西门空气质量的微生物调查
作者：许岳楷 20122501087
小组成员：蔡润苑，邓佳钰，马优，许岳楷
华南师范大学生命科学学院2012级生物科学二班第二小组，广东广州 510631
摘要：采用平板沉降法对天河区华南师范大学西门外街区不同区域内空气中细菌、放线菌、霉菌、酵母菌的含量进行检测，并以空气中微生物评价标准对结果进行分析，本调查是为了解天河区华南师范大学西门外街区空气情况以及获取对于天河区华南师范大学西门外街区环境问题的相关改善意见，提出提高空气质量的几点建议，结果石牌实惠多店空气质量较清洁，五山水果店和山东煎饼摊轻微污染.
关键词：微生物；空气；华南师范大学西门外街区
Summary : Use flat settlement law to, Tianhe District, South China Normal University Simen outside Block different regional in the air in the bacteria, and actinomycetes, and mold, and yeast bacteria content detection, and to air in the microbial Evaluation of standard to results analysis of, the investigation is For know, Tianhe District, South China Normal University Simon outside block air situation and gets for, Tianhe District, South China Normal University Simon outside Block environment problem related improve views, made improve air quality several point recommendations,
results.
Keywords : microbial ; the air ; Simen outside the block of South China Normal University
1 前言
大气作为环境的重要成分之一，不仅是人类生存的基础，也是疾病传播的重要媒介.空气中的细菌、霉菌、放线菌、酵母菌等微生物往往吸附在颗粒物上形成生物粒子，随风散播引发呼吸道疾病，尤其在人口密集的地区，空气作为媒介传播疾病的情况更为严重.华南师范大学西门外街区人口密集区域，餐饮业发达，环境卫生极差，开展对其空气中微生物的检验研究对于控制疾病传播、保护师生身体健康具有重要意义.
2 材料与方法
2.1华南师范大学西门外街区概况
华南师范大学西门外街区位于天河北路和五山路交汇处，华南师范大学西门正对面.地处繁华地段，距离地铁华师站不到100米，毗邻华南理工大学、暨南大学和华南农业大学等著名高等学府，人流量巨大，因此存在多家各地特色小吃店，而各家卫生条件参差不齐.总体上，环境条件恶劣.
2.2采样点选择及采样方法
根据西门外街区主要活动的区域（实惠多石牌店、山东煎饼摊(师大后门店)、五山水果店等）选取作为采样点，于2013年冬季进行样品采集.在各功能区人员活动最频繁（一般为晚 17: 00－18: 00）)时采样，并设对角线式均匀分布，每个采样点重复采样4次，结果取平均值.
2.3培养基采集培养基
牛肉膏蛋白胨培养基（500mL）用于采集培养微生物.
配方：牛肉膏1.5g、蛋白胨5g、氯化钠2.5g、水500mL、琼脂10g
2.4采集方法
采用平板沉降法，将采集所用的三种培养基同时放在室内各采样点处，采样高度为距地面 1.5-1.8m，将培养皿盖打开，静置7min，盖好后培养.培养条件为37℃恒温培养48h
表1 华师西门空气采样点环境描述(采样时间: 2013.11.22)
编号采样点环境描述
1 石牌实惠多往来购物人多
2 五山水果店车流量大，往来购物人多
3 山东煎饼摊地面脏，小店面多，人车往来
2.5细菌的初步鉴定
（1）肉眼鉴定法：在每个采样点选择不同培养特征的菌落，挑选菌落数多且独立的培养皿，除做菌落计数外，还根据菌落大小、颜色、表面光滑度、边缘是否整齐、透明度、扁平或隆起、湿润和黏度等特点挑取单菌落分别进行菌株鉴定.
（2）显微镜鉴定：
2.6计算方法
根据培养皿中不同种类的菌落数，计算出平均菌落数，采用奥梅梁斯基公式计算空气中
的各类微生物菌落数,即：
C=50000N/（At），
式中：C为空气微生物含量值，单位为cfu/m^3；A为培养皿面积，单位为cm^2；t为培养皿在空气曝露的时间（min）；N为培养皿中微生物菌落数，单位为cfu.
2.6质量评价
采用中科院生态中心推荐使用的空气微生物评价标准，（见表1），进行空气中微生物的污染状况评价.
级别号级别细菌霉菌微生物总数
Ⅰ清洁﹤1﹤0.5＜3
Ⅱ较清洁 1.0－2.50.5－0.753－5
Ⅲ轻微污染 2.5－5.00.75－1.005－10
Ⅳ污染5－10 1.0－2.510－15
Ⅴ中污染10－20 2.5－6.015－30
Ⅵ严重污染20－45 6.0－2030－60
Ⅶ极重污染﹥45﹥20＞60
3 结果与分析
3．1数据记录
表3华师西门外街区各采样点培养皿细菌菌落总数
公共场所点1点2点3点4平均值
石牌实惠多181031110.5
五山水果店5466292543.5
山东煎饼摊4055402339.5
图1、华师西门外街区各采样点培养皿细菌菌落总数
表4华师西门外街区各采样点培养皿微生物菌落总数
公共场所点1点2点3点4平均值
石牌实惠多182461616
五山水果店6964505860.25
山东煎饼摊43
60432342.25
图2、华师西门外街区各采样点培养皿微生物菌落总数
表5华师西门外街区空气微生物测定数据(×)
采样点细菌总数微生物总数
石牌实惠多 1.179523 1.179523
五山水果店 4.886597 6.768218
山东煎饼摊
4.437255 4.746178
3．2结果分析：
（1）由表格数据以及图1和图2可知，石牌实惠多店空气质量较清洁，五山水果店和山东煎饼摊轻微污染
（2）不同功能区污染程度不同，采样点五山水果店污染最严重，可能由于五山水果店内空气流动差，人员密集等原因造成空气微生物含量最高，以及水果店腐烂水果多，所以微生物易于存活，实惠多店虽然人口流量大，但是空气流动好，地理开阔，充足的光线使得地面干燥，不利于微生物的存活，从而使微生物数量低于五山水果店，山东煎饼摊附近小店面较多，卫生难以维持，地面废弃物痰迹多，以及食材长期暴露在空气中，容易滋生细菌，因此微生物浓度较高,同时数据显示空气微生物的污染主要由细菌引起，这与其他类似研究成果相一致
4 讨论
4.1可行性分析
（1）空气微生物监测的目的就是为了保障最大多数人员的身体健康，所以选在各功能区人员负荷最重活动最频繁时采样，即晚 17: 00－18: 00流动人口及就餐人数最多时，使得对结果的评价更具生物学意义.
（2）华师西门空气质量的优劣直接影响华师师生及附近居民的身心健康.在目前以致病菌作为直接评价空气质量指标有一定技术困难时,以细菌总数作为空气质量的评价指标是简捷可行的方法.
（3）广州市多年主导风向为东北风和东南风，冬季地面以东北风为主导风向，出现频率为27.7%，静风频率高达30.1%.夏季的地面风主要以东南风为主，出现频率为27.8%，静风频率为20.7%.在冬季静风条件下，西门内空气微生物的扩散受外界气流的影响很小，实验结果能反映空气微生物在西门内部综合因素的作用下的扩散模式.
4.2误差分析
（1）由于经济上的原因,多数都采用平板沉降法进行采样.但平板沉降法采样确实存在局限性, 加之没有严格执行统一规定的采样条件,使得采样结果存在很大偏差.
（2）目前国家尚无室外空气细菌总数卫生标准.本研究采用中科院生态中心推荐使用的空气微生物评价标准，（见表2），进行空气中微生物的污染状况评价，相对准确可靠，不排除存在一定误差.
（3）由于温度降低，人类的活动减少，使得这一结果可能与某些研究结论不一致，可能与采样的季节不同有关，本文主要研究冬季微生物的分布，这一季节空气干燥，温度较低，不利于微生物的繁殖.
4.3影响空气中微生物的因素
（1）城市空气细菌总数的高低,与人们对空气质量的正确认识并付诸行动有关,同时与城市卫生文明建设、加强城市公共场所卫生监督与管理力度有关.
（2）室内空气中细菌总数的多少取决于室内人口密度、人员活动时间长短及室内通风效果等因素.
（3）人员、车辆活动以及绿化植被是影响室外大气中细菌总数的重要因素.
4.4改良建议
（1）西门外街区街规划设计还需做适当改进,应种植行道树,灌木丛和花卉等, 增加绿化面积;改善空气流通状况和采取加湿措施,尽量降低空气中尘埃粒子数, 减少空气中微生物含量,改善空气质量.
5 参考文献
[1] 高杨，刘铭.校园空气质量的微生物学检查[J]. 科技与企业，2012-04-22.
[2] 王瑞君,包帆.宜春市城区空气微生物数量测定及分析[J].宜春学院学报,33(4):118-119
无菌方法适用性试验记录 记录编号： 2、培养基制备：按规定程序新鲜配制硫乙醇酸盐流体培养基、胰酪大豆胨液体培养基，121℃灭菌15min，灭菌后备用。 4、实验用仪器设备 □立式压力蒸汽灭菌器型号：编号： □净化工作台型号：编号： □生物安全柜型号：编号： □电热恒温培养箱型号：编号： □霉菌培养箱型号：编号： □电热鼓风干燥箱型号：编号：
5、菌液制备 5.1取经30-35℃培养18-24h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨液体培养基新鲜培养物，分别用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液稀释为不大于100cfu/ml的菌悬液备用。 5.2取经30-35℃培养18-24h的生孢梭菌的硫乙醇酸盐流体培养基新鲜培养物，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液稀释为小于100cfu/ml的菌悬液备用。 5.3取经20-25℃培养24-48h的白色念珠菌的沙式葡萄糖培养基新鲜培养物，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液稀释为小于100cfu/ml的菌悬液备用。 5.4取经20-25℃培养5-7d的黑曲霉的沙式葡萄糖琼脂斜面培养基新鲜培养物，取3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，采用适宜的办法吸出孢子悬液至无菌试管里，用含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液稀释为小于100cfu/ml的菌悬液备用。 6、实验操作 6.1薄膜过滤法：取6管滤器按规定加入供试品接种量过滤，其中3管加入硫乙醇酸盐流体培养基，分别接种上述金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌的菌液适量，另3管加入胰酪大豆胨液体培养基，分别接种上述枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉适量；再取6管滤器，3管加入硫乙醇酸盐流体培养基和分别接种上述金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌的菌液适量，作为对照，置于规定温度培养不超过3d；另3管加入胰酪大豆胨液体培养基和分别接种上述枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉适量，作为对照，置于规定温度培养不超过5d，观察结果。 6.2直接接种法：取6支各装有9ml流乙醇酸盐流体培养基的试管，分别接种上述金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌的菌液各2支，取6支各装有
安庆师范学院本科毕业（学位）论文 姓名：王婷婷 年级： 2 0 0 7级 专业：环境科学 论文题目：微生物多样性对植物 群落影响的研究进展 完成日期：2011年4月27日 指导老师：潘少兵 安庆师范学院资源环境学院 二O一一年四月二十七日
微生物多样性对植物群落影响的研究进展 作者：王婷婷指导老师：潘少兵 （安庆师范学院资源环境学院安徽安庆246011） 摘要：土壤是微生物的主要存在场所，它承载了大部分生命的基因多样性。微生物群落在各种生态进程中具有重要作用，但是对于微生物多样性与执行生态功能能力的联系却研究的很有限。这篇文章以微生物多样性在植物群落方面的作用为基础，探讨微生物群落在执行生态功能中的冗余现象。 关键词：微生物多样性；功能冗余；植物多样性 Advancement of Effect of Microbial Diversity on Plant Diversity Autor：Wang Tingting Instructor: Pan Shaobing （School of Resources and environmental science,Anqing Teachers’College,Anqing 246011,Anhui） Abstract: Microbes are abundant in soil and comprise a large portion of Life's genetic diversity. Soil microbes play key roles in a large number of important ecosystem process- es. But the relativity between soil microbial diversity and their ecological functions is still poorly understood. Here we approach the functional redundances during soil microb- es influencing the ecological functions based on the various roles that they play in plant diversity. Key words：microbial diversity, functional redundances, plant diversity 引言： 土壤是微生物的主要存在场所，微生物在土壤养分转化与腐殖质形成过程中有着非常重要的作用。土壤生态系统是保证动植物生存、农业健康、持续发展的基础[1],对全球的生态环境变化有着深远的影响。土壤微生物群落是土壤中的活性组分, 包括细菌、真菌、放线菌和原生动物、病毒和小型藻类[2],每克土壤中栖息着大约100 亿个微生物[3]。土壤微生物群落对全球生态系统功能如养分转化、有机物的分解、土壤基本结构的维持、
土壤酶活性测定方法 土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法） 一、原理 脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。 土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯 2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。 3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。 5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。 6）氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg 氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（0.01mg/ml）。 三、操作步骤 称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10%尿素溶液和20ml PH 6.7柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计与578nm波长处比色。（靛酚的蓝色在1h 内保持稳定）。 标准曲线制作：在测定样品吸光值之前，分别取0、1、3、5、7、9、11、13ml氮工作液，移于50ml容量瓶中，然后补加蒸馏水至20ml。再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。20min后显色，定容。1h内在分光光度计上于578nm波长处比色。然后以氮工作液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 注意事项: 1、每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品 实验相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。 2、整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与样品实验相同，以检验试剂纯
微生物多样研究中的—β多样性分析概述
一、β-多样性分析介绍 1. β（Beta）Diversity： 是对不同样品/不同组间样品的微生物群落构成进行比较分析。 ?β多样性分析前的数据“来源”： 1）OTUs的丰度信息表； 2）OTUs之间的系统发生关系， 计算Unweighted Unifrac及Weighted Unifrac距离。 ?通过多变量统计学方法主成分分析(PCA，Principal Component Analysis)，主坐标分析(PCoA，Principal Co-ordinates Analysis)，非加权组平均聚类分析(UPGMA，Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Means)等分析方法，从中发现不同样品（组）间的差异。
2. PCA & PCoA分析 ?主成分分析（PCA）是多变量统计学中最为人熟知的分析方法，它通过线性变换，将原始的高维数据投影至少量新合成的变量（即主成分），从而简化数据结构，展现样品的自然分布。 ?主成分分析不考虑原始变量之间可能存在的相互关系，并且是基于欧式距离评价样品之间的相似度。 ?多维尺度分析与主成分分析类似，但是它可以采用任何距离评价样品之间的相似度。主坐标分析（Principal coordinates analysis，PCoA）是经典的多维尺度分析方法。
3.UniFrac距离 ?由于微生物极其多样，不同微生物彼此之间的系统发育关系往往千差万别，仅仅将群落中不同微生物成员视为相互独立的变量显然并不合理。 ?因此，在比较不同群落样品之间的差异时，需要考虑两个群落成员之间的系统发育关系是否相似。 ?基于这个思想，计算微生物群落样品间距离的UniFrac距离应运而生，通过比较两个群落各自独有的微生物成员之间系统发育关系的远近，更为客观地反映两个群落样品之间的相似程度。
微生物限度检查方法适用性试验方案
验证方案组织与实施 微生物限度检查方法适用性试验工作应由质量管理部门负责组织，质量管理部门有关人员组成验证小组，参与实施。 方案起草 方案审核 方案批准
目录 一、概述 二、验证目的和风险评估 三、验证内容 四、方法判定 五、再验证周期 六、参考文献 七、结果评价及结论
1、概述： 微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括需氧菌数、霉菌数和酵母菌数及控制菌检查。当建立产品的微生物限度检查法时，应进行需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法的适用性试验和控制菌检查方法的适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的需氧菌、霉菌和酵母菌数的测定和控制菌检查。 依照中国药典2015版，需氧菌、霉菌和酵母菌及控制菌均采用平皿法进行方法适用性试验。 2、试验目的和风险评估： 验证目的：确认所采用的需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法及控制菌检查方法适合我公司所生产产品的微生物限度检查。 风险评估： 3、验证内容： 、培养基来源： 确认人：确认日期： 、检查用培养基配制方法：
确认人：确认日期： 、使用仪器 确认人: 确认日期： 、验证试验用菌种： 确认人：确认日期： 试验方法： 取供试品10 ml加氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml→1:10供试液。需氧菌、霉菌和酵母菌、控制菌采用
常规法。 菌液的制备： 取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨琼脂斜面培物一铂金饵，加入胰酪大豆胨液体培养基中置30～35℃培养箱中培养18～24h，取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨液体培养物1ml加入％无菌氯化钠溶液中，制成10-1 的菌液，依法10倍稀释至10～7，分取各菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基20ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml和1000CFU/ml的菌液备用。 取白色念珠菌的沙氏葡萄糖琼脂斜面培养物，加入沙氏葡萄糖液体培养基中置20～25℃培养箱中培养24～48h，取白色念珠菌的沙氏葡萄糖液体培养物1ml加入％无菌氯化钠溶液中，制成10-1 的菌液，依法10倍稀释至10～7，取菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基25ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml和1000CFU/ml的菌液备用。 取黑曲霉的新鲜培养物接种子沙氏葡萄糖琼脂斜面上，20-25℃培养5-7天，加入3-5ml含%聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。取1ml加入含%聚山梨酯80的9ml %无菌氯化钠溶液中，制成10-1的菌液，依法10倍稀释至10～7，取，取菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基25ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml和1000CFU/ml的菌液备用。 需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法适用性试验： 供试液制备： 取供试品10 ml，加氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml→1:10供试液。 实验条件： 需氧菌培养温度：30～35℃3～5天培养箱： 霉菌和酵母菌培养温度：20～25℃5～7天培养箱： 试验方法： 试验组： 分别取供试液，分别加入浓度为1000CFU的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌，混匀后取其中1ml注皿,倾注温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml，置30～35℃或培养箱中培养不超过3天，计数，每株试验菌平行制备2个平皿。 分别取供试液，分别加入浓度为1000CFU白色念珠菌、黑曲霉菌液，混匀后分别取其中1ml注皿,倾注温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml，置30～35℃或培养箱中培养不超过5天，计数，每株试验菌平行制备2个平皿。另分别取其中1ml注皿, 倾注温度不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml，置20～25℃或培养箱中培养不超过5天，计数，每株试验菌平行制备2个平皿。
(5)高通量测序：环境微生物群落多样性分析 微生物群落多样性的基本概念 环境中微生物的群落结构及多样性和微生物的功能及代谢机理是微生物生态学的研究 热点。长期以来，由于受到技术限制，对微生物群落结构和多样性的认识还不全面， 对微生物功能及代谢机理方面了解的也很少。但随着高通量测序、基因芯片等新技术 的不断更新，微生物分子生态学的研究方法和研究途径也在不断变化。第二代高通量 测序技术（尤其 是Roche 454高通量测序技术）的成熟和普及，使我们能够对环境微生物进行深度测序，灵 敏地探测出环境微生物群落结构随外界环境的改变而发生的极其微弱的变化，对于我 们研究微生物与环境的关系、环境治理和微生物资源的利用以及人类医疗健康有着重 要的理论和现实意义。 在国内，微生物多样性的研究涉及农业、土壤、林业、海洋、矿井、人体医学等诸多领域。以在医疗领域的应用为例，通 过比较正常和疾病状态下或疾病不同进程中人体微生物群落的结构和功能变化，可以 对正常人群与某些疾病患者体内的微生物群体多样性进行比较分析，研究获得人体微 生物群
落变化同疾病之间的关系；通过深度测序还可以快速地发现和检测常见病原及新发传 染病病原微生物。研究方法进展 环境微生物多样性的研究方法很多，从国内外目前采用的方法来看大致上包括以下四 类：传统的微生物平板纯培养方法、微平板分析方法、磷脂脂肪酸法以及分子生物学 方法等等。 近几年，随着分子生物学的发展，尤其是高通量测序技术的研发及应用，为微生物分 子生态学的研究策略注入了新的力量。 目前用于研究微生物多样性的分子生物学技术主要包 括:DGGE/TGGE/TTGE 、 T-RFLP 、SSCP、FISH 、印记杂交、定量 PCR、基因芯片等。 DGGE 等分子指纹图谱技术，在其实验结果中往往只含有数十条条带，只能反映出样品中少数 优势菌的信息；另一方面，由于分辨率的误差，部分电泳条带中可能包含不只一种 16S rDNA 序列，因此要获悉电泳图谱中具体的菌种信息，还需 对每一条带构建克隆文库，并筛选克隆进行测序，此实验操 作相对繁琐；此外，采用这种方法无法对样品中的微生物做 到绝对定量。生物芯片是通过固定在芯片上的探针来获得微
生物多样性 2012, 20 (5): 572–580 Doi: 10.3724/SP.J.1003.2012.10129 Biodiversity Science http: //https://www.doczj.com/doc/f916743246.html, —————————————————— 收稿日期: 2012-06-13; 接受日期: 2012-08-10 基金项目: 国家自然科学基金重点项目(30930005) ? 通讯作者 Author for correspondence. E-mail: guold@https://www.doczj.com/doc/f916743246.html, 中国微生物物种多样性研究进展 郭良栋* (中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室, 北京 100101) 摘要: 微生物是分布最为广泛的生命形式, 几乎分布到地球上的所有生境, 具有丰富的物种多样性。我国地域辽阔, 跨越热带至寒温带, 气候条件多样, 地理环境与生态系统类型复杂, 是世界上生物多样性最丰富的国家之一。我国已开展了大量微生物多样性研究, 并证实我国多样的生境蕴藏着丰富的微生物物种多样性。目前我国已报道真核微生物(菌物)约14,700种, 其中包括真菌约14,060种、卵菌约300种、黏菌约340种, 而真菌中有药用菌473种、食用菌966个分类单元。特别是近年来通过免培养的分子生物学技术发现我国存在丰富的原核微生物多样性。本文概述了传统方法和现代分子生物学技术在我国原核微生物(古菌、细菌)和真核微生物(真菌、卵菌、黏菌)物种多样性研究的最新进展。 关键词: 真核微生物, 原核微生物, 物种多样性, 培养方法, 分子技术 Progress of microbial species diversity research in China Liangdong Guo * State Key Laboratory of Mycology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101 Abstract: Microbes with rich species and genetic diversity are widely distributed throughout various habitats in the world. China possesses a variety of climate zones, geographic environments, and complex ecosystems, which play a large role shaping the complex biodiversity of this country. Microbial diversity has been widely studied and well documented by Chinese scientists. For example, a total of ca. 14,700 eukaryotic microbe species have been recorded, including ca. 14,060 fungi, ca. 300 oomycetes, and ca. 340 slime molds. Within the Fungi, there have been 473 medicinal fungal species and 966 edible fungal taxa recorded. However, re-cent studies have documented much high species diversity of prokaryotic microbes using molecular tech-niques, which have greatly promoted the study level of microbial diversity in China. This review paper sum-marizes recent research progress of microbial (i.e., archaea, bacteria, fungi, oomycetes, and slime molds) di-versity in China based on traditional and molecular techniques. Key words: eukaryotic microbe, prokaryotic microbe, species diversity, cultivation method, molecular technique 微生物是分布最为广泛的生命形式, 几乎分布到地球上的所有生境, 可利用各种有机化合物、无机盐等作为能源, 在有氧或无氧条件下, 在寒冷的极地、高达100℃的热泉或高盐碱度等极端环境中生活。微生物具有丰富的物种和遗传多样性, 并以高度的变异性适应不同的生境。作为生态系统中的重要组分, 微生物在自然界的物质与能量循环、生态系统的演替以及生物多样性的维持中发挥重要的生态功能。微生物与人类的生活休戚相关, 在直 接或间接地为人类提供了极其丰富的物质资源的同时, 也为人类带来了巨大危害。 Woese 和Fox(1977)以核糖体RNA(rRNA)的小亚基(原核生物的16S 、真核生物的18S 基因)序列为依据, 提出了独立于真细菌(Eubacteria)和真核生物(Urkaryotes)之外的第三种生命形式——古菌(Archaea), 认为它和真核生物以及真细菌是从一个具有原始遗传机制的共同祖先分别进化而来。随后Woese 等(1990)提出了三域(Domain)分类系统, 将
微生物植酸酶在体外条件下活性的测定 东北农业大学动物营养研究所 石宝明 单安山 由于添加无机磷导致粪便中磷的排出量增 多,污染水源和土壤,同时磷酸氢钙还易导致氟中 毒和其他重金属中毒,因此在饲料中添加植酸酶 代替直接添加无机磷日益受到重视。植酸酶的应 用效果,关键在于其在消化道中的活性。自然界 有许多不同的植酸酶来源,通过遗传工程技术,利 用微生物(黑曲霉—A spe rgillus nige r)发酵工程技 术生产饲用植酸酶,已成功地应用于猪和家禽中。 本试验是应用这种微生物植酸酶,以玉米、豆饼、 麦麸为植酸磷载体,模拟畜禽胃肠消化道环境,在 体外条件下测定微生物植酸酶的活性。 1 材料与方法 1.1 试验材料 微生物植酸酶,由德国BASF公司提供。 1.2 试验设计 1.2.1 时间与微生物植酸酶的活性 准确称取玉米、豆饼、麦麸各4g,固定温度为40℃,加入pH为5.5的乙酸溶液10mL和0.1g植酸酶,振荡混匀,在催化时间分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11h后,加入4mol/L盐酸3mL中止反应,然后置烘干箱中烘干,烘干后用TC A法测植酸磷含量,计算出植酸磷降解率。 1.2.2 温度与微生物植酸酶的活性 准确称取玉米、豆饼、麦麸各4g,加入pH5.5的乙酸溶液10mL和0.1g植酸酶,振荡混匀,在催化温度分别为25、30、35、40、45、50、55、60、65、70℃下,反应4h后加入4mol/L盐酸3mL中止反应,然后置烘干箱中烘干,烘干后用TC A法测植酸磷含量,计算出植酸磷降解率。 1.2.3 pH与微生物植酸酶的活性 准确称取玉米、豆饼、麦麸各4g,固定温度40℃,加入0.1g 植酸酶,振荡混匀,然后分别加入pH为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的乙酸溶 液10mL,反应4h后加入4mol/L盐酸3mL中止反应,然后置干燥箱中烘干,烘干后用TCA法测植酸磷含量,计算出植酸磷降解率。 1.3 计算方法 植酸磷降解率(%)=(催化前载体中植酸磷含量-不同催化条件下植酸磷含量)/催化前载体中植酸磷含量×100。 2 试验结果 2.1 时间与微生物植酸酶的活性 微生物植酸酶在不同催化时间下,对饲料中植酸磷的降解率见图1。 图1 不同催化时间对微生物植酸酶活性的影响 从图1可以看出,微生物植酸酶对植酸磷的降解率随着催化时间的增加而增加,在4h后为80%,在5～6h后基本完全降解。 2.2 温度与微生物植酸酶的活性 微生物植酸酶在不同温度下,对饲料中植酸磷的降解率见图2。 图2 不同温度对微生物植酸酶活性的影响 从图2中可以看出,微生物植酸酶的活性,随着温度(25～70℃范围内)的增加而增强。在pH — 23 — 2000年第15期 中国饲料DOI:10.15906/https://www.doczj.com/doc/f916743246.html, https://www.doczj.com/doc/f916743246.html,11-2975/s.2000.15.012
变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE） 普通的聚丙烯酰胺凝胶电泳只能通过片段大小不同在同一浓度的胶上电泳迁移率不同而分离不同的DNA片段，对于片段大小接近或相同的DNA片段无法做到有效地分离；DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis) 即变性梯度凝胶电泳，是利用DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。 DGGE作为一种成熟的分子生物学技术被广泛应用于环境科学（土壤、海洋、河流、冰川、淤泥等）、医学（各种疾病治疗前后，病变部位微生物的差异）、人体（鼻咽、口腔、黏膜、肠道）等领域进行微生物多样性分析。 实验流程图： 实验结果 实验结果包括以下内容 1 引物设计 以下是DGGE中常用的引物，我们将根据客户的不同需求，进行针对性的引物设计。 引物序列（5’-3’）
细菌 16S V3 区扩 增引物 357-F-GC CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGG GCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG 518r ATTACCGCGGCTGCTGG 引物 序列（5’-3’） 真核 18S V1-3区扩增引物 Euk1A CTGGTTGATCCTGCCAG EukA516r-GC CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCA CGGGGGGACCAGACTTGCCCTCC 2 基因组DNA 抽提电泳检测图 针对客户的样本来源不同，我们针对性优化不同的基因组抽提方法，已达到提取效果最佳。 说明：1-8为样本所抽提基因组DNA，上样量3uL；M 为1kb Marker 上数第一条带为8 kb，中间的亮带为3kb，浓度为30ng/uL，其余为10 ng/uL。 3 目的片段PCR 检测 说明：1-8为样本，负为负对照（说明我们的实验没有污染，这对分子实验是至关重要的），上样量为5uL；M 为DL2000 Marker，上样量3uL。其中亮带为20ng/uL，其余为10 ng/uL。 Reconditioning PCR： 第一轮PCR 产物将会作为新的模板再进行少数循环的第二轮PCR 扩增，这叫做“Reconditioning PCR”。由于在“ Reconditioning PCR”的过程中引物和模板之
姓名：崔靖璞学号：2010212802 专业：生物科学 微生物多样性研究进展 摘要：微生物资源丰富,开发潜力巨大,是生命科学发展的主要动力之一.本文介绍了几种常用的研究微生物多样性的分子生物学技术,主要包括:16SrDNA测序、DGGE/TGGE/TTGE、T-RFLP、SSCP、FISH、印记杂交、定量PCR、基因芯片等,并对微生物多样性研究技术的未来发展进行了展望，同时本文也介绍几种微生物多样性的研究实验方法。 关键词:微生物多样性聚合酶链式反应基因芯片平板纯培养 微生物是地球上生物多样性最为丰富的资源,微生物资源的开发,是21世纪生命科学发展的主要动力之一.由于微生物的微观性,微生物多样性与其他高等生物相比有许多独特之处,包括:生存环境多样;生长、繁殖速度多样;营养、代谢类型多样;生活方式多样.微生物多样性的揭示与研究技术的发展和创新是密不可分的,研究技术的进步是微生物多样性研究向前发展的重要推动力量.近年来,随着微电子、计算机、分子生物学、物理、化学等技术的发展,微生物多样性研究技术也在吸收其他学科先进技术的基础上不断向前发展.各种研究方法的发展使得这种状况有了很大改观.现代分子生物学技术在微生物多样性研究上的应用克服了微生物培养技术的限制,能对样品进行较客观的分析,较精确地揭示了微生物种类和遗传的多样性.目前用于研究微生物多样性的分子生物学技术主要包括:16SrDNA 测序、DGGE/TGGE/TTGE、T-RFLP、SSCP、FISH、印记杂交、定量PCR、基因芯片等。 1核酸探针杂交技术 核酸分子杂交技术是20世纪70年代发展起来的一种分子生物学技术.该技术快速、灵敏、具有高度特异性,近年来被广泛应用于微生物多样性的研究中.用于微生物多样性研究的探针主要有三类:双链DNA、单链DNA和RNA以及寡核苷酸探针,杂交方式主要有荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)、全细胞杂交(whole-cell hybridization)、数量印迹杂交(quantitative dot blot)及生物芯片(biochip).对于环境微生物样品解析而言,最有意义的核酸杂交技术是原位杂交技术,在原位杂交技术中,应用最广泛的是荧光原位杂交技术。
奥扎格雷钠注射液无菌检查方法适用性试验 发表时间：2018-03-05T11:28:42.313Z 来源：《中国医学人文》2017年第12期作者：张春景王晓旦王强周欣盈黄庆春 [导读] 本文对奥扎格雷钠注射液的无菌检查方法进行试验研究，以确定奥扎格雷钠注射液的无菌检查方法的有效性。 浙江北生药业汉生制药有限公司浙江省 322100 摘要：目的建立奥扎格雷钠注射液的无菌检查方法的适用性试验。方法按《中国药典》2015年版四部无菌检查方法要求，采用薄膜过滤法，对奥扎格雷钠注射液（规格5 ml:80 mg）进行无菌检查方法适用性试验。结果奥扎格雷钠注射液采用薄膜过滤法，以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌，进行无菌检查方法学验证，验证结果符合《中国药典》2015年版四部无菌检查方法适用性试验要求。结论该方法可作为奥扎格雷钠注射液的无菌检查方法。 关键词：奥扎格雷钠注射液；无菌检查；薄膜过滤法；方法学适用性试验 中图分类号：R284.1；R917.101 文献标志码：A 文章编号：1007-7693 奥扎格雷钠注射液主要用于治疗急性血栓性脑梗塞和脑梗塞所伴随的运动障碍，及改善蛛网膜下腔出血手术后的脑血管痉挛收缩和并发脑缺血症状。临床上也可联合用药，如与纳洛酮注射液联合用药治疗脑梗死。与低分子肝素钙治疗不稳定型心绞痛效果显著，有助于改善患者血液流变学指标。有研究表明奥扎格雷钠注射液对慢性阻塞性肺病有保护作用。奥扎格雷钠注射液无抑菌性，可直接采用薄膜过滤法进行该产品的无菌检查。本文对奥扎格雷钠注射液的无菌检查方法进行试验研究，以确定奥扎格雷钠注射液的无菌检查方法的有效性。 1 仪器与试剂 1.1 供试品奥扎格雷钠注射液（规格：5 ml:80 mg；批号：1704271、1704272、1704273；），供试品均由浙江北生药业汉生制药有限公司提供。 1.2 培养基和试剂硫乙醇酸盐流体培养基（批号：150605）、胰酪大豆胨液体培养基（批号：150629）、胰酪大豆胨琼脂培养基（批号：1612262）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号：1611283）、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：1310292），培养基生产厂家均为北京三药科技开发公司。聚山梨酯80（批号：20150608），生产厂家为国药集团化学试剂有限公司。 1.3 试验菌株金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B) 26003]、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B) 63501]、大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B) 44102]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F) 98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F) 98003]、生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(B) 64941]，菌种均来自浙江省食品药品检验研究院，所用菌种均为3代菌种。 1.4 仪器集菌培养器（杭州泰林生物技术设备有限公司）、隔水式电热培养箱（上海浦东荣丰科技仪器有限公司）、生化培养箱（上海申贤恒温设备厂）、电热手提压力蒸汽消毒器（上海医用核子仪器厂）、立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）、电热恒温鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、集菌仪（杭州高得(泰林)医疗器械有限公司）、生物安全柜（济南鑫贝西生物技术有限公司）。 2 方法与结果 2.1 菌液制备 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌至胰酪大豆胨液体培养基中，30～35 ℃培养18～24小时。取经培养的菌液培养物1 ml，加入9 ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，10倍稀释成含菌数不大于100 cfu的菌悬液，稀释级别为10-7、10-7、10-4、10-7，。接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35 ℃培养18～24小时。取经培养的菌液培养物1 ml，加入9 ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，10倍稀释成含菌数不大于100 cfu的菌悬液，稀释级别为10-5。接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，20~25 ℃培养24~48小时。取经培养的菌液培养物1 ml，加入9ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，10倍稀释成含菌数不大于100cfu的菌悬液，稀释级别为10-5。接种黑曲霉的新鲜培养物，至沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20~25℃培养5~7天。取培养物，加入3ml含0.05%（ml·ml-1）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液将孢子洗脱，吸出孢子悬液转移至无菌空试管作为原液，加含0.05%（ml·ml-1）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10倍稀释成含菌数不大于100cfu的菌悬液，稀释级别为10-3。 2.2 试剂的制备 培养基及所选的的溶剂按照《中国药典》2015年版四部无菌检查的规定进行配制、分装和灭菌后备用。 2.3 培养基适用性检查 2.3.1 无菌性检查每批培养基随机取5瓶，硫乙醇酸盐流体培养基置30~35℃，培养14天，胰酪大豆胨液体培养基置20~25℃，培养14天，观察，无菌生长。 2.3.2 灵敏度检查取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基7支，分别接种小于100cfu金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种，作为空白对照，培养3天；取每管装量为9ml的胰酪大豆胨液体流体培养基7支，分别接种小于100cfu枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种，作为空白对照，培养5天，逐日观察结果。培养基的灵敏度检查符合规定。结果见表1：表1 培养基灵敏度检查结果 Tab 1 The medium sensitivity tests results
第27卷增刊V ol 127,Sup 1广西农业生物科学Journal o f Guangx i A g ric 1and Biol 1Science 2008年6月June,2008 收稿日期:20080122。 基金项目:广西大学博士启动基金项目(X05119)。 作者简介:姚晓华(广西大学副教授,博士;E -mail:x hy ao@g xu 1edu 1cn 。文章编号:10083464(2008)增008405 土壤微生物群落多样性研究方法及进展 姚晓华 (广西大学农学院,广西南宁530005) 摘要:微生物多样性是指群落中的微生物种群类型和数量、种的丰度和均度以及种的分布情况。研究 土壤微生物群落多样性的方法包括传统的以生化技术为基础的方法(直接平板计数、单碳源利用模式等) 和以现代分子生物技术为基础的方法(从土壤中提取DN A ,进行G+C%含量的分析,或杂交分析,或进 行PCR,产物再进行D GGE/T GG E 等分析)。现代生物技术与传统微生物研究方法的结合使用,为更全面 地理解土壤微生物群落的多样性和生态功能提供了良好的前景。 关键词:微生物多样性;生化技术;分子生物学技术;DN A 中图分类号:.Q 938115 文献标识码:A Advancement of methods in studying soil microbial diversity YAO Xiao -hua (Co llege of Ag ricultur e,G uangx i U niv ersit y,N anning 530005,China) Abstract:Species div ersity consist o f species richness,the total number of species,species ev enness,and the distribution of species 1Methods to measure microbial diversity in so il can be categ orized into tw o g roups:biochemica-l based techniques and m olecular -based techniques 1The fo rmer techniques include plate counts,sole carbon so urce utilizatio n patterns,fatty acid methy l ester analysis,and et al 1The latter techniques include G +C%,DNA reassociation,DNA -DNA hy br idization,DGGE/TGGC,and et al 1Ov er all,the best w ay to study soil microbial diversity w o uld be to use a variety of tests w ith differ ent endpoints and degr ees o f r esolutio n to o btain the bro adest picture possible and the most inform ation r eg ar ding the microbial co mmunity 1 Key words:microbial diversity;biochem ica-l based techniques,mo lecular -based techniques,DNA 微生物多样性研究是微生物生态学最重要的研究内容之一。微生物在土壤中普遍存在,对环境条件的变化反应敏捷,它能较早地预测土壤养分及环境质量的变化过程,被认为是最有潜力的敏感性生物指标之一[1] 。但土壤微生物的种类庞大,使得有关微生物区系的分析工作十分耗时费力。因此,微生物群落结构的研究主要通过微生物生态学的方法来完成,即通过描述微生物群落的稳定性、微生物群落生态学机理以及自然或人为干扰对群落产生的影响,揭示土壤质量与微生物数量和活性之间的关系。利用分子生物学技术和研究策略,揭示自然界各种环境中(尤其是极端环境)微生物多样性的真实水平及其物种组成,是微生物生态学各项研究的基础和核心,是重新认识复杂的微生物世界的开端。
几种检测方法的适用性： 静载试验法 这是目前公认的检测基桩竖向抗压承载力最直接、最可靠的试验方法。但在工程实践中发现，基准桩的问题有时会被检测人员所忽视，容易出现基准桩打入深度不足，试验过程产生位移的问题。 钻芯法 这种方法具有科学、直观、实用等特点，在检测混凝土灌注桩方面应用较广。一次完整、成功的钻芯检测，可以得到桩长、桩身混凝土强度、桩底沉渣厚度和桩身完整性的情况，并判定或鉴别桩端持力层的岩土性状。抽芯技术对检测判断的影响很大。某工程先用XY－1型工程钻机，采用硬质合金单管钻具，用低压慢速小泵量及干钻相结合的钻进方法，结果采芯率不到70%，芯样完整性极差，大多呈碎块；后来改用SCZ－1型液压钻机，采用金刚石单动双管钻具，采芯率达99%，芯样呈较完整的圆柱状。所以，《技术规范》对钻机和钻头作了相应的规定，就是为了避免抽芯验桩的误判。 反射波法 目前在国内，绝大多数的检测机构采用反射波法（瞬态时域分析法）检测桩身完整性，主要原因是其仪器轻便、现场检测快捷，同时将激励方式、频域分析方法等作为测试、辅助分析手段融合进去。当然，低应变法检测时，不论缺陷的类型如何，其综合表现均为桩的阻抗变小，而对缺陷的性质难以区分，这是其最大的局限性。 高应变法 它的主要功能是判定桩竖向抗压承载力是否满足设计要求。高应变法在判定桩身水平整合型缝隙、预制桩接头等缺陷时，能够在查明这些“缺陷“是否影响竖向抗压承载力的基础上，合理判定缺陷程度，可作为低应变法的补充验证手段。目前在某些地区，利用高应变法增加承载力和完整性的抽查频率，已成为一种普遍做法。
声波透射法 与其他完整性检测方法相比，声波透射法能够进行全面、细致的检测，且基本上无其他限制条件。但由于存在漫射、透射、反射，对检测结果会造成影响。 低应变动测法 低应变动测法是使用小锤敲击桩顶，通过粘接在桩顶的传感器接收来自桩中的应力波信号，采用应力波理论来研究桩土体系的动态响应，反演分析实测速度信号、频率信号，从而获得桩的完整性。该方法检测简便，且检测速度较快，但如何获取好的波形，如何较好地分析桩身完整性是检测工作的关键。 测试过程是获取好信号的关键，测试中应注意：①测试点的选择。测试点数依桩径不同、测试信号情况不同而有所不同，一般要求桩径在120cm 以上，测试3～4 点。②锤击点的选择。锤击点宜选择距传感器 20～30 cm 处不必考虑桩径大小。③传感器安装。传感器根据所选测试点位置安装，注意选择好粘贴方式，一般有石蜡、黄油、橡皮泥在保证桩头干燥，没积水的情况下。④尽量多采集信号。一根桩不少于10 锤，在不同点，不同激振情况下，观测波形的一致性，以保证波形真实且不漏测。 综述 在桩基检测中，各个检测手段需要配合使用，利用各自的特点和优势，按照实际情况，
土壤酶活性及土壤微生物计数测定方法 The manuscript was revised on the evening of 2021
土壤酶活性及微生物测定 土壤酶活性测定 取样工具及取样方法 在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。土样在自然条件下烘干装入袋中备用。 所需试剂： 酒石酸钠、NaCl、阿拉伯胶、纳氏试剂、硫酸铵[(NH4)2SO4]、甲苯、苯磷酸二钠、、HAc、酚、铁氰化钾、4-氨基安替吡啉、碘化钾、氯化汞、氢氧化钾、、 配置方法： 铵态氮标准溶液：称取0.4717g(精确至0.0001g)干燥的硫酸铵[(NH4)2SO4]溶于水中，再加水稀释至1000mL，此溶液1mL含100μg N。往500ml容量瓶中注入10、25、40、60、75、90ml标准溶液并用蒸馏水稀释至刻度，制备成的溶液在490nm下比色，并绘制标准曲线。 醋酸缓冲液：，50g，溶于适量水中，加6mol/LHAc34ml，稀释至500ml。 硼酸缓冲液：，80毫升l硼砂（）和l的硼酸混合。 纳氏试剂：将碘化钾10g溶于10ml水中，边搅拌边慢慢地加入氯化汞饱和水溶液，直至生成的红色沉淀不再溶解为止。加入氢氧化钾30g并溶解之，再加入氯化汞饱和溶液1ml，加水至200ml。静置，取上层清液，贮于棕色瓶中
酚的标准溶液：（1）原液—1克酚溶于蒸馏水中定容至1升，溶液在暗色中稳定，（2）工作液—取50ml原液稀释至1升（1ml含酚）；分别向100ml容量瓶中注入1、2、3、4、5、6、7ml工作液并显色定容（分别相当于、、、、、、毫克酚），待颜色稳定后，570nm比色绘制标准曲线。 测定方法 磷酸酶活性测定 一、试验原理 土壤中的磷，很大部分以有机磷化合物的形式存在。磷酸酶能促进有机磷化合物的水解。实验表明，土壤微生物对于土壤含磷有机物质的矿化起着主要作用；土壤的磷酸酶活性，在很大程度上取决于土壤的腐殖质含量，活性磷量，能矿化有机磷化合物的微生物数量，植物类型等因素，土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力状况。 二、实验仪器 恒温箱、分光光度计、 三、实验药品 甲苯、苯磷酸二钠、酚、醋酸缓冲液、硼酸缓冲液、铁氰化钾、4-氨基安替吡啉、 四、实验步骤 取5克过20目筛的风干土样于50毫升容量瓶中，用(16滴)毫升甲苯处理，15分钟后，加入5毫升苯磷酸二钠溶液（6.75克苯磷酸二钠溶于水，并稀释至1升）和5毫升相应的缓冲液（碱性磷酸酶用pH10的硼酸缓冲液，中性磷