一、细胞凋亡
细胞凋亡是Kerr等于1972年首先提出的一种不同于细胞坏死的细胞死亡方式，它具有特征性形态和生化改变，是细胞自身主动死亡的过程，又称为程序性细胞死亡（programmed
cell death, PCD），生命体内细胞死亡有两种完全不同的形式，当细胞遭受急性和严重损害时，细胞肿胀破裂，胞液外溢导致周围组织发生炎症，即坏死过程。细胞在正常死亡时，出现细胞收缩，细胞核成片状，电镜可见到细胞膜上有很多的小泡生成。DNA电泳区带呈梯状，这种方式称为细胞凋亡。细胞凋亡是指细胞在生理和病理情况下的一种死亡模式，参与胚胎发育及变形胸腺细胞的克隆选择、细胞介导的细胞毒作用、衰老造血细胞的清除、肿瘤发生、人类免疫缺陷、病毒感染及化学治疗等。因此，对细胞凋亡的研究成为免疫学、细胞生物学、肿瘤学和分子生物学等领域的热门课题。
二、细胞凋亡与自由基作用的关系
众所周知，氧化还原反应是人体内最为广泛和重要的化学反应，自由基尤其是活性氧（reactive oxygen species, ROS）及其衍生物自由基是氧化反应中的重要成分。ROS与衰老密切相关，而衰老细胞的死亡实质上就是细胞凋亡。
目前，研究较多的肿瘤坏死因子（tumor
necrosis factor, TNF）是由巨噬细胞和单核细胞产生，激活TNF受体可使细胞内ROS明显增加。体外试验表明TNF能诱导细胞凋亡，细胞对TNF的敏感性还与SOD的降低有关，如缺乏SOD的T细胞对TNF、电离辐射和高温引起的细胞凋亡更敏感。
据报道，能引起细胞氧化的因素均能引起细胞凋亡。电离辐射和紫外线照射能通过直接攻击水分子而在水中产生·OH，并能诱导细胞凋亡，如图9-10所示。H2O2在体内Fe2+分子反应生成超氧阴离子O2-和H2O2，通过对巨噬细胞和单核细胞的研究，Albina等提出NO也是细胞凋亡的诱导剂。抗肿瘤药物如阿霉素和顺铂等虽然本身不是自由基，但是它们可以引起ROS的增加；而另一种药物如Bathionine
Sulfoxamine等则能消耗细胞内GSH，两类抗肿瘤药物能使细胞对多种因素诱导的细胞凋亡更敏感。
图9-10 氧化诱导细胞凋亡的机制及其调节
（源自：陆怡等生物化学与生物物理进展.23（2））现已报道，有25个癌基因与细胞凋亡有关。与自由基尤其是氧化关系最密切的是bcl-2基因，bcl-2基因是人类发现的第一个死亡抑制基因。已证实，bcl-2基因表达能抑制多种因素（电离辐射、高温、GSH合成抑制剂、生长因子缺乏）引起的细胞凋亡，其机制不清，Kane等报导，bcl-2的表达并不能增加细胞SOD活性，可能是通过阻断电子传递链中ROS的产生，或者起了ROS清除剂的作用而调节细胞的氧化还原状态，从而调节细胞凋亡。
三、细胞凋亡相关基因
细胞凋亡相关基因大致可分为两大类，即凋亡促进（apoptosis
on）基因和凋亡抑制（apoptosis off ）基因。它们分别起着促进凋亡和抑制凋亡的作用，彼此之间还存在一定的相互关联。
1．凋亡促进基因
凋亡促进基因有ced-3,4、p53、ICE、Bax、bcl-Xs、TGFβ等。其中ced-3，4是在线虫索中发现的，而p53、ICE等存在于哺乳动物中。p53为肿瘤的抑制基因，分为两型，一型是使细胞周期停止在GI期，抑制细胞繁
殖的野生型；另一型是具有突变能力的变异型。野生型p53可诱导易感细胞发生凋亡。白介素1β转换酶（interlukin
1-β-converting enzyme, ICE）,与线虫细胞凋亡相关基因ced-3有较高的同源性，具有直接诱导细胞凋亡的作用。Bax和bcl-Xs均为bcl-2基因家族成员，两者可结合形成二聚体或异体二聚体，两者之间的比例决定了细胞的命运。若Bax占多数，则bcl-2被抑制，诱导细胞死亡；反之，则Bax受到抑制,细胞得以生存。
2．凋亡抑制基因
凋亡抑制基因包括bcl-2、ced-9、bcl-X，其中最主要也是当前研究最多的是bcl-2，bcl-2是癌基因的一种，在人体多种形态的肿瘤中过度表达，可抑制由多种剌激包括化疗和放疗引起的细胞凋亡。bcl-2常在淋巴细胞系统（胸腺、脾、淋巴结）和神经系统（右脑、中脑，小脑）中表达，抑制该部位的细胞凋亡。淋巴性白血病细胞中bcl-2也是过度表达的。Bcl-X1也是bcl-2家族成员，是由bcl-X编码的两种不同
bcl-XmRNA而产生。bcl-X1有抑制神经细胞凋亡的作用。
四、细胞凋亡与脂质代谢紊乱的关系
Forrest等[3]发现H2O2诱导的细胞凋亡中，让H2O2作用于细胞膜两h后，用膜保护剂Trolox（VitE类似物）能阻止细胞凋亡的发生。由于ROS很容易与膜的多聚不饱和脂肪酸（PUFA）和胆固醇反应，引起氧化链式反应，因此膜脂质过氧化以后才有DNA损伤、细胞损害。最近Isabelle等[5]报道，氧化低密度脂蛋白（OxLDL）可诱导细胞凋亡。
自由基尤其是ROS具有很强的生物活性，很容易与生物大分子反应，直接损害或者通过一系列过氧化链式反应而引起广泛的生物结构的破坏。为了减少有氧代谢过程中自由基对细胞的损害，细胞内有一系列有效的抗氧化防御机制，包括清除ROS的SOD、过氧化氢酶（CAT），谷胱甘肽过氧化物酶（GSHP X）、硫氧还原蛋白（phioredoxin）等和阻断过氧化链式反应的生育酚、胡罗卜素和抗坏血酸等。通常细胞处于氧化与抗氧化平衡中而维持着正常的功能。一旦氧化与抗氧化作用失衡，细胞的功能将会受到影响，细胞凋亡可能就是这种失衡的结局之一。
细胞凋亡试验常用的方法（MTT法、荧光法、DNA琼脂糖凝胶电泳法与流式细胞仪检测法） （一）药物对肿瘤细胞的抑制效应的MTT法： 用培养基将肿瘤细胞调整至2 X108个/L，在96孔板中每孔加入100ul细胞悬液于37℃、5% CO2下培养过夜。 次日每孔加入不同浓度的药物100mg/L作为试验组，设加完全培养基不加药物的阴性对照，并用功能明确的药物为阳性对照和0.5%的乙醇溶剂对照，每组均设4-6个复孔（平行孔）、37℃、5% CO2继续培养。 培养至12h、24h、48h、实验终止前4-6h加入10ulMTT（5g/L），培养4-6h后，阴性对照孔中已形成明显的蓝紫色颗粒结晶时加100ul/孔SDS-HCl终止反应，于37℃存放过夜。 用酶标仪在A570波长下测吸光度值，按下式计算抑制率 抑制率（%）=（1-试验组平均吸光度值/阴性对照组平均吸光度值）x 100%。 （二）荧光法： 选用上述最佳浓度作用于肿瘤细胞，培养细胞48h后，收货细胞用PBS洗2-3次后用0.4%多聚甲醛室温下固定30min。 弃去固定液，并用PBS洗2次后，用1%Triton X-100作用4min加入适量的0.5mg/L DAPI 荧光染色60min，用PBS冲洗3次，取10ul滴片，干燥后于荧光显微镜下检测断裂的颗粒和片状荧光。 （三）DNA琼脂糖凝胶电泳法： 1、DNA提取： 用大方瓶培养肿瘤细胞，每瓶10ml，细胞浓度为3 x 108个/ml，每隔药物浓度、作用时间均设2瓶，共分3个时间段，4个药物浓度。共培养26瓶细胞。 分别于细胞中加入不同浓度的药物，于37℃、5% CO2中分别培养12h、24h、48h，收货细胞，用PBS洗2-3次。 于-20℃将细胞冷却处理10min后将细胞收集至离心管中，加1ml细胞裂解液，再加蛋白酶K，轻轻振摇使悬液混匀，成黏糊状，50℃过夜。 冷却后加入等体积的饱和酚溶液，混合后10000r/min离心10min，吸出上层水相，移至另一离心管中，再加入等体积饱和酚溶液重复抽提一次，直到无蛋白为止。 吸上清加入氯仿/异戊醇（24：1）按上述方法再抽提一次。 吸取水相层加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠溶液，混匀。 再加入2.5倍体积冷无水乙醇，混合置-20℃处理30min后，10000r/min离心10min，沉淀部分为提供的DNA，弃去无水乙醇后用70%乙醇漂洗2次，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干乙醇。 加入200ulTE缓冲液融解DNA，再加入25ul的RNA酶，置37℃作用30min，置4℃冰箱保存。 2、琼脂糖凝胶电泳： TBE缓冲液配制1.8%琼脂糖凝胶。在微波炉内煮沸至琼脂糖融解，待冷却至60℃时，加入溴化乙锭，使其终浓度为0.5mg/ml，混匀后灌胶。 待凝胶固定后放入含TBE电泳液的电泳槽内，使TBE电泳液盖过凝胶。 取10-15ul提取的各组DNA样品液与上样缓冲液按4：1比例混匀后点样。 60V电泳1h，用紫外透射仪观察梯形条带。
细胞凋亡和细胞坏死的区别 高考频度：★★★☆☆难易程度：★★☆☆☆ 典例在线 脑缺氧、心缺血、急性胰腺炎、动脉粥样硬化等疾病都是由细胞坏死引起的。近日，厦门大学生命科学学院韩家淮教授课题组的一项研究表明，存在于人体内的一种名为RIP3的蛋白激酶，能够将细胞凋亡转换成细胞坏死，通过调控这种酶的合成，就可以调控细胞的死亡方式。下列有关叙述错误的是 A．从以上分析可知细胞坏死过程中存在基因的选择性表达 B．一些细胞的坏死对人体也有益处，比如被病原体感染的细胞在免疫系统的作用下死亡 C．抑制RIP3的活性，能在一定程度上对急性胰腺炎起治疗、防御的作用 D．在人体的癌细胞中，也可能存在控制RIP3合成的基因 【参考答案】B 基因都是一样的，D正确。 学霸推荐 1．下列有关细胞凋亡、坏死与癌变的说法，正确的是 A．细胞坏死常引起炎症；细胞癌变，代谢增强 B．细胞凋亡受基因控制；细胞癌变不受基因控制 C．细胞坏死，膜的通透性降低；细胞癌变，膜的黏着性增强 D．细胞癌变，细胞周期延长；细胞凋亡，细胞周期变短 2．下列关于细胞凋亡和细胞坏死的叙述中，错误的是 A．细胞凋亡是主动的，细胞坏死是被动的 B．细胞凋亡是生理性的，细胞坏死是病理性的 C．细胞凋亡是由基因调控的，细胞坏死是由外界因素引起的 D．细胞凋亡是急性的，细胞坏死是慢性的 3．下列实例不属于细胞凋亡的是 A．清除被病原体感染的细胞 B．骨折时造成的细胞死亡
C．成熟生物体中细胞的自然更新 D．人体内红细胞的正常死亡 4．细胞凋亡也称为细胞编程性死亡，其大致过程如图所示。下列有关叙述错误的是 A．细胞皱缩、染色质固缩表明细胞处于衰老状态 B．图示过程只发生在胚胎发育过程中 C．吞噬细胞吞噬凋亡小体与细胞膜的流动性密切相关 D．细胞凋亡是由遗传物质控制的，与细胞坏死有明显区别 5．香烟中含有大量的有害物质，如尼古丁等会造成吸烟者肺部细胞的死亡。这种细胞的死亡过程属于A．生理性死亡B．正常衰亡 C．细胞坏死D．细胞凋亡 答案 1．【答案】A 【解析】细胞坏死常引起炎症反应，以清除坏死细胞；细胞癌变时，具有无限增殖能力，代谢增强，A 正确；细胞癌变是原癌基因和抑癌基因突变的结果，导致细胞受突变后的基因的控制，B错误；细胞癌变后，细胞表面的糖蛋白减少，细胞的黏着性降低，C错误；细胞癌变后，分裂增殖失控，细胞周期变短，D错误。 2．【答案】D 3．【答案】B
细胞凋亡实验步骤及注意事项 一、实验目的 1、掌屋凋亡细胞的形态特征 2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞与坏死 细胞的方法 二、实验原理 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡与坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界,在生物个体与生存中起着非常重要的作用。它就是细胞在一 定生理条件下一系列顺序发生事件的组合,就是细胞遵循一定规律自己结束生命 的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学与生物化学特征。 在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触,细胞变园,细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网与细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体,凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外,不会影响其它细胞,因而不引起炎症反应。 在生物化学上,多数细胞凋亡的过程中,内源性核酸内切酶活化,活性增加。核DNA 随机地在核小体的连接部位被酶切断,降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳,可显示以180-200bp为基数的DNA ladder(梯状带纹)的特征。 相比之下,坏死就是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期 即丧失质膜完整性,各种细胞器膨胀,进而质膜崩解释放出其中的内容物,引起炎症反应,坏死过程中细胞核DNA虽也降解,但由于存在各种长度不等的DNA片断,不能形成梯状带纹,而呈弥散状。 一些温与的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡,通常这些因素在诱导凋亡的同时,也可产生细胞坏死,这取决于损伤的剧烈程度与细胞本身对刺激的敏感 程度。 三尖杉酯碱(HT)就是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病,急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0、02~5μg/ml范围内作用2小时,即可诱导HL-60细胞凋亡,并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡,同时也有少数细胞发生坏死。用 Hoechst33342与碘化丙啶(propidium iodide,PI)对细胞进行双重染色,可以区别凋亡、坏死及正常细胞。 细胞膜就是一选择性的生物膜,一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时,质膜不完整,PI就进入细胞内部,它可嵌入到DNA或RNA中,使坏死细胞着
细胞凋亡检测方法 一、细胞凋亡的形态学检测 1 光学显微镜和倒置显微镜 （1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，全面皱缩，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体，凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 （2）染色细胞： 姬姆萨（Giemsa）染色、瑞氏染色等：正常细胞核色泽均一；凋亡细胞染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态；坏死细胞染色浅或没染上颜色。 苏木素-伊红（HE）染色：细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色（凋亡细胞），正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色，坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有：Hoechst 33342，Hoechst 33258，DAPI。三种染料与DNA 的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，能进入正常细胞膜而对细胞没有太大细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。 DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。 PI和Hoechst33342双标：PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。但PI不能通过正常细胞膜，Hoechst则为膜通透性荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调
亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。 凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。 3 透射电子显微镜观察 凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜内侧，但在细胞凋亡早期，PS可从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面，暴露在细胞外环境中。磷脂酰丝氨酸的转位发生在凋亡早期阶段，先于细胞核的改变、DNA断裂、细胞膜起泡。体内的吞噬细胞可通过识别
细胞凋亡实验技术总结 一形态学检测 1、光学显微镜和倒置显微镜观察法 未染色细胞:凋亡细胞体积变小、变形，膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩，变圆，脱落。染色细胞:姬姆萨染色，瑞氏染色等。凋亡细胞染色质浓缩，边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状，形成凋亡小体。 2、荧光显微镜检测法-荧光染料 例如，碘化丙啶(PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。选用536nm 激发光，细胞核呈红色荧光。 3、电子显微镜 收集细胞，2.5%戊二醛4°C 固定24h，1%四氧化锇后固定，丙酮梯度脱水，经包埋剂浸透后环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色，透射电镜观察。凋亡Ⅰ期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象的空泡结构。Ⅱa 期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 4、激光扫描共焦显微镜技术 FITC-AnnexinV+PI双染，观察凋亡过程中细胞膜PS表面的变化，并区分正常细胞(An-PI-)，早期凋亡细胞(An+PI-)，晚期凋亡细胞及坏死细胞(An+PI+)，细胞收集过程中出现的损伤细胞(An-PI+)。 二、细胞凋亡的生化及分子生物学检测 1、DNA 断裂检测法 如使用琼脂糖凝胶电泳检测，细胞凋亡时，核染色质凝聚，染色质DNA 在核小体单位之间的连接处断裂。凋亡早期可形成50~300kbp 的DNA 大片段，晚期核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180~200bp 整数倍的寡核苷酸片段。 2、膜联蛋白V 法 磷脂酰丝氨酸(PS)位于正常细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS 可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜表面。Annexin-Ⅴ(膜联蛋白-V)是一种分子量为35-36KD 的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，与PS高亲和力。将Annexin-Ⅴ进行荧光素或生物素标记，以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针，利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。 3、细胞凋亡的酶Caspase检测 检测Caspase活力可用免疫杂交技术分析酶原的加工和底物水解的产物，或用人工底物检测酶活力，也可对活化的Caspase做亲和标记。例如分析底物的水解产物，PARP(多聚ADP-核糖聚合酶)第一个被认识的caspase-3底物，它的相对分子质量为116000，水解后形成相对分子质量为85000 及相对分子质量为25000 的两个片段，用抗相对分子质量为85000 片段的抗体检测细胞是否发生凋亡。 4、线粒体膜势能变化的检测 线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱反映了线粒体内膜电负性的增高或降低流式细胞仪检测细胞的荧光强度或荧光显微镜观察，拍照正常细胞中, Rh123 能够依赖线粒体跨膜电位进入线粒体基质，荧光强度减弱或消失。而凋亡时，线粒体膜完整性破坏，线粒体膜通透性转运孔开放，引起线粒体跨膜电位的崩溃, Rh123 重新释放出线粒体, 从而发出强黄绿色荧光。
1.简述G蛋白偶联受体所介导的信号通路的异同G蛋白偶联受体所介导信号通路分为三类： ①激活离子通道；②激活或抑制腺苷酸环化酶，以cAMP 为第二信使；③激活磷脂酶C ，以IP3 和DAG 作为双信使 激活离子通道： 当受体与配体结合被激活后，通过偶联G蛋白的分子开关作用，调控跨膜离子通道的开启和关闭，进而调节靶细胞的活性。 激活或抑制腺苷酸环化酸的cAMP信号通路： 细胞外信号（激素，第一信使）与相应G蛋白偶联的受体结合，导致细胞内第二信使cAMP的水平变化而引起细胞反应的信号通路。腺苷环化酶调节胞内cAMP的水平，cAMP被环腺苷酸磷酸二酯酶降解清除。 cAMP信号通路主要是通过活化cAMP依赖性蛋白激酶A (PKA) ，激活靶酶开启基因表达，从而表现出不同的效应。蛋白激酶A 由2个催化亚基和2个调节亚基组成，cAMP的结合可改变调节亚基的构象，释放催化亚基产生活性。 蛋白激酶A被激活后，一方面通过对底物蛋白的磷酸化，引起细胞对胞外信号的快速反应；另一方面，其催化亚基可进入细胞核，磷酸化cAMP应答元件结合蛋白 (CREB) 的丝氨酸残基。磷酸化的CREB蛋白被激活，它作为基因转录的调节蛋白识别并结合到靶细胞的cAMP应答元件 (CRE) 启动靶基因的转录，引起细胞缓慢的应答反应。 cAMP信号通路中的缓慢反应过程：激素→G-蛋白偶联受体→G-蛋白→腺苷酸环化酶→ cAMP→ cAMP依赖的蛋白激酶A→基因调控蛋白→基因转录。 cAMP是由腺苷酸环化酶 (adenylyl cyclase，AC) 催化合成的，腺苷酸环化酶为跨膜12次的糖蛋白，在Mg2+或Mn2+存在下能催化ATP生成cAMP；细胞内的环腺苷酸磷酸二酯酶 (PDE) 可降解cAMP生成5’-AMP，导致细胞内cAMP水平
细胞凋亡与疾病 细胞凋亡指机体细胞在发育过程中或在某些因素作用下，通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡。细胞凋亡对胚胎发育及形态发生组织内正常细胞群的稳定、机体的防御和免疫反应、疾病或中毒时引起的细胞损伤、老化、肿瘤的发生进展起着重要作用[1]。自1972年Kerr提出细胞凋亡这一概念后，从20世纪80年代末期开始成为肿瘤病因学、病理学研究热点，近几年的研究在凋亡信号转导途径、细胞凋亡的生化反应机制及细胞凋亡的调控基因，细胞凋亡与疾病的关系等方面都取得了显著的进展[2]。文章就细胞凋亡与疾病的关系进行综述。 1、概述 早在1972年，Kerr等已发现从细胞形态、超微结构和生化变化等方面来分析，细胞有两种死亡形式：一种是早被熟知的细胞坏死(Necrosis)，另一种是细胞凋亡(Apoptosis)[3]。 1.1概念 凋亡(apoptosis)一般是指机体细胞在发育过程中或在某些因素作用下，通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡(programmed cell death)。一般表现为单个细胞的死亡，且不伴有炎症反应。细胞凋亡又称程序性细胞死亡(PCD)，指的是细胞将自身裂解为许多膜小泡的一种精
确调节的细胞死亡过程，是有机体为保持自身组织稳定、调控自身细胞的增殖和死亡之间的平衡、由基因控制的细胞主动性死亡，一种正常的生理过程[4]。细胞凋亡参与调节机体细胞生长与更新间的平衡稳定，在机体发育过程中和成年机体新陈代谢中都起着重要作用。但近年来的研究表明，细胞凋亡还与多种疾病(如发育畸形、神经退化症、自身免疫性疾病、肿瘤、艾滋病等)的发生发展有关，从而使细胞凋亡研究成为生命科学研究的热点之一[5]。 2、细胞凋亡的形态学和生化特征 2.1 形态学特征 细胞凋亡时伴随着细胞膜表面、细胞质和核的一系列形态学改变，首先出现细胞体缩小、胞核固缩、胞浆密度增高，继而胞膜内陷将细胞自行分割为多个有膜包绕的凋亡小体(apoptotis bodies)。凋亡小体几乎立即被邻近的吞噬细胞所吞噬。吞噬细胞内的凋亡小体能停留数小时，可借助组织切片染色用光学显微镜观察[6]。在凋亡发生的全过程中，细胞膜一直保持完整。胞内容物不释放出来，所以不引起周围的炎症反应。同一组织中，不同细胞发生凋亡的过程并不同步[7]。 2.2生化特征 细胞凋亡时，早期Ca2+内流引起胞质中Ca2+浓度持续升高，激活了Ca2+依赖性核酸内切酶，于180碱基对处将DNA 切断，胞质内蛋白质发生交联，产生单个核小体和穴聚核小
第一节细胞凋亡的生物学意义及其相关基因 对于一个多细胞生物来说，要维持完整性和保持平衡性，凋亡是一个非常重要的生物学过程。多细胞生物的诞生、生长、发育、存活以及死亡，无一不伴随着细胞凋亡过程。 关于细胞增殖能力和寿命是有限的观点。细胞，至少是培养的二倍体细胞，有一定的寿命；它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限，这就是 Hayflick 界限。癌细胞或培养的细胞系是不正常细胞，其染色体数目或形态已经不同于原先的细胞细胞的增殖能力与供体年龄有关。物种寿命与培养细胞寿命之间存在着一定的关系。 一、细胞衰老 二倍体细胞的衰老是由细胞本身决定的。决定细胞衰老的因素在细胞内部，而不是外部的环境；是细胞核而不是细胞质决定了细胞衰老。在机体内，细胞的衰老和死亡是常见的现象，甚至在个体发育的早期也会发生;衰老动物体内，细胞分裂速度显著减慢，其原因主要是G1期明显延长;衰老个体内的环境因素影响了细胞的增殖和衰老; 二、衰老细胞结构的变化 细胞核的变化： 体外培养的二倍体细胞，细胞核随着细胞分裂次数的增加不断增大；细胞核的核膜内折（invagination）、染色质固缩化。 2. 内质网的变化： 衰老动物内质网成分弥散性地分散于核周胞质中，粗面内质网的总量似乎是减少了。 3.线粒体的变化： 通常细胞中线粒体的数量随龄减少，而其体积则随龄增大；致密体的生成：脂褐质，老年色素等。 4.膜系统的变化： 衰老的细胞，其膜流动性降低、韧性减小。衰老细胞间间隙连接减少；细胞膜
内（P面）颗粒的分布也发生变化（减少）三、细胞衰老的分子机理氧化性损伤学说：代谢过程中产生的活性氧基团或分子（ROS---O2-， OH-， H2O2），引发的氧化性损伤的积累，最终导致衰老。 端粒与衰老：发现端粒长度确实与衰老有着密切的关系，提出细胞衰老的“有丝分裂钟”学说（Harley,1990）。 rDNA与衰老: 酵母染色体外rDNA 环的积累，导致细胞衰老。 沉默信息调节蛋白复合物与衰老：复合物存在于异染色质区，其作用在于阻断所在位点DNA转录。. 细胞衰老的分子机理：SGS1基因和WRN基因与衰老：SGS1基因和WRN基因同源,编码解旋酶;酵母sgs1突变体寿命明显短于野生型（平均9.5代:24.5代）; wrn 突变引发早老症. 2.发育程序与衰老: 线粒体DNA与衰老: Sen-DNA(80年代);mtDNA突变积累与细胞衰老有关 (一)细胞死亡的方式死亡是生命的普遍现象，但细胞死亡并非与机体死亡同步。正常的组织中，经常发生“正常”的细胞死亡，它是维持组织机能和形态所必需的。 细胞死亡的方式通常有3种： ①细胞坏死（necrosis） ②细胞凋亡（apoptosis） ③细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD） 影响因素:化学因素（如强酸、强碱、有毒物质）、物理因素（如热、辐射）、 生物因素（如病原体）、坏死细胞的形态改变。 病理过程 酶性消化：参与此过程的酶，如来源于死亡细胞本身的溶酶体，则称为细胞自溶（autolysis）；若来源于浸润坏死组织内白细胞溶酶体，则为异溶（heterolysis）蛋白变性 坏死细胞的形态改变
实验七、Hela细胞凋亡诱导及检测 一、实验目的 学习细胞凋亡诱导及检测。 二、实验原理 1.细胞凋亡是多细胞有机体为调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细 胞主动死亡过程，是细胞衰老自然死亡的主要方式之一，是一种自然的生理学 过程。与细胞坏死不同，不会引起炎症反应，不释放细胞内容物。 2.DAPI是一种荧光染料，它可以与DNA双螺旋的凹槽部分发生相互作用，从而与 DNA紧密结合，可在紫外下激发蓝光。 三、实验材料 8.8mol/L的H2O2溶液，甲醇，PBS溶液，10μg/mL的DAPI染液 四、实验步骤 1.细胞传代（上一次实验完成） 2.凋亡诱导 1)取做H.E染色的小皿，加H2O2溶液150μL使终浓度为0.8mol/L 2)24小时后收集细胞进行染色和形态学观察。 3. 染色 1）收集细胞，观察，贴壁细胞较多，直接用PBS溶液洗 2）吸出洗液，加入500μL甲醇，室温固定10min 3）倒掉甲醇，PBS洗净，加500μLPBS溶液和50μLDAPI母液，于37℃染色10min 4）倒掉染液，用PBS洗净（注意避光），加入500μLPBS溶液，倒置荧光显微镜 下观察并拍照。 五、实验结果与分析 1.观察： 实验开始前镜检： 细胞贴壁较多，细胞有的仍呈不规则状，有的细胞已皱缩，还有一些细胞呈圆形浮在培养基中，核质分界不明显。可以看到有的细胞处于裂解状态。 染色后： 由于DAPI染料只对核进行染色，所以在紫外下只可见核的结构。 视野里最多的是正常细胞，其特点是染色质均一且核表面光滑，说明凋亡是不同步的。 凋亡各时期的细胞也都可见，其主要特点是染色不均一。凋亡前期和中期的细胞较多。很少看到凋亡末期的细胞，除了这个时期细胞较少外，还可能因 为在前期操作中很多凋亡小体被洗掉了。而且有的细胞在正常光下观察是明显 的裂解状态，但是到紫外光路下就变得很不明显了。 另外，可以看到很多分裂期的细胞，其特点为染色深，细胞核染色质浓缩，但是看起来较均一，往往有对称性，特别是分裂末期的细胞两个子细胞会靠在 一起。 2.照片及分析：
一、细胞内膜泡运输的概况、类型及其主要功能 膜泡运输是蛋白质分选的一种特有的方式，普遍存在于真核细胞中。在转运过程中不仅涉及蛋白质本身的修饰、加工和组装，还涉及多种不同的膜泡靶向运输及其复杂的调控过程。主要分为一下三种类型： COPⅠ包被小泡：负责回收、转运内质网逃逸蛋白返回内质网。 COPⅡ衣被小泡：介导内质网到高尔基体的物质运输。 网格蛋白衣被小泡：介导质膜→胞内体、高尔基体→胞内体、高尔基体→溶酶体、植物液泡的物质运输 二、试述物质跨膜的种类及其特点 主要有三种途径： （一）被动运输： 指通过简单扩散或协助扩散实现物质由高浓度向低浓度方向的跨膜转运。动力来自物质的浓度梯度，不需要细胞提供代谢能量。 1、简单扩散：也叫自由扩散（free diffusion）。特点：①沿浓度梯度（或电化学梯度）扩散； ②不需要提供能量；③没有膜蛋白的协助。 2、促进扩散：特点：①比自由扩散转运速率高；②运输速率同物质浓度成非线性关系； ③特异性；④饱和性。 （二）主动运输: 是由载体蛋白所介导的物质逆浓度梯度或电化学梯度由浓度低的一侧向高的一侧进行跨膜转运的方式。 主动运输的特点是：①逆浓度梯度（逆化学梯度）运输；②需要能量；③都有载体蛋白。（三）吞排作用 真核细胞通过胞吞作用和胞吐作用完成大分子与颗粒性物质的跨膜运输。 三、试述Na+—K+泵的工作原理 Na+—K+ATP酶通过磷酸化和去磷酸化过程发生构象的变化，导致与Na+、K+的亲和力发生变化。在膜内侧Na+与酶结合，激活ATP酶活性，使ATP分解，酶被磷酸化，构象发生变化，于是与Na+结合的部位转向膜外侧；这种磷酸化的酶对Na+的亲和力低，对K+的亲和力高，因而在膜外侧释放Na+、而与K+结合。K+与磷酸化酶结合后促使酶去磷酸化，酶的构象恢复原状，于是与K+结合的部位转向膜内侧，K+与酶的亲和力降低，使K+在膜内被释放，而又与Na+结合。总的结果是每一循环消耗一个ATP；转运出3个Na+，转进2个K+。 四、试述胞间通信的主要类型 1）、细胞间隙连接 细胞间隙连接：是一种细胞间的直接通讯方式。两个相邻的细胞以连接子相联系。连接子中央为直径1.5nm的亲水性孔道。 2）、膜表面分子接触通讯 是指细胞通过其表面信号分子（受体）与另一细胞表面的信号分子（配体）选择性地相互作用，最终产生细胞应答的过程，即细胞识别。 3）、化学通讯 细胞分泌一些化学物质（如激素）至细胞外，作为信号分子作用于靶细胞，调节其功能，这种通讯方式称为化学通讯。根据化学信号分子可以作用的距离范围，可分为以下3类：内分泌、旁分泌、自分泌
细胞凋亡学说在帕金森病发病机制的理 论探索 （作者:___________单位: ___________邮编: ___________） 作者：吴建军肖清刘凯刘永琦苏韫聂蕾郑炜 【关键词】帕金森病;发病机制;细胞凋亡 帕金森病(PD)主要症状包括静止性震颤、肌肉僵直、运动迟缓和姿势平衡障碍等，病理变化主要为黑质致密部(DSN)和多巴胺(DA)能神经元选择性变性〔1〕。PD病情呈渐进性的加重过程，患者晚期生活无法自理，最终死于肺部感染等并发症。PD 在中老年人群发病率很高，流行病学调查显示〔2〕，55 岁以上人口 PD 患病率为 1.4%，在 75 岁以上人口达 3.4%。PD 被发现以来其病因到目前仍不明确，有关病因的假说主要有遗传学说和环境毒素学说。随着研究水平的提高，从细胞凋亡理论探索PD的发病机制近几年受到了国内外学术界的关注。 1 PD研究中已克隆出的相关基因与细胞凋亡〔3〕 见表1。这些基因的发现能够解释家族性 PD 的病因，但家族性PD占PD病人的总数还不到10%，其余的大部分都是散发性PD，很难确定其中的遗传因素。环境毒素学说的提出最早开始于1甲基4 苯基1，2，3，6四氢吡啶(1methyl4phenyl1，
2,3,6tetrahydropyridine，MPTP)毒性作用的发现〔4〕。人类和非灵长类动物给予MPTP后引起PD的运动缺乏表现，并且伴随着有DSN、DA 能神经元的选择性破坏和DA含量的显著降低。另外，除草剂和杀虫剂的使用与PD的发生呈正相关。鱼藤酮是一种被广泛应用的杀虫剂，能够抑制线粒体复合体Ⅰ的活性。在动物实验中发现，静脉注射鱼藤酮可以选择性造成DA能神经元的死亡，残存神经元内形成一种被称为Lewy小体的物质，并且动物出现类似PD运动障碍的症状〔5〕。这都表明在散发型PD的发病过程中环境因素可能起着重要的作用。虽然遗传学说和环境毒素学说都各有依据，但彼此不能互相否定。许多遗传学的研究不能排除亲缘关系较近的人群受共同生活环境的影响;而环境毒素学说也不能解释为什么接触毒素后仅有少数人出现了PD症状。这就产生了另外一个假说，即大部分PD是在一定的遗传背景下受环境毒素侵害而发病的，但这一学说有待于相关研究的证实。 PD的发病机制尚未明确。目前有关PD发病机制的假说有氧化应激、线粒体损伤、神经兴奋毒性、神经营养缺失、蛋白水解应激、免疫异常、炎症反应、多巴胺转运体失活、αsynuclein异常沉积和细胞凋亡等，其中神经兴奋毒性、氧化应激和细胞凋亡学说较受重视〔6〕。神经兴奋毒性学说认为兴奋型神经递质如谷氨酸(Glu)等大量释放，通过激动α氨基羟甲恶唑丙酸(AMPA)受体及N甲基D天门冬酸(NMPA)受体和代谢型Glu受体以及通过膜去极化激活电压依赖性钙通道造成胞内钙超载，最终通过一系列机制导致细胞死亡。氧化应激学说认为PD是由于神经细胞氧化磷酸化过程中所产生的自由基
实验14 细胞凋亡的诱导和检测 20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式：凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡，坏死过程细胞膜通透性增高，细胞肿胀，核碎裂，继而溶酶体、细胞膜破坏，细胞容物溢出，细胞坏死常引起炎症反应。 细胞凋亡apoptosis一词来源于古希腊语，意思是花瓣或树叶凋落，意味着生命走到了尽头，细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。凋亡是细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。凋亡时细胞皱缩，表面微绒毛消失，染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘，继而核裂解，由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面，最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整，不引起炎症反应。细胞凋亡时的生化变化特征是核酸切酶被激活，染色体DNA被降解，断裂为50～300 kb长的DNA片段，再进一步断裂成180～200bp整倍数的寡核苷酸片断，在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DNA Ladder)。细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。 1．细胞凋亡的检测方法 凋亡细胞具有一些列不同于坏死细胞的形态特征和生化特征，据此可以鉴别细胞的死亡形式。细胞凋亡的机制十分复杂，一般采用多种方法综合加以判断，同时不同类型细胞的凋亡分析方法有所不同，方法选择依赖于具体的研究体系和研究目的（表？）。
形态学观察方法：利用各种染色法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征： （1）DAPI时常用的一种与DNA结合的荧光染料。借助于DAPI染色，可以观察细胞核的形态变化。 （2）Giemsa染色法可以观察到染色质固缩、趋边、凋亡小体形成等形态。 （3）吖啶橙(AO)染色，荧光显微镜观察，活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （4）吖啶橙(A())／溴化乙啶(EB)复染可以更可靠地确定凋亡细胞的变化，AO只进入活细胞，正常细胞及处于凋亡早期的细胞核呈现绿色；EB只进入死细胞，将死细胞及凋亡晚期的细胞的核染成橙红色。 （5）台盼蓝染色对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助，如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。使用透射电镜观察，可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 （6）木精-伊红（HE）染色是经典的显示细胞核、细胞质的染色方法，染色结果清晰。发生凋亡的细胞经HE染色后，其细胞大小的变化及特征性细胞核的变化：染色质凝集、呈新月形或块状靠近核膜边缘，晚期核裂解、细胞膜包裹着核碎片“出芽”凸出于细胞表面形成凋亡小体等均可明显显示出来。 DNA凝胶电泳：细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞小分子 质量DNA片段增加，高分子DNA减少，胞质出现DNA片段。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180～200 bp DNA片段，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片段，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。
细胞凋亡 同学们好，这一讲开始我们来学习细胞凋亡的检测方法。 细胞死亡的方式有很多种，最常见的有坏死（necrosis），它是细胞受到物理或化学损伤的情况下，以及缺氧时会发生的现象，另一种常见的死亡方式是细胞凋亡（apoptosis），又称细胞程序性死亡，它是细胞主动的有序的死亡过程，用来去除多余的，不需要的或异常的细胞，保障生物体内环境的稳定，是一种基本的生物学现象。其他死亡方式还有自噬性细胞死亡（autophagic cell death）和细胞焦亡（Pyroptosis）。随着生命科学的发展，这些死亡方式逐渐进入我们的视野，被关注。 不同的死亡方式有着各自的特征。比如坏死，从形态学上观察，胞体肿胀、胞质空泡化，胞膜破损、最后崩解，所以坏死又称细胞胀亡（Oncosis）。而细胞凋亡，胞体缩小，膜表面出芽状形成凋亡小体，最终从细胞表面脱落，膜基本保持完整、。 细胞凋亡研究有着非常重要的生理和病理意义，2002年诺贝尔生理学或医学奖就授予了细胞程序性死亡方面的研究工作。细胞凋亡参与机体的正常发育与分化、内环境的稳定、免疫系统防御等重要的生理过程，一旦凋亡异常就会导致一些重大疾病的发生与发展，比如肿瘤的发生，肿瘤早期阶段细胞凋亡都是受到抑制的，诱导肿瘤细胞凋亡已成为抗肿瘤药物研发的一个重要方向。 近年来，许多细胞凋亡检测方法得到广泛的应用。下面介绍四种近年来细胞凋亡的主要检测方法： 一、形态学观察 细胞发生凋亡时会出现一系列独特的形态学特征，如细胞体积变小;核固缩，染色质高度凝聚，且堆积在核膜内侧缘或聚集于核中央部;接着凋亡小体的产生，细胞膜皱褶、细胞表面产生了许多泡状或芽状突起，形成单个的凋亡小体。借用光学显微镜、电子显微镜或荧光显微镜可不同程度、不同层次地观测到这些形态学特征。这种细胞凋亡形态学检测的方法简易、直观和有较好定位，但也有不足之处:缺乏特定标准，主观性大，因人而异;又不能定量，有较大的局限性，因而形态学观察多用于固定组织细胞检测，常作为其他技术的辅助。 二、流式细胞术 流式细胞仪(flow cytometry，FCM)是一种对液相中分散着的细胞进行定性、定量分析与分选的设备，具有分析速度快、敏感性好，和精确度高的特点，能够对于不同细胞发生凋亡进度不同的过程，进行准确检测。当待检测的细胞随着液流系统经过探测点，检测到的前向散射光强度代表了细胞的大小，而侧向散射光反应细胞内颗粒的复杂程度。细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞的前向散射光降低，侧向散射光增高;而坏死细胞的前向散射光和侧向散射光同时增高。因此，可区分正常、坏死和凋亡细胞。FCM可以配合荧光染料进行多参数测定，凋亡检测中常用的是AnnexinV-FITC/PI双荧光标记，能够进行早、中期凋亡阶段凋亡率的测定。 三、细胞凋亡的DNA片段检测 DNA断裂是细胞凋亡最显著的生物化学特点，细胞凋亡时，核酸内切酶与相关蛋白水解酶被激活，将DNA降解，形成长度为180～200bp或其整倍数的
第十二章细胞增殖与细胞周期 一、单项选择题1．细胞周期中，决定一个细胞是分化还是增殖的控制点（R 点）位于 A. G1期末 B. G2期末 C. M期末 D.高尔基复合体期术 E. S期 2．细胞分裂后期开始的标志是 A. 核仁消失 B.核膜消失 C.染色体排列成赤道板 D.染色体复制E着丝粒区分裂，姐妹染色单体开始分离 3 .细胞周期中，DNA合成是在 A. G1 期 B. S期 C. G2 期 D. M 期E GO 期 4．有丝分裂中，染色质浓缩，核仁、核膜消失等事件发生在 A.前期 B.中期 C.后期 D.末期 E.以上都不是 5．细胞周期中，对各种刺激最为敏感的时期是 A. GO 期 B. G1 期 C. G2 期 D. S期 E. M 期 6．组蛋白的合成是在细胞周期的 A. S期 B. G1 期 C. G2 期 D. M 期E GO 期 7 下列哪种关于有丝分裂的叙述不正确 A.在前期染色体开始形成 B.前期比中期或后期都长 C. 染色体完全到达两极便进入后期 D.中期染色体最粗短 E 当染色体移向两极时，着丝点首先到达 8 着丝粒分离至染色单体到达两极是有丝分裂的 A .前期B.中期 C.后期D.末期E.胞质分裂期 9 细胞增殖周期是指下列哪一阶段 A.细胞从前一次分裂开始到下一次分裂开始为止 B 细胞从这一次分裂开始到分裂结束为止 C 绌胞从这一次分裂结束到下一次分裂开始为止 D. 细胞从前一次分裂开始到下一次分裂结束为止 E 细胞从前一次分裂结束到下一次分裂结束为止 10. 细胞周期中，遗传物质的复制规律是 A.异染色质先复制 B.常染色质先复制 C 异染色质大量复制，常染色质较少复制 D. 常染色质大量复制，异染色质较少复制 E 常染色质和异染色质同时复制 11. 真核生物体细胞增殖的主要方式是 A.有丝分裂 B.减数分裂 C.无丝分裂 D.有丝分裂和减数分裂 E.无丝分裂和减数分裂 12. 从细胞增殖角度看，不再增殖细胞称为 A. G1A态细胞 B. G1B态细胞 C. G1期细胞 D. G2期细胞 E. G0期细胞 13. 在细胞周期中，哪一时期最适合研究染色体的形态结构 A.间期 B.前期 C.中期D后期E.末期 14. 细胞周期的顺序是 A. M期、G1期、S期、G2期B . M期、G1期、G2期、S期 C. G1期、G2期、S期、M期 D. G1期、S期、M期、G2期
细胞生物学：研究细胞基本生命活动规律的科学，它从不同层次(显微、亚显微和分子水平)上研究细胞结构与功能，细胞增殖、分化、衰老与凋亡，细胞信号转导，细胞基因表达与调控，细胞起源与分化等。 细胞分化：其本质是细胞内基因选择性表达功能蛋白质的过程。 细胞质膜 ( plasma membrane )：又称细胞膜，指围绕在细胞最外层，由脂质和蛋白质组成的生物膜。 内膜：形成各种细胞器的膜。 生物膜( biomembrane )：质膜和内膜的总称。 细胞外被：也叫糖萼，由质膜表面寡糖链形成。 膜骨架：质膜下起支撑作用的网络结构。 细胞表面：由细胞外被、质膜和表层胞质溶胶构成。 脂筏模型(lipid rafts model) ：即在生物膜上胆固醇等富集而形成有序脂相,如同脂筏一样载着各种蛋白。脂筏是质膜上富含胆固 醇和鞘磷脂的微结构域。 被动运输指通过简单扩散或协助扩散实现物质由高浓度到低浓度方向的跨膜运输。 水孔蛋白(aquporins ；AQPs) ：或称水分子通道，是一类具有选择性、高效转运水分的膜通道蛋白。不具有“水泵”功能，通过减小水分跨膜运动的阻力而使细胞间的水分迁移速度加快。 协助扩散：也称促进扩散( facilitated diffusion )：各种极性分子和无机离子顺着浓度梯度或电化学梯度的跨膜运输。 通道蛋白：跨膜亲水性通道，允许特定离子顺浓度梯度通过，又称离子通道。 配体门通道：受体与细胞外的配体结合，引起通道构象改变，“门”打开，又称离子通道型受体。 协同运输：靠间接提供能量完成主动运输，所需能量来自膜两侧离子的浓度梯度。动物细胞中常常利用膜两侧Na+ 浓度梯度来驱动。植物细胞和细菌常利用H+ 浓度梯度来驱动。分为：同向协同和反向协同。 膜泡运输：真核细胞通过胞吞作用( endocytosis )和胞吐作用( exocytosis )完成大分子与颗粒性物质的跨膜运输。 胞吐作用：包含内容物的囊泡移至细胞表面，与质膜融，将物质排出细胞之外底物水平的磷酸化：由相关酶将底物分子上的磷酸基团直接转移到ADP 分子生成ATP 的过程。氧化磷酸化：在呼吸链上与电子传递相耦联，ADP 被磷酸化生成ATP 的过程。 半自主性细胞器：自身含有遗传表达系统，但编码的遗传信息十分有限，其RNA 转录、蛋白质翻译、自身构建和功能发挥等必须依赖核基因组编码的遗传信息。 细胞内膜系统：是指细胞内在结构、功能及发生上相关的、由膜包被的细胞器或细胞结构。包括内质网、高尔基体、溶酶体和分泌泡等。 粗面内质网：多为扁囊状，在ER 膜的外表面附有大量的核糖体，普遍存在于分泌蛋白质的细胞中。 光面内质网：ER 膜上无颗粒(核糖体) ，ER 的成分不是扁囊，而常为小管小囊，它们连接成网，广泛存在于能合成类固醇的细胞中。 次级溶酶体：是正在进行或完成消化作用的溶酶体，分为自噬溶酶体和异噬溶酶体。 残体：又称后溶酶体( post-lysosome )，已失去酶活性，仅留未消化的残渣，可排出细胞，也可能留在细胞内逐年增多，如表皮细胞的老年斑，肝细胞的脂褐质。 细胞内蛋白质分选：除线粒体和植物叶绿体中能合成少量蛋白质外，绝大多数的蛋白质均在细胞质基质中的核糖体上开始合成然后运至细胞的特定部位，这一过程称蛋白质的定向转运或蛋白质分选。 信号序列：引导蛋白质定向转移的线性序列，通常15-60 个氨基酸残基，对所引导的蛋白质没有特异性要求。 信号斑：存在于完成折叠的蛋白质中，构成信号斑的信号序列之间可以不相邻，折叠在一起构成蛋白质分选的信号。翻译后转运：在细胞质基质游离核糖体上完成多肽链的合成，然后转运至膜围绕的细胞器或成为基质可溶性驻留蛋白和支架蛋白。共翻译转运：蛋白质合成在游离核糖体上起始后，由信号肽引导转移至糙面内质网，然后新生肽链边合成边转入糙面内质网，经高尔基体加工包装转运溶酶体、细胞质膜或分泌到细胞外。 分子伴侣：细胞中的某些蛋白质分子，可以识别正在合成的多肽或部分折叠的多肽，并与多肽的某些部位结合，从而帮助这些多肽转运、折叠、或装配。这类分子本身并不参与最终产物的形成。 细胞信号转导：指细胞外因子通过与受体(膜受体或核受体)结合，引发细胞内的一系列生物化学反应以及蛋白间相互作用，直至细胞生理反应所需基因开始表达、各种生物学效应形成的过程。 双信使系统：在磷脂酰肌醇信号通路中胞外信号分子与细胞表面G 蛋白耦联型受体结合，激活质膜上的磷脂酶C( PLC-
细胞凋亡与疾病 一、基本要求 （一）掌握细胞凋亡的概念、生物学意义 （二）掌握细胞凋亡的发生机制 （三）熟悉细胞凋亡的过程及细胞凋亡与坏死的差别 （四）熟悉细胞凋亡的主要变化 （五）熟悉细胞凋亡的调控 （六）了解细胞凋亡与常见疾病或病理过程的关系 （七）了解细胞凋亡在疾病防治中的意义 二、知识点纲要 一、基本概念 （一）细胞凋亡的定义：由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞自杀过程称为细胞凋亡(apoptosis)，也称为程序性细胞死亡(programmed cell death， PCD)。 （二）细胞凋亡的基本过程 1．凋亡信号转导 2．凋亡基因激活 3．细胞凋亡的执行 4．凋亡细胞的清除 （三）凋亡时细胞的主要变化 1．细胞凋亡的形态学改变：胞膜空泡化，细胞固缩，染色质边集，凋亡小体。 2．细胞凋亡的生化改变：DNA“梯”状条带，内源性核酸内切酶激活，caspases（凋亡蛋白酶）激活。 （四）细胞凋亡的调控 1．细胞凋亡相关因素 细胞凋亡相关因素分诱导性因素和抑制性因素两大类 (1) 诱导性因素:激素和生长因子失衡,理化因素,免疫性因素,微生物等 (2) 抑制性因素: 某些激素（ACTH、睾丸酮）或细胞因子(IL-2，神经生长因子等) 的去除,某些二价金属阳离子如:Zn2+，药物如: 苯巴比妥、半胱氨酸蛋白酶抑制剂，病毒如：EB病毒，牛痘病毒CrmA等及中性氨基酸具有抑制细胞凋亡的作用。 2. 细胞凋亡信号的转导 (1)特点:凋亡信号转导系统是连接凋亡诱导因素与核DNA片段化断裂及细胞结构蛋白降解的中间环节。这个系统的特点是:①多样性;②偶联性;③同一性;④)多途性。 （2）研究较多的信号转导系统有：①胞内Ca2+信号系统；②cAMP/ PKA信号系统；③) Fas蛋白/Fas配体信号系统；④神经酰胺信号系统；⑤二酰甘油/蛋白激酶C信号系统；⑥酪氨酸蛋白激酶信号系统。 （五）凋亡相关基因 细胞凋亡相关基因多达数十种，根据功能的不同可将其分为三类:抑制凋亡基因（EIB、I AP、Bcl-2），促进凋亡基因（Fas、Bax、ICE、P53），双向调控基因（c-myc、Bcl-x）。 1． Bcl-2 是抑制凋亡的基因。 2.Fas Fas基因的表达可促进细胞凋亡。 3．p53 野生型P53基因具有诱导细胞凋亡的功能，当该基因发生突变后反而可抑制细胞凋亡。 4. c-myc，Bcl-x c-myc是一种癌基因，它能诱导细胞增殖，也能诱导细胞凋亡，具有