帮助 才能将外源DNA引人受体细胞并在其中增殖和表达。将供体DNA与载体用同样的限制酶处理, 使载体带上各种各样的外源DNA片断, 然后引人受体细菌细胞增殖, 菌细胞增殖, 再筛 选出所需的菌株, 便获得带有某一目的基因的繁殖系.用这种方法, 已成功地将酵母菌的咪哇
名师精编优秀资料 限制性核酸内切酶相关知识归纳 编制：军长 2013.12.10 限制性核酸内切酶是基因工程中最难把握的知识点，高考中对这种酶的考察特别重视，我们有必要对其相关的知识进行归纳，才有利于解答试题。 1 限制性核酸内切酶的基本知识 ①来源及化学本质:主要是从原核生物中分离纯化出来的。化学本质为蛋白质。 ②作用：催化作用，可用于DNA的切割获取目的基因和载体的切割，切割的化学键为磷酸二酯键。 ③作用特点：特异性,即限制酶可识别特定的脱氧核苷酸序列,切割特定位点。 ④切割方式：错位切--产生两个相同的黏性末端，平切--形成平末端。如果是错位切则将一个基因从DNA分子上切割下来,需要破坏4个磷酸二酯键,同时产生4个黏性末端，增加4个游离的磷酸基团。 2 限制性核酸内切酶的难点解析 2.1 目的基因切割要点归纳 ①要把目的基因切割下来需要在目的基因的两边都进行切割，但绝对不可以破坏目的基因的结构。 ②切割目的基因的酶可以用同一种限制酶，也可以用两种不同的限制酶。 ③切割产生的末端有三种情况：都是平末端、都是粘性末端、一边是粘性末端，一边是平末端。 2.2 质粒切割要点归纳 ①质粒的切割可以切一个切口，也可以切两个切口。如果是一个切口，则连接时可能会产生一些我们不需要的连接物(如自身环化等)；如果是两个切口则质粒会丢失一段DNA片段，但可以控制连接物就是我们需要的目的基因和质粒的连接。切割时注意不要破坏了载体上的标记基因（至少保留有一个标记基因）、终止子、启动子、复制原点等。 ②切割质粒的酶可以用同一种限制酶，也可以用两种不同的限制酶。 ③切割产生的末端有三种情况：都是平末端，都是粘性末端，一边是粘性末端，一边是平末端。 2.3 限制性核酸内切酶的说明 不同的酶识别序列一般不同，但也有识别序列相同的。如果识别序列相同，切割点也相同则切割产生的粘性末端一样。一种酶的识别序列中可能包含另外一种酶的识别序列，切割时可以产生相同的粘性末端。不同的酶识别的序列一般不同，但有时也可能相同，这时切割产生的粘性末端也相同。 2.4 酶切割后的DNA片段的连接 如果是用一种限制性内切酶切割质粒表达载体和目的基因, 不可以防止载体和目的基因的自身环化,两个DNA片段连接产物有：目的基因—目的基因；目的基因—载体；载体—载体。这些连接物可以环化。如果是用两种不同的限制性内切酶切割载体和目的基因, 可以防止载体和目的基因的自身环化, 同时可以防止目的基因和质粒表达载体在酶切后不发生任意连接。两个DNA片段连接产物也有：目的基因—目的基因；目的基因—载体；载体—载体。这些连接物也可以环化。
限制性核酸内切酶相关知识归纳 编制：军长 2013.12.10 限制性核酸内切酶是基因工程中最难把握的知识点，高考中对这种酶的考察特别重视，我们有必要对其相关的知识进行归纳，才有利于解答试题。 1 限制性核酸内切酶的基本知识 ①来源及化学本质:主要是从原核生物中分离纯化出来的。化学本质为蛋白质。 ②作用：催化作用，可用于DNA的切割获取目的基因和载体的切割，切割的化学键为磷酸二酯键。 ③作用特点：特异性,即限制酶可识别特定的脱氧核苷酸序列,切割特定位点。 ④切割方式：错位切--产生两个相同的黏性末端，平切--形成平末端。如果是错位切则将一个基因从DNA分子上切割下来,需要破坏4个磷酸二酯键,同时产生4个黏性末端，增加4个游离的磷酸基团。 2 限制性核酸内切酶的难点解析 2.1 目的基因切割要点归纳 ①要把目的基因切割下来需要在目的基因的两边都进行切割，但绝对不可以破坏目的基因的结构。 ②切割目的基因的酶可以用同一种限制酶，也可以用两种不同的限制酶。 ③切割产生的末端有三种情况：都是平末端、都是粘性末端、一边是粘性末端，一边是平末端。 2.2 质粒切割要点归纳 ①质粒的切割可以切一个切口，也可以切两个切口。如果是一个切口，则连接时可能会产生一些我们不需要的连接物(如自身环化等)；如果是两个切口则质粒会丢失一段DNA片段，但可以控制连接物就是我们需要的目的基因和质粒的连接。切割时注意不要破坏了载体上的标记基因（至少保留有一个标记基因）、终止子、启动子、复制原点等。 ②切割质粒的酶可以用同一种限制酶，也可以用两种不同的限制酶。 ③切割产生的末端有三种情况：都是平末端，都是粘性末端，一边是粘性末端，一边是平末端。 2.3 限制性核酸内切酶的说明 不同的酶识别序列一般不同，但也有识别序列相同的。如果识别序列相同，切割点也相同则切割产生的粘性末端一样。一种酶的识别序列中可能包含另外一种酶的识别序列，切割时可以产生相同的粘性末端。不同的酶识别的序列一般不同，但有时也可能相同，这时切割产生的粘性末端也相同。 2.4 酶切割后的DNA片段的连接 如果是用一种限制性内切酶切割质粒表达载体和目的基因, 不可以防止载体和目的基因的自身环化,两个DNA片段连接产物有：目的基因—目的基因；目的基因—载体；载体—载体。这些连接物可以环化。如果是用两种不同的限制性内切酶切割载体和目的基因, 可以防止载体和目的基因的自身环化, 同时可以防止目的基因和质粒表达载体在酶切后不发生任意连接。两个DNA片段连接产物也有：目的基因—目的基因；目的基因—载体；载体—载体。这些连接物也可以环化。 1
限制性内切酶综述 30多年前，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。细菌可以抵御新病毒的入侵，而这种"限制"病毒生存的办法则可归功于细胞内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶。首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoR I和EcoR II，以及来源于Heamophilus influenzae的Hind II和Hind III。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功能及表达非常有用的工具。 当限制性内切酶的应用在上世纪七十年代流传开来的时候，以NEB为代表的许多公司开始寻找更多的限制性内切酶。除了某些病毒以外，限制性内切酶只在原核生物中被发现。人们正在从数以千计的细菌及古细菌中寻找新的限制性内切酶。而对已测序的原核基因组数据分析表明，限制性内切酶在原核生物中普遍存在--所有自由生存的细菌和古细菌似乎都能编码限制性内切酶。 限制性内切酶的形式多样，从大小上来说，它们可以小到如Pvu II（157个氨基酸），也可以比1250个氨基酸的Cje I更大。在已纯化分类的3000种限制性内切酶中，已发现了超过250种的特异识别序列。其中有30%是在NEB发现的。对具有未知特异识别序列的限制性内切酶的研究发现工作仍在继续。人们从分析细胞提取物的生化角度研究的同时，也采用计算机分析已知的基因组数据，以期有更多的发现。尽管很多新发现的酶的识别序列与已有的重复--即同裂酶，仍然有识别新位点的酶不断被发现。 上世纪80年代，NEB开始克隆并表达限制性内切酶。克隆技术由于将限制性内切酶的表达与原有细胞环境分离开来，避免了原细胞中其它内切酶的污染，从而提高了酶的纯度。此外，克隆技术提高了限制性内切酶的产量，简化了纯化过程，使得生产成本显著降低；克隆的基因很容易进行测序分析，表达出的蛋白也能进行X射线结晶分析，这使得我们对于克隆产物更加确定。 限制性内切酶
目录 摘要 (1) 关键词 (1) Abstract (1) Key words (1) 1、限制性核酸内切酶的定义 (2) 2、限制性核酸内切酶的起源 (3) 2、1限制与修饰现象 (4) 2、2限制酶的发现 (5) 3、限制性核酸内切酶的分类 (6) 4、限制性核酸内切酶识别的序列 (7) 4.1、限制酶识别序列的长度 (7) 4.2、限制酶识别序列的结构 (8) 4.3、限制酶切割的位置 (9) 5、限制性核酸内切酶产生的末端 (9) 5.1、限制酶产生匹配粘端（matched ends） (9) 5.2、限制酶产生平末端（Blunt end） (10) 5.3、限制酶产生非对称突出端 (10) 6、限制性核酸内切酶的应用 (10) 参考文献 (12) 致谢 (13)
摘要：限制性核酸内切酶简称限制性核酸酶。这是一类能从DNA分子中间水解磷酸二酯键,从而切断双链DNA的核酸水解酶。它们不同于一般的脱氧核糖核酸酶（DNase）,它们的切点大多很严格，要求专一的核苷酸顺序──识别顺序。长期以来，难以深入研究的DNA大分子,借此可以切割成特定的小片段来分析。限制性核酸酶的发现,为基因结构、DNA碱基顺序分析和基因工程的研究开辟了途径。 关键词：限制性核酸内切酶种类起源识别序列应用 Abstract：Short restriction endonuclease restriction nucleases.This is a class of DNA molecules from the middle of the phosphodiester bond hydrolysis, thereby cutting off the double-stranded DNA nuclease enzymes. They are different from the general deoxyribonuclease (DNase), they are mostly very strict cut-off point, requiring specific nucleotide sequence ─ ─ recognition sequence. For a long time, in-depth study of DNA molecules is difficult, to be cut into small fragments specific for analysis. The discovery of restriction nucleases for gene structure, DNA base sequence analysis and genetic engineering research opens the way. Key words ：Restriction endonuclease Species Origin Recognition sequence Application
限制性内切酶的一般原则和建议 1．如何做酶切反应？ 该问题看似什么简单：DNA中加上酶，然后保温一段时间就可以了。但是在实际操作过程中，我们不断听到：切不动，装不上。问题在什么地方？能系列生产限制性内切酶的公司国际上，就那么几个，位列前3 的是NEB, Fermentas, SibEnzyme。这些公司提供酶的品质一般都能得到保证。您可以怀疑酶的质量问题，但是更多的问题来源于模板是否合适酶切要求。下面几点对你的酶切是有帮助的。 1) 成功酶切的关键是准备好模板DNA。DNA样品中不能含有有机溶剂（会使酶变性或产生星号货性），不能含有干扰酶活性的污染物质，不能含有高浓度的EDTA (TE中的EDTA 浓度较低，对Mg的浓度影响较小)；同时要对DNA甲基化程度及其对酶切效率的影响要做到心中有数。 2) 选用合适的酶。根据酶切序列选用，特别注意选用甲基化对酶活性的干扰。 3) 正确使用和保存酶。酶需要保存在-20度的低温环境中，只是在需要用酶才从冰箱中取出来。运输和临时存放时需要将酶至于冰上。手拿酶管时不要接触酶管下步含酶的部分，移酶时尽可能用长TIP, 避免污染。用完后需要及时送回原处。注意：酶通常是最后加。所有4) 反应体积需要根据实验目的定，常规的酶切一般要维持在10-50ul，酶切鉴定10-20ul就可以了。 5) 模板浓度问题：浓度过高，溶液黏度过大，酶不能有效扩散，酶切效果不会好。浓度过低，也会影响酶活性。 6)注意模板用量和反应体积的关系。对酶用量，模板用量，反应体积等要素的确定需要的是时间和经验的积累。 7) 酶切反应的各个组分加完后，需要用TIP小心混匀几次，short spin 一下就可以保温了。一般不能使用振荡器混匀。 8) 反应温度的选择。一般反应都用37度，但是Sma I 的最适合温度是25度，37度时酶仍表现出活性，但是效率下降50%。部分从耐热菌制备的酶需要在37度以上的温度反应，如Taq I的最适温度为65度，37度保温，效率仅为前者的1/10。 9) 反应时间的选择。一般酶切鉴定30分钟就可以了。要完全酶切可以采用少量的酶长时间反应，或较高的酶量短时间处理都可以达到。在使用高酶量的时候需要注意甘油的最终浓度不要超过5%，也就是说10ul的体系，酶的用量不要超过1ul。