SECTION 5 转录和转录水平的调控 重点： 转录的反应体系，原核生物RNA聚合酶和真核生物中的RNA聚合酶的特点，RNA的转录过程大体可分为起始、延长、终止三个阶段。真核RNA的转录后加工，包括各种RNA前体的加工过程。基因表达调控的基本概念、特点、基本原理。乳糖操纵子的结构、负性调控、正性调控、协调调节、转录衰减、SOS 反应。 难点： 转录模板的不对称性极其命名，原核生物及真核生物的转录起始，真核生物的转录终止，mRNA前体的剪接机制（套索的形成及剪接），第Ⅰ、Ⅱ类和第Ⅳ类内含子的剪接过程，四膜虫rRNA前体的加工，核酶的作用机理。真核基因及基因表达调控的特点、顺式作用元件和反式作用因子的概念、种类和特点. 以及它们在转录激活中的作用。 一．模板和酶： 要点 1．模板 RNA的转录合成需要DNA做模板，DNA双链中只有一股链起模板作用，指导RNA合成的一股DNA链称为模板链（template strand），与之相对的另一股链为编码链（coding strand），不对称转录有两方面含义:一是DNA链上只有部分的区段作为转录模板(有意义链或模板链),二是模板链并非自始至终位于同一股DNA单链上。 2．RNA聚合酶 转录需要RNA聚合酶。原核生物的RNA聚合酶由多个亚基组成:α2ββ'称为核心酶,转录延长只需核心酶即可。α2ββ'σ称为全酶,转录起始前需要σ亚基辨认起始点,所以全酶是转录起始必需的。真核生物RNA聚合酶有RNA-polⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种,分别转录45s-rRNA; mRNA(其前体是hnRNA);以及5s-rRNA、snRNA和tRNA。 3.模板与酶的辨认结合 转录模板上有被RNA聚合酶辨认和结合的位点。在转录起始之前被RNA聚合酶结合的DNA部位称为启动子。典型的原核生物启动子序列是-35区的TTGACA序列和-10区的Pribnow盒即TATAAT序列。真核生物的转录上游调控序列统称为顺式作用元件,主要有TATA盒、、CG盒、上游活化序列(酵母细胞)、增强子等等。和顺式作用元件结合的蛋白质都有调控转录的作用,统称为反式作用因子。反式作用因子已发现数百种,能够归类的称为转录因子(TF),相应于RNA-polⅠ、Ⅱ、Ⅲ的是TFⅠ、TFⅡ、TFⅢ。TFⅡ又有A、B、C、D、E、F多种及其亚类。 基本概念： 1.不对称转录: 两重含义,一是指双链DNA只有一股单链用作转录模板(模板链);二是对不同基因同一单链上某些区段作为模板链而另一些区段作为编码链，即模板链并非永远在同一单链上。 2.编码链: DNA双链上不用作转录模板的那一段单链,因其碱基序列除由T代 替U而外,其他与转录产物mRNA序列相同而得名。
一、生物信息分析流程 获得原始测序序列(Sequenced Reads)后，在有相关物种参考序列或参考基因组的情况下，通过如下流程进行生物信息分析： 二、项目结果说明 1 原始序列数据 高通量测序(如illumina HiSeq TM2000/MiSeq等测序平台)测序得到的原始图像数据文件经碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列(Sequenced Reads)，我们称之为Raw Data或Raw Reads，结果以FASTQ(简称为fq)文件格式存储，其中包含测序序列(reads)的序列信息以及其对应的测序质量信息。 FASTQ格式文件中每个read由四行描述，如下： @EAS139:136:FC706VJ:2:2104:15343:197393 1:Y:18:ATCACG GCTCTTTGCCCTTCTCGTCGAAAATTGTCTCCTCATTCGAAACTTCTCTGT + @@CFFFDEHHHHFIJJJ@FHGIIIEHIIJBHHHIJJEGIIJJIGHIGHCCF 其中第一行以“@”开头，随后为illumina 测序标识符(Sequence Identifiers)和描述文字(选择性部分)；第二行是碱基序列；第三行以“+”开头，随后为illumina 测序标识符(选择性部分)；第四行是对应序列的测序质量(Cock et al.)。 illumina 测序标识符详细信息如下：
第四行中每个字符对应的ASCII值减去33，即为对应第二行碱基的测序质量值。如果测序错误率用e表示，illumina HiSeq TM2000/MiSeq的碱基质量值用Q phred 表示，则有下列关系： 公式一：Q phred = -10log 10 (e) illumina Casava 1.8版本测序错误率与测序质量值简明对应关系如下： 2 测序数据质量评估 2.1 测序错误率分布检查 每个碱基测序错误率是通过测序Phred数值(Phred score, Q phred )通过公式1转化得到，而Phred 数值是在碱基识别(Base Calling)过程中通过一种预测碱基判别发生错误概率模型计算得到的，对应关系如下表所显示： illumina Casava 1.8版本碱基识别与Phred分值之间的简明对应关系 测序错误率与碱基质量有关，受测序仪本身、测序试剂、样品等多个因素共同影响。对于RNA-seq技术，测序错误率分布具有两个特点： (1)测序错误率会随着测序序列(Sequenced Reads)的长度的增加而升高，这是由于测序过程中化学试剂的消耗而导致的，并且为illumina高通量测序平台都具有的特征(Erlich and Mitra, 2008; Jiang et al.)。 (2)前6个碱基的位置也会发生较高的测序错误率，而这个长度也正好等于在RNA-seq 建库过程中反转录所需要的随机引物的长度。所以推测前6个碱基测序错误率较高的原因为随机引物和RNA模版的不完全结合(Jiang et al.)。测序错误率分布检查用于检测在测序长度范围内，有无异常的碱基位置存在高错误率，比如中间位置的碱基测序错误率显着高于其他位置。一般情况下，每个碱基位置的测序错误率都应该低于0.5%。 图2.1 测序错误率分布图
RNA聚合酶I：大的核糖体RNA前体基因 i.RNA聚合酶II ii.RNA聚合酶III：tRNA基因，snRNA基因，5s rRNA基因 iii.真核细胞三种RNA聚合酶 a.细菌仅一种RNA聚合酶 b.基本概念 1.RNA聚合酶中的Segma因子负责模板链的选择和转录的起始。在此阶段，启动子活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确结合。启动子的结构决定于RNA聚合酶的 亲和力，从而影响基因表达的水平。除启动子外，增强子对基因的转录也有明显 的作用。 1)原核： i.不能直接识别启动子区，需要转录调控因子的结合 1)真核: ii.模板识别 a.RNA 链上的第一个核苷酸键生成，不需要引物 i.通过启动子：转录形成后，直到形成9个核苷酸短链的阶段，RNA聚合酶一直处于启动子区，新生的RNA链与模板DNA结合不够牢固，容易脱落；离开启动子后，转录进入正常的延申阶段 ii.转录起始 b.RNA 聚合酶释放segama 因子离开启动子后，核心酶沿着模板DNA 移动使新生的RNA 链不断延长 i.转录的延申： c.依赖于p 因子的终止，其为六聚体蛋白，水解各种核苷三磷酸，使得新生RNA 链从三元复合物中解离出来，从而终止转录 i.不依赖于p 因子的终止：模板上存在终止转录信号-终止子，每个基因或操纵子都要一个启动子和一个终止子，终止位点上游一般存在富含GC的二重对称区，该段DNA转录产生的RNA容易形成发卡式结构，使得RNA聚合酶暂停破坏RNA-DNA 杂合双链5'端正常结构，从而使得RNA从三元复合物中解离出来。 ii.转录的终止 d.在-25~-35区含有TATA序列，在-70~-80区含有CCAAT序列，在-80~-110含有GCCACACCC序列。 i.TATA 盒使转录精确起始；CAAT 和GC 区主要控制转录起始频率 ii.真核启动子： e.转录的基本过程 2.DNA 转录 2019年6月18日21:17
（2018海南卷. 13题，2分）关于复制、转录和逆转录的叙述，下列说法错误的是A．逆转录和DNA复制的产物都是DNA B．转录需要RNA聚合酶，逆转录需要逆转录酶 C．转录和逆转录所需要的反应物都是核糖核苷酸 D．细胞核中的DNA复制和转录都以DNA为模板 【答案】C （2018海南卷. 15题，2分）现有DNA分子的两条单链均只含有14N（表示为14N14N）的大肠杆菌，若将该大肠杆菌在含有15N的培养基中繁殖两代，再转到含有14N的培养基中繁殖一代，则理论上DNA分子的组成类型和比例分别是 A．有15N14N和14N14N两种，其比例为1:3 B．有.15N15N和14N14N两种，其比例为1:1 C．有15N15N和14N14N两种，其比例为3:1 D．有15N14N和14N14N两种，其比例为3:1 【答案】D （2018天津卷6，6分）某生物基因型为A1A2，A1和A2的表达产物N1和N2可随机组合形成二聚体蛋白，即N1N1、N1N2、N2N2三种蛋白。若该生物体内A2基因表达产物的数量是A1的2倍，则由A1和A2表达产物形成的二聚体蛋白中，N1N1型蛋白占的比例为A．1/3 B．1/4 C．1/8 D．1/9 【答案】D （2018年江苏卷3，2分)）下列关于DNA和RNA的叙述，正确的是 A．原核细胞内DNA的合成都需要DNA片段作为引物 B．真核细胞内DNA和RNA的合成都在细胞核内完成 C．肺炎双球菌转化实验证实了细胞内的DNA和RNA都是遗传物质 D．原核细胞和真核细胞中基因表达出蛋白质都需要DNA和RNA的参与 【答案】D （浙江2018年11月选考18，2分）下列关于遗传物质的叙述，正确的是 A. 烟草的遗传物质可被RNA酶水解 B. 肺炎双球菌的遗传物质主要是DNA C. 劳氏肉瘤病毒的遗传物质可逆转录出单链DNA D. T2噬菌体的遗传物质可被水解成4种脱氧核糖核酸 【答案】C （浙江2018年11月选考23，2分）下列关于洋葱根尖细胞遗传信息转录过程的叙述，正
植物转录因子及转录调控数据与分析平台 PlantTFDB：植物转录因子数据库 URL: https://www.doczj.com/doc/fa10953507.html, 包含资源：植物转录因子的家族分类规则、基因组转录因子全谱、丰富的注释、转录因子结合图谱(binding motifs)、转录因子预测、系统发生树等 涉及物种：包含拟南芥、水稻、杨树、大豆、玉米、小麦等165个物种。 PlantRegMap：植物转录调控数据与分析平台 URL: https://www.doczj.com/doc/fa10953507.html, 包含资源：植物转录调控元件、植物转录调控网络、转录因子结合位点预测、转录调控预测与富集分析、GO富集分析、上游调控因子富集分析等。 涉及物种：包含拟南芥、水稻、杨树、大豆、玉米、小麦等156个物种。 ATRM: 拟南芥转录调控网络及其结构和演化分析 URL: https://www.doczj.com/doc/fa10953507.html, 包含资源：基于文本挖掘和人工校验的拟南芥转录调控网络、植物转录调控网络的结构和演化特征 涉及物种：拟南芥 植物转录因子及转录调控数据与分析平台(导航页) 我们致力于为广大科研人员提供一个关于植物转录因子和转录调控、集数据和分析于一体的高质量平台，为研究和理解植物转录调控系统保驾护航。 植物转录因子数据库(PlantTFDB) 一套完整的植物转录因子分类规则 覆盖绿色植物各大分支的转录因子全谱 丰富的功能和演化注释 基因组范围的高质量转录因子结合矩阵（156个物种） 在线转录因子预测平台 植物转录调控数据与分析平台(PlantRegMap) 基于高通量实验(ChIP-seq和DNase-seq)和比较基因组方法鉴定的多种转录调控元件 基于转录因子结合矩阵和转录调控元件推测的转录调控网络 涉及165物种的GO注释 一套植物转录调控预测与分析工具，包括转录因子结合位点预测、转录调控预测与富集分析、GO富集分析及上游调控因子富集分析等 拟南芥转录调控网络及其结构和演化特征(ATRM) 基于文本挖掘和人工校验的拟南芥转录调控网络 植物转录调控网络的结构和演化特征
转录的多种终止机制 展开全文 转录进行到一定程度，会停止下来，复合物解体，新生RNA释放出来，称为转录的终止（termination）。终止通常需要一个标志，即终止子（terminator），DNA模板上作为转录终止信号的顺式作用元件（cis-acting element）。 元件（element）指DNA上有特定功能的一段序列。相对来说，与之作用的蛋白质被称为“因子”（factor）。顺式（cis）与反式（trans）来自拉丁文前缀，是“在同一侧”和“在另一侧”的意思。这两个词在顺反异构中比较好理解，在分子生物中的用法与早期研究有关。
在早期的分子遗传学研究中，经常要判断对某基因的调控作用是来自DNA分子本身，还是来自另一个分子。前者称为顺式作用，比如增强子对启动子的作用；后者称为反式作用，比如某个蛋白因子对启动子的作用。在顺反子的定义中也是同样的含义。 原核生物有两类终止子：依赖ρ因子的终止子和不依赖ρ因子的终止子。ρ因子（Rho）是一种高度保守的终止因子，存在于几乎所有的原核生物。除了终止转录以外，Rho还有抑制反义转录，影响tRNA和小调节RNA的合成，沉默外源DNA等多种功能。 两类终止子都有一段回文结构。简单终止子有两个对称的富含GC的片段，下游还有一段富含A的序列。而依赖ρ因子的终止子不需要GC序列和寡聚A序列。 简单终止子转录出RNA后，两段富含GC的片段会形成茎环结构，破坏了RNA和模板DNA的杂合双链结构。此时下游恰好是结合力较弱的AU对，进一步造成了转录延伸复合物的不稳定，导致聚合酶解离和转录终止。 转录的内部终止模型。Biomolecules. 2015 Jun; 5(2): 1063–1078.这种终止也称为内部终止（intrinsic termination）。大肠杆菌中的大多数基因采用内部终止，Rho依赖的终止大约占20-30%。 大肠杆菌的Rho因子是环状六聚体，每个亚基47KD。亚基
转录组学主要技术及其应用研究 姓名：梁迪 专业：微生物学 年级：2013 学号：3130179 二零一四年六月十五日
转录学主要技术及其应用研究 摘要：转录组(transcriptome)是特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的集合。转录组学研究能够从整体水平研究基因功能以及基因结构，揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理。目前，转录组学研究技术主要包括两种：基于杂交技术的微阵列技术（microarray)和基于测序技术的转录组测序技术，包括表达序列标签技术（Expression Sequence Tags Technology，EST）、基因表达系列分析技术（Serial analysis of gene expression，SAGE）、大规模平行测序技术（Massively parallel signature sequencing，MPSS）、以及RNA 测序技术（RNA sequencing，RNA-seq）。文章主要介绍了以上转录组学主要研究技术的原理、技术特点及其应用，并就这些技术面临的挑战和未来发展前景进行了讨论，为其今后的研究与应用提供参考。 关键词：转录组学；微阵列技术；转录组测序技术；应用 Study on the main technologies of transcriptomics and their application Abstract: The transcriptome is the complete set of transcripts for certain type of cells or tissues in a specific developmental stage or physiological condition. Transcriptome analysis can provide a comprehensive understanding of molecularmechanisms involved in specific biological processes and diseases from the information on gene structure and function. Currently, transcriptomics technology mainly includes microarry -based on hybridization technology and transcriptome sequencing-based on sequencing technology, involving Expression sequence tags technology, Serial analysis of gene expression, Massively parallel signature sequencing and RNA sequencing. The detailed principles, technical characteristics and applications of the main transcriptomics technologies are reviewed here, and the challenges and application potentials of these technologies in the future are also discussed. This will present the useful information for other researchers. Keywords: transcriptomics ; microarray ; transcriptome sequencing; application 随着后基因组时代的到来，转录组学、蛋白质组学、代谢组学等各种组学技术相继出现，其中转 录组学是率先发展起来以及应用最广泛的技术[1]。
RNA-Seq名词解释 1.index 测序的标签，用于测定混合样本，通过每个样本添加的不同标签进行数据区分，鉴别测序样品。 2.碱基质量值 （Quality Score或Q-score）是碱基识别（Base Calling）出错的概率的整数映射。碱基质量值越高 表明碱基识别越可靠，碱基测错的可能性越小。 3.Q30 碱基质量值为Q30代表碱基的精确度在99.9%。 4.FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped） 每1百万个map上的reads中map到外显子的每1K个碱基上的fragment个数。计算公式为 公式中，cDNA Fragments 表示比对到某一转录本上的片段数目，即双端Reads数目；Mapped Reads(Millions)表示Mapped Reads总数， 以10为单位；Transcript Length(kb)：转录本长度，以kb个碱基为单位。 5.FC（Fold Change） 即差异表达倍数。 6.FDR（False Discovery Rate） 即错误发现率，定义为在多重假设检验过程中，错误拒绝(拒绝真的原(零)假设)的个数占所有被拒绝 的原假设个数的比例的期望值。通过控制FDR来决定P值的阈值。 7.P值（P-value） 即概率，反映某一事件发生的可能性大小。统计学根据显著性检验方法所得到的P 值，一般以P<0.05 为显著，P<0.01为非常显著，其含义是样本间的差异由抽样误差所致的概率小于0.05或0.01。 8.可变剪接（Alternative splicing）
转录分析的5种方法 信号通路，只有一个目的：将细胞的外部信号转换成细胞的内部变化。不管是胰岛素，还是异亮氨酸，抗原还是肾上腺素，它们的终极目的总是如出一则：对转录活性的改变。 这些对于转录活性的影响来自于转录因子与基因的调控区域：如启动子、增强子、沉默子等结合达到的。经典的凝胶迁移滞后试验（the electrophoretic mobility shift assay）已经成为证明某种蛋白能与特定的短基因序列结合的有力方法手段。但是凝胶迁移滞后试验具有速度慢，通量低，不定量和具有放射性的特点。即使完了你还不知道究竟是何种蛋白或者是蛋白的何种基团负责指导体内转录的变化。 为了弄清楚蛋白与基因序列结合的精确位点，需要利用基于抗体的实验。目前已经有了一些方便快捷的分析试剂，可以有力的帮助进行转录研究分析，其中有一些适用于发现型（筛选多种因子），有一些用于证实猜想的。当然这些总是从初期的工作，进入精细进一步的研究工作。 PROTEIN ARRAYS（蛋白芯片） What they are：固定的转录因子阵列，利用标记的基因序列或者蛋白质进行探索。 What to use them for：用于发现和证实转录因子的结合位点或者蛋白－蛋白相互作用。 Pros（优点）：能提供一种在广泛的因子中检测与特定序列结合的因子。 Cons（缺点）：可能会错失一些同源因子和一些转录后的变化。 Things to keep in mind：蛋白分析提供了一种在DNA片段中筛选潜在的结合位点的方法。但这种方法缺乏柔韧性，因此只局限于广泛的已研究的因子。 Available kits： Panomics的 TF Protein Array I for DNA-Protein Interactions (48 proteins, Catalog No. MA3505,
文章编号： １０００－１３３６（２００８）02－0200-04 收稿日期：２００７－１０－２５ 国家自然科学基金项目（３００７０３５５）资助 作者简介：郭明日（１９８２－），男，硕士生， Ｅ－ｍａｉｌ：ｍｉｎｇｒｉｇｕｏ＠１２６．ｃｏｍ ；曾卫民（１９５７－），男，教授，硕士生导师，联系作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｅｎｇｗｍｉｎ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ ；李莉萍（１９８２－），女，硕士生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｌｉｐｉｎｇ－８２＠１２６．ｃｏｍ Ｐ－ＴＥＦｂ在转录延伸中的作用及其与人类疾病的关系 郭明日 曾卫民 李莉萍 （中南大学生物科学与技术学院生物化学系，长沙 ４１００７８） 摘要：正性转录延伸因子ｂ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｂ， Ｐ－ＴＥＦｂ）由ＣＤＫ９和 ｃｙｃｌｉｎ Ｔ１（或ｃｙｃｌｉｎ Ｔ２ａ、ｃｙｃｌｉｎ Ｔ２ｂ、ｃｙｃｌｉｎ Ｋ）组成，对真核生物ＲＮＡ－ｐｏｌｙⅡ所介导的转录延伸具有正性调节作用。体内Ｐ－ＴＥＦｂ存在活性型（Ｐ－ＴＥＦｂ－Ｂｒｄ４）和非活性型（Ｐ－ＴＥＦｂ－７ＳＫｓｎＲＮＡ－ＨＥＸＩＭ１）两种形式，二者间的转变是调节转录延伸的关键。近年来发现Ｐ－ＴＥＦｂ与ＨＩＶ－１感染和心肌肥大等疾病密切相关。 关键词：Ｐ－ＴＥＦｂ（ＣＤＫ９－ｃｙｃｌｉｎ Ｔ１） ；ＨＥＸＩＭ１；７ＳＫ ｓｎＲＮＡ；转录延伸；Ｂｒｄ４中图分类号：Ｑ７１ 真核生物ＲＮＡ聚合酶Ⅱ（ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅⅡ，ＲＮＡＰⅡ）所介导的蛋白质编码基因的转录可分为起始前、起始、启动子识别、延伸和终止等五个阶段。转录延伸是转录过程中耗时最长的阶段，也是调控转录最重要的环节。转录延伸的重要标志是ＲＮＡＰⅡ离开转录启动子区，并向下游移动。研究表明正性转录延伸因子ｂ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｂ， Ｐ－ＴＥＦｂ）是调节这一过程至关重要的因素。近年来发现Ｐ－ＴＥＦｂ参与诸如ＨＩＶ－１感染、心肌肥大等多种疾病的发生发展，阐明Ｐ－ＴＥＦｂ在转录延伸调控中的作用对研究这些疾病的发病机制并研发新的药物靶标具有重要意义。本文将介绍Ｐ－ＴＥＦｂ在转录延伸中的调控作用，分析其在ＨＩＶ－１感染、心肌肥大等疾病发生中的作用机制，并对Ｐ－ＴＥＦｂ在新药开发方面的应用前景作一展望。 １． Ｐ－ＴＥＦｂ在转录延伸中的作用 １．１ Ｐ－ＴＥＦｂ的组成 Ｐ－ＴＥＦｂ由细胞周期蛋白依赖性激酶９（ｃｙｃｌｉｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ ９， ＣＤＫ９）及其调节亚基组成。哺乳动物ＣＤＫ９存在两种形式：ＣＤＫ９４２（分子量为 ４２ ｋＤａ）和ＣＤＫ９５５（分子量为５５ｋＤａ），ＣＤＫ９５５在氨基末端比ＣＤＫ９４２ 多１１７个氨基酸残基。细胞内ＣＤＫ９以ＣＤＫ９４２ 为主，不同ＣＤＫ９作用的底物相同，但两者的相对含量在不同组织类型的细胞中有所不同，在一些外界因素的作用下，其相对含量也会发生变化［１］。 已发现ＣＤＫ９的调节亚基至少有Ｔ１、Ｔ２ａ、Ｔ２ｂ和Ｋ四种细胞周期蛋白（ｃｙｃｌｉｎ， Ｃｙｃ），它们的氨基末端都有一个高度保守的细胞周期蛋白盒域，该序列对其活性发挥是必需的［２］。已知细胞内Ｃｙｃ Ｔ１的量远高于Ｃｙｃ Ｔ２和Ｃｙｃ Ｋ，且是ＣＤＫ９最主要的调节亚基，其氨基末端除细胞周期蛋白盒域外，还有一个卷曲－卷曲基序和一个Ｈｉｓ富集基序，羧基末端有ＰＥＳＴ序列。ＣｙｃＴ２ａ和Ｔ２ｂ则属于同一基因编码的、因转录后经ｍＲＮＡ编辑而产生的不同产物，两者亦存在Ｈｉｓ富集区。该区域是识别ＲＮＡＰⅡ羧基末端结构域（ｃａｒｂｏｘｙｌ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ， ＣＴＤ）的关键部位，所以，无论是结合在ＲＮＡ还是ＤＮＡ上的Ｃｙｃ Ｔ（Ｔ１、Ｔ２）－ＣＤＫ９复合物都能藉Ｈｉｓ富集区识别并结合ＲＮＡＰⅡＣＴＤ而激活转录。Ｃｙｃ Ｋ虽也可和ＣＤＫ９结合并形成活性复合物，但缺乏识别ＲＮＡＰⅡ ＣＴＤ的Ｈｉｓ富集区。因此，与ＣｙｃＴ－ＣＤＫ９不同，仅募集在ＲＮＡ上的Ｃｙｃ Ｋ－ＣＤＫ９才可调控转录［３］。 １．２ Ｐ－ＴＥＦｂ正性调节ＲＮＡＰⅡ所介导的转录延伸 Ｐ－ＴＥＦｂ是迄今发现唯一通用的正性转录延伸因子。作为一种５，６－二氯－１－β－呋核亚硝脲－苯并咪唑（５，６－
第三章 RNA 转录(RNA transcription) 3.1. Basic concept 3.2. Trancription survey 3.3. Promoter in Eukaryotes and Prokaryotes 3.4. Transcription Termination 3.5. Pre-RNA processing in Eukaryotes 3.1. 基本概念（P64） Basic concept ● 基因表达的第一步 ● 以D. S. DNA 中的一条单链作为转录的模板 某一基因只以一条单链DNA 为模板进行转录（不对称转录） ● 在依赖DNA 的RNA 聚合酶的作用下 ● 按A U ，C G 配对的原则，合成RNA 分子 ● 模板单链 DNA 的极性方向为3’ → 5’, 而非模板单链 DNA 的极性方向与RNA 链相同，均为5’ → 3’. ● RNA 的转录包括promotion, elongation, termination 三个阶段 ● 从启动子（promoter ）到终止子（terminator ）的DNA 序列称为转录单位 （transcriptional unit ） ● 原核生物中的转录单位多为 polycistron in operon 真核生物中的转录单位多为monocistron, No operon ● 转录原点记为+1，其上游记为负值，下游记为正值 ● RNA 的主要种类及功能：mRNA ——携带编码多肽的遗传信息 tRNA ——将核苷酸信息转化为aa 信息 转运aa 进入核糖体 rRNA ——参与多肽合成 3.2.RNA 转录概况 3.2.1转录的基本过程 1. 模板识别：RNApol 与启动子相互识别并结合的过程 （形成封闭的二元复合物） ? 启动子（promoter ）：DNA 分子上结合RNApol 并形成转录起始复合物的区域，通常也包括促进这一过程的调节蛋白结合位点rich A/T ，易发生DNA 呼吸现象形成单链区 2转录起始：启动子区解链，转录起始 （封闭的二元复合物 开放的二元复合物 三元复合物） 通常在这一过程中RNApol 移动较慢，且易发生脱落——流产式起始 ——决定启动子的强弱 3延伸： 延伸过程中的延宕现象（Eukaryotes ）：Euk genome G/C 分布不均匀 σ脱离全酶（Pro ）/RNApol 脱离转录起始复合物（Euk ） 4终止：在终止子（terminator ）处停止转录 3.2.2 RNApolymerase 1 RNA polymerase in Prokaryotes （以E.coli 为例） 1）构成 DNA 3’----TACTCAT----5’ RNA 5’----AUGAGUA----3’ 5’---ATGAGTA----3’ Non-template (sense strand) template (antisense strand)
转录因子互作研究方法 在生物体中，各种生命活动几乎都有蛋白质的参与，而且绝大多数的生命活动都需要多种蛋白质参与，它们或者形成一个复合体，或者在不同的时间、不同的位置参与到生命活动中。这样就不可避免的发生各种类型的蛋白质相互作用，这些相互作用构成一个庞大的网络，支撑生命体的活动。特别是各类转录因子之间的相互作用，在生物体内基因表达的调控及各类信号通路中起关键作用。 随着对转录因子以及转录因子相互作用研究的深入，研究蛋白质之间相互作用的技术越来越多。其中有可以大量检测蛋白质相互作用的技术，如酵母双杂交技术（Yeast Two-Hybrid）、蛋白质芯片（Protein Chip）；还有一些多用于已知蛋白相互作用验证的技术，包括：免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）、Pull-down技术（Pull-down assay）、荧光共振能量转移技术（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）、分子荧光互补技术（Bimolecular fluorescence complementation，BiFC）；还有一些新的技术层出不穷，如美国Signosis的转录因子互作微孔板芯片技术。 1、酵母双杂交技术 Fields等人首先在1989年介绍了酵母双杂交技术，这是一种基于酵母转录激活因子GAL4特点建立起来的技术。在酵母双杂交实验过程中，将诱饵蛋白基因与DBD结构域基因融合，将需要筛选的全长cDNA构建成与AD结构域基因融合的文库。当诱饵蛋白与cDNA表达的蛋白质发生相互作用时，会将DBD结构域与AD结构拉近，启动下游报告基因的表达。 酵母双杂交技术有自身的优势：a、蛋白质之间的相互作用在细胞体内进行，在一定程度上反应了蛋白质相互作用的真实环境；b、利用酵母体内激活因子的特性，相对来说比较敏感。同时，酵母双杂交也存在一些缺陷：首先，诱饵蛋白与靶蛋白的相互作用发生在细胞核内，对于一些不能入核的蛋白质无法检测；第二，酵母中表达的蛋白质只能进行有限的翻译后修饰，对于一些需要多种翻译后修饰的蛋白质作用有限；第三，酵母双杂交实验中经常出现假阳性和假阴性的现象；第四，有一些诱饵蛋白对酵母具有毒性或者本身就能够激活报告基因的表达，不适合使用酵母双杂交技术。 2、免疫共沉淀 免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）是基于抗原-抗体专一性反应的一种研究蛋白质相互作用的经典方法。这种方法在非变性条件下裂解完整细胞，细胞中的大多数蛋白质都以其原本的状态存在于裂解液中，很多蛋白质复合体保持聚合状态，使得很多蛋白质与蛋白质之间的相互作用都保留了下来。使用一种已知蛋白质的抗体将其沉淀，那么与这种蛋白质相互作用的蛋白质也会一起沉淀下来，进一步分析沉淀下来的蛋白复合物，可以得到与已知蛋白相互作用的蛋白质的信息。该方法最大的特点是在蛋白质本身所处的细胞环境中检测蛋白质相互作用，真实性较高，所以常被用于验证两种蛋白质的相互作用是否真实，也可用于确定某种蛋白质在细胞内的伴侣蛋白。其缺点是常常产生非常显著的背景，而且也不适用于高通量的实验研究。 3、Pull-down技术 Pull-down技术（Pull-down assay）利用了标签与相应固相支持物之间的亲和作用。将已知蛋白与适当的标签融合表达，由于标签的存在，融合蛋白会吸附在固相支持物上，与已知蛋白相互作用的蛋白质会随之保留下来，其余蛋白则被洗
转录部分的考试范围： 1.复制与转录的异同点？转录是否需要引物？为什么？ 答：1） 相同点： 1、都以DNA链作为模板 2、合成的方向均为5’→3’ 3、聚合反应均是通过核苷酸之间形成的3’，5’-磷酸二酯键，使核苷酸链延长。 3）原因是：转录时，RNA聚合酶有特定的结合位点，当该酶结合到DNA上时，就确定了用哪条链，将来的核糖核苷酸的排列顺序；复制时需要引物的原因很简单，因为DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，前面必须有一段DNA或RNA作为引物。 2.真核生物RNA聚合酶I，II，III的转录产物分别是什么？ 答：18S,28S,5.8SrRNA（核糖体RNA）；snRNA,hnRNA（不均一核RNA，多属mRNA 前体）；5SrRNA,snRNA，tRNA（转录RNA）。 3.什么是启动子？如何鉴定启动子？大肠杆菌的启动子具有哪两个结构 特征区域？ 答：1）指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列2）有两种方法来鉴定，①RNA聚合酶保护法，利用交联剂将RNA聚合酶与其结合的DNA片段交联在一起，利用核酸酶消化，可以释放出被RNA聚合酶保护的DNA片段，这个片段就是启动子区；②将双链DNA的一条链的末端用同位素标记，用DNA酶将其剪切一次，收集有同位素标记的DNA片段进行电泳分离，观察得到的条带，缺失的区域就是启动子区域。 3）-10有TATAAT，-35有TTGACA。 4.大肠杆菌的聚合酶具有哪些亚基，简述各个亚基的功能？什么是核心酶？ 什么是全酶？什么是σ因子？为什么σ70因子至关重要？ 答：1）大肠杆菌RNA聚合酶含α（核心酶组装，与一些调控蛋白发生相互作用），β（参与催化过程，链的起始与延伸），β’（与DNA模板结合），ω（在体外使变性的RNA聚合酶恢复到有功能的状态），σ（存在多种σ因子，用于知道聚合酶识别不同的启动子）；
转录的大概过程 如图所示：一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。转录因子之间互相结合，生成有活性和专一性的复合物，再与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。 一、转录起始 转录的起始就是生成由RNA聚合酶，模板和转录5'端首位核苷酸组成的起始复合物。 原核生物RNA5'端是嘌呤核苷酸（A、G）,而且保留三磷酸核苷的结构，所以其起始复合物是：pppG－DNA－RNA聚合酶。 真核生物起始，生成起始前复合物（PIC）。例如，RNA－pol－Ⅱ转录，是由各种TFⅡ相互辨认结合，再与RNA聚合酶结合，并通过TF结合到TATA盒上。 二、转录延长 转录的延长是以首位核苷酸的3'－OH为基础逐个加入NTP即形成磷酸二酯键，使RNA逐步从5'向3'端生长的过程。 在原核生物，因为没有细胞膜的分隔，转录未完成即已开始翻译，而且在同一DNA模板上同时进行多个转录过程。电镜下看到的羽毛状图形和羽毛上的小黑点（聚多核糖体）,是转录和翻译高效率的直观表现。 三、转录终止 转录的终止在原核生物分为依赖Rho因子与非依赖Rho因子两类。Rho因子有ATP酶和解螺旋酶两种活性，因此能结合转录产物的3'末端区并使转录停顿及产物RNA脱离DNA模板。 非依赖Rho因子的转录终止，其RNA产物3'－端往往形成茎环结构，其后又有一串寡聚U。茎环结构可使因子聚合酶变构而不再前移，寡聚U则有利于RNA不再依附DNA模板链而脱出。 因此，无论哪一种转录终止都有RNA聚合酶停顿和RNA产物脱出这两个必要过程。 真核生物转录终止是和加尾（mRNA的聚腺苷酸poly A）修饰同步进行的。RNA上的加尾修
转录因子包括什么主要的功能结构域？其主要的结构特点与功能是什么？ 作为蛋白质的转录因子从功能上分析其结构可包含有不同区域：①DNA结合域（DNA binding domain），多由60-100个氨基酸残基组成的几个亚区组成；②转录激活域（activating domain），常由30-100氨基酸残基组成，这结构域有富含酸性氨基酸、富含谷氨酰胺、富含脯氨酸等不同种类，一酸性结构域最多见； ③连接区，即连接上两个结构域的部分。不与DNA直接结合的转录因子没有DNA 结合域，但能通过转录激活域直接或间接作用与转录复合体而影响转录效率。 与DNA结合的转录因子大多以二聚体形式起作用，与DNA结合的功能域常见有以几种： ①螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix，HTH）及螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix，HLH） 这类结构至少有两个α螺旋其间由短肽段形成的转角或环连接，两个这样的motif结构以二聚体形式相连，距离正好相当于DNA一个螺距(3.4nm）,两个α螺旋刚好分别嵌入DNA的深沟。 ②锌指（zinc finger）其结构如图所示，每个重复的“指”状结构约含23个氨基酸残基，锌以4个配价键与4个半胱氨酸、或2个半胱氨酸和2个组氨酸相结合。整个蛋白质分子可有2-9个这样的锌指重复单位。每一个单位可以其指部伸入DNA双螺旋的深沟，接触5个核苷酸。例如与GC盒结合的转录因子SP1 中就有连续的3个锌指重复结构。 ③碱性-亮氨酸拉链（basic leucine zipper，bZIP）这结构的特点是蛋白质分子的肽链上每隔6个氨基酸就有一个亮氨酸残基，结果就导致这些亮氨酸残基都在α螺旋的同一个方向出现。两个相同的结构的两排亮氨酸残基就能以疏水键结合成二聚体，这二聚体的另一端的肽段富含碱性氨基酸残基，借其正电荷与DNA 双螺旋链上带负电荷的磷酸基团结合。若不形成二聚体则对DNA的亲和结合力明显降低。在肝脏、小肠上皮、脂肪细胞和某些脑细胞中有称为C/EBP家族的一大类蛋白质能够与CAAT盒和病毒增强子结合，其特征就是能形成bZIP二聚体结构。
Fermentas 体外转录疑难问题解答指南 1. 低产量或无RNA转录子 1.1. 反应条件未优化。 常规体外转录反应时，1 μg模板经RNA聚合酶或T7 Transcription Kit (#K0411)介导可转录产生至少10 μg RNA转录子。如需获得更高产量的RNA转录子(多达200 μg)，推荐使用TranscriptAid? T7 High Yield Transcription Kit (#K0441)。每20 μl反应体系中加入0.02-0.1 u (0.2-1 μl) Pyropho sphatase, Inorganic (#EF0221)可降低焦磷酸抑制作用，增加RNA产量。 1.2. RNase污染。 工作环境、DNA模板、试剂或电泳系统都有可能污染RNases。 遵照RNA操作常规推荐。 使用无RNase污染的酶、核苷酸和DEPC-处理水(#R0601)。 使用RiboLock? RNase Inhibitor(#EO0381)保护合成的RNA免受RNases降解。 备注 RiboLock? RNase Inhibitor可抑制RNases A、B和C的活性。但是其不能抑制RNases I、T1、T2、H、U1、U2和CL3的活性。 不要使用曾经小量分析过质粒DNA的电泳装置，因为其可能污染有RNases A或T1。 1.3. 短片段转录子产量低。 增加模板用量和延长反应时间可提高短片段转录子(<100 bases)的产量。模板用量可增加到2 μg；反应时间也可延长到4-8小时。 1.4. DNA模板纯度或浓度低。 与对照模板协同作用，分析样本模板是否含有抑制反应的污染物。与对照模板相比，如果样本模板的转录产量非常低，建议更改转录反应条件(将实验模板和对照模板等量混合，DEPC-处理水(#R0601)调整反应体积)。 琼脂糖凝胶评价转录子： 图. 混合实验结果分析。 C –对照模板
角朊细胞 角朊细胞的增殖和分化是一个受到精细调节的过程，并伴随着一系列形态学和生化改变，最终形成角质细胞，这就必然涉及到许多结构基因的同时活化与灭活，即基因表达的调控，而转录水平的调控尤为重要。现已发现许多转录因子如AP1、AP2、Sp1、POU结构域及C/EBP等可调节角朊细胞基因的表达。 目录
转录水平、翻译水平及翻译后水平，其中最常见的调控方式就是转录调控。现已发现AP1、AP2、NFκB、C/EBP、ets、Sp1及POU结构域等转录因子可作为表皮中的调控蛋白，从而调节编码套膜蛋白（involucrin, iNV）、转谷氨酰胺酶（transglutaminase，TG）、SPRR2A、兜甲蛋白（loricrin）、角蛋白及BPAG1等蛋白的基因的表达。本文就与角朊细胞基因表达有关的转录因子作一简要综述。 编辑本段转录因子的一般特征 转录因子（transcription factor）是能与位于转录起始位点上游50～5000bp的顺式作用元件（cis-acting elements）、沉默子（silencer）或增强子（enhancer）结合并参与调节靶基因转录效率的一组蛋白，并能将来自细胞表面的信息传递至核内基因。转录因子通常有几个功能域，可分为DNA结合域、转录调控域及自身活性调控域，DNA结合域可与特定的DNA序列（一般长8～20bp）相互作用，使转录因子与靶基因结合起来，随之转录调控域就可发挥其激活或抑制作用，通常这些结构域在结构与功能上是独立分开的。不同的转录因子还可结合于紧密相邻的DNA序列而形成一种多聚体结构来调节基因表达，这种组合调控（combinatorial regulation）不论转录因子是否激活及其含量多少均可激活基于靶基因中特定转录因子结合位点的转录。除启动基础转录活性外，转录因子还能整合从细胞表面经信号转导途径传递而来的信号[2]。 编辑本段激活角朊细胞基因表达的转录因子 （一）AP1 AP1转录因子通常以jun(c-jun、junB、junD)与Fos（Fra-1、Fra-2、c-fos、fosB）家族成员组成的同源或异源二聚体表达其活性，即结合于5’-GTGAGCTCAG-3’序列。目前已知AP1位点对于编码角蛋白（K1、K5、 K6及K19）、丝聚合蛋白原（profilaggrin）基因的最适转录活性十分重要[3,7]，编码角质化包膜（cornified envelope）相关蛋白-TG1、兜甲蛋白及INV的基因也含有功能性AP1 位点[8，9]，如hINV基因启动子在其转录起始位点上游2.5kb内有5个AP1共有结合位点（AP1-1～5），其中2个AP1位点AP1-1和AP1-5若同时发生突变时角朊细胞的转录水平就可下降80%；佛波酯（TPA）则可使AP1与hINV启动子处AP1-1及AP1-5位点的结合能力增强10～100倍，后经点突变实验证实AP1-1和AP1-5位点可部分介导佛波酯（TPA）诱导的效应[10]。丝聚合蛋白原、K1、兜甲蛋白及K19基因中的AP1位点可活化转录[3,6,7]，