作者简介：杨明俊（１９７９－），男（汉），硕士研究生，研究方向：微生物药物学。
＊通讯作者
杨明俊１，杨晓彤１，＊，冯慧琴１，糜可１，杨庆尧２
（１．上海师范大学微生物与免疫学研究所，上海２００２３４；２．上海杨杨百草研究所，上海２００２３４）
两种纳豆激酶活性测定方法对比及相关性分析
摘
要：从线性和精密度两个方面对纤维蛋白平板法和四肽底物法测定纳豆激酶活性的两种方法进行了比较研
究，并验证了两种方法测定值之间的直线相关性。结果表明：纤维蛋白平板法和四肽底物法分别在１０．７７ＩＵ／ｍＬ￣８０．７３ＩＵ／ｍＬ和０．０３Ｕ／ｍＬ￣０．０９Ｕ／ｍＬ浓度范围内呈线性，且日间和日内变异系数均小于１０％。
两者结果具有直线相关性，其关系为纤维蛋白平板法测定值（ＩＵ）＝２６４．８７×四肽底物法测定值（Ｕ）－１９．６３３，（Ｒ２＝０．９９４２）。结论：纤维蛋白平板法与四肽底物法均能用于纳豆激酶活性测定，前者测定结果直接，但四肽底物法更灵敏，还可应用于高通量筛选。关键词：纳豆激酶；纤维蛋白平板法；四肽底物法
ＡＣＯＭＰＡＲＩＳＯＮＡＮＤＣＯＲＲＥＬＡＴＩＯＮＳＴＵＤＹＯＦＴＷＯＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＮＡＴＴＯＫＩＮＡＳＥＡＣＴＩＶＩＴＹＤＥＴＥＣＴＩＯＮ
ＹＡＮＧＭｉｎｇ－ｊｕｎ１，ＹＡＮＧＸｉａｏ－ｔｏｎｇ１，＊，ＦＥＮＧＨｕｉ－ｑｉｎ１，ＭＩＫｅ１，ＹＡＮＧＱｉｎｇ－ｙａｏ２
（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＳｈａｎｇｈａｉＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００２３４，Ｃｈｉｎａ；
２．ＳｈａｎｇｈａｉＹａｎｇ’ｓＨｅｒｂＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００２３４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｃｏｍｐａｒｅｄｔｈｅｌｉｎｅａｒｉｔｙａｎｄｐｒｅｃｉｓｉｏｎｏｆｆｉｂｒｉｎｐｌａｔｅ（ＦＰ）ｍｅｔｈｏｄｗｉｔｈｔｅｔｒａ－ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ｐＮＡ）ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＳＳ）ｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄｔｈｅｉｒｒｅｓｕｌｔｓ’ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｙｗａｓａｌｓｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｒｅ－ｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ：Ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｌｉｎｅａｒｒａｎｇｅｓｗｅｒｅ１０．７７ＩＵ／ｍＬ￣８０．７３ＩＵ／ｍＬｆｏｒＦＰｍｅｔｈｏｄａｎｄ０．０３Ｕ／ｍＬ￣０．０９Ｕ／ｍＬｆｏｒＳＳｍｅｔｈｏｄｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｉｌｅｂｏｔｈＣＶｓｗｅｒｅｌｅｓｓｔｈａｎ１０％ｉｎｗｉｔｈｉｎ－ｄａｙａｎｄｄａｙ－ｔｏ－ｄａｙｔｅｓｔｓ．Ｔｈｅｔｗｏｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄａｇｏｏｄｌｉｎｅａｒｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎａｎｄｃｏｕｌｄｂｅｃｏｎｖｅｒｔｅｄａｓ：ＦＰｖａｌｕｅｓ（ＩＵ）＝２６４．８７×ＳＳｖａｌｕｅｓ（Ｕ）－１９．６３３，（Ｒ２＝０．９９４２）．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ：ｆｉｂｒｉｎｐｌａｔｅｍｅｔｈｏｄａｎｄｔｅｔｒａ－ｐｅｐｔｉｄｅｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＳＳ）ｍｅｔｈｏｄａｒｅｂｏｔｈａｐ－ｐｌｉｃａｂｌｅｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇＮａｔｔｏｋｉｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｆｒｏｍＦＰｍｅｔｈｏｄｃａｎｄｉｒｅｃｔｌｙｒｅｆｌｅｃｔｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ’ｓｔｈｒｏｍ－ｂｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｔｈｅｔｅｔｒａ－ｐｅｐｔｉｄｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｍｅｔｈｏｄｈａｓｔｈｅａｄｖａｎｔａｇｅｆｏｒｆａｓｔ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ；ｆｉｂｒｉｎｐｌａｔｅｍｅｔｈｏｄ；ｔｅｔｒａ－ｐｅｐｔｉｄｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｍｅｔｈｏｄ纳豆（Ｎａｔｔｏ）是日本的传统发酵食品，以大豆为原料由纳豆芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｖａｒ．ｎａｔｔｏ）发酵而成，其风味独特、营养丰富。纳豆激酶（Ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ，ＮＫ）是纳豆中的一种丝氨酸蛋白酶，具有较强纤溶活性，因此常食纳豆可减少血管栓塞的危险，有益于老年性心血管疾病的预防［１］。
纳豆激酶的活性反映了纳豆的保健功效，因此活性测定是纳豆研究和质量控制中必需也是关键的技术之一。纳豆激酶活性测定方法常见的有纤维蛋白平板法［２］、
纤维蛋白块溶解时间法［３］、四肽底物法［４］、酶联免疫吸附法［５］和血清板法［６］等，其中使用得较多的是纤维蛋
白平板法，即根据纳豆激酶将纤维蛋白平板内纤维蛋白（Ｆｉｂｒｉｎ）水解而形成透明圈的原理，利用透明圈面积计算纳豆激酶纤溶活性。该测定法的优点是结果比较直观，但由于所用试剂为生物制品，批次差异大，实验操作复杂，实验过程耗时，难以进行大批量样品高通量筛选。已知纳豆激酶对Ｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ｐＮＡ最为敏感［７］，可以将该底物水解生成对硝基苯胺（ｐ－ＮＡ）而使溶液呈黄色，根据单位时间内对硝基苯胺的释放量计算酶的活性。此法底物为人工合成的小肽，品质容易控制，操作便捷，特别是可以进行大批样品的高通量筛选。但其测定的纳豆激酶活性与纤溶活性的相关性一直未经验证，用于纳豆激酶测定的具体条件也未见报道。
本研究分别用纤维蛋白平板法和四肽底物法测
图１
尿激酶活性标准曲线
Ｆｉｇ．１ＳｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｏｆＵｒｏｋｉｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ
定了纳豆激酶的活性，研究了与纤维蛋白平板法结果的相关性，并初步建立了纳豆激酶四肽底物测定法的具
体条件。
１材料与方法１．１材料和主要仪器
纳豆激酶粗酶提取冻干粉：由上海杨杨百草研究所提供；尿激酶标准品（６９０ＩＵ／支）：中国药品生物制品检定所；牛纤维蛋白原（７２ｍｇ可凝蛋白／支）：中国药品生物制品检定所；牛凝血酶（１９０ＢＰ单位／支）：中国药品生物制品检定所；琼脂糖：上海东海制药厂；四肽底物（Ｌ－１４００，Ｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ｐＮＡ）：Ｂａｃｈｅｍ公司；对硝基苯胺：上海试剂三厂。
Ｍｏｄｅｌ６８０型酶标仪：Ｂｉｏ－Ｂａｄ公司；ＧＳＰ－９１６０ＭＢＥ隔水式恒温培养箱：上海博迅实业有限公司；ＤＫ－Ｓ２４型电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司。
１．２方法
１．２．１纤维蛋白平板法
首先用２％（ｗ／ｖ）牛纤维蛋白原巴比妥－氯化钠（ｐＨ７．８）溶液５ｍＬ；１０％（ｗ／ｖ）琼脂糖生理盐水溶液
５ｍＬ；２００ＢＰ单位／ｍＬ牛凝血酶溶液２５ｍＬ制成纤维蛋白平板。
用巴比妥－氯化钠缓冲液配制１００ＩＵ／ｍＬ尿激酶标准品溶液并稀释成８０ＩＵ／ｍＬ、６０ＩＵ／ｍＬ、４０ＩＵ／ｍＬ、
２０ＩＵ／ｍＬ和１０ＩＵ／ｍＬ的浓度梯度，然后各取１０ｍＬ滴加到纤维蛋白平板上，３７℃条件下孵育１８ｈ后测量形成透明圈两条相互垂直的直径，并计算其面积。
以尿激酶活力单位的对数值为横坐标，透明圈面积的对数值为纵坐标，绘制标准曲线。样品溶液形成的透明圈按同样的方法测定，并计算透明圈面积的对数值，根据标准曲线以尿激酶活力单位表示其纤溶活性。
１．２．１．２纤维蛋白平板法的线性
以巴比妥－氯化钠缓冲液配制浓度分别为３０ｍｇ／ｍＬ、
２４ｍｇ／ｍＬ、１８ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ和６ｍｇ／ｍＬ的样品溶液，同法滴加在纤维蛋白平板上，测量透明圈的面积，每浓度重复５次取平均值，以ＳＰＳＳ１０．０对样品溶液浓度与相应透明圈面积的关系进行直线回归分析。
１．２．１．３纤维蛋白平板法的精密度
分别取各浓度的样品溶液滴加在纤维蛋白平板上，测量透明圈的面积，日内和日间各重复３次，以变异系数（ＣＶ）表示测定值批次间的差异。
１．２．２四肽底物法
用Ｔｒｉｓ－ＣａＣｌ２缓冲液（０．１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ，０．０１ｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２，
ｐＨ８．０）配制１ｍｍｏｌ／Ｌ的四肽底物溶液。３７℃条件下，分
别取５０ｍＬ不同浓度的样品溶液加入细胞培养孔中，再同时加入５０ｍＬ四肽底物溶液，振荡混匀，以４１５
ｎｍ为测定波长５５０ｎｍ为参比波长，用酶标仪测定１ｍｉｎ内酶促反应速度
（ｍＯＤ／ｍｉｎ）。以对硝基苯胺标准溶液的浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标作出标准曲线。根据标准曲线得到样品水解四肽底物生成对硝基苯胺的物质量。活力单位定义为，３７℃条件下，１ｍｉｎ时间内１ｍＬ反应体系中，水解四肽底物生成１ｍｍｏｌ对硝基苯胺的酶活力为１Ｕ。
１．２．２．１四肽底物法的线性
以Ｔｒｉｓ－ＣａＣｌ２缓冲液配制浓度分别为７．５ｍｇ／ｍＬ、
６ｍｇ／ｍＬ、４．５ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ和１．５ｍｇ／ｍＬ的样品溶液，同法测酶促反应的速度，重复５次取平均值，以
ＳＰＳＳ１０．０对样品溶液的浓度与相应酶促反应速度的关系进行直线回归分析。
１．２．２．２四肽底物法的精密度
分别取各浓度的样品溶液测酶促反应的速度，日内和日间各重复３次，以变异系数表示测定值批次间的差异。
１．２．３纤维蛋白平板法和四肽底物法测定值的相关性
在３０ｍｇ／ｍＬ、２４ｍｇ／ｍＬ、１８ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ和
６ｍｇ／ｍＬ浓度梯度下，分别以纤维蛋白平板法和四肽底物法测定样品溶液的活性，以ＳＰＳＳ１０．０对测定的结果进行相关性分析。
２结果与分析２．１纤维蛋白平板法２．１．１尿激酶标准曲线
尿激酶标准溶液的活力单位与其形成透明圈面积的关系见图１。
在１０ＩＵ／ｍＬ￣１００ＩＵ／ｍＬ浓度范围内，尿激酶活力单位的对数值与透明圈面积的对数值呈线性关系，
Ｙ＝０．４０５６Ｘ－０．４７４９，Ｒ２＝０．９９０２。
图２样品溶液浓度对数值与透明圈面积对数值的线性关系
Ｆｉｇ．２Ｔｈｅｌｉｎｅａｒｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｌｏｇａｒｉｔｈｍｖａｌｕｅｏｆｓａｍｐｌｅ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｌｙｔｉｃｃｉｒｃｌｅａｒｅａ
图３对硝基苯胺溶液吸光值的标准曲线
Ｆｉｇ．３Ｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｓｏｆｐ－ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｅａｂｓｏｒｂｅｎｃｙ
图４
样品溶液浓度与反应速度的关系
Ｆｉｇ．４Ｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｏｆｓａｍｐｌｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄ
ｒｅａｃｔｉｏｎｖｅｌｏｃｉｔｙ
２．１．２纤维蛋白平板法的线性
以样品溶液浓度的对数值与透明圈面积的对数值作图，发现样品溶液不同浓度的对数值与相应透明圈面积的对数值呈线性关系，Ｙ＝０．５１１２Ｘ－０．４４２３，
Ｒ２＝０．９９０２。
以ＳＰＳＳ１０．０进行直线回归分析可见：显著性概率小于１％，二者之间有极显著的直线回归关系，见表１。
２．１．３纤维蛋白平板法的精密度
各浓度的样品溶液在日内和日间分别重复３次测定，其结果见表２。
由表２可见，在日间和日内各进行３次实验其变异系数均小于１０％，显示该方法具有较高的精密度，符合生物样品的测定要求。在测定浓度范围内，随着样品溶液活性的升高变异系数明显降低。
在日间和日内进行测定具有相似变异系数的结
果，显示该方法具有较高的精密度和批次稳定性。该法在低浓度时变异系数较高的原因可能由于样品溶液形成的透明圈的边界比较模糊容易引起测量误差，因为低浓度的样品溶液在形成的透明圈较小，该误差对测定结果的影响也就更加明显。因此，在以该法进行测定时，应调整样品溶液的浓度使其活性不低于１０ＩＵ／ｍＬ。
２．２四肽底物法２．２．１吸光值标准曲线
该法采用的参考物质对硝基苯胺标准溶液的浓度与其吸光值的关系见图３。
在０．０４ｍｍｏｌ／Ｌ￣２ｍｍｏｌ／Ｌ浓度范围内，对硝基苯胺标准溶液的浓度与其吸光值呈线性关系Ｙ＝１．６４６６
Ｘ＋０．０２１２，Ｒ２＝０．９９９６。２．２．２四肽底物法的线性
以样品溶液的浓度与相应酶促反应速度作图见图４，由图４可知，样品溶液的浓度与相应酶促反应的速度呈线性关系，Ｙ＝１７．９７３Ｘ＋４４．４５，Ｒ２＝０．９８２４。
以ＳＰＳＳ１０．０进行直线回归分析可见：显著性概率小于１％，二者之间有极显著的直线回归关系，见表３。
表１
样品溶液浓度对数值与透明圈面积对数值的回归关系
Ｔａｂｌｅ１
Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｒｅｌａｔｉｏｎｏｆｓａｍｐｌｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｌｏｇａｒｉｔｈｍ
ｖａｌｕｅａｎｄｌｙｔｉｃｃｉｒｃｌｅａｒｅａ
ＳＳ０．３０２０．００３０．３０５
ｄｆ１３４
ＭＳ０．３０２０．００１
Ｆ３０３．１４１
Ｓｉｇ０
变异来源Ｓｏｕｒｃｅｏｆｖａｒｉａｔｉｏｎ回归Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ残差Ｒｅｓｉｄｕａｌ
总变异Ｔｏｔａｌｖａｒｉａｔｉｏｎ
日内Ｗｉｔｈｉｎ－ｄａｙ日间Ｄａｙ－ｔｏ－ｄａｙ透明圈面积平均值／ｃｍ２
Ｍｅａｎｏｆｌｙｔｉｃｃｉｒｃｌｅａｒｅａ／ｃｍ２
０．８６１．３１１．６１１．８３２．００
变异系数／％
ＣＶ／％６．２８２．１８２．３８１．９３１．２０透明圈面积平均值／ｃｍ２
Ｍｅａｎｏｆｌｙｔｉｃｃｉｒｃｌｅａｒｅａ／ｃｍ２
０．８７１．３５１．６５１．８４１．９８
变异系数／％
ＣＶ／％６．４１３．４６２．３９１．４１１．７０
表２
纤维蛋白平板法的精密度分析结果
Ｔａｂｌｅ２Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｆｉｂｒｉｎｐｌａｔｅｍｅｔｈｏｄ
样品溶液浓度／（ｍｇ／ｍＬ）
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ／（ｍｇ／ｍＬ）
６．００１２．００１８．００２４．００３０．００
日内Ｗｉｔｈｉｎ－ｄａｙ
日间Ｄａｙ－ｔｏ－ｄａｙ
ｄｆ１３４
变异来源Ｓｏｕｒｃｅｏｆｖａｒｉａｔｉｏｎ回归Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ残差Ｒｅｓｉｄｕａｌ总变异ＴｏｔａｌｖａｒｉａｔｉｏｎＳＳ７２９０．０００１３８．８００７４２８．８００ＭＳ７２９０．０００４６．２６７Ｆ１５７．５６５Ｓｉｇ．０．００１表３
样品稀释度与酶促反应速度的回归关系
Ｔａｂｌｅ３Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｒｅｌａｔｉｏｎｏｆｓａｍｐｌｅｄｉｌｕｔｉｏｎａｎｄｅｎｚｙｍｅ
ｒｅａｃｔｉｏｎｖｅｌｏｃｉｔｙ２．２．３四肽底物法的精密度
各浓度的样品溶液在日内和日间分别重复３次测定，其结果如表４。
由表４可见，在日间和日内各进行３次实验其变异系数均小于１０％，显示该方法具有较高的精密度，符合生物样品的测定要求。在测定浓度范围内，随着样品溶液活性的升高变异系数明显降低。
当样品溶液浓度较低时，酶促反应产物的变化量不能被酶标仪准确读取；当样品溶液的浓度较高时，反应体系内的底物在极短时间内被耗尽，酶促反应进入混合级，引起测定结果的误差比较明显。在此反应体系内，适当调整样品溶液的浓度使其活性不低于０．０３Ｕ／ｍＬ。
２．３纤维蛋白平板法和四肽底物法测定值的相关性
在相同浓度梯度条件下，将四肽底物法与纤维蛋白平板法所测定的结果以ＳＰＳＳ１０．０进行相关性统计学分析，呈极显著的正相关关系（Ｒ２＝０．９９４２，Ｐ＜０．０１）。可见四肽底物法测得的数值可以表示纳豆激酶的纤溶活性，二者之间的关系为：纤维蛋白平板法测定值（ＩＵ）＝２６４．８７×四肽底物法测定值（Ｕ）－１９．６３３。
３小结
近年纳豆激酶因具有口服溶栓作用而备受关注。目前纳豆激酶活性的测定大多为测定其溶栓作用，如纤维蛋白平板法［２］、纤维蛋白块溶解时间法［３］等，通过参考尿激酶标准品来定出活性。这些方法直观，但难以进行大批量样品的高通量筛选。四肽底物法则可进行高通量筛选，且实验操作简便、快速，但因为该法并非直接测定溶栓活性，而是测定其酰胺水解活性，其测定结果是否可代表纳豆激酶的溶栓作用一直受到质疑［８］。
本研究用纤维蛋白平板法和四肽底物法分别测定了纳豆激酶样品溶液的活性，并研究了两种方法所得结果间的相关性。结果显示，用两种不同方法测定所得的结果之间呈极显著的正相关关系（Ｒ２＝０．９９４２，Ｐ＜０．０１），因此四肽底物法完全可作为纳豆激酶活性的测定方法，二者之间的关系为：纤维蛋白平板法测定值（ＩＵ）＝２６４．８７×
四肽底物法测定值（Ｕ）－１９．６３３。精密度实验结果显示，纤维蛋白平板法精确测定的活性范围不宜低于１０ＩＵ／ｍＬ，而四肽底物法精确测定的最低活性约相当于２．５ＩＵ／ｍＬ。可见，四肽低物法的灵敏度要明显高于纤维蛋白平板法。
纤维蛋白平板法和四肽底物法测得的结果还表明，样品活性在分别在１０．７７ＩＵ／ｍＬ￣８０．７３ＩＵ／ｍＬ和
０．０３Ｕ／ｍＬ￣０．０９Ｕ／ｍＬ时，样品溶液浓度与活性间都具有极显著的直线回归关系，且日内与日间不同批次测定值的变异系数均小于１０％，显示两种方法均具有较高的精密度。
总之，纤维蛋白平板法直接以尿激酶活性表示其测定值，适用于纳豆激酶的活性标定；而四肽底物法虽间接反映溶栓活性，但有简便、快捷、灵敏度高等优点，更适用于纳豆激酶的快速测定及发酵工艺、分离纯化等需要高通量筛选的分析。
致谢：本课题由上海杨杨百草研究所资助。参考文献：
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表４
四肽底物法的精密度分析结果
Ｔａｂｌｅ４Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｅｔｒａ－ｐｅｐｔｉｄｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｍｅｔｈｏｄ样品溶液
浓度／（ｍｇ／ｍＬ）
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ／（ｍｇ／ｍＬ）１．５０３．００４．５０６．００７．５０反应速度平均值／（ｍＯＤ／ｍｉｎ）Ｍｅａｎｏｆｒｅａｃｔｉｏｎｖｅｌｏｃｉｔｙ／（ｍＯＤ／ｍｉｎ）６８．４７１０２．４３１２９．５０１５１．９０１６９．５０变异系数／％ＣＶ／％９．５７４．９３６．４９２．４１０．８２反应速度平均值／（ｍＯＤ／ｍｉｎ）Ｍｅａｎｏｆｒｅａｃｔｉｏｎｖｅｌｏｃｉｔｙ／（ｍＯＤ／ｍｉｎ）
６２．３７９９．９３１３３．５０１５９．０７１７６．６３
变异
系数／％ＣＶ／％７．６２５．９９５．５７１．７２３．３９
作者简介：于见亮（１９７９－），男（汉），在读硕士研究生，主要从事肉类科学的研究。
＊通讯作者：卢士玲（１９７６－），女，博士，讲师。［５］
ＹｕｋｉＹ，ＮａｋａｇａｗａＴ，ＦｕｊｉｔａＭ，ｅｔａｌ．Ａｓａｎｄｗｉｃｈｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙｆｏｒｎａｔｔｏ［Ｊ］．Ｂｉｏｓｃｉ．ＢｉｏｔｅｃｈＢｉｏｃｈｅｍ，１９９４，５８（２）：３６６－３７０
［６］ＨａｒａＴ，ＴａｄｏｋｏｒｏＹ，ＳａｔｏｙａｍａＴ．Ａｓｉｍｐｌｅ，ｅａｓｙａｎｄｒｏｕｔｉｎｅａｓｓａｙｏｆ
ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．Ｊｐｎ．Ｓｏｉ．ＦｏｏｄＳｃｉ．Ｔｅｃｈ．，１９９６，４３（２）：１７２－１７５
［７］ＦｕｊｉｔａＭ，ＮｏｍｕｒａＫ，ＨｏｎｇＫ，ｅｔａｌ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ－
ｔｉｏｎｏｆａｓｔｒｏｎｇｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅ（Ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ）ｉｎｔｈｅｖｅｇｅｔａｂｌｅｃｈｅｅｓｅＮａｔｔｏ，ａｐｏｐｕｌａｒｓｏｙｂｅａｎｆｅｒｍｅｎｔｅｄｆｏｏｄｉｎＪａｐａｎ［Ｊ］．Ｂｉｏ－ｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３，１９７（３）：１３４０－１３４７
［８］陈志文，徐尔尼，肖美燕．纳豆激酶的研究进展［Ｊ］．食品科学，２００２，
２３（１０）：１３０－１３４
收稿日期：２００７－０６－１８
应用ＫＤＹ－９８２０凯氏定氮仪测定羊肉中
挥发性盐基氮
摘要：应用ＫＤＹ－９８２０凯氏定氮仪测定羊肉中挥发性盐基氮，通过与半微量定氮法对比及精密度实验，结果表明
ＫＤＹ－９８２０全自动定氮仪能简便、
快速、准确地测定肉中的挥发性盐基氮。关键词：ＫＤＹ－９８２０凯氏定氮仪；挥发性盐基氮；羊肉；检测方法
ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＴＩＯＮＯＦＴＨＥＴＶＢ－ＮＯＦＭＵＴＴＯＮＢＹＫＤＹ－９８２０ＴＹＰＥＡＵＴＯＭＡＴＩＣＡＺＯＴＯＭＥＴＥＲ
ＹＵＪｉａｎ－ｌｉａｎｇ１，ＬＩＫａｉ－ｘｉｏｎｇ１，ＬＵＳｈｉ－ｌｉｎｇ１，＊，ＨＵＡＮＧＣｈａｏ２，ＰＵＪｕ－ｓｈｕａｎｇ２，ＺＥＮＧＸｉａｏ－ｈｏｎｇ２（１．ＦｏｏｄＣｏｌｌｅｇｅｏｆＳｈｉｈｅｚｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｉｈｅｚｉ８３２００３，Ｘｉｎｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ；２．ＬｕＸｉａｎｇＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙ
ＬｉｍｉｔｅｄＬｉａｂｉｌｉｔｙＣｏｍｐａｎｙｏｆＸｉｎｊｉａｎｇ，Ｔａｃｈｅｎｇ８３４６０１，Ｘｉｎｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴＶＢ－ＮｏｆｍｕｔｔｏｎｗａｓａｎａｌｙｓｅｄｂｙＫＤＹ－９８２０ｔｙｐｅａｕｔｏｍａｔｉｃａｚｏｔｏｍｅｔｅｒ，ｔｈｒｏｕｇｈｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｋｊｅｌｄａｈｌａｎｄｓｔｕｄｉｅｄｔｈｅｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，ａｃｃｕｒａｃｙａｎｄｉｎａｃｃｕｒａｃｙｏｆＫＤＹ－９８２０ｔｙｐｅａｕｔｏｍａｔｉｃａｚｏｔｏｍｅｔｅｒ．Ａｓａｒｅ－ｓｕｌｔｏｆｔｅｓｔ，ａｓｉｍｐｌｅ，ｆａｓｔａｎｄａｃｃｕｒａｔｅａｎａｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄｉｓｃｏｎｆｉｒｍｅｄｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＴＶＢ－ＮｏｆｍｅａｔｂｙｔｈｅＫＤＹ－９８２０ｔｙｐｅａｕｔｏｍａｔｉｃａｚｏｔｏｍｅｔｅｒ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＫＤＹ－９８２０ｔｙｐｅａｕｔｏｍａｔｉｃａｚｏｔｏｍｅｔｅｒ；ＴＶＢ－Ｎ；ｍｕｔｔｏｎ；ｔｅｓｔｉｎｇｍｅｔｈｏｄ于见亮１，李开雄１，卢士玲１，＊，黄超２，蒲菊霜２，曾小红２
（１．石河子大学食品学院，新疆石河子８３２００３；２．新疆绿翔牧业有限公司，新疆塔城８３４６０１）
挥发性盐基氮（ＴＶＢ－Ｎ）能有效地反映肉的新鲜度，新鲜肉、次鲜肉、变质肉之间挥发性盐基氮的差异非常明显，并与感官变化一致，是评定肉的新鲜度变化的客观指标。目前，通常采用半微量定氮法测定肉中的挥发性盐基氮，但该方法有操作过程繁琐、费时的缺点，其次在加样蒸馏时，碱的作用会使反应室内样液剧烈沸腾而发泡，带有氧化镁颗粒的泡沫往往会污染反应室顶部使其难以清洗。自动定氮仪具有自动加液、蒸馏、吸收等功能，操作简单、省时快速、结果准确，被广泛应用于各类食品和饲料等的蛋白质测定，但应用在
肉中测挥发性盐基氮的报导较少，且尚无标准的测定方法。本研究应用ＫＤＹ－９８２０凯氏定氮仪测定羊肉中挥发性盐基氮含量，对测定处理条件进行探讨，从而建立适合于批量肉样品的挥发性盐基氮测定的一种快速而准确的检测方法。
１材料与方法１．１材料与仪器
材料：羊后腿瘦肉。
主要仪器为：ＫＤＹ－９８２０凯氏定氮仪：北京通润源机电技术有限责任公司；ＡＡＲ２１４０万分之一电子天平：美国奥豪斯公司；微量滴定管。
试剂：均为分析纯。
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叶绿体得提取 一、试剂配置 １、PＢS提取液:每L水依次加入MES(１9５.2×0。05=９、7６g)、山梨糖醇(0。33×182。2＝60。1２6g)、ＮaCｌ(０、０10×58.5=0、５85g)、MgCｌ(０.002×95=0、19g)、EDＴA(292、２5×０.0０２=０、５84５g)、KH2PO４(２00×0.0005=０、１g);使用时加入ASＡ—Nａ(１98。1×0、00２=0、３962g); 2、悬浮液:将ＰBS提取液中得MES换为238。３×0.05＝１１、９15g得HEＰＥS(238、3×０。05=11。915ｇ); ３、8０%Pｅrｃoｌ:8０ml原液+２0ml水;40％Perｃol:４0ｍl原液＋60ml水; 实际配制: PBS提取液2000ｍl(3个处理*2个品种＊３个重复＊20ml＊３次=1０80mｌ), 悬浮液100ml(３个处理＊2个品种＊3个重复*1mｌ＊3次＝5４ml); 8０％Percol ２０0ml;40%Percｏl 200ml。(3个处理*2个品种*3个重复*3mｌ＊3次=162ｍl) 二、提取步骤 1、10g鲜样加20ｍl提取ＰＢS(50mM MES PH６、1,含0、３3M山梨糖醇,10mM NaＣl,2mMＭgCｌ２,２ｍM EＤTA,０.5 mMKH2PＯ４,2mM ASA—Ｎa,ASＡ—Na使用前现配现加) 2、快速研磨,使叶片碎成绿豆粒大小,４层纱布过滤,去除残渣(注意过滤时不可用力挤压,以免叶绿体膜破碎) 3、滤液20００g ３ｍin,小心倒出上清液,将离心管放入离心机后,使离心机得加速很快上升到预定值(水平转头,加速度调到9),约经30s后很快使其下降停止,整个离心持续大约2—3ｍｉｎ左右完成; 4、沉淀用１ml提取液漂洗表面悬浮物; 5、用1ml悬浮液(５０mM HＥPＥS pＨ7。6,含０、３３mM山梨糖醇,１０mM NaＣl,2mM MgＣl2,2mM EDTA,0。5mMKH2PＯ４,2mM ASA－Ｎａ,ASＡ-Na使用前现配现加)将沉淀悬浮,在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷,或者用手握住离心管在冰块之间搅动,使叶绿体由于震动分散开来,不要用棉球吸滤,以防被膜压破。叶绿体悬浮时要浓点,含叶绿素２ｍg、ml-1以上,这样有利于保持活性。 6、２000g 1min; 7、沉淀再用悬浮液悬浮;(悬浮液同5,可以不做) 8、用Ｐｅrcol试剂进行梯度离心(将3ml含有80％Peｒcｏl(原液按100％算)铺在１0mｌ离心管下层,再把３ｍl 40％Perｃol铺在离心管中层,然后将1mｌ叶绿体悬浮液轻轻铺在离心管上层)１500ｇ2-3mｉn(用
SOD酶活性测定 所需药品： （1）0.1mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液： A液：0.1mol/l磷酸氢二钠液 B液：0.1mol/l磷酸二氢钠液 1毫升B+10.76毫升A （2）0.026mol/l蛋氨酸液（Met）：现用现配 称取0.3879克蛋氨酸，用1号液定容至100毫升。 （3）75*10-5mol/l氯化硝基四氮唑蓝（NBT）液：现用现配 称取0.1533克NBT，先用少量蒸馏水溶解，然后定容至250毫升。 （4）1umol/lEDTA-2钠和2*10-5mol/l核黄素混合液 （5）0.05mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液 （6）石英砂 实验步骤： 1.酶液制备：称取0.5克鲜叶，放入研钵中，加入3毫升5号液和少量石英砂，于冰浴中研成匀浆。然后用5号液定容至8毫升，于0～4℃、13000g时离心15分钟，上清液即为酶提取液。酶液可在低于0℃下的环境中保存。 2.按下表加入试剂： 试剂摇匀后，迅速遮光处理1号杯，其余杯在25℃、光强为4000勒克司的条件下照光处理15分钟，然后立即遮光。接着在560nm下，以1号杯作为空白测定其余杯中溶液的光密度。假定2、3号杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率为100%，然后按下式分别计算其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率。 M/N=100/X M——2、3号杯中溶液的光密度的平均值 N——其余杯中溶液的光密度值 X——其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率 然后以酶液量为横坐标，以其余杯中溶液抑制NBT光还原的相对百分率（X）为纵坐标制作曲线，根据线性好的曲线所得出的函数关系计算抑制NBT光还原的相对百分率为50%时所加入的酶液量，以该酶液量作为1个酶活单位。 结果计算：SOD活力按下式计算： A=V*1000*60/（B*W*T）
抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定 过氧化氢酶（CAT）活性测定 过氧化物酶（POD）测定方法 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定 小组第一次讨论结果： 一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定 1.原理 APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关。 2.所用方法 （1）采用碘液滴定法: 称取新鲜材料1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20 ℃下浸提30 min，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液。反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL，20 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。每个处理设3 个重复。（2）紫外吸收法： 称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH 7.8）提取液（含1 mmol·L-1 AsA，3 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5 mmol·L-1PMSF，
2% PVP，1 mM EDTA）。用液氮研磨，提取液于4℃，12000×g离心20 min，上清液用于酶活性的测定。取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na
碱性蛋白酶及各种蛋白酶活力测定方法及测定有感 因长期测定碱性蛋白酶酶活力与角蛋白酶活力与胶原酶活力和弹性蛋白酶活力，碱性蛋白酶活力测定还好，因有国家标准，测定按照国标来便可大大减少误差。其余酶活力测定过程中因无统一标准且底物差异大，导致长期酶活力测定的混乱，各种酶活力测定方法与各种试剂添加，最后实际测定的酶活力只能仅作参考。 以下是各种蛋白酶活力测定方法及标曲绘制： 碱性蛋白酶测定方法 根据国标GB/T 23527-2009 附录B 蛋白酶活力测定福林法 以下是方法
碱性蛋白酶的测定方法参考 GB/T 23527-2009 附录 B 中福林酚法进行，即 1 个酶活力单位（U/mL）定义为 1 mL 酶液在 40℃、pH= 10.5 条件下反应 1 min 水解酪蛋白产生 1 μg 酪氨酸所需要的酶量，主要步骤如下。 2.2.6.1 标准曲线的绘制 （1）L-酪氨酸标准溶液：按表 2-6 配制。 表 2-6 L-酪氨酸标准溶液配置表 Table 2-6 L-Tyrosine standard solution form 管号酪氨酸标准溶液的浓度/ （μg/mL） 取 100 μg/mL 酪氨酸标准 溶液的体积/（mL） 取水的体积/ （mL）
0 0 0 10 1 10 1 9 2 20 2 8 3 30 3 7 4 40 4 6 5 50 5 5 （2）分别取上述溶液各 1.00 mL，各加 0.4 mol/L 碳酸钠溶液 5.0 mL，福林试剂使用 液 1.00 mL，置于 40 ℃±0.2 ℃水浴锅中显色 20 min，用分光光度计于波长 680 nm，10 mm 比色皿，以不含酪氨酸的反应管作为空白，分别测定其吸光度值，以吸光度值 A 为纵坐标，酪氨酸浓度 C 为横坐标，绘制 L-酪氨酸标准曲线。 图 2-1 L-酪氨酸标准曲线 Fig. 2-1 L-tyrosine standard curve 根据作图或用回归方程计算出当吸光度为 1 时的酪氨酸的量（μg），既为吸光度常数 K 值。其 K 值应在 95-100 范围内。上图所示标准曲线符合要求，可用于下一步实验。 2.2.6.2 测定方法 （1）计算方法 X = A × K × 4 / 10 × n = 2 / 5 × A × K × n 式（2-1） 式中，X —样品的酶活力，μ/g； A —样品平行实验的平均吸光度； K —吸光常数； 4 —反应试剂的总体积，mL； 10—反应时间 10 min，以 1 min 计； n —稀释倍数。 （2）测定方法 ①先将干酪素溶液放入 40 ℃±0.2 ℃恒温水浴中，预热 5 min。 ②按下列程序操作，进行测定。 于 680 nm 波长，用 10 mm 比色皿测其吸光度。
测试与标准 纤维素酶活力测定方法 张瑞萍 南通工学院(226007) 摘 要 用DN S 为显色剂,分别以滤纸和CM C 为底物,以滤纸糖酶活性(FP A )和羧甲基纤维素酶活性(CM C a se )表征纤维素酶活力。确定酶活测定用波长为530nm,参比溶液应为失活酶、底物和DN S 等共热的反应物;比较了两种底物的酶活力测定方法。结果表明,CM C a se 比FP A 高,说明酶对水溶性底物有较高的活力,也表明吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响;对于不同牌号的纤维素酶,织物的酶减量率与CM C 酶活力关系密切。 叙 词: 测试 纤维素酶 活度中图分类号: TS197 纤维素酶是多组分复合物,各组分的底物专一性不同。纤维素酶作用的底物比较复杂,反应产物不同,致使纤维素酶活力测定方法很多,各国的方法亦不统一。我们选择滤纸、CM C 为底物,原理系利用纤维素酶催化水解纤维素,产生纤维多糖、二糖及葡萄糖等还原糖,与显色剂反应,求出还原糖的浓度,间接求出酶的活力。由不同底物测得的酶活力分别称作FPA (滤纸糖酶活力)和CM C ase (羧甲基纤维素酶酶活力)。本文分析确定酶活力测定的主要条件,比较两种底物的酶活力测定方法的结果,探讨纤维素酶活力与织物减量率的关系,为酶在生产中的利用提供依据。 1 实验方法 1.1 化学药品、材料 纤维素酶(工业品),DNS 试剂(自配),冰醋酸,醋酸钠,葡萄糖(均为分析纯),滤纸(定性),羧甲基纤维素酶CM C (试剂级),纯棉针织物半制品(南通针织厂)。 1.2 FPA 滤纸酶活力和CMC 酶活力的测定 取适当稀释的酶液,分别以滤纸或1%的CM C 溶液为底物,于50℃恒温水解反应1h ;然后加入显色剂DNS,沸水浴中煮沸5min;再加入蒸馏水,于530nm 测定吸光度OD 值。 酶活可定义为:每毫升酶液1min 产生1mg 葡萄糖为一个单位( )。 1.3 针织物酶减量率的测定 将酶处理前后的试样在烘箱中105℃烘至恒重。减量率= 处理前织物干重-处理后织物干重 处理前织物干重 ×100% 2 结果与讨论 2.1 显色剂的选择 选用DNS ,在碱性条件下与还原糖反应,生成有色化合物,用分光光度计比色,确定低分子糖含量。 碱性条件下DNS 与还原糖共热反应如下: O 2N OH O 2N CO OH +还原糖 H 2N OH CO OH O 2N DN S(黄色) 3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色) 生成的棕红色氨基化合物系比色法测定基础。2.2 最大吸收波长的确定 选取490～580nm 波长对显色液进行比色。由图1可知,不同浓度的葡萄糖溶液在490～500nm 处有最大吸收,DNS 在此波长下也有较明显的吸收。为了排除DNS 的干扰,选择在波长 530nm 处进行测定,此波长下的葡萄糖吸收虽有所降低,然而符合“吸收最大、干扰最小”的原则。 图1 D NS 与葡萄糖的吸收曲线 2.3 底物及酶本身含糖量的影响 在实验过程中发现,底物特别是滤纸,也含有一定的还原糖,在碱性的DNS 试剂中也会发色。而且,试验所用的纤维素酶是一种工业级的复合酶,品种不同,其本身含糖量也不同。为了排除这类还原糖的干扰,参比溶液取失活后的酶、底物、DNS 等共热的反应物。2.4 葡萄糖标准曲线 用不同浓度的葡萄糖溶液作为标准溶液,与DNS 共热反应显色后,测出其吸光度OD 值(见图2)。标准曲线的线性相关系数R 2为0.9991(见图2),线性相当好,可以用于酶活力的测定。 38 印 染(2002No .8) www .cdfn .com .cn
一、过氧化物酶（POD）活性的测定 POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。 测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。 △470 ×V T POD活性= 0.01×t×Vs×W 式中：△470----反应时间内吸光度值的变化； V T ----提取酶液的总体积（ml） t----反应的时间（min） Vs ----测定时取用酶液体积（ml） W----样品鲜重（g） 二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定 多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。 酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成浆，4℃条件下12000r/min离心15min后上清液即为粗酶液。 PPO活性测定：反应试管中分别加入0.1 mL酶液+3.9 mL磷酸缓冲液+ 1 mL 1m mol／L的邻苯二酚。混匀后于30℃保温10 min，迅速加入2 mL质量分数为20％的三氯乙酸终止反应，立即于525nm下测定其吸光度值，计算酶活。 PPO活性= O D×V T 0.01×t×0.5g×V s = O D×V T 0.005 OD——反应时间内吸光值的变化； V T ----提取酶液的总体积（ml） Vs ----测定时取用酶液体积（ml） T———反应时间(min)；
土壤纤维素酶活性测定（3,5- 二硝基水杨酸比色法）一、原理 纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一。在纤维素酶作用下，它的最初水解产物是纤维二糖，在纤二糖酶作用下，纤维二糖分解成葡萄糖。所以，纤维素酶是碳素循环中的一个重要的酶。纤维素酶解所生成的还原糖与 3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。 二、试剂 1）甲苯 2）1%羧甲基纤维素溶液：1g 羧甲基纤维素钠，用50%的乙醇溶至100ml。 3）pH5.5醋酸盐缓冲液： 0.2mol/L 醋酸溶液 11.55ml 95% 冰醋酸溶至1L. 0.2mol/L 醋酸钠溶液 16.4g C2H3O2Na或27.22g C2H3O2Na.3H2O溶至1L. 取11ml 0.2mol/L 醋酸溶液和88ml 0.2mol/L 醋酸钠溶液混匀即成PH 5.5醋酸盐缓冲液. 4）3,5-二硝基水杨酸溶液：称1.25g二硝基水杨酸，溶于50ml 2mol/LNaOH和125ml水中，再加75g酒石酸钾钠，用水稀释至250ml（保存期不过7天）， 5）葡萄糖标准液（1mg/mL） 预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。 三、操作步骤 葡萄糖标准曲线：分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL 于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS溶液3ml混匀，于沸腾水浴中加热5min，取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。 称10g土壤置于50ml三角瓶中，加入1.5ml甲苯，摇匀后放置15min，再加5ml 1%羧甲基纤维素溶液和5ml pH5.5醋酸盐缓冲液，将三角瓶放在37℃恒温箱中培养72h。培养结束后，过滤并取1ml滤液，然后按绘制标准曲线显色法比色测定。（为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照；如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。） 四、结果计算 纤维素酶活性以72h，1g干土生成葡萄糖毫克数表示。 纤维素酶活性=（a样品－a无土－a无基质）×n／m a样品、a无土、a无机质分别表示其由标准曲线求的葡萄糖毫克数；n为分取倍数；m 表示烘干土重
前处理： 称取叶片0.5克，加5ml（1+4）提取液PH7.8 Pbs，冰浴研磨，12000g，4℃，20min，上清液即为粗酶提取液。 注：粗酶提取液要全部转移；加入石英砂后离心需配平 1.SOD测量 取透明度好的指形管，按下表加入各溶液： 试剂（酶）用量（ml） 0.05M磷酸缓冲液 1.5 65mM Met溶液0.3 500uM NBT溶液0.3 100uM EDTA-Na 2 0.3 200uM核黄素0.3 酶液0.1（对照管加缓冲液） 蒸馏水0.5 总体积 3.3 混匀后将一支对照管置暗处作空白对照，其余各管于4000lx光下反应20-30min，反应结束后，以不照光的对照管为空白，560nm测定OD值。按下式计算SOD活性。 SOD总活性=[(A CK —A E )×V]/[ A CK ×1/2×W×a] SOD比活力=SOD总活性/蛋白质浓度 SOD总活性以每克鲜重每单位表示：比活力单位以酶单位/mg蛋白表示A CK —照光对照管的消光度值 A E —样品管的消光度值 V—样液总体积（ml） a—测定时样品用量（ml） W—样重（g） 蛋白质浓度单位为：mg蛋白/g样重。 【试剂配制】 磷酸缓冲液配制： 母液：A：Na 2HPO 4 ?12H 2 O 36g，稀释至500ml B：NaH 2PO 4 ?2H 2 O 15.92g，稀释至500ml 提取液配制：取0.0186gEDTA（0.1mM），5g PVP （1%（g/ml））,用磷酸缓冲液（PH7.8）稀释至500ml。 PH7.8 Pbs配制：A 114.35ml + B 10.625ml，定容至500ml。 PH7.0 Pbs配制：A 152.5ml（76.25ml）+ B 97.5ml（48.75ml）稀释至1000ml （500ml）。 65 mmol/L Met: 取0.97g Met 用磷酸缓冲液（PH 7.8）定容至100ml； 500 umol/L NBT:取0.0409g NBT用磷酸缓冲液（PH 7.8）定容至100ml（避光保存）； 100 umol/L EDTA-Na 2: 0.03721g（0.0186g）EDTA-Na 2 磷酸缓冲液（PH 7.8）定 容至1000ml（500ml）； 200 umol/L 核黄素：0.0753（0.03765）g核黄素磷酸缓冲液（PH 7.8）定容至1000ml（500ml）；（现用现配）
1淀粉酶活性测定 原理 淀粉酶从淀粉中分解出还原物质，可以从他们与3，5—二硝基水杨酸的还原反应能力来测定这些还原物质，以一水麦芽糖计算。一个淀粉酶单位相当于在规定条件下释放lmg还原碳水化合物(以一水麦芽糖计算)时所需的酶量。 主要试剂 (1)磷酸盐缓冲液(PH 6.9)；取0.067M的磷酸二氢钾溶液(9.12gKH2PO4溶于蒸馏水中，并定容至1000m1)与0.067M的二水磷酸氢二钠溶液 (11.93gNa2HPO4·2H20溶于蒸馏水中，并定容至1000m1)混合，直至用测得其PH值达到6.9为止。取39mg氯化钠溶于35ml上述溶液内，并用蒸馏水定容至lOOml。 (2)底物溶液：取1.Og可溶性淀粉溶于lOOml上述磷酸盐缓冲液。 (3)指示剂溶液：取1.Og 3,5-二硝基水杨酸(C7H4N207)与少许蒸馏水拌和。添加20ml2N氢氧化钠溶液后此酸便溶解。取30.0g四水酒石酸钾钠(C4H4KNaO6·4H2O)溶于此溶液，并用蒸馏水将此指示剂定容至100ml。 (4)麦芽糖溶液；称取lOOmg一水麦芽糖(C12H22O11·H20)用蒸馏水定容至lOOml。 测定方法 用移液管将1.Oml底物溶液移入一试管，并加热至25℃。加1.Oml酶溶液(同样也已预热至25℃)，摇匀，保温3min后加2ml指示剂溶液，终止反应。将此溶液置于沸水浴中5min后，取出来置于冰水中或进行流水冷却。随后用蒸馏水定容至20ml。用分光光度计于490nm处，以空白值为参比测定其颜色深度。以1ml灭活的酶液作为空白对照。 2脂肪酶活性测定 原理 脂肪酶为一种水解酶，在一定条件下，可以把甘油三酯脂肪逐步水解，最后生成甘油及对应的脂肪酸。用己知浓度的标准溶液对水解液进行滴定，即可定量求出脂肪酸的量，从而求出脂肪酶活性。 1个脂肪酶单位相当于在试验条件下释放出1μmol醋酸所需的量。 主要试剂 (1)0.025 mol·L-1磷酸缓冲液(PH 7.5)：
植物五种酶活性检测方 法 The document was finally revised on 2021
选择茶树不同品种，每个茶枝接种5头叶蝉，按不同的时间点 (0h/6h/12h/18h/24h/36h/48h/72h/96h)取样，每个样品重复三次，测定 PPO/POD/PAL/CAT/LOX 五种酶活。 1、多酚化酶（Polyphenoloxidase，PPO）活性的测定 适量茶鲜叶（3g）,料液比1:2，加入内含5%PVP（w/v）经遇冷的pH为的柠檬酸-磷酸盐缓冲液（L）,冰浴研磨，隔夜浸提12h，于4℃、9000r/min离心35min，取上清液，过滤得到初酶液。 取200ml初酶液，加入L柠檬酸-磷酸盐缓冲液200uL,混合反应液（L柠檬酸-磷酸盐缓冲液：脯氨酸：1%邻苯二酚=10:2:3），反应30min（37℃恒温水浴锅），6mol尿素终止反应，460nm波长测吸光度。对照为不加邻苯二酚的反应混合液。 酶活性单位：本实验条件下，以邻苯二酚反应液在460nm处吸光度值每分钟增加为一个活性单位。 2、苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonialyase，PAL）活性的测定 称取新鲜样品于预冷研钵中，加入6ml L（）硼酸钠-硼酸缓冲液，加入适量的石英砂，冰浴研磨后转入离心管中。混匀后在4℃冰箱中浸提4h。4℃10000r/min离心 20min，取上清液即为酶提取液。 取酶提取液，加入由硼酸钠缓冲液配制的L L-苯丙氨酸，蒸馏水，摇匀，在40℃水浴上反应30min，冰浴中终止反应，测定OD290值，以相同体积缓冲液代替酶液进行同样的反应为对照。PAL的酶活性以每小时在290nm处吸光度变化为一个活力单位。 3、脂氧合酶(linoleate:oxygen oxidoreductase，LOX)活性的测定 取新鲜样品，加7ml经4℃预冷的1mol/L（）的tris-HCL缓冲液冰浴上研磨。4℃、12000r/min离心25min,上层清液即为LOX酶提取液。
酸性蛋白酶产品概述: 蛋白质由氨基酸组成，是自然界中发现的最复杂的有机化合物之一。由盐酸和蛋白酶分解成易被高等动物的肠道和微生物有机体的细胞膜吸收的氨基酸。包括人类在内的每种动物，必须要有足够的蛋白质来维持自身生长，来生成每个细胞所必需的氨基酸，一些特种蛋白质还是某些特殊细胞、腺体分泌物、酶和激素的功能性组成元素。 蛋白酶是指一些有催化功能的酶，能够水解（断裂）蛋白质，因此也被称为蛋白水解酶。蛋白水解酶在许多的生理和病理过程中发挥着重要作用，在食品和乳品加工业也有着广泛应用。工作机理 蛋白水解酶制剂本产品能在酸性条件下水解蛋白质食品中的缩氨酸键，释放氨基酸或者多肽。在酒精、葡萄酒、果汁、啤酒、黄油和酱油生产中，添加酸性蛋白酶可澄清发酵液中的雾气。酵母在发酵阶段的生长可以通过悬浮蛋白质转化的氨基酸来加以促进，从而加速发酵并提高产量。本产品是一种酸性蛋白酶制剂，在酸性条件下具有较高活性，由酸性蛋白酶高产菌株——曲霉菌深层发酵而成。它广泛应用于饲料、纺织、废水处理和果汁提纯方面。 酸性蛋白酶（Acid protease ）是指蛋白酶具有较低的最适pH，而不是指酸性基团存在于酶的活性部位，酸性蛋白酶的最适PH从2左右（胃蛋白酶）到4左右。从酶的活力-PH曲线分析，在酶的活性部位中含有一个或更多的羟基。这一类蛋白酶中研究最彻底的是胃蛋白酶。（酸性蛋白酶537容易失活） 简介：酸性蛋白酶是由隆科特黑曲霉优良菌种经发酵精制提炼而成，
它能在低PH条件下，有效水解蛋白质，广泛应用于酒精、白酒、啤酒、酿造、食品加工、饲料添加、皮革加工等行业。 1、产品规格：，规格有5万u/g～10万u/g 液体型为黑褐色液体，规格有50000u/ml～10000u/ml. 2、酶活力定义：一个酶活力单位是1g酶粉或1ml酶液在40℃，PH3.0条件下，1分钟水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位（u/g或u/ml） 特性1、温度范围为：最适温度范围为40℃-50℃2、PH为：最适PH范围为2.5～3.5 使用方法 1、白酒工业： 本品用以淀粉为原料的生产酒精及白酒行业，提高出酒率0.25%个酒分，提高发酵速度。 2、食品工业： 食品上用以淀粉改良，提高食品风味、改良品质，因能提高氨基酸含量 3、啤酒生产： 能有效阻断双乙酰生成，缩短啤酒成熟期。 4 饲料添加剂：提高饲料利用率。 5、毛皮软化： 提高上色率，手感丰满，增加毛皮光泽。 推荐实验的初始添加量从醪液的百万分之一开始。推荐使用：先
淀粉酶活力的测定方法 淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶，它们广泛存在于动物、植物和微生物界。不同来源的淀粉酶，性质有所不同。植物中最重要的淀粉酶是α -淀粉酶和β-淀粉酶。 α -淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分α -1,4糖苷键，单独使用时最终生成寡聚葡萄糖、α-极限糊精和少量葡萄糖。Ca 2+能使α-淀粉酶活化和稳定，它比较耐热但不耐酸，pH 3.6 以下可使其钝化。 β-淀粉酶从非还原端作用于α-1,4糖苷键，遇到支链淀粉的α -1,6键时停止。单独作用时产物为麦芽糖和β-极限糊精。β-淀粉酶是一种巯基酶，不需要 Ca 2+ 及 Cl —等辅助因子，最适pH偏酸，与α -淀粉酶相反，它不耐热但觉耐酸，60 ℃保温15min可使其钝化。 通常提取液中α -淀粉酶和β-淀粉酶同时存在。可以先测定（α + β）淀粉酶总活力，然后在60 ℃加热 15 min ，钝化β-淀粉酶，测出α -淀粉酶活力，用总活力减去α - 淀粉酶活力，就可求出β- 淀粉酶活力。 淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与 3,5- 二硝基水杨酸的显色反应来测定。还原糖作用于黄色的 3,5- 二硝基水杨酸生成棕红色的 3- 氨基 -5- 硝基水杨酸，生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比。以每克样品在一定时间内生成的还原糖（麦芽糖）量表示酶活大小。 1 酶活测定方法 （1）标准曲线的制作(见下表) ①取7支20 ml具塞刻度试管,预先洁净灭菌干燥,编号,按表加入试剂。②摇匀,至沸水浴中煮沸5 min。取出后流水冷却,加蒸馏水定容至20 ml,以1号管作为空白调零点,在520 nm的波长下比色测定吸光度值。并建立通过吸光度值求麦芽糖含量的回归方程。 表1 标准麦芽糖溶液成分表及OD测定值 试剂 麦芽糖标准液（mL） H2O（mL） 3,5-二硝基水杨酸（mL）麦芽糖含量（mg） OD520 1 0 2.0 2.0 0 2 0.2 1.8 2.0 0.2 3 0.6 1. 4 2.0 0.6 4 1.0 1.0 2.0 1.0 5 1.4 0. 6 2.0 1.4 6 1.8 0.2 2.0 1.8
二十、果蔬中多酚氧化酶活性的测定 一、目的要求 了解多酚氧化酶的作用，掌握果蔬组织中多酚氧化酶活性的测定方法。 二、基本原理 多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）是一种以铜为辅基的酶，能催化多种简单酚类物质氧化形成醌类化合物，醌类化合物进一步聚合形成呈现褐色、棕色或黑色的聚合物。在后熟衰老过程或在采后的贮藏加工过程中，果蔬出现的组织褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。 多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化形成的产物在420 nm处有最大光吸收峰。因此，可利用比色法测定多酚氧化酶的活性。 三、材料、仪器及试剂 （一）材料 梨、苹果、马铃薯等。 （二）仪器及用具 研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、计时器、移液器、离心管、试管、容量瓶（100mL、1000 mL）。 （三）试剂 1．100 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液 母液A（200 mmol/L醋酸溶液）：量取11.55 mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1 000 mL。 母液B（200 mmol/L醋酸钠溶液）：称取16.4 g无水醋酸钠（或称取27.2 g 三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、定容至1 000 mL。 取68 mL母液A和432 mL母液B混合后，调节pH至5.5，加蒸馏水稀释至1 000 mL。 2．提取缓冲液（含1 mM PEG、4% PVPP和1% Triton X-100） 称取340 mg PEG 6000（聚乙二醇6000）、4 g PVPP（聚乙烯吡咯烷酮，Polyvinyl–polypyrrolidone），取1 mL Triton X-100，用100 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液溶解、稀释至100 mL。 3．50 mmol/L邻苯二酚 称取275 mg邻苯二酚，用50 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液溶解、稀释至50 mL。 四、实验步骤 （一）酶液制备 称取5.0 g果蔬组织样品，置于研钵中，加入5.0 mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃、12 000×g离心30 min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。 （二）活性测定 取一支试管，加入4.0 mL 50 mmol/L、pH 5.5的醋酸缓冲液和1.0 mL 50 mmol/L邻苯二酚溶液，最后加入100 μL酶提取液，同时立即开始计时。将反应混合液倒入比色杯中，置于分光光度计样品室中。以蒸馏水为参比，在反应15 s 时开始记录反应体系在波长420 nm处吸光度值作为初始值，然后每隔1 min 记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据。重复三次。 五、实验结果与计算 1．将测定的数据填入下表
土壤酶活测定 取根际土壤为土壤样品，同时挖取根系周围0-20cm和20-40cm土样，分层充分混合后作为非根际土壤样品。充分混匀后取样，用于土壤酶活性测定的土壤经风干后，过1mm筛，测定多酚氧化酶活性土样过0.25mm筛。供微生物分析的鲜土样装入已消毒过的密封塑料袋，带回实验室，磨细过2mm筛后，置于4℃冰箱内保存备测土壤微生物种群、数量等。 蔗糖酶测定（比色法） 1. 方法选择及原理 蔗糖酶能酶促蔗糖水解生成葡萄糖和果糖。蔗糖酶活性的测定方法有用酶学的方法测量所产生的葡萄糖（滴定法或重量法）或是根据蔗糖的非还原性，用生成物（葡萄糖和果糖）能够还原菲林溶液中的铜，再根据生成的氧化亚铜的量求出糖的含量。也可根据蔗糖水解的生成物与某种物质（3，5-二硝基水杨酸或磷酸铜）生成有色化合物进行比色测定。还有一种方法，根据蔗糖液酶促反应前后光偏振面的变化（旋光法）进行测定。 目前，我国常用的主要是硫代硫酸钠滴定法，它是测定土壤蔗糖酶活性的经典方法。3，5-二硝基水杨酸比色法重现性较好，且手续较简便，适于成批样品测定。 测定土壤蔗糖酶活性时，均以蔗糖为基质，蔗糖液浓度范围为5-20％。在酸性介质中，蔗糖酶活性最大。为保持该酶最适pH，多使用下列缓冲液：醋酸盐缓冲液（pH4.5-5.5），磷酸盐缓冲液（pH4.9-5.5），醋酸盐-磷酸盐缓冲液（pH5.5）。 2. 试剂配制 （1）3，5-二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml 2N氢氧化钠和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释至100ml（不超过7天）。（2）pH5.5磷酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠（11.867g Na2PO4?2H2O溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M 磷酸二氢钾（9.078gKH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml 即成。
各种酶活性测定方法 第一超氧化物歧化酶SOD测定 一、原理 超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD 可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料；水稻或小麦叶片 （二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支。 （三）试剂 1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；3.750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；4. 100μmo l/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA －Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。 三、实验步骤 1. 酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取1.5～2ml于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。 2. 显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L 磷酸缓冲液1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol/L 750μmol/L NBT溶液0.375μmol/L 100μmol/L EDTA－Na2液0.310μmol/L 20μmol/L 核黄素0.320μmol/L 酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积 3.0混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。 3. SOD活性测定与计算至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的吸光度。 四、结果计算 已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD 活性。SOD总活性＝(A ck－A E)×V/(A ck×0.5×W×V t) 上式中，SOD比活力＝SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位／mg蛋白表示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积（ml）Vt测定时样品用量（ml）W样鲜重（g）蛋白质含量单位为：mg蛋白／g鲜重。
各种酶活性测定方法
各种酶活性测定方法 第一超氧化物歧化酶SOD测定 一、原理 超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料；水稻或小麦叶片 （二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支。 （三）试剂 1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）； 2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称
1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml； 3.750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT 用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存； 4. 100μmol/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA－Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml； 5. 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g 核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。 三、实验步骤 1. 酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取1.5～2ml于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。 2. 显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L 磷酸缓冲液 1.5130mmol/L Met 溶液0.313mmol/L 750μmol/L NBT溶液0.375μmol/L 100μmol/L EDTA－Na2液0.310μmol/L 20μmol/L 核黄素0.320μmol/L 酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25
实验二酶活力测定方法的研究（1） ——淀粉酶活性的测定 一、研究背景 酶Enzyme，指具有生物催化功能的高分子物质。酶通过降低化学反应的活化能来加快反应速率，因而具有高效性，同时酶具有高度的专一性。酶的催化活性可以受其他分子影响：抑制剂是可以降低酶活性的分子；激活剂则是可以增加酶活性的分子。酶的活性还可以被温度、化学环境（如pH值）、底物浓度以及电磁波（如微波）等许多因素所影响。酶在工业和人们的日常生活中的应用也非常广泛。例如，药厂用特定的合成酶来合成抗生素；加酶洗衣粉通过分解蛋白质和脂肪来帮助除去衣物上的污渍和油渍。 淀粉酶是一类水解淀粉的糖苷键的总称，按照其水解淀粉的方式，可以分为α-淀粉酶和β-淀粉酶等。α-淀粉酶是一种内切葡萄糖苷酶，催化水解α-1,4-糖苷键，生成α-麦芽糖和少量葡萄糖。β-淀粉酶从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1,4-葡聚糖链。对于象直链淀粉能完全分解得到麦芽糖和少量的葡萄糖。作用于支链淀粉或葡聚糖的时候，切断至α-1,6-键的前面反应就停止了，因此生成分子量比较大的极限糊精。 二、研究目标 1.掌握酶活力的测定方法 2.进一步学会设计实验方案 3.测定α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性 三、研究策略 酶的活力单位为：每分钟每克鲜重麦种所催化生成的麦芽糖毫克数。 实验的总体思路是测定每分钟内催化生成的麦芽糖的量。 1.酶的获取 淀粉酶广泛存在于禾谷物类的种子中α-淀粉酶是在萌发的过程中产生的。所以取萌发的种子浸提获取酶溶液。 2.反应过程 β-淀粉酶不耐热，在高温下容易钝化，而α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下发生钝化。尽管在种子的萌发过程中，提取液中同时含有两种淀粉酶，可利用这两种淀粉酶的不同特性加以处理，钝化其一，即可测定另外一种酶的活力。 3.产物的检测 淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用还原糖的3,5-二硝基水杨酸法测定。 四、研究方案及可行性分析 研究方案： α-淀粉酶耐高温，而β-淀粉酶在高温下易失活。可以在适当的高温下水浴，使β-淀粉酶失去活性，而α-淀粉酶的活性不受很大的影响，这样分解的淀粉可以认为是α-淀粉酶催化的产物。同时可以测量α-淀粉酶和β-淀粉酶的总活力，从而推出β-淀粉酶的活力。 可行性分析： 温度可以通过恒温水浴来实现。试剂等都是实验室常见的，仪器实验室也有。
中华人民共和国专业标准 蛋白酶活力测定法 SB/T 10317-1999 Measurement of proteinase activity ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。 1 福林法 1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯 1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O) 100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。 取去冷凝器,加入硫酸锂(Li2SO4)50g,蒸馏水50mL,混匀,加入几滴液体溴,再煮沸15min, 以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色,需要再加几滴溴液,再 煮沸除去之。冷却后,定容至1000mL,用细菌漏斗(No4～5)过滤,置于棕色瓶中保存。此溶 液使用时加2倍蒸馏水稀释。即成已稀释的福林试剂。 1.1.2 0.4mol碳酸钠溶液: 称取无水碳酸钠(Na2CO3)4 2.4g,定容至1000mL。 1.1.3 0.4mol三氯乙酸(T C A)溶液: 称取三氯乙酸(CCL3COOH)65.4g,定容至1000mL。 1.1.4 pH7.2磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.2g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液(A液)。称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)71.63g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液(B液)。 取A 液28mL 和B 液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成0.1mol pH7.2的磷酸盐缓冲液。 1.1.5 2%酪蛋白溶液:准确称取干酪素2g,称准至0.002g,加入0.1N氢氧化钠10mL,在 水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸),然后用pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存,否则极易繁殖细菌,引起变质。 1.1.6 100μg/mL酪氨酸溶液:精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g,逐 步加入6mL 1N盐酸使溶解,用0.2N盐酸定容至100mL,其浓度为1000μg/mL,再吸取此液10 mL,以0.2N盐酸定容至100mL,即配成100μg/mL的酪氨酸溶液。此溶液配成后也应及时使 用或放入冰箱内保存,以免繁殖细菌而变质。 1.2 仪器 a. 分析天平: 感量0.1mg; b. 581-G型光电比色计或72型分光光度计; c. 水浴锅; d. 1、2、5、10mL移液管等。 1.3 操作 1.3.1 标准曲线的绘制 1.3.1.1 按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液(表1)。 表 1 配制各种不同浓度的酪氨酸溶液 ━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ┃管号 试剂┣━━┳━━┳━━┳━━┳━━┳━━━