大肠菌群和大肠杆菌的区别
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JM109，DH5a，BL21这些感受态有何区别 1：DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1 2：BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7 噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3） 3：BL21(DE3) pLysS菌株 该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS ，Camr 4：JM109菌株 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株 基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’5：TOP10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 基因型：F- ，mcr AΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU ，galK ，rps，(Strr) endA1，nupG 6：HB101菌株 该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验 基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1 M110或SCS110 大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5位置上引入甲基。常用的菌株都会产生dam,dcm，从而受到甲基化的影响. 部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等，一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。 大多数酶切位点的甲基化不影响切割，而有些会影响，如XbaI, BclI等。而且甲基化只发生在特定序列，以XbaI为例，只有在位点序列旁出现GA或TC，该XbaI位才会被甲基化。而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法： （1）选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化影响； （2）利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA的制备，如E.coli JM110和链霉菌等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲出，而后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细胞中抽提的DNA 就能被上述酶切割。 E.coli JM110
大肠杆菌种子液的制备 牛肉膏蛋白胨培养基的配方： 液体培养基 牛肉膏 3.0g 蛋白胨 10.0g 氯化钠 5.0g 水 1000ml pH 固体培养基在液体培养基的基础上再加入％－％的琼脂1 试管斜面与平板的制备 （1）称量按培养基配方比例依次准确称取蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂、水放入烧杯中。 （2）熔化在上述烧杯中先加入少于所需要量的水，用玻璃棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，药品完全溶解后， 补充水到所需的总体积。将称量好的％琼脂放入已溶的药 品中，再加热熔化，最后补充所损失的水分。 （3）调PH 在未调PH前，先用精密PH试纸测量培养基的原始PH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH, 边加边搅拌，并随时用PH试纸测基PH直到PH达到。反之 用1mol/L HCl进行调节。 （4）分装将培养基分装入三个试管中和三角烧瓶中。其试管装量不超过管高的1/5，三角烧瓶的量不超过1/2加塞培 养基分装完毕后，在试管口和三角烧瓶口上塞上棉塞。
（5）包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名 称、配制日期。 （6）灭菌将上述培养基以,121℃,15min高压蒸气灭菌。 （7）倒平板，取三个已消毒的培养皿，在无菌操作台上用三角烧瓶中的培养基倒制三个平板培养基，冷却。 （8）搁置斜面将灭菌的试管培养基冷却至50℃左右，将试管口端搁在玻璃棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的 一半为宜。 2 接种大肠杆菌斜面种子 (1) 取实验室储备的大肠杆菌BL21种子，在酒精灯附近， 用接种环在已制备好的斜面上接种上大肠杆菌。 (2) 将接种好的斜面放入37℃的恒温培养箱子中培养24h。 3 制备平板种子 (1) 在无菌条件下，取一支保存的大肠杆菌的斜面，用无菌 生理盐水将菌种冲洗下来，再用无菌生理盐水将其梯度 稀释为1倍，10倍，100倍和1000倍，用移液枪分别吸 取各梯度的溶液涂布平板(每个梯度涂布三个平板，每次 吸取溶液100ul)，然后在37℃培养箱中过夜。 （12）次日，挑取生长状态好，特征明显的单个菌落，接种于新鲜灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基中37℃，170r/min 恒温振荡培养18h作种子培养液。
目的 1 验证目的........................................ 错误!未定义书签。 2 适用范围........................................ 错误!未定义书签。
3 编写依据........................................ 错误!未定义书签。 4 简述............................................ 错误!未定义书签。 纯化水系统工艺流程设计.................................... 错误!未定义书签。 纯化水的使用点............................................ 错误!未定义书签。系统流程简图....................................... 错误!未定义书签。 5 验证职责及小组成员.............................. 错误!未定义书签。 6 验证计划........................................ 错误!未定义书签。 7 培训确认........................................ 错误!未定义书签。 8 设计确认........................................ 错误!未定义书签。 目的...................................................... 错误!未定义书签。 检查记录.................................................. 错误!未定义书签。 9 安装确认和运行确认.............................. 错误!未定义书签。 开箱检查和资料附件的确认.................................. 错误!未定义书签。 公用工程安装确认.......................................... 错误!未定义书签。 纯化水系统各设备单元安装确认和运行确认.................... 错误!未定义书签。 10 纯化水系统性能确认............................. 错误!未定义书签。性能确认目的....................................... 错误!未定义书签。 纯化水验证计划............................................ 错误!未定义书签。 取样方法.............................................. 错误!未定义书签。 纯化水合格标准........................................ 错误!未定义书签。 纯化水系统取样时间计划及频率.......................... 错误!未定义书签。 纯化水系统性能确认各阶段水质检验结果统计.................. 错误!未定义书签。 样品异常情况处理.......................................... 错误!未定义书签。 系统运行警戒指标.......................................... 错误!未定义书签。 系统运行指标趋势分析...................................... 错误!未定义书签。 11 验证结果评价及建议............................. 错误!未定义书签。
【引用】常用大肠杆菌感受态JM109，DH5a，BL21等的区别 生命科学2011-03-31 14:48:42 阅读80 评论0 字号：大中小订阅 本文引用自xxrrzq《常用大肠杆菌感受态JM109，DH5a，BL21等的区别》 1：DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1 2：BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3） 3：BL21(DE3) pL ysS菌株 该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pL ysS ，Camr 4：JM109菌株 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株 基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15] 5：TOP10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU ，galK ，rps，(Strr) endA1，nupG 6：HB101菌株 该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验 基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1 7：M110或SCS110 大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶 C-5位置上引入甲基。常用的菌株都会产生dam,dcm，从而受到甲基化的影响. 部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等，一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。 大多数酶切位点的甲基化不影响切割，而有些会影响，如XbaI, BclI等。而且甲基化只发生在特定序列，以XbaI为例，只有在位点序列旁出现GA或TC，该XbaI位才会被甲基化。 而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法： （1）选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化影响；
超纯水工艺流程 预处理----反渗透----CEDI膜块----抛光树脂 膜法超纯水制取设备工艺流程：原水—超滤(多介质过滤器、活性炭过滤器)—反渗透—EDI—超纯水 渗透/电去离子（RO/EDI）集成膜技术是近年来迅速发展成熟，并得到大规模工业应用的最新一代超纯水制造技术，在国际上已逐渐成为纯水技术的主流。RO/EDI的集成膜技术在电子企业用水，实验室纯水系统，电厂用水等方面具有独特的优势。 自来水进入原水箱，通过原水泵增压，经砂滤器、炭滤器、阻垢剂加药、保安过滤器，到达反渗透单元，经两级反渗透过滤进入EDI单元，达到电阻率15MΩ.cm（25℃）进入纯水水箱。纯水供水设计为循环方式，经纯水供水泵增压，通过紫外线消毒器、抛光混床、0.22微米过滤器接入纯水供水管，到达使用点。 1.1预处理单元 采用石英砂过滤、活性炭过滤、保安过滤作为两级反渗透的预处理。 1.2膜系统单元 膜系统单元是本系统的核心，负责去除水中大部分的有害物质，保证终端产水达到标准要求。本设计中采用辅以pH值调节的两级反渗透作为初级脱盐工艺，EDI模块作为深度脱盐工艺。 1.2.1反渗透模块 反渗透膜是以压力差为驱动力的液相膜分离方法，可以看作是渗透的一种反向作用。在压力推动下，溶液中的水分子透过膜，而其它分子、离子、细菌、病毒等被截留，从而实现脱盐效果，达到纯化目的。 整个反渗透系统由高压泵、反渗透膜、压力容器以及相应的仪器、仪表、阀门、机架、管道及管件等组成；此外还有独立的化学清洗装置。
1.2.2EDI模块 EDI技术是将膜法和离子交换法结合起来的新工艺，基本原理主要包括离子交换、直流电场下离子的选择性迁移及树脂的电再生。水中的离子首先通过交换作用吸附于树脂颗粒上，再在电场作用下经由树脂颗粒构成的“离子传输通道”迁移到膜表面并透过离子交换膜进入浓室。由于离子的交换、迁移及离子交换树脂的电再生相伴发生，犹如边工作边再生的混床离子交换树脂柱，因此可以连续不断地制取高质量的纯水、高纯水。 EDI系统由增压泵、膜堆、电源以及相应的仪器、仪表、阀门、机架、管道等组成。 1.3供水单元 纯水供水循环采用254nm紫外线杀菌、抛光混床脱盐、0.22微米过滤，达到用户的纯水水质要求。 为保证纯水的品质以及生物学指标，在纯水制备的终端设置精度为0.22μm的微滤膜过滤器，用于截留去除脱盐设备出水中的微粒以及细菌尸体。由于0.22μm的微滤膜膜过滤器为整个脱盐工艺的最后一道处理设备，因此又称终端过滤器。过滤器内装折叠式微孔滤膜，过滤精度0.22μm，过滤器出口设置压力表。过滤器经过一段时间的运行后，滤膜表面截留了大量杂质，使滤膜堵塞，导致工作压力增加，当进出口压力差增大到某一设定值时，更换滤膜。 终端过滤器由罐体、0.22μm滤芯、压力表组成。 1.4主要设备 主要设备：原水箱、原水增压泵、砂滤器，炭滤器罐体、多路阀、阻垢剂计量泵、阻垢剂(氨基三甲叉膦酸ATMP)药罐、保安过滤器、保安过滤滤芯、一级RO高压泵、一级RO膜、二级RO高压泵、二级RO膜、膜壳、PH值调整计量泵、EDI增压泵、EDI模块、超纯水水箱、纯水增压泵、抛光混床罐、抛光树脂、0.22微米过滤器、0.22微米滤芯等。
常用大肠杆菌感受态JM109，DH5a，BL21等的区别 1：DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pU C系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gy rA96，relA1 2：BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3） 3：BL21(DE3) pLy sS菌株 该菌株含有质粒pLy sS，因此具有氯霉素抗性。PLy sS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰 目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLy sS ，C amr 4：JM109菌株 该菌株在使用pU C系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的La cZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株 基因型：recA1，endA1，gy r A96，thi－1，hsdR17，supE44，re lA1，Δ（lac－proA B）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15] 5：TO P10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 基因型：F- ，mcr AΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU，galK ，rps，(Strr) endA1，nupG 6：HB101菌株 该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验 基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xy l-5，mtl-1，le uB6，thi-1 7：M110或SCS110 大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GA TC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC 序列的第一个胞嘧啶C-5位置上引入甲基。常用的菌株都会产生dam,dcm，从而受到甲基化的影响. 部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如F baI和MboI等，一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。 大多数酶切位点的甲基化不影响切割，而有些会影响，如XbaI, BclI等。而且甲基化只发生在特定序列，以XbaI为例，只有在位点序列旁出现GA或TC，该XbaI位才会被甲基化。 而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法： （1）选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化影响； （2）利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA的制备，如E.coli JM110和链霉菌等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲出，而后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细胞中抽提的DNA就能被上述酶切割。 8：E.coli JM110 要排除dam,dcm甲基化的影响，需要用特定的dam-,dcm-的菌株，如JM110 如果由JM110或SCS110等甲基化缺失的菌株产生的质粒，则不会被甲基化. 各种感受态细胞的区别用途特征 Xl1-Blue菌株
北京华越洋生物提供QQ:1733351176 大肠杆菌菌株，酵母菌菌株，农杆菌菌株-北京现货 菌种名称编号类别抗性规格 RosettaBlue(DE3)pLac I 12-300 大肠杆 菌 1 mL RosettaBlue(DE3)pLys S 12-321 大肠杆 菌 1 mL SF21 12-318 昆虫细 胞 无 1 mL SF9 12-319 昆虫细 胞 1 mL SG1117 12-251 大肠杆 菌 1 mL SMD 11681 12-270 酵母 1 mL SMD1163 12-272 酵母 1 mL SMD1168 12-114 酵母 1 mL SMD1168H 12-208 酵母 1 mL SMD168H 12-271 酵母 1 mL Stbl2 12-252 大肠杆 菌 nalidixic acid 1 mL Stbl3 12-253 大肠杆 菌 Str 1 mL Stbl4 12-254 大肠杆 菌 Tet 1 mL SURE 12-255 大肠杆 菌 Kan;Tet 1 mL T1 12-327 大肠杆 菌 1 mL TB1 12-256 大肠杆 菌 无抗性 1 mL TG1 12-44 大肠杆 菌 无抗性 1 mL TH1 12-257 大肠杆 菌 无抗性 1 mL TKB1 12-310 大肠杆 菌 Tet 1 mL
北京华越洋生物提供QQ:1733351176 Top10 12-81 大肠杆 菌 Str 1 mL Top10F 12-188 大肠杆 菌 1 mL Top10F’ 12-381 大肠杆 菌 Str,Tet 1 mL Tuner 12-306 大肠杆 菌 无抗性 1 mL Tuner(DE3) 12-258 大肠杆 菌 无抗性 1 mL Tuner(DE3))plysS 12-219 大肠杆 菌 Cam 1 mL Tuner(DE3)pLacI 12-307 大肠杆 菌 Cam 1 mL Turbo 12-259 大肠杆 菌 无抗性 1 mL WB600 12-276 枯草宿 主菌 1 mL X33 12-273 农杆菌 1 mL XL blue 12-260 大肠杆 菌 无抗性 1 mL XL-10 gold 12-261 大肠杆 菌 Tet,Cam 1 mL XL1 Blue 12-308 大肠杆 菌 Tet,Nalidi xic Acid 1 mL XL2 Blue 12-309 大肠杆 菌 Tet,Cam, Nalidixic Acid 1 mL Y1089 12-262 大肠杆 菌 1 mL Y1090 12-263 大肠杆 菌 1 mL Y187 12-325 酵母 1 mL Y2HGold 12-326 酵母 菌种名称编号类别抗性规格 1A75 12-274 枯草宿 主菌 1 mL
纯化水系统再验证方案 颁发部门：质量管理部 分发部门与数量：设备工程部.1，质量管理部.1，生产技术部.1，
再验证立项申请表 再验证方案审批表
目录1.验证组织系统
2.概述 3.验证目的 4.相关文件 5.验证范围 6.人员培训 7.验证内容 8.纯化水日常监测 9.再验证规定 10.验证结果评定及结论 11.文件执行 12.文件归档 13 附表 附表1：再验证方案变更申请表 附表2：纯化水系统管道、阀门运行确认记录 附表3：纯化水系统输送泵运行确认记录 附件4：机械过滤器、活性碳过滤器、精密过滤器、二级反渗透装置监测记录 附表5：紫外灭菌器参数监测记录 附表6：纯化水系统性能确认数据 附表7：纯化水检测报告统计表（性能确认数据） 附表8：纯化水在线监测数据 附表9：纯化水系统日常监测与验证周期 附表10：漏项、偏差处理表 1验证组织系统 1.1验证委员会机构
1.1.1验证委员会成员及其职责 1.1.2验证委员会职责 主任：负责验证方案、验证报告的批准；负责签发验证证书。 委员：审核验证方案、验证报告，制定验证计划。 1.2验证小组成员及其职责 1.2.1系统验证小组成员 1.2.2各成员职责 组长——负责验证实施全过程的组织协调工作； 组员——负责验证过程中的具体工作，并做好记录工作。 1.2.3验证过程中各相关部门职责 1.2.3.1质量管理部： 负责组织验证方案、报告与结果的会审会签；负责对验证全过程实施
监控；负责核查、汇总验证数据；负责建立验证档案，及时将批准实施的验证资料收存归档。 1.2.3.2生产技术部 负责指导车间相关人员做好验证记录。 1.2.3.3设备工程部 负责提供设备相关文件；负责编制设备使用标准操作规程、维护标准操作规程及清洁规程。 1.2.3.4化验室 负责验证过程的取样、检验及结果报告。 1.2.3.5综合制剂车间 负责设备所在操作间的清洁处理，保证运行环境符合设计要求； 负责协助验证小组保证验证工作顺利进行。 2.概述： 纯化水为经过蒸馏法、离子交换法、反渗透法或其他适宜方法制备的制药用水。其质量应符合2005年版药典规定，纯化水不应含有任何附加剂。 本公司纯化水处理系统由原水储罐、石英砂过滤器、活性炭吸附器、精密过滤器、二级反渗透纯水机、清洗液储罐、一级纯水储罐、纯化水储罐、紫外线灭菌器等部分组成，针对公司原水水质及产品工艺的要求，制备用于车间洁净区。 纯化水系指水中的绝大多数强电解质及难以去除的硅酸及二氧化碳等弱电解质去除到很低的程度，水中不溶解的胶体物质与微生物、微粒、溶解气体、有机物等也已去除到很低程度。含盐量控制在1mg/L以下，温度在25℃时水的电阻率>0.5MΩ?cm或电导率<2μs/cm。 2.1 反渗透法制备纯化水系统工艺流程图
重组人IL-2大肠杆菌工程菌质粒稳定性的研究 摘要 基因工程菌中质粒稳定性对于基因工程菌的发酵有着重要影响，但基因工程菌在传代中经常出现质粒不稳定遗传的现象。本试验通过在工程菌的培养过程中添加抗生素这一选择压力和诱导表达目的蛋白的方式来提高基因工程菌的稳定性，并通过双酶切电泳分析及高效率的诱导表达外源蛋白来进行检测，得出工程菌在LB（-）和LB（+）平板上都能生长且形态相似；电泳图平行、酶切片段的位置大致一致；诱导表达的外源基因的质粒稳定。提高质粒稳定性有利于外源蛋白表达，以满足大规模生产发酵。 关键词：基因工程菌；质粒；稳定性 -I-
Study on the stability of plasmid of recombinant human IL-2 E.coli bacteria Abstract Escherichia coli. plasmid stability for the genetic engineering of bacteria fermentation has important implications genetically engineered bacteria in the mid-recurring genetic instability of the plasmid. This experiment in engineering from the training course to add the option of antibiotic pressure and protein expression induced by way of reference high genetically engineered bacteria stability and digested by electrophoresis and high efficiency induced expression of foreign proteins to detect, the virus can grow in the panel of LB(-) and LB(+), and the morphology is similar; The electrophoregram is parallel, and the position of the fragment is consistenct roughly; Inducible expression of foreign genes is stabile. We improve the stabilization of the foreign gene in order to meet the large-scale fermentation. Key words: Genetic engineering ; plasmid ; stability -II-
目录 1概述 2目的 3验证范围及依据 4验证组织与职责 5验证周期及验证进度安排6验证项目及方法 6.1纯化水系统安装确认 6.2纯化水系统运行确认6.3纯化水系统性能确认7验证结果与评价 8验证方案的培训 9验证记录
1 概述 我公司的纯化水系统由原水罐、原水泵、石英砂过滤器、活性炭过滤器、树脂软化器、保安过滤器(5μm)、一级反渗透装置、离子交换床、保安精密过滤器(0.22μm)、纯化水罐、臭氧发生器、微孔膜过滤器（0.22μm）、纯化水输送泵、紫外灭菌器等设备组成。原水经原水罐、石英砂过虑器、活性炭过滤器、树脂软化器、一级反渗透装置、离子交换床、保安精密过滤器、进入纯水罐再经过微孔膜过滤器（0.22μm）、紫外灯灭菌后供给车间。现对纯化水系统进行验证。 1.1纯化水系统工艺流程 正反清洗水排放 正反清洗水排放
1.2 系统各部分功能
1.2.1 原水的预处理设备及功能 1.2.1.1 石英沙过滤器内充填精选的石英砂和锰砂，可过滤掉原水中的颗粒杂质和悬浮物及部分重金属离子（例如：铁等），控制进水浊度及淤泥污染。 1.2.1.2 活性炭过滤器内充填活性炭，除污及吸附有机物、余氯；还可去除臭味，降低色度以及残留的浊度等。 1.2.1.3 树脂软化器内充填阳树脂主要除钙镁离子，防止反渗透膜上结垢，尽可能的避免污堵；提高膜组的使用寿命。稳定膜组的工作性能。 1.2.2 纯化水制备装置及功能 1.2.2.1 5μm保安过滤器去除阳树脂等大于5μm以上的细微颗粒，保护反渗透膜不受阻塞； 1.2.2.2 一级反渗透系统对预处理后的水进行一级脱盐处理，降低水的含盐量、脱盐率能达到99%。 1.2.2.3 离子交换床：利用离子交换树脂的原理来去掉溶解於水中的无机离子。 1.2.2.3 0.22μm精密过滤器主要出去水中的阴阳树脂等杂质的细微颗粒。 1.2.2.4 微孔过滤器（0.22μm）防止纯化水残留有细微体积在0.2-1.0μm以上等污染水质。 1.2.2.5 紫外灭菌器杀死循环管道中可能残留的细菌。 1.3 主要设备技术参数：
质粒DNA的转化操作步骤 该实验主要有两个用途： 1．重组质粒的鉴定。当质粒的重组或其它载体重组后，通常会发生质粒的重组失败，包括质粒的自身环化。因而要求进行筛选，把重组成功的质粒找出来。在目前常用的质粒和其它载体中含有相应的抗生素抗性基因，一旦重组成功，质粒环化（包括自身环化），抗生素抗性基因表达，被转化的大肠杆菌便具备抗相应抗生素的能力，可以含该抗生素的培养基中生长传代，不然，重组失败，大肠杆菌便不能抵抗该抗生素而死亡。 2．为扩增质粒和其它载体作准备。由于大肠杆菌繁殖快，在适宜的条件下繁殖一代仅需要20~30分钟，而且常用质粒可以在大肠杆菌中达到几百个拷贝，因此，通过对转化成功的大肠杆菌培养，可以在短时内极大地扩增目的质粒。（作为分子生物学用大肠杆菌，是经过实验室改造过的工程菌。） 【原理】 转化是将外源DNA分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。转化所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶(R-， M-)。将对数生长期的细菌(受体细胞)经理化方法处理后，细胞膜、的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子(带有异源DNA分子的细胞)。 本实验采用CaCl2法制备感受态细胞。其原理是细胞处于0～4℃，CaCl2低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃90秒热激处理，促进细胞吸收DNA得合物。将细菌放置在非选择性培养基中（无抗LB培养液）于37℃振动培养一段时间，可使细菌复苏，表达质粒编码的抗生素抗性基因，在转化过程中获得的新的表型，提高转化效率。如氨苄青霉素耐药(Ampr)得到表达，然后将此细菌培养物涂在含Amp的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。 本实验是将[ 某]重组质粒转化DH5α扩增菌，转化后在含Amp的培养基上进行筛选，生长的菌落即为含重组质粒的工程菌。含[ 某]重组质粒的DH5α菌用于质粒DNA的扩增，获得的质粒将作为限制性内切酶的酶切底物DNA。 【实验步骤】 自-70℃冰箱中取出受感态大肠杆菌，插入湿冰中溶解约15分钟，轻轻混匀。吸取50ul移入1.5ml管，并立刻将细菌放回-70℃冰箱。 细菌50 ul 质粒1 ul 轻轻混匀，静置冰上30分钟。 于42℃水浴中热休克细菌90秒，迅速移入湿冰中，静置3分钟，加入700ul无抗LB 培养液，放入37℃恒温箱摇床，220rpm摇晃培养45min。取30-200ul涂于含氨卞青霉素的LB琼脂平板皿上，待干燥后，倒置，存放于37℃的培养箱中过夜。 次日，检查各培养皿中是否出现菌落。
山东大学 实验名称：大肠杆菌营养缺陷型菌株 的诱变和筛选 作者：姚健(201000140136) 同组者：刘新强 指导老师：林建群(教授) 实验日期：2013年5月22日-6月1日
微生物大实验报告 大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选 山东大学生命基地班姚健 201000140136 摘要：营养缺陷型菌株或称异养型（auxotroph）菌株是许多微生物生理生化以及遗传研究的重要菌株材料。此类菌株不仅在生物研究方面有着很重要的作用，而且在生物工程和生物技术上都有很重要的作用。营养缺陷型菌株的筛选也成为了微生物科学工作者必备的基本实验技能之一。实验采用物理诱变非电离辐射紫外线（15W）为诱变剂，来对大肠杆菌诱发突变，并用抗青霉素法淘汰野生型（富集营养缺陷型），采用点植对照法检出营养缺陷型，划线复证后得到两株营养缺陷型菌，进行生长谱法鉴定，两个平板都长满了菌落，即没有预期的营养缺陷型菌株出现。 Abstract:Auxotrophic bacterias are very important materials in the microbial biochemical and genetical research.Auxotrophic bacterias are important to not only bioresearch but also biotechnology.The screening of auxotrophic bacterias has become one of scientists’ primary experimental skills.We use the ultravioley light as the mutagen to induce the mutation of the E.coli,then weed out the wild type by Penicillin resistance method to gather auxotrophic bacterias,next we check out the auxotrophic bacterias by spot planting.We get two auxotrophic bacterias by marking out，finally we test the type of auxotroph by auxanography.Each bacteria grew well everywhere in the plate indicating that t here’s no auxotrophic bacteria. 关键词：大肠杆菌；营养缺陷型菌株；紫外线诱变；划线复证；生长谱测定；筛选 Key words:Escherichia;auxotrophic bacteria；ultravioley mutation;marking out;auxanography;screening 1引言 筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、营养缺陷性的浓缩、检出、鉴定缺陷型。本实验选用紫外线为诱变剂来诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。 1.1 营养缺陷型 营养缺陷型是指野生型菌株由于某些物理因素或化学因素处理，使编码合成代谢途径中某些酶的基因突变，丧失了合成某些代谢产物(如氨基酸、维生素)的能力，必须在基本培养基中补充该种营养成分，才能正常生长的一类突变株[1]。这类菌株可以通过降低或消除末端产物浓度，在代谢控制中解除反馈抑制或阻遏，而使代谢途径中间产物或分支合成途径中末端产物积累。在氨基酸、核苷酸生产中已广泛使用营养缺陷型菌株；也可用于遗传学分析、微生物代谢途径的研究及细胞和分子水平基因重组研究中作为供体和受体细胞的遗传标记。因此，营养缺陷型在工业上有重要的应用价值。营养缺陷型是由野生型突变产生，营养缺陷型经回复突变恢复野生表型得到原养型。为了获得营养缺陷型菌株，需从诱变处理后的菌液中认真筛选，以便检出突变体，常用的方法有：影印接种法、夹层培养法和青霉素浓缩法等。 1.2 紫外线诱变 诱变育种是人为地采用物理、化学的因素，诱导有机体产生遗传变异，并经过人工选择、鉴定、培育新品种的方法。诱变育种的目标是改变或增加一个满意品种的某一特性，而在其他方面保持不变。诱变育种具有以下特点：1）提高突变率，扩大变异谱；2）适于进行个别性状的改良；3）育种程序简单，年限短；4）变异的方向和性质不定。 紫外线是一种短波光，波长介于100-400nm之间。它是一种非电离辐射诱变剂，照射物体时可使原
制药纯化水系统的工艺流程及标准说明 药品生产企业的工艺用水主要是指制剂生产中洗瓶、配料等工序以及原料药生产的精制、洗涤等工序所用的水。水的名称应避免和水的制造过程有关，如去离子水、除盐水、蒸馏水这样的名称，即水的制造过程与其名称脱钩，而是从化学和微生物的角度根据质量指标对水进行分类(如中国药典规定纯化水可以用三种不同方法制得，将来可能还会有更好得方法)。 注射用水一般用纯化水通过蒸馏法(还有反渗透法和超滤法)制得，化学纯度高达 99.999% ，无热原。因纯蒸汽的制备过程与用蒸馏水制备注射用水的过程相同，可使用同一台多效蒸馏水机或单独的纯蒸汽发生器，故将纯蒸汽放在注射用水一起讨论。 二级反渗透是以采用一级反渗透的产水作为原水，进行第二次反渗透的净化，产水导电率≤3μs/cm。在饮用纯净水方面已广泛应用。反渗透技术常应用于预除盐处理，能够使离子交换树脂的负荷减轻90%以上，树脂的再生剂用量也减少90%。因此，不仅节约运行费用，而且还利于环境保护。反渗透独特水处理技术是其他净水方法如蒸馏、电渗析、离子交换等无法达到的 制药纯化水系统工艺流程 原水→原水增压泵→多介质过滤器→活性碳过滤器→软水器→精密过滤器→第一级反渗透→PH调节装置→中间水箱→第二级反渗透→纯化水箱→输送泵→紫外线杀菌器→微孔过滤器→用水点(推荐工艺)。 原水→原水增压泵→多介质过滤器→活性碳过滤器→软水器→精密过滤器→第一级反渗透→中间水箱→中间水泵→离子交换设备→纯化水箱→输送泵→紫外线杀菌器→微孔过滤器→用水点(传统工艺)。
原水→原水增压泵→多介质过滤器→活性碳过滤器→软水器→精密过滤器→第一级反渗透→中间水箱→中间水泵→EDI设备→纯化水箱→输送泵→紫外线杀菌器→微孔过滤器→用水点(最新工艺)。 制药纯化水的标准： 药品生产用水要求参考纯化水标准，参考纯化水检测方法 1、医药业无菌、无热源纯化水制取。 2、物医药用水。 3、医疗血液透析用水。 4、饮用纯净水、饮料用水的制取。
大肠菌群和大肠杆菌的区别 名称定义检测方法检测意义 大肠菌群 是指具有某些特性的一组与粪便 污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌 氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革 兰氏阴性无芽胞杆菌。 大肠菌群包含大肠杆菌、柠檬酸 杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌 等。 MPN计数法 参见GB4789.3-2010 《中 华人民共和国国家标准食 品微生物学检验大肠菌群 计数》。 食品标准中一般只规定大肠菌群的含量限制， 而对大肠杆菌没有限制。 大肠菌群分布较广，在动物粪便和自然界广泛 存在。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境 中则以大肠菌群其他型别较多。 大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要 指标，作为食品中的粪便污染指标。 食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污 染，既可能有肠道致病菌存在，因而也就有可能通 过污染的食品引起肠道传染病的流行。大肠菌群数 的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体 健康危害性的大小。 大肠杆菌 （大肠埃希氏菌） 也称大肠埃希氏菌，分类于肠杆 菌科，归属于埃希氏菌属，属于细菌。 大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、 乳糖发酵产酸产气、IMViC试验（靛基 质、MR、V-P、柠檬酸盐试验）为+ + - -或- + - -的细菌。它分布在自然界， 平板计数法 参见GB4789.38-2012《食 品安全国家标准食品微生 物学检验大肠埃希氏菌计 数》。 2
大多数是不致病的，主要附生在人或动物的肠道里，为正常菌群，少数的大肠杆菌具有毒性，可引起疾病。 备注： 生产加工中两者没有单独的控制方法，需按照食品加工标准卫生操作规范，从控制人员、器具、环境的清洁卫生着手，做好清洁消毒工作，确保生产加工过程不受到大肠菌落的污染。 2
各种大肠杆菌菌株特点 1：DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1 2：BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3） 3：BL21(DE3) pLysS菌株 该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS ，Camr 4：JM109菌株 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株 基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’ 5：TOP10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU ，galK ，rps，(Strr) endA1，nupG 6：HB101菌株 该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验 基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1 7：M110或SCS110 大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶 C-5位置上引入甲基。常用的菌株都会产生dam,dcm，从而受到甲基化的影响. 部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等，一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。 大多数酶切位点的甲基化不影响切割，而有些会影响，如XbaI, BclI等。而且甲基化只发生在特定序列，以XbaI为例，只有在位点序列旁出现GA或TC，该XbaI位才会被甲基化。 而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法： （1）选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化影响； （2）利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA的制备，如E.coli JM110和链霉菌等，