【课题】：课题6 血红蛋白的提取和分离【备课人】：
【备课时间】：【上课时间】：
【课型】：复习【课时数】：1课时
【复习目标】
本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。
【复习重点与难点】
复习重点：凝胶色谱法的原理和方法。
复习难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。
【知识回顾】：
一、实验原理
蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。
1．凝胶色谱法（分配色谱法）：
（1）原理：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。
（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。
（3）分离过程：
混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子
＊洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。
（4）作用：分离蛋白质，测定生物大分子分子量，蛋白质的脱盐等。
2．缓冲溶液
（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，HC－NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。
（2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。
3．凝胶电泳法：
（1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。
（2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
（3）分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。
二、实验步骤
1．样品处理
①红细胞的洗涤
洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，采集的血样要及时采用低速短时间离心分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。
②血红蛋白的释放
在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。
注：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。
2．粗分离
①分离血红蛋白溶液
将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的甲苯层，第2
层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。
②透析
取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中，透析12h。透析可以去除样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。
3．纯化
调节缓冲液面：打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝↓胶面平齐，关闭出口。
加入蛋白质样品：用吸管将透析后的样品沿管壁环绕移动加到色谱柱的顶端。加样后，∣打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全渗入凝胶层后，
↓关闭出口。
调节缓冲液面：加入20mmol/L的磷酸缓冲液到适当高度
↓
洗脱：连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。
↓
收集分装蛋白质：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集。
4.纯度鉴定------SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）
三、注意事项
1.电泳技术
电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。
2. 红细胞的洗涤
如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。
3．如何检测凝胶色谱柱的装填是否成功
由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。
此外，还可以加入大分子的有色物质，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。
4．为什么凝胶的装填要紧密、均匀？
如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。
5．沸水浴处理加入洗脱液的湿凝胶的目的
不但节约时间，还能除去凝胶中可能带有的微生物和排除凝胶内的空气。
6．G-75
“G”代表凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围，75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5g。
7．装填完后，立即用洗脱液洗脱的目的：使凝胶装填紧密
8．加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？
防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。
9．与其他真核细胞相比，红细胞的特点及这一特点对进行蛋白质的分离的意义哺乳动物及人的成熟的红细胞是双面凹圆饼状，没有细胞核和细胞器。其含有的血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。
10．如何检测血红蛋白的分离是否成功
如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。
【典例解析】
用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质（）
A路程较长，移动速度较慢B路程较长，移动速度较快
C路程较短，移动速度较慢D路程较短，移动速度较快
【习题巩固】
一．选择题
1．凝胶色谱法是根据（）分离蛋白质的有效方法。
A分子的大小B相对分子质量的大小C带电荷的多少D溶解度
2．缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（）基本不变。
A温度 B pH C渗透压D氧气浓度
3．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（）的电极移动。
A相同B相反C相对D相向
4.哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（）与氧气的运输有关。
A血红蛋白B肌红蛋白C肌动蛋白D肌球蛋白
5．血液由血浆和各种血细胞组成，其中（）的含量最多。
A白细胞B血小板C红细胞D淋巴细胞
6．为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（）。
A. NaCl
B.甲苯
C.蒸馏水
D.柠檬酸钠
7．将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层，其中第3层是（）
A无色透明的甲苯层B脂溶性物质的沉淀层C血红蛋白的水溶液D其他杂质的暗红色沉淀物
二．非选择题
1．电泳利用了待分离样品中各种分子以及、的不同，使带电分子产生不同的迁移速率，从而实现样品中各种分子的分离。
2．你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？
课题6 例题D BBBACDC
1答案：带电性质的差异；分子本身的大小；形状的不同
2答案：血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步。包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；在经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。
一、胶囊色谱(Micellar Chromatography,MC) 又称拟相液相色谱或假相液相色谱(Pseudophase LC)，是一种新型的液相色谱技术。特点是应用含有高于临界胶囊浓度的表面活性剂溶液作为流动相。所谓“胶囊”就是表面活性剂溶液的浓度超过其临界胶囊浓度(Critical MicelleConcentration,CMC)时形成的分子聚合体。通常每只胶囊由n个（一般为25～160个）表面活性剂单体分子组成，其形状为球形或椭圆球形。在CMC值以上的一个较大浓度范围内，胶囊溶液的某些物理性质（如表面张力、电导等等）以及胶囊本身的大小是不变的。构成胶囊的分子单体与溶液中自由的表面活性剂的分子单体之间存在着迅速的动态平衡。通常有正相与反相两种胶囊溶液。前者是由表面活性剂溶于极性溶剂所形成的亲水端位于外侧而亲脂端位于内部的胶囊；后者是指表面活性剂溶于非极性溶剂所形成的亲水端位于核心而亲脂基位于外面的胶囊。被分离组分与胶囊的相互作用和被分离组分与一般溶剂的作用方式不同，并且被分离组分和两种胶囊的作用也有差别。改变胶囊的类型、浓度、电荷性质等对被分离组分的色谱行为、淋洗次序以及分离效果均有较大影响。胶囊色谱就是充分运用了被分离组分和胶囊之间存在的静电作用、疏水作用、增溶作用和空间位阻作用以及其综合性的协同作用可获得一般液相色谱所不能达到的分离效果。适用于化学结构类似、性质差别细微的组分的分离和分析，是一种安全、无毒、经济的优越技术。 （一）原理：胶囊溶液是一种微型非均相体系(Microheterogenous system)。在胶囊色谱中，分离组分在固定相与水之间、胶囊与水相之间以及固定相与胶囊之间存在着分配平衡。组分的洗脱得为取决于三相之间分配系数的综合作用；同时定量地指出分离组分的容量因子k’的倒数值与胶囊浓度成正比，一般增加胶囊浓度即可获得较佳的分离效果。 （二）方法特点：与传统液相色谱的最大区别在于胶囊色谱流动相是由胶囊及其周围溶剂介质组成的一种微型的非均相体系，而常规流动相是一种均相体系。特点：1、高度的选择性：因分离组分与胶囊之间存在着静电、疏水以及空间效应的综合作用，只要通过流动相中胶囊浓度的改变，就可使分离选择性获得改善和提高。此外，通过适当固定相以及表面活性剂的选择也可提高分离选择性。 2、便于梯度洗脱：由于表面活性剂的浓度高于CMC后再增大浓度时，溶液中仅胶囊的浓度发生改变，而表面活性剂单体分子的浓度不变，不影响流动相与固定相的平衡过程，因而比传统的梯度洗脱技术大大缩短了分析时间，并减少了流动相的消耗，适用于常规。 3、提高检测灵敏度：胶囊流动相可增加某些化合物的荧光强度，从而提高检测灵敏度。还可稳定某些化合物在室温条件下发生的液体磷光。 4、因分离组分不易分出，故缺点是柱效低且不适于制备分离。 （三）常用表面活性剂：常用的阳离子表面活性剂主要有：溴化或氯化十六烷基三甲铵(Cetyltrimethylammoniumbromideor chloride,CTMAD或CTMAC)；阴离子表面活性剂有十二烷基硫酸钠(SDS)；非离子表面活性剂有Brij-35即(聚氧乙烯)35-十二烷基醚。 二、手性分离色谱(ChiralSeparationChromatography,CSC) 是采用色谱技术(TLC、GC和HPLC)分离测定光学异构体药物的有效方法。由于许多药物的对映体(Enantiomer)之间在药理、毒理乃至临床性质方面存在着较大差异，有必要对某些手性药物进行对映体的纯度检查。 （一）原理和方法：对映体化合物之间除了对偏振光的偏转方向恰好相反外，其理化性质是完全相同的，因而难以分离。传统方法（分步结晶法、酶消化法等）有很大局限性，特别是难以进行微量分离和测定。60年代前后，TLC、GC法逐渐用于对映体化合物的拆分。但这两种方法只能拆分不多的化合物，且需要较复杂的样品处理步骤，制备分离也难以进行。80年代初HPLC法迅速成为药物对映体分离和测定最为广泛应用的方法。 HPLC用于手性分离概括起来可分为两大途径：间接(CDR)和直接(CMPA、CSP)方法。
凝胶色谱法 添加摘要 凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高 分子物质有很高的分离效果。凝胶色谱法又称分 子排阻色谱法。 凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级 分析以及相对分子质量分布测试。目前已经被生 物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学 以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学 实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。 凝胶色谱法-分类 根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC ）和凝胶渗透色谱（GPC ）。 凝胶过滤色谱一般用于分离水溶 性的大分子，如多糖类化合物。 凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱 溶剂主要是水。 凝胶渗透色谱法主要用于有机溶 剂中可溶的高聚物 (聚苯乙烯、 聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯 酸甲酯等) 相对分子质量分布分 析及分离，常用的凝胶为交联聚 苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋 喃等有机溶剂。 凝胶色谱不但可以用于分离测定 高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离油溶性和水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。 近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。 凝胶色谱系统 凝胶色谱仪
凝胶渗透色谱技术原理 凝胶色谱法-分子筛效益 一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这 种现象叫分子筛效应。具有多孔 的凝胶就是分子筛。 各种分子筛的孔隙大小分布有一 定范围，有最大极限和最小极限。 分子直径比凝胶最大孔隙直径大 的，就会全部被排阻在凝胶颗粒 之外，这种情况叫全排阻。两种 全排阻的分子即使大小不同，也 不能有分离效果。直径比凝胶最 小孔直径小的分子能进入凝胶的 全部孔隙。如果两种分子都能全 部进入凝胶孔隙，即使它们的大 小有差别，也不会有好的分离效 凝胶色谱法原理 果。因此，一定的分子筛有它一 定的使用范围。 在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子较小的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小
专题5 DNA和蛋白质技术 课题3 血红蛋白的提取和分离 编制人：魏善春审核人：孙高宏包科领导： 【学习目标】 1、简述蛋白质提取和分离的基本原理 2、理解蛋白质提取与分离的实验操作过程 【重点与难点】 重点：蛋白质提取和分离的基本原理 难点：蛋白质提取与分离的实验操作（凝胶色谱操作）过程 【知识链接】 1.血红蛋白存在于何种细胞？其特性和作用分别是什么？ 2.为何不选用鸡血做实验材料？ 3.分离不同种类蛋白质的依据是什么？ 【自主学习内容一】基础知识（记忆） 1．凝胶色谱法：凝胶色谱法也称做，是根据分离蛋白质的有效方法。凝胶实际上是一些由构成的多孔球体，在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时的速度不同，相对分子质量较小的蛋白质由于能够路程较，移动速度；而相对分子质量较大的的蛋白质，只能在移动，路程，移动速度。 2．缓冲液缓冲液通常是由1～2种缓冲剂（如NaHCO3、（NH4）2SO4）溶解于水中配制而成；其作用是。 3．电泳：电泳是指电泳利用了待分离样品中各分子以及，使带电分子产生不同的，从而实现样品中各种分子的分离。两种常用的电泳方法是和。在测定蛋白质分子量时通常使用，其中SDS的作用是，。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率取决于它以及等因素。【自主学习内容二】实验操作（凝胶色谱法） 1.蛋白质的提取和分离一般分四步：、、和。 2.样品处理 （1）红细胞的洗涤：洗涤红细胞的目的是采
集的血样要及时通过采用的方法使红液分层，用胶头吸管吸出上层透明的黄色，将下层红细胞倒入烧杯，再加入，缓慢搅拌低速离心，如此重复三次，直到，表明红细胞忆洗涤干净。注意：离心转速及离心时间不能过长，否则，达不到分离效果。 （2）血红蛋白的释放：原理是当外界溶液浓度低于细胞内液浓度时，细胞，红细胞由于没有的保护，而，释放出血红蛋白；使用的试剂是。 （3）分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的，第2层为白色薄层固体，是，第3层是红色透明的液体，这是，第4层是红细胞破碎物沉淀物（其他杂质，呈色）。将试管中的液体用滤纸过滤，除去，于分液漏斗中静置片刻后，分出层的红色透明液体。 （4）透析：取2mL的血红蛋白溶液装入中，将透析袋放入盛有300mL的物质量浓度为中（pH为），透析12h。透析可以去除样品中的杂质，或用于。 3．凝胶色谱操作 首先要；第二步是，因为，因此装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需的凝胶量。在装填凝胶柱时，不得有，避免影响分离效果；第三步是。【合作探究】 1．凝胶色谱分离蛋白质的原理是怎样的？ 2.根据凝胶色谱分离的原理分析，在装填凝胶时要紧密、均匀的原因。 【学习反思】
凝胶色谱法 添加摘要 凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。 凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。 凝胶色谱法-分类 根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC ）和凝胶渗透色谱（GPC ）。 凝胶过滤色谱一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。 凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物 (聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等) 相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。 凝胶色谱不但可以用于分离测定 高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离油溶性和水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。 近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。
凝胶渗透色谱技术原理 凝胶色谱法-分子筛效益 一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同 的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗 粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在 凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过 程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分 子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后 流出，分子最小的最后流出，这Array种现象叫分子筛效应。具有多孔 的凝胶就是分子筛。 各种分子筛的孔隙大小分布有一 定范围，有最大极限和最小极限。 分子直径比凝胶最大孔隙直径大 的，就会全部被排阻在凝胶颗粒 之外，这种情况叫全排阻。两种 全排阻的分子即使大小不同，也 不能有分离效果。直径比凝胶最 小孔直径小的分子能进入凝胶的 全部孔隙。如果两种分子都能全 部进入凝胶孔隙，即使它们的大 小有差别，也不会有好的分离效 果。因此，一定的分子筛有它一 定的使用范围。 在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大， 完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应 的部分。大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变 凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子， 在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而 分子较小的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小
色谱法的分类及其原理 （一）按两相状态 气相色谱法:1、气固色谱法 2、气液色谱法 液相色谱法:1、液固色谱法 2、液液色谱法 （二）按固定相的几何形式 1、柱色谱法(column chromatography) ：柱色谱法是将固定相装在一金属或玻璃柱中或是将固定相附着在毛细管内壁上做成色谱柱，试样从柱头到柱尾沿一个方向移动而进行分离的色谱法 2、纸色谱法（paper chromatography）：纸色谱法是利用滤纸作固定液的载体，把试样点在滤纸上，然后用溶剂展开，各组分在滤纸的不同位置以斑点形式显现，根据滤纸上斑点位置及大小进行定性和定量分析。 3、薄层色谱法(thin-layer chromatography, TLC) ：薄层色谱法是将适当粒度的吸附剂作为固定相涂布在平板上形成薄层，然后用与纸色谱法类似的方法操作以达到分离目的。 （三）按分离原理 按色谱法分离所依据的物理或物理化学性质的不同，又可将其分为：
1、吸附色谱法：利用吸附剂表面对不同组分物理吸附性能的差别而使之分离的色谱法称为吸附色谱法。适于分离不同种类的化合物（例如，分离醇类与芳香烃）。 2、分配色谱法：利用固定液对不同组分分配性能的差别而使之分离的色谱法称为分配色谱法。 3、离子交换色谱法：利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法，利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱主要是用来分离离子或可离解的化合物。它不仅广泛地应用于无机离子的分离，而且广泛地应用于有机和生物物质，如氨基酸、核酸、蛋白质等的分离。 4、尺寸排阻色谱法：是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法，体积大的分子不能渗透到凝胶孔穴中去而被排阻，较早的淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。这样，样品分子基本按其分子大小先后排阻，从柱中流出。被广泛应用于大分子分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。 5、亲和色谱法：相互间具有高度特异亲和性的二种物质之一作为固定相，利用与固定相不同程度的亲和性，使成分与杂质分离的色谱法。例如利用酶与基质（或抑制剂）、抗原与抗体，激素与受体、外源凝集素与多糖类及核酸的碱基对等之间的专一的相互作用，使相互作用物质之一方与不溶性担体形成共价结合化合物，
简介 凝胶色谱技术是上世纪六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，对高分子物质有很好的分离效果。在生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域被广泛采用，工业生产上也有非常广泛的应用。 一、分离原理 一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。具有多孔的凝胶就是分子筛。各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，就会全部被排阻在凝胶颗粒之外，这种情况叫全排阻。两种全排阻的分子即使大小不同，也不能有分离效果。直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙。如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差别，也不会有好的分离效果。因此，一定的分子筛有它一定的使用范围。综上所述，在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小的移动距离较长。于是分子较大的先通过凝胶床而分子较小的后通过凝胶床，这样就利用分子筛可将分子量不同的物质分离。另外，凝胶本身具有三维网状结构，大的分子在通过这种网状结构上的孔隙时阻力较大，小分子通过时阻力较小。分子量
高效液相色谱法的分类及其分离原理 高效液相色谱法分为：液-固色谱法、液-液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法。 1.液-固色谱法（液-固吸附色谱法） 固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的。 ①液-固色谱法的作用机制 吸附剂：一些多孔的固体颗粒物质，其表面常存在分散的吸附中心点。 流动相中的溶质分子X（液相）被流动相S带入色谱柱后，在随载液流动的过程中，发生如下交换反应： X（液相）+nS（吸附）<==>X（吸附）+nS（液相） 其作用机制是溶质分子X（液相）和溶剂分子S（液相）对吸附剂活性表面的竞争吸附。 吸附反应的平衡常数K为： K值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附的溶质分子很少，先流出色谱柱。 K值较大：表示该组分分子的吸附能力较强，后流出色谱柱。 发生在吸附剂表面上的吸附-解吸平衡，就是液-固色谱分离的基础。 ②液-固色谱法的吸附剂和流动相 常用的液-固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等。 一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（如硅胶、氧化铜）之间的作用力很弱，分配比k较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强，分配比k大，保留时间长。 对流动相的基本要求： 试样要能够溶于流动相中 流动相粘度较小 流动相不能影响试样的检测 常用的流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。 ③液-固色谱法的应用 常用于分离极性不同的化合物、含有不同类型或不；数量官能团的有机化合物，以及有机化合物的不同的异构体；但液-固色谱法不宜用于分离同系物，因为液-固色谱对不同相对分子质量的同系物选择性不高。 2.液-液色谱法（液-液分配色谱法） 将液体固定液涂渍在担体上作为固定相。 ①液-液色谱法的作用机制 溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离的目的。 液-液色谱法与液-液萃取法的基本原理相同，均服从分配定律：K=C固/C液 K值大的组分，保留时间长，后流出色谱柱。 ②正相色谱和反相色谱 正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂（如苯、正己烷等）作流动相。 反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂（如水、甲醇、己腈等）作流动相。
血红蛋白的提取和分离 目标导航 1.了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。2.理解缓冲液的组成和作用机理。3.体验提取生物大分子的基本过程和方法。 一、分离蛋白质的基本方法原理 1．蛋白质的分离方法——凝胶色谱法 凝胶色谱法也称做________________，是根据________________的大小分离________的有效方法。 相对分 子质量直径大小运动方式 运动速 度 运动 路程 洗脱 次序 大____凝胶颗粒空 隙直径，被排阻 在____ 垂直向下移动____较短 先从凝 胶柱洗 脱出来 小____凝胶颗粒空 隙直径，可以进 入颗粒内部 垂直向下移动， 无规则扩散进入 凝胶颗粒 ____较长 后从凝 胶柱洗 脱出来 2.缓冲液的作用和组成
(1)作用 在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界________和________对溶液 ________的影响，维持pH基本不变。 纯水的pH因加入少量的强酸或强碱而发生很大变化。然而，1滴浓盐酸加入到1 L CH3COOH—CH3COONa混合溶液或NaH2PO4—Na2HPO4混合溶液中，[H＋]的增加不到百分之一(从1.00×10－7 mol/L增到1.01×10－7 mol/L)，pH没有明显变化。 (2)组成 缓冲溶液通常由________种缓冲剂溶解于水中配制而成，调节缓冲剂的____________就可以制得________________________的缓冲液，其类型主要有3种： ①弱酸及其对应盐，如CH3COOH—CH3COONa，H2CO3—NaHCO3。 ②多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐，如 NaHCO3—Na2CO3，NaH2PO4—Na2HPO4。 ③弱碱及其对应盐，如NH3·H2O—NH4Cl。 3．电泳 (1)概念 电泳是指____________在________的作用下发生________的过程。许多重要的生物大分子，如________、________等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上________或________。在电场的作用下，这些带电分子会向着________________的电极移动。
血红蛋白提取与分离原理 一、选择题(每小题 4 分，共20分) 1．利用凝胶色谱法先洗脱出来的蛋白质是 ( ) 。 A ?相对分子质量大的 B ?溶解度高的 C.相对分子质量小的 D .所带电荷多的 解析相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量大的蛋白质，路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。 答案A 2.将经处理破裂后的红细胞混合液以 2 000 r/min 的速度离心10 min 后，离心管中 的溶液分为四层，从上到下的顺序依次是 ( ) 。 A .血红蛋白、甲苯层、脂溶性物质层、沉淀层 B .甲苯层、沉淀层、血红蛋白、脂溶性物质层 C.脂溶性物质层、血红蛋白、甲苯层、沉淀层 D .甲苯层、脂溶性物质层、血红蛋白、沉淀层 解析混合液经离心后，按密度大小排列，在离心管中从上到下的顺序依次是：第1层为无色透明的甲苯层；第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质沉淀层；第3层为红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液；第 4 层为暗红色沉淀物，主要是红细胞破碎物沉淀。 答案D 3.下列关于电泳的说法不正确的是 ( ) 。 A .电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 B .带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动 C.蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少 D .用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大 小 解析蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素，SDS能与各种蛋白质形成蛋白质一SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超
过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。 答案C 4?已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种物质，其分子大小、电荷的性质和数量情况如下图所示。下列叙述正确的是 ()。 k相对分子质量 丙. ?丁?戊 0 电荷基 A ?将样品装入透析袋中透析12 h,若分子乙保留在袋内，则分子甲也保留在袋内 B ?若五种物质为蛋白质，则用凝胶色谱柱分离时，甲的移动速度最快 C?将样品以2 000 r/min的速度离心10 min，若分子戊存在于沉淀中，则分子丙也 存在于沉淀中 D ?若五种物质为蛋白质，用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质分子， 则分子甲和分子戊形成的电泳带相距最近 解析透析的原理是相对分子质量小的物质能透过半透膜，相对分子质量大的物质不 能透过，乙保留在袋内，甲则不一定保留在袋内；凝胶色谱柱分离时，相对分子质 量小的物质路程长、移动慢；离心时相对分子质量大的物质先沉淀，戊沉淀，则 乙、丁、丙均已沉淀；用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质时，电泳迁移率主要 取决于分子大小。 答案C 5.下面说法不正确的是 ()。 A .在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸、碱对溶液pH的影响，维持 pH基本不变 B .缓冲溶液通常由1?2种缓冲剂溶解于水中配制而成 c?电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 D ?透析袋能使大分子自由进出，而将小分子保留在袋内 解析透析袋一般是用硝酸纤维素（又叫玻璃纸）制成的。透析袋能使小分子自由进
凝胶渗透色谱法（GPC） 一、凝胶渗透色谱 凝胶渗透色谱Gel Permeation Chromatography（GPC)，一种新型的液体色谱，原理是利用高分子溶液通过一个装填凝胶的柱子，在柱子中按分子大小进行分离。 柱子为玻璃柱或金属柱，内填装有交联度很高的球形凝胶。其中的凝胶类型有很多，都是根据具体的要求而确定（常用的有聚苯乙烯凝胶）。然而，无论哪一种填料，他们都有一个共同点，就是球形凝胶本身都有很多按一定分布的大小不同的孔洞（见图1）。 图1 GPC分离原理 不仅可用于小分子物质的分离与鉴定，而且可作为用来分析化学性质相同但分子体积不同的高分子同系物。可以快速、自动测定高聚物的平均分子量及分子量分布。现阶段，已经成为最为重要的测定聚合物的分子量与分子量分布的方法。 二、测定原理 凝胶色谱法的固定相采用凝胶状多孔性填充剂，是根据样品中各
种分子流体力学提及的不同进行分离的。比凝胶孔径大的分子完全不能进入孔内，随流动相沿凝胶颗粒间流出柱外，而娇小的分子则可或多或少地进入孔内。因此大分子流程短，保留值小；小分子流程长，保留值大，所以凝胶色谱是按分子流体力学体积的大小，从大到小顺序进行分离的。（见图2） 图2 GPC淋出曲线 溶质分子的体积越小，其淋出体积越大，这种解释不考虑溶质与载体间的吸附效应以及溶质在流动相和固定相中的分配效应，其淋出体积仅仅由溶质分子的尺寸和载体的孔径尺寸决定，分离完全是由于体积排除效应所致。 凝胶色谱的特点是样品的保留体积不会超出色谱柱中溶剂的总量，因为保留值的范围是可以推测的，这样可以每隔一定时间连续进样而不会造成谱峰的重叠，提高了仪器的使用率。 三、分子量校正曲线（LogM-V曲线） 凝胶色谱图计算样品的分子量分布的关键是把凝胶色谱曲线中的淋洗体积V转化成分子量M，这种分子量的对数
第15课时血红蛋白的提取和分离 1.归纳蛋白质多样性的原因 (1)图甲说明：氨基酸的种类不同，构成的肽链不同。 (2)图乙说明：氨基酸的数目不同，构成的肽链不同。 (3)图丙说明：氨基酸的排列次序不同，构成的肽链不同。 (4)图丁说明：肽链的数目和空间结构不同，构成的蛋白质不同。 2.血液包括血细胞和血浆，血细胞又分为红细胞、白细胞和血小板，其中红细胞含有血红蛋白，使红细胞呈现红色。 3.红细胞放到低渗溶液中，会吸收水分，体积膨胀直至涨破。
课堂导入 蛋白质是生命活动不可缺少的物质，随着基因组测序工作的完成，人们对蛋白质的研究和应用工作进入了新的时代，这就需要获得纯度较高的蛋白质。因此对蛋白质的分离就是生物学研究中经常要做的工作，下面我们就以血红蛋白的提取和分离来学习有关蛋白质的一些基本技术。
探究点一蛋白质分离技术 生物体内的蛋白质多种多样，按照科学的需要有时要把它们分开，分离蛋白质常使用的方法是凝胶色谱法和电泳法，都是根据不同蛋白质分子的之间的差异来分离的。 1.蛋白质特性的差异 (1)分子的形状和大小； (2)所带电荷的性质和多少； (3)溶解度； (4)吸附性质； (5)对其他分子的亲和力。 2.分离的方法 (1)凝胶色谱法 Ⅰ.概念：凝胶色谱法，也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。
Ⅱ.凝胶：是一些微小的多孔球体，大多数是由多糖类化合物构成的，内含许多贯穿通道，具有多孔的凝胶又称为分子筛。 Ⅲ.凝胶色谱法分离蛋白质的原理(如图A) ①蛋白质混合物上柱； ②洗脱开始，相对分子质量较小的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；相对分子质量较大的蛋白质则被排阻于凝胶颗粒之外； ③相对分子质量较小的蛋白质被滞留；相对分子质量较大的蛋白质向下移动； ④相对分子质量不同的蛋白质分子完全分开； ⑤相对分子质量较大的蛋白质行程较短，已从层析柱中洗脱出来，相对分子质量较小的蛋白质还在行进中。 (2)电泳 ①概念：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。 ②原理：在同一电场下，由于各种分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同，
专题5D N A与蛋白质技术 课题5.3 血红蛋白的提取和分离 辉县市第二高级中学李艳琴一、【课题目标】 知识与能力目标 1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白。 2、说出色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。 学科素养 1、基础知识（从血液中提取和分离血红蛋白；色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理）； 2、基本技能（通过体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，注意按照操作提示进行相关步骤，培养学生理论联系实际的能力）； 3、基本思想（通过体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神）； 4、基本活动经验（通过色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理的学习，关注学生科学态度的教育，拓展学生视野）。 二、【课题重点】 凝胶色谱法的原理和方法 三、【课题难点】 样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填 四、【教学方法】 启发式教学 五、【教学工具】 多媒体课件 六、【教学过程】 （一）引入新课
蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞内含量最高的有机化合物。对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识和理解。所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。怎样提取蛋白质呢？ （二）进行新课 1．基础知识 蛋白质的理化性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。 1.1凝胶色谱法（分配色谱法）： （1）原理：（图5－13a）分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。 （2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。 （3）分离过程：（图5－13b） 混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子 ＊洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。 1.2缓冲溶液 （1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。 （2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。 1.3凝胶电泳法： （1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。 ［思考］阅读教材后，填写下表： （2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 （优教提示：打开素材实验演示：琼脂糖凝胶电泳） （3）分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。 2．实验设计 （优教提示：打开素材实验演示：血红蛋白的提取和分离） 2.1蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤？
课题3 血红蛋白的提取和分离 蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞内含量最高的有机化和物。对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识和理解。所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。怎样提取蛋白质呢？ （二）进行新课 1．基础知识 蛋白质的物化理性质：______________________________________________________，由此提取和分离各种蛋白质。 1．1凝胶色谱法（分配色谱法）： （1）原理：（图5－13a）分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。 （2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。 （3）分离过程：（图5－13b） 混合物上柱→__________→___分子流动快、___分子流动慢→收集___分子→收集__分子 ＊洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。 1．2缓冲溶液 （1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，HC－NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等），______________________________________。 （2）缓冲液作用：______________________________________________。 1．3凝胶电泳法： （1）原理：不同蛋白质的__________________________不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。
（2）分离方法：_______________________、____________________等。 （3）分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的_______，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅___________________。 2．实验设计 2.1蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤？ ______________、_____________、_______、_____________。 思考：是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的？为什么？ _____。_______________________________________________。 2.2选择实验材料 （1）你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？ _____________。___________________________________________________。 （2）请阅读教材，认识哺乳动物血液组成及血红蛋白性质。并思考回答下列问题： 血液由和两部分组成。 血细胞中细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是。 该化合物是由和构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的 基团。 2.3从红细胞中分离出血红蛋白的过程为：洗涤红细胞、释放血红蛋白、分离血红蛋白、透析。洗涤红细胞的目的是什么？ _____________________________，有利于后续步骤的分离纯化。 红细胞的洗涤过程为 血液＋____________→___速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水→缓慢搅拌10min→____________离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无____色 思考：加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？ 防止__________；防止______________；防止____________________________。 思考：你有什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来？
SEC/GPC 凝胶渗透色谱分析的工作原理 PS-OBG 用作尺寸排除色谱（size exclusion chromatography ，又称凝胶渗透，gel permeation chromatography ）测量大分子分子量时的标准样品。 首先介绍尺寸排除色谱（SEC/GPC ）的工作原理： 如图三所示，红色和紫色两种颗粒代表不同尺寸的两种高分子，蓝色月牙形颗粒代表色谱柱内的填料。通常色谱柱填料是经过设计的具有不同孔径的高分子凝胶珠。当红色和紫色的高分子进入色谱柱以后，以一定速度流动的流动相在不停地冲洗色谱柱的同时，带动高分子颗粒在色谱柱内的移动。当高分子与凝胶珠填料接触时，尺寸大的高分子不能进入凝胶珠填料的孔，如图三中红色的大分子。所以红色的大分子在流动相的冲洗下先流出色谱柱。而紫色的尺寸较小的高分子可以进入凝胶填料珠的小孔，好像暂时被填料保留住了一样，最后由于流动相不停的冲洗，紫色高分子也会流出色谱柱，但是流出的时间较红色分子长了很多。图三右下方给出红色高分子和紫色高分子的凝胶色谱图，横坐标为保留时间，可以看出红色高分子的保留时间明显小于紫色高分子，这说明红色高分子分子量较大，比紫色高分子先流出色谱柱。 色谱柱的工作原理告诉我们，尺寸排除色谱可以将尺寸不同的高分子按照保留时间分开。保留时间越小的高分子（也就是流经色谱柱需要时间越短的高分子）的分子量越大，相反，保留时间越大的高分子（也就是流经色谱柱需要时间越长的高分子）的分子量越小。
懂得了这个原理，我们就可以用SEC/GPC来测分子量了！ 但是，如何根据保留时间来确定高分子的分子量呢？也就是说，怎么将不同的保留时间与分子量一一对应起来呢？这时我们需要制定一条标准工作曲线。标准工作曲线的目的是建立保留时间和分子量的关系，当我们用SEC/GPC测定了一个未知的高分子，得到这个高分子的流出时间（保留时间），有了工作曲线，我们就可以很快知道这个未知高分子的分子量。 标准工作曲线的制定 标准工作曲线由一系列分布很窄，分子量已知的高分子标样做出，同时标样的结构和分子链的构象要与未知高分子尽可能的接近。 1．首先选用与被测样品类型相似的单分散性(d≤1.1)标样。先用其他方法精确测定其绝对分子量（百特纯使用激光光散射的方法测得PS-OBG的绝对分子量）。 2．然后将PS-OBG标样进行SEC/GPC分析，得到每个窄分布标样的峰位淋洗体积(V e),也就是每个标样在色谱柱内的保留时间 流速。 3．以V e为X轴，logM为Y轴作图，这样就可以得到校正曲线。 式中,A,B为常数，A表示排斥极限, B表示渗透极限4．将待测高分子进行SEC/GPC分析，得到待测高分子的峰位淋洗体积V’。 在标准曲线上将V’推回Y轴得到logM’，此M’即为待测高分子的分子量。 百特纯大分子（武汉）科技有限公司是由供职于加拿大联邦政府农业部国家实验室科学家及其他投资人共同创办。目前主要从事碳水化合物大分子领域新品研发及应用。百特纯的目标是向高等研究单位、院校提供高质量、高纯度、高均一性（极窄分子量分布），特定结构的医药及功能性碳水化合物大分子标准品及凝胶色谱标样,燕麦葡聚糖标样,1%精制燕麦OBG水溶液。
高效液相色谱法地分类及其分离原理 高效液相色谱法分为：液固色谱法、液液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法. .液固色谱法（液固吸附色谱法） 固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上地吸附作用不同来进行分配地. ①液固色谱法地作用机制 吸附剂：一些多孔地固体颗粒物质，其表面常存在分散地吸附中心点. 流动相中地溶质分子（液相）被流动相带入色谱柱后，在随载液流动地过程中，发生如下交换反应： （液相）（吸附）<>（吸附）（液相） 其作用机制是溶质分子（液相）和溶剂分子（液相）对吸附剂活性表面地竞争吸附. 吸附反应地平衡常数为： 值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附地溶质分子很少，先流出色谱柱. 值较大：表示该组分分子地吸附能力较强，后流出色谱柱. 发生在吸附剂表面上地吸附解吸平衡，就是液固色谱分离地基础.资料个人收集整理，勿做商业用途 ②液固色谱法地吸附剂和流动相 常用地液固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等. 一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（如硅胶、氧化铜）之间地作用力很弱，分配比较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间地作用力很强，分配比大，保留时间长.资料个人收集整理，勿做商业用途 对流动相地基本要求： 试样要能够溶于流动相中 流动相粘度较小 流动相不能影响试样地检测 常用地流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等. ③液固色谱法地应用 常用于分离极性不同地化合物、含有不同类型或不；数量官能团地有机化合物，以及有机化合物地不同地异构体；但液固色谱法不宜用于分离同系物，因为液固色谱对不同相对分子质量地同系物选择性不高.资料个人收集整理，勿做商业用途 .液液色谱法（液液分配色谱法） 将液体固定液涂渍在担体上作为固定相. ①液液色谱法地作用机制 溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小地组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大地组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离地目地.资料个人收集整理，勿做商业用途 液液色谱法与液液萃取法地基本原理相同，均服从分配定律：固液 值大地组分，保留时间长，后流出色谱柱. ②正相色谱和反相色谱 正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂（如苯、正己烷等）作流动相. 反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂（如水、甲醇、己腈等）作流动相.
教学准备 1. 教学目标 1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白 2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理 2. 教学重点/难点 教学重点： 凝胶色谱法的原理和方法 教学难点： 样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填 3. 教学用具 教学课件 4. 标签 教学过程 （一）引入新课 蛋白质的知识回忆： 含量：占细胞干重的50％以上，是细胞中含量最多的有机化合物。 2、组成元素：C、H、O、N 3、基本单位：氨基酸 4、分子结构： 氨基酸—多肽—蛋白质 肽键：—CO—NH— 5、相对分子质量：高分子化合物
蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞内含量最高的有机化合物。对蛋白质的研究 有助于人们对生命过程的认识和理解。所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。怎样提取 蛋白质呢？ （二）蛋白质分子的差异性 1．基础知识 蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等 千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。 1．1凝胶色谱法（分配色谱法）： （1）原理：（见课件图）分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。 （2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。 （3）分离过程： 混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子 ＊洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。 1．2缓冲溶液 （1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，HC－NaC， NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。 （2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。 1．3凝胶电泳法： （1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。 ［思考］阅读投影补充材料后，填写下表：