细胞外基质及其与细胞的相互作用
一、概述
细胞外基质指分布于细胞外空间，由细胞分泌的蛋白和多糖所构成的网络结构，构成支持细胞的框架，负责组织的构建；对细胞形态、生长、分裂、分化和凋亡起重要的调控作用。 是由一些不溶性大分子构成的、结构精细而错综复杂的网络结构；
为细胞的生存及活动提供适宜的场所，并通过信号转导系统影响细胞的形状、代谢、功能、迁移、增殖和分化。
二、细胞外基质的主要组成成分
（一）氨基聚糖和蛋白聚糖
是一些高分子的含糖化合物。构成细胞外高度亲水的凝胶，赋予组织良好的弹性和抗压性。
1. 氨基聚糖（GAG ）
是由重复的二糖单位构成的直链多糖。又称粘多糖。
二糖单位之一是氨基己糖（N -乙酰氨基葡萄糖或N -乙酰氨基半乳糖）。
二糖单位另一个糖残基多为糖醛酸（葡萄糖醛酸或艾杜糖醛酸），糖残基带有羧基，呈强负电性。
据糖残基的性质、连接方式、硫酸化数量和存在的部位，可分为六种：
（1）透明质酸（HA ）
存在于结缔组织、皮肤、软骨、滑液、玻璃体。
5000-10000个二糖重复单位排列构成。
二糖为N -乙酰氨基葡萄糖-葡萄糖醛酸，是唯一不含硫酰酸基团的氨基聚糖
其糖醛酸的羧基带有大量负电荷，其相斥作用使整个分子伸展膨胀，占据很大的空间；在有限的空间可产生膨压，赋予组织良好的弹性和抗压性。
其表面有大量亲水基团，可结合大量水分子，形成凝胶。
在组织创伤、早期胚胎中尤为丰富，促进细胞迁移和增殖。
胚胎发育早期的空间填充物，用于定形，如心脏形成。
作为关节液的重要成分，有润滑作用。
（2）硫酸软骨素（CS ）
存在于软骨、角膜、骨、皮肤、动脉。
（3）硫酸皮肤素（DS ）
存在于皮肤、血管、心、心瓣膜。
（4）硫酸乙酰肝素（HS ）
存在于肺、动脉、细胞表面。
（5）肝素
存在于肺、肝、皮肤、肥大细胞。
（6）硫酸角质素（KS ）
存在于软骨、角膜、椎间盘。
多糖 纤维蛋白
结合作用：胶原和弹性蛋白
黏合作用：纤黏连蛋白和层黏连蛋白
（非胶原性黏合蛋白） 纤维网架 氨基聚糖和蛋白聚糖
凝胶样基质
2. 蛋白聚糖（PG）
是由氨基聚糖（除透明质酸外）与核心蛋白共价形成的高分子复合物，不同于一般糖蛋白。 分子量大，含糖量高，可达95%，多为较长的、不分枝的GAGs糖链。
核心蛋白为单链多肽，其上可连接1-100条以上氨基聚糖（可为不同的氨基聚糖），形成蛋白聚糖。
若干个蛋白聚糖单体通过连接蛋白，以非共价键与透明质酸结合，形成蛋白聚糖多聚体。
如软骨中的蛋白聚糖复合体。
蛋白聚糖多聚体
氨基聚糖为硫酸软骨素和硫酸角质素，糖链数约130余条左右，分子量为3×109，使软骨具有良好的弹性和抗压性。
3. 氨基聚糖和蛋白聚糖的功能
使组织具有弹性和抗压性；
对物质转运有选择渗透性：其糖基纵横交错，构成高度水化孔胶样物，孔的大小和电荷密度可调节对分子及细胞的通透性，如肾小球基膜中的硫酸软骨素蛋白聚糖对原尿的生成即具有筛滤作用；
角膜中蛋白聚糖具有透光性：硫酸软骨素、硫酸角质素高度硫酸化使基质脱水变得致密，阻止血管的形成，使角膜柔软、具有透光性，角质化亦有保护作用；
氨基聚糖具有抗凝血作用：肝素蛋白聚糖由靠近血管的肥大细胞产生；
细胞表面的氨基聚糖有传递信息作用，如连接素。
氨基聚糖与蛋白聚糖与组织老化有关，随着年龄增长：
?如皮肤中透明质酸逐渐减少，后逐渐被硫酸皮肤素所取代；
?关节软骨中的蛋白聚糖逐渐减少，可硫酸软骨素被硫酸角质素取代；
?蛋白聚糖糖链比例下降，导致组织的保水性及弹性减弱；
?氨基聚糖的阴离子可结合钙离子，在组织的钙化、尤其是骨盐的沉积中起重要作用。
4. 氨基聚糖和蛋白聚糖与疾病
粘多糖累积病Hunter综合症；
动脉粥样硬化脂类沉积；
肿瘤的发生；
治疗高脂血症。防治冠心病、心绞痛、心肌梗死、冠状动脉粥样硬化、心肌缺血。（二）胶原与弹性蛋白
1. 胶原
是细胞外基质中的骨架结构。
占哺乳动物总蛋白量的1
4
，含量最丰富。
可由成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞及某些上皮细胞合成并分泌到细胞外。胶原分子结构
为三股螺旋，3条α多肽链盘绕而成，长300nm，直径1.5nm。
人类每条肽链约1050aa，其中Gly占1
3
，同时富含Pro和Lys，2种氨基酸经常羟基化
形成Hypro和Hylys，Lys选择性糖基化。
肽链中的氨基酸组成规律的三肽重复序列Gly-X-Y。
胶原的类型
α链是胶原的基本亚单位，不同的α链组合生成不同类型的胶原。目前已发现25种不同的α链，26种胶原。
I 型胶原[α1(I)]2[α2(I)]，存在于肌腱、皮肤、骨、韧带；
II 型胶原[α1(II)] 3，存在于软骨；
III 型胶原[α1(III)]3，存在于皮肤、肌肉、结缔组织，在血管壁和各种软组织或器官间质
形成微细的纤维网，常与I 型共分布；
IV 型胶原[α1(IV)]2[α2(IV)]，仅存基底膜。
胶原的合成装配（I-III 型）
胶原的降解
胶原的周转很缓慢，成年人骨中的胶原分子，可维持达10年；一般的蛋白质半衰期为数小时或数天。参与胶原分解的酶类主要有：
胶原酶，主要作用于I 、Ⅱ、Ⅲ型胶原；
明胶酶，作用于Ⅳ、V 、Ⅶ、Ⅺ型胶原；肿瘤细胞能产生明胶酶，特异性地作用于Ⅳ型
胶原，破坏基膜，为侵袭、转移开辟道路；
基质裂解素，作用于Ⅲ、IV 、Ⅸ、X 型胶原。
胶原的功能与相关疾病
协助完成细胞生长、粘附、运动、增殖、分化
粘连、支持、保护细胞连聚为组织、器官，如：
? 羟化赖氨酸和弹性蛋白交连，使组织有弹性，交联受阻 胶原病；
? 缺抗坏血酸，脯氨酸羟化受阻，不利于交联氢键的生成，影响胶原的稳定，胶原分
子生长不良，间质胶原大大减少，血管变脆、牙龈出血，引起坏血病；
? 肝肺纤维化：胶原生成失衡。
2. 弹性蛋白
是构成细胞外基质中弹性纤维网络的主要成分，是高度疏水的非糖基化纤维蛋白。 为高度疏水蛋白，人类的为830aa ，富含脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸。 无糖基化，很少有羟脯氨酸，不含羟赖氨酸。
主要由2类片段组成：
? 疏水性短肽：与分子的的弹性有关；
? α螺旋片段：富含丙氨酸、赖氨酸，与相邻分子形成交联。
弹性蛋白以可溶性蛋白原的形式分泌到细胞外，通过赖氨酸残基之间相互交联装配，形
成弹性纤维网。
弹性蛋白表面包饶一层糖蛋白组成的微原纤维。
前α链，带有信号肽和前肽（不含Gly-X-Y 结构） 去除信号肽；选择性羟基化、糖基化； C-端前肽借二硫键形成链间交联，使3条对齐排列，3
条
α链以氢键相连，形成三股螺旋，前肽部分不螺
旋，即
前胶原 分泌到细胞外；去除前肽；相邻分子相错14
长度，约67nm ，前后分子相距约35nm ，聚合形成明暗相间
的纤维，即
胶原原纤维
细胞外基质中聚集成束，形成
胶原纤维 内质网 高尔基体
细胞外
?其中原纤蛋白是保持弹性纤维完整所必需的成分，其基因突变，可导致马凡氏综合
症。
胶原纤维与弹性纤维交织，可以限制其伸展程度，防止组织撕裂，使组织既有弹性又有韧性。
弹性蛋白是动脉中含量最高的细胞外基质蛋白，其基因突变可导致动脉壁平滑肌过度增殖引起动脉狭窄。
3. 纤粘连蛋白（FN）
为高分子糖蛋白，含糖量4.5%-9.5%，其含糖量因组织不同和分化状态不同而有差异。有两种存在形式：
血浆纤粘连蛋白（PF），主要存在于体液、血浆中，促进血液凝固、创伤愈合、细胞吞噬；
细胞纤粘连蛋白（CF），高度不溶，主要存在于细胞外基质和细胞表面。CF在细胞表面装配，沉积在细胞外基质（包括某些基膜），主要由间质细胞分泌。
FN结构特点
纤维状糖蛋白。
由2个相似的亚单位构成二聚体，二聚体C端以二硫键相连，“V”形，活动度大。
?其中PF为二聚体。
?CF为二聚体交联后形成的多聚体。
有许多结合位点，可结合ECM成分或细胞。
每条肽链约含2450aa，构成5-7个有特定功能的球形结构域。
?各结构域之间的肽段可折曲，对蛋白酶敏感。
具有三肽序列Arg-Gly-Asp（RGD）结合活性部位，是细胞表面各种FN受体识别并结合的最小单位，但并非FN所特有。
FN功能
黏着、迁移。
介导细胞-细胞外基质的黏着；
与细胞的迁移：在黏着斑处FN受体（如整联蛋白）通过FN与细胞外基质相连，通过黏着斑的形成于解离，影响细胞骨架的组装与去组装，促进细胞迁移；
在胚胎发生期引导细胞迁移及细胞分化；
在组织创伤中，PF可结合血浆纤维蛋白，在伤口处吸引成纤维细胞平滑肌细胞、和内皮细胞向伤口迁移，形成肉芽组织。
FN与疾病
肾小球炎；
恶性肿瘤中的FN受体异常，细胞黏着能力下降。
4. 层粘连蛋白（LN）
是胚胎发育中出现的最早的细胞外基质成分，为糖蛋白，含糖13-28%。结构复杂，功能多样。
高分子糖蛋白，分子量820-850Da，300nm长。
由αβγ三条多肽组成的异三聚体。
?一条重链α与两条轻链βγ以二硫键相连，呈不对称十字结构：三条短臂（N-端）、
一条长臂。
至少有8个细胞结合位点，结合上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、神经元、神经鞘细胞、肿瘤细胞等。
是一个大的蛋白家族，现已鉴定出8种不同一级结构序列的LN亚单位。
LN的功能
基膜的主要成分；
具有RGD序列，被各种细胞识别，从而固定在基膜上；
在早期胚胎中保持细胞间的黏附、细胞的极性、及细胞的分化具有重要意义。
LN与疾病
糖尿病基底膜的改变。
三、基膜/基底膜
是细胞外基质的特化的柔软、坚韧的网膜结构。
一般厚40-120nm。
位于上皮细胞或内皮细胞基底部，或包绕在肌细胞、雪旺氏细胞周围，将细胞与结缔组织隔离。
A D S C s的分离与纯化关于ADSCs的获取方法很多，但不管哪种方法所得到的并非单一的脂肪干细胞，是一组具有干细胞特性的细胞群。目前应用最广泛的分离方法是酶胶原消化法。首先将无菌条件下切取的脂肪组织块剪成细小的颗粒，PBS液冲洗干净后，用0．1％的胶原酶在37℃下振荡消化4O～90min，再用含10％胎牛血清的等体积DMEM培养基终止。1200r ／min离心5～10min，弃上清液及悬浮的脂肪组织，重悬细胞后经过细胞筛过滤，所得细胞按2—4×105／cm接种于50ml培养瓶内。37℃条件5％的CO饱和湿度培养箱内培养，2d后首次换液，以后3d换液一次，至细胞达70％～8O％融合时用0．25％胰酶消化，并传代。经过提取获得的以脂肪干细胞为主的细胞群接种后数小时即开始贴壁生长，24h内完成贴壁。细胞的形状与成纤维细胞相似，体积较小，核浆比较大，随后细胞体积渐增大，克隆形成。经传代后，细胞的形态及排列才趋于一致。由于目前尚未发现脂肪干细胞表面存在特异性的分子标记物，因此无法利用分子表型来分离纯化。然而可通过纯化脂肪组织块来间接达到纯化脂肪干细胞的目的。流式细胞仪检测显示：传至第3代时，可达95％以上的细胞纯度。 ADSCs的生物学特性 1.ADSCs的鉴定
在ADSCs鉴定上，现阶段尚无特异性鉴定方法。用免疫荧光法和流式细胞术检测结果均显示ADSCs表达特异性分子CD44，OCT一4，E—eadherin，流式细胞术检测细胞周期显示绝大多数细胞是处于静止期的干细胞，传代后生长迅速，随机挑选来源标本，对细胞进行染色体核型分析显示ADSCs具有遗传稳定性。 ADSCs分泌多种生长因子 在生理功能方面，脂肪干细胞能分泌相当数量的细胞因子，包括肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胎盘生长因子(PGF)、转化生长因子一B(TGF—B)、成纤维细胞生长因子(FGF一2)等，低表达的因子有Ang一2C。 2.ADSCs的多向分化能力 与骨髓间充质干细胞相比，脂肪干细胞具有储量丰富、取材容易、扩增迅速、不宜衰老、排斥反应低等优点。在特定培养基和特异的诱导剂作用下可分化为特定的体细胞，在组织修复、细胞移植、基因治疗等领域有着潜在价值。 向脂肪细胞分化：在特定培养基中加入一定浓度地塞米松、胰岛素、吲哚美辛及1一甲基一3～异丁基一黄嘌呤，3周后发现ADSCs向脂肪细胞分化，可检测出ADSCs表达许多脂肪细胞的特异性标记：脂蛋白脂肪酶、脂肪酸结合蛋白aP2、PPAR—r2、leptin(瘦素)、Glut4(葡
脂肪干细胞的提取及鉴定 一、脂肪干细胞(ASCs)的提取及鉴定 1、实验技术及原理: 运用细胞培养技术、流式细胞术(体外扩增后ACSs的表型会发生改变，主要体现在细胞表面蛋白和细胞因子表达的变化)，差异离心术(可将基质血管细胞沉淀与悬浮的成熟脂肪细胞分离，沉淀中除ASCs，还包括血细胞、成纤维细胞和内皮细胞，基质血管细胞沉淀可以接种到孰料培养瓶中，基质细胞可贴壁，造血和其他杂质细胞不贴壁，在随后的传代过程中被出去，最终得到的ASCs可再很长时间内保持摸分化状态)。取C57BL,6 WT小鼠2只，常规麻醉消毒，取腹股沟脂肪组织剪碎至糊状，PBS液冲洗去麻药及血液，0.075%II型胶原酶消化(37?，30分钟)以去除外基质，生理盐水终止胶原酶的消化，离心(1200g,10分钟)，去上清液及未消化的脂肪，10%FBS的DMEM重悬细胞沉淀，0.16mol/L氯化氨溶解剩余红细胞，离心洗涤，过200目铜网，得到单个核细胞。?镜下计数，按10个细胞/ml种植在培养瓶中，37?5%CO2孵箱培养，24小时后第一次换液，以后3天换液一次，80%融合后0.25% Trypsin,0.02%EDTA消化传代。细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型(CD29/CD44)的鉴定。 2、实验用品: 2.1 材料:C57BL,6 WT小鼠 2.2 试剂:PBS液，0.075%II型胶原酶消化，10%FBS，低糖DME M 2.3 仪器设备:超净工作台、恒温培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、离心机、离心管、解剖剪、眼科剪、镊子(尖头、平头和有沟镊)、小烧杯，200目铜网过滤器，低糖DMEM、血球计数板、橡皮瓶塞、酒精灯、换药碗 3、细胞培养的方法与步骤:
骨髓间充质干细胞研究进展(一) 【摘要】骨髓间充质干细胞是干细胞领域的研究热点之一。虽然近几年来有关间充质干细胞的研究已取得了很大进展，但仍有很多问题有待进一步解决。本文主要对间充质干细胞的生物学特性、以及免疫耐受性、分化和促修复、间充质干细胞的标记等问题进行综述。 【关键词】骨髓间充质干细胞分化标记 骨髓间充质干细胞，BMSCs)是骨髓内除造血干细胞(hematopoieticstemcells，HSC)之外的另一类干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，在体内外均具有支持和调控造血的作用。因其比较容易贴壁和形成成纤维样的克隆，因此也称成纤维细胞集落形成单位(Colonyformingunitfibroblast，。又由于它们来自骨髓的支持结构，并作为滋养层支持造血干细胞的生长，因此也有人称其为骨髓基质细胞(Bonemarrowstromalcells，BMSCs)。 1骨髓MSCs的生物学特性 不同物种的BMSCs体外培养的形态学特征大致相同，主要表现为梭形、纺锤形，少数为多角形。目前，BMSCs的分离方法主要有以下几种：(1)全骨髓培养，是将无菌抽取的骨髓加入培养液制成细胞悬液并培养，原代培养培养物以造血细胞成分居多，为利于BMSCs的贴壁生长，可采用DMEM和胎牛血清培养。BMSCs对营养要求高，胎牛血清终浓度为10％～20％，有人认为红细胞会随着换液而逐渐被自然去除，对BMSCs影响不大。细胞融合后以1:2比例传代，3～4天换液一次〔1〕；(2)离心培养法，是根据骨髓中细胞成分比重的不同，采用离心分离法提取单核细胞进行培养。在新鲜无菌的骨髓抽取物中加入抗凝培养液稀释1500～2000r／min离心20～30min，采集交界处的单核细胞层，PBS洗涤2～3次后，加入培养液接种培养；(3)细胞表面分子标记分选法，主要是根据BMSCs的细胞表面分子特征来分离。一般采用流式细胞仪、免疫磁珠或免疫沉积法来进行分选。但由于目前仍未找到BMSCs 特异性的细胞表面标记物〔2〕该法较少采用。影响BMSCs扩增的主要因素：(1)血清：血清对大量扩增BMSCs起着重要的作用，不同浓度的血清对培养BMScs纯度的影响亦较大，常用1０%～20%的胎牛血清培养BMSCs;(2)接种密度：BMSCs的体外扩增速度与其接种密度也有关，一般认为较低密度种植有益于增殖。高密度接种后细胞生长较慢其原因可能是由于细胞间的接触抑制，或细胞释放到培养基中的因子影响了BMSCs的生长;(3)细胞因子：一些细胞因子对于维持BMSCs增殖和未分化状态亦十分重要;(4)动物种属：一般认为BMSCs的生长特性相似，但也有资料显示BMSCs生长特点有种属差异〔3〕。 2间充质干细胞移植后的免疫耐受性 在移植治疗中，一般情况下，移植物会引起宿主的免疫排斥反应。但对于间充质干细胞来说却不是这样。实验表明间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖从而导致免疫耐受〔4～7〕。T 细胞与其它细胞的相互作用可以通过混和淋巴细胞反应来观察。被标记的T细胞与其它细胞混合后，如果可以引起T细胞的免疫反应，则可以观察到T细胞的增殖现象。但当把间充质干细胞与T细胞混合后却观察不到T细胞的增殖反应，而且这种现象并不是由于T细胞凋亡或其它的有害作用引起的。因为在去除间充质干细胞后，这些T细胞仍然可以对其它物质进行反应。此外，使用趋化膜将两种细胞分隔开培养后，间充质干细胞对T细胞的抑制作用依然存在，表明这种抑制作用可能通过某种可溶性的小分子起作用。另外，除了未分化的间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖外，实验也表明，随着干细胞的分化，其抗原性并没有随之增加〔8〕。总之，间充质干细胞可以通过某种机制抑制T细胞的成熟来逃避免疫系统的清除。也暗示间充质干细胞可能在机体免疫系统的调节及骨髓中各种干细胞未分化状态的维持方面起作用。 3促组织修复和细胞分化 骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓组织中的一类成体干细胞(adultstemcells，AS)，在一
第十一章细胞外基质及其细胞的相互作用 定义：细胞外基质extracellular matrix, ECM是细胞分泌到细胞外空间的分泌蛋白和多糖构成的精密有序的网状结构 分类：构成细胞外基质的大分子种类繁多，大致分为三类： ①氨基聚糖与蛋白聚糖；②胶原和弹性蛋白；③非胶原性黏合蛋白：纤连蛋白和层粘连蛋白 第一节细胞外基质的主要组成成分 ·从结构表现形式上，细胞外基质主要由①凝胶样基质（氨基聚糖、蛋白聚糖）和②纤维网架（胶原、弹性蛋白）构成，③起黏着作用：纤连蛋白、层粘连蛋白 ·分布：细胞外基质含量因组织种类而不同，上皮、肌组织、脑等含量较少；结缔组织中细胞外基质含量最大 一、糖胺聚糖glycosaminoglycan, GAG与蛋白聚糖proteoglycan, PG GAG与PG是一些高分子量的含糖化合物，构成细胞外高度亲水的凝胶，赋予组织良好的弹性和抗压性 （一）糖胺聚糖是由重复的二糖单位（氨基乙糖/糖醛酸）构成的直链多糖 因糖残基上有羧基，故氨基聚糖呈强负电性 透明质酸HA Hyaluroinc acid 结缔组织、皮肤、软骨、滑液、玻 璃体硫酸化× 硫酸软骨素CS Chondroitin sulfate 软骨、角膜、骨、皮肤、动脉√ 硫酸皮肤素DS Dermatan sulfate 皮肤、血管、心瓣膜、韧带√ 硫酸乙酰肝素HS Heparan sulfate 肺、动脉、细胞表面√ 肝素heparin 肺、肝、皮肤、肥大细胞√ 硫酸角质素KS Keratan sulfate 软骨、角膜、椎间盘√ HA：透明质酸是氨基聚糖中结构最简单的一种，其二糖单位是N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸。透明质酸的糖醛酸的羧基带有大量负电荷，其相斥作用使整个分子伸展膨胀，占据很大的空间，一个透明质酸分子可以占据1000倍于自身分子的空间，有良好的弹性和抗压性，HA在组织创伤、早期胚胎中尤为丰富，促进细胞迁移和增殖；是胚胎发育早期的空间填充物，用于定形，如心脏形成；作为关节液的重要成分，有润滑作用。任务完成后，可被透明质酸酶降解（二）蛋白聚糖是由糖胺聚糖和核心蛋白共价结合形成的高分子量复合物 定义：蛋白聚糖proteoglycan, PG是由氨基聚糖（透明质酸除外）与核心蛋白共价形成的高分子复合物，是含糖量极高的糖蛋白。其分子量大，含糖量高，可达分子量的95% 1.蛋白聚糖的分子结构 核心蛋白为单链多肽，一条核心蛋白分子上可连接1~100条以上氨基聚糖（相同或不同的氨基聚糖），形成蛋白聚糖单体。 若干个蛋白聚糖单体通过连接蛋白linker protein，以非共价键与透明质酸结合，形成蛋白聚糖多聚体 2.蛋白聚糖的合成与装配 核心蛋白在粗面内质网核糖体上合成，在内质网腔中装配上直链多糖——蛋白聚糖单体 装配时，首先一个专一的四糖(-木糖-半乳糖-半乳糖-葡萄糖醛酸-)(Xyl-Gal-Gal-GlcUA)结合到核心蛋白的丝氨酸残基上；然后在糖基转移酶作用下，一个个糖基依次加上，形成氨基聚糖糖链 蛋白聚糖的显著特点——多态性：核心蛋白氨基酸序列不同、糖链长度和成分不同
申请学位： 学士学位 院 系： 药学院 姓 名： 孟凡飞 学 号： 122120209 指导老师： 张怀斌（讲师） The Review of The Interaction of Nano Materials and Cells 毕 业 设 计（综 述） 纳米材料与细胞作用的研究综述 二0一四年六月十二日
目录 摘要 (1) Abstract (2) 引言 (3) 1纳米ZnO的制备及性质 (3) 1.1 纳米ZnO的制备 (3) 1.1.1 制备方法的概述 (3) 1.1.2 醋酸锌法制备纳米ZnO (3) 1.2 纳米ZnO的性质 (5) 2纳米ZnO与不同细胞的相互作用 (5) 2.1 纳米ZnO与人支气管上皮细胞(BEAS-2B) (5) 2.2 纳米ZnO黄曲霉细胞的相互作用 (6) 2.3 对白色念珠菌的生物毒性 (6) 2.4 纳米ZnO对人胚肺成纤维细胞（HELF）的生物毒性的剂量效应 (7) 2.5 尺寸效应对ZnO纳米粒子对洋葱表皮细胞作用的影响 (8) 3展望 (9) 3.1 发展与应用 (9) 3.2 缺点与改进 (10) 参考文献 (11) 致谢 (13)
纳米材料与细胞作用的研究综述 孟凡飞 摘要: 从近年来对于纳米材料的安全性评价的工作进展看，人们对于现今应用较广的ZnO纳米材料的生物安全性研究较少。本文将着重阐述ZnO纳米材料在机理、剂量、尺寸方面对不同生物细胞的相互作用，为做好纳米材料使用的安全防护工作、研究纳米材料在生物安全性方面的影响、建立一套研究纳米材料安全性评价的方法提供必要依据。关键词: ZnO纳米材料；机理；剂量；尺寸；生物细胞；相互作用
ADSCs的分离与纯化 关于ADSCs的获取方法很多，但不管哪种方法所得到的并非单一的脂肪干细胞，是一组具有干细胞特性的细胞群。目前应用最广泛的分离方法是酶胶原消化法。首先将无菌条件下切取的脂肪组织块剪成细小的颗粒，PBS液冲洗干净后，用0．1％的胶原酶在37℃下振荡消化4O～90 min，再用含10％胎牛血清的等体积DMEM培养基终止。1 200 r／min离心5～10 min，弃上清液及悬浮的脂肪组织，重悬细胞后经过细胞筛过滤，所得细胞按2—4×105／cm 接种于50ml培养瓶内。37℃条件5％的CO 饱和湿度培养箱内培养，2 d后首次换液，以后3d换液一次，至细胞达70％～8O％融合时用0．25％胰酶消化，并传代。经过提取获得的以脂肪干细胞为主的细胞群接种后数小时即开始贴壁生长，24h内完成贴壁。细胞的形状与成纤维细胞相似，体积较小，核浆比较大，随后细胞体积渐增大，克隆形成。经传代后，细胞的形态及排列才趋于一致。由于目前尚未发现脂肪干细胞表面存在特异性的分子标记物，因此无法利用分子表型来分离纯化。然而可通过纯化脂肪组织块来间接达到纯化脂肪干细胞的目的。流式细胞仪检测显示：传至第3代时，可达95％以上的细胞纯度。 ADSCs的生物学特性 1.ADSCs的鉴定 在ADSCs鉴定上，现阶段尚无特异性鉴定方法。用免疫荧光法和流式细胞术检测结果均显示ADSCs表达特异性分子CD44，OCT一4，E—eadherin，流式细胞术检测细胞周期显示绝大多数细胞是处于静止期
的干细胞，传代后生长迅速，随机挑选来源标本，对细胞进行染色体核型分析显示ADSCs具有遗传稳定性。 ADSCs分泌多种生长因子 在生理功能方面，脂肪干细胞能分泌相当数量的细胞因子，包括肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胎盘生长因子(PGF)、转化生长因子一B(TGF—B)、成纤维细胞生长因子(FGF一2)等，低表达的因子有Ang一2 C。 2.ADSCs的多向分化能力 与骨髓间充质干细胞相比，脂肪干细胞具有储量丰富、取材容易、扩增迅速、不宜衰老、排斥反应低等优点。在特定培养基和特异的诱导剂作用下可分化为特定的体细胞，在组织修复、细胞移植、基因治疗等领域有着潜在价值。 向脂肪细胞分化：在特定培养基中加入一定浓度地塞米松、胰岛素、吲哚美辛及1一甲基一3～异丁基一黄嘌呤，3周后发现ADSCs向脂肪细胞分化，可检测出ADSCs表达许多脂肪细胞的特异性标记：脂蛋白脂肪酶、脂肪酸结合蛋白aP2、PPAR—r2、leptin(瘦素)、Glut4(葡萄糖转运蛋白等。镜下观察可见胞内有空泡形成。这些特点是脂肪细胞形成的标志。 向血管内皮细胞分化：将ADSCs置于含甲基纤维素和血管内皮生长因子的半固体培养基中加以培养，镜下可见有分支状的管腔结构形成，免疫组化证实有内皮细胞特异性的表面标记一CD31和vW 因子。Planat等描述了将培养3d的ADSCs注入后肢缺血损伤的实验小鼠后
骨髓基质干细胞及其应用的研究进展(一) 【摘要】骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)，又称骨髓基质干细胞，是骨髓中非造血实质细胞的干细胞，具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，可分化成多种细胞。【关键词】骨髓干细胞 骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)，又称骨髓基质干细胞，是骨髓中非造血实质细胞的干细胞，具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，可分化成多种细胞。近来研究表明它可以向三个胚层的多种组织分化，如来源于外胚层的神经元、神经胶质细胞等，MSCs移植为脑缺血患者开辟了一种新的治疗方法。本文对MSCs移植治疗脑缺血的研究综述。 1骨髓基质细胞的生物学特性 1.1目前发现至少存在3种形态的MSCs。Colter等从培养的人骨髓细胞中分离出MSCs后，发现来自单细胞的克隆中除了含有小的梭形和大的扁平MSCs外，还有一种非常小的圆形细胞，这种小圆形细胞有更强的折光性，它们比大的MSCs能更快分裂、增殖，并且有更强的多向分化潜能，当将MSCs放在不同的微环境内时，它们可相应地分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或成肌细胞等1-3]。MSCs具有多向分化的潜能，MSCs经静脉途径或局部注射移植到不同的组织时，MSCs即可在相应的组织内分化形成该类组织细胞3，4]。 1.2MSCs的易粘附、易贴壁生长，易增殖特性使得它们经过数次换液和传代后得到分离、纯化3]。 2骨髓基质细胞在体外诱导分化为神经元和胶质细胞 最近研究发现，在特定的实验条件下可将人、大鼠及小鼠等的MSCs在体外诱导分化为神经元样和胶质细胞样细胞，SanchozRamos等发现，表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF)或脑源性营养因子(brain-derivedneuotroficfactor，BDNF)可诱导人及小鼠的少数MSCs分化为神经元样及胶质细胞样细胞，它们表达神经前体细胞的标志物巢素蛋白(nestin)及其RNA、神经元标记物神经元特异性核蛋白(neuronspecificnuclearprotein，NeuN)、星形胶质细胞标记物胶质原纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)。将人或小鼠的MSCs与胚胎大鼠中脑或纹状体神经元共培养时，部分MSCs分化为NeuN阳性的神经元样细胞及GFAP阳性的星形胶质细胞样细胞，因此，除了可能通过营养因子和细胞因子传递信号外，细胞与细胞的直接接触还可能在MSCs的分化中发挥重要作用5]。 3MSCS移植治疗局灶性脑缺血的可行性及原理 3.1供体与受体 MSCs移植治疗脑缺血多为同种异体移植，如Brazelton等6]采用的供体鼠为成熟转基因大鼠，鼠龄8～10w，受体鼠为致死量放疗后的相同鼠龄的大鼠，移植的为新鲜未经培养的MSCs。有些学者将供体鼠化疗(5-氟尿嘧啶，150mg/kg，腹部注射)2d后取其骨髓进行体外培养3代，移植前72h加BrdU进行标记，受体鼠亦为相同鼠龄相同体重的同种鼠7]。Zhao等8]的研究中，hMSCs来自于10～35岁的健康志愿者，hMSCs转染了增强的绿色荧光蛋白基因，经26代培养后移植入成熟雄鼠体重(230～250g)，结果未出现免疫排斥反应，说明MSCs具有相当大的免疫反应调节能力。上述研究中，或是供体经化疗或是受体经放疗或是MSCs经多次传代培养以降低免疫活性，从而减少移植物抗宿主反应的发生。 3.2MSCs在脑内有迁移能力 Kopen等将小鼠MSCs注入新生小鼠侧脑室后12d，发现MSCs已迁移至前脑、小脑，而且不破坏脑组织结构，其迁移方式与出生后早期的神经发育过程相同，提示MSCs的行为类似神经前体细胞9]。 3.3目前MSCs移植治疗局灶性脑缺血的途径有3种：脑立体定向移植，经颈内动脉注射移植及经静脉注射移植
干细胞培养基的选择 研究背景： 小鼠骨髓间充质干细胞的目前干细胞培养难点。小鼠的骨髓基质细胞成分复杂，间充质干细胞比率低，分离培养有一定的难度。广东医学院的博士研究生陈博士在培养过程中就遇到该问题。他曾成功饲养成人和大鼠骨髓间充质干细胞。但新近培养的小鼠间充质干细胞状态就很差。按照自己的分析：细胞培养操作没有问题，培养条件也不错，试剂来源可靠。问题应该出现在培养基配方上。陈博士以原来的骨髓间充质干细胞培养基为基础，按照导师的提点，修改了配方，但细胞不好不坏。为此他做了两次正交，结果缺总不理想，细胞状态并不稳定。陈博士为此焦头烂额，担心下一步的实验无法进行。经朋友介绍找到百恩维公司的技术支持。 解决方案： 百恩维的干细胞技术专家了解了陈博士的情况，培养技术、取材和试剂来源等，觉得不存在大问题；问题主要的原因是培养基的成分配比。建议陈博士重新配制培养基或使用现成的完全培养基。陈博士为了加快实验进度，直接选用了百恩维小鼠骨髓间充质干细胞培养基。 选用产品：小鼠间充质干细胞培养基（Catalog No.BW110014） 实施步骤： 1、使用百恩维的小鼠间充质干细胞培养基，进行原代的取材； 2、同样时间下，百恩维的培养基的MSC细胞状态明显优于自己配置的培养液； 3、经过传代，细胞的状态和增殖能力都很好； 4、成功获得了足够进行下一步实验所需的mouse MSC。 结果分析：细胞状态良好，成梭状、紧密分布，大小较均匀。目前已经传至20代。对于这次走的弯路，陈博士感慨良多。要高效的完成课题实验，就需要转变观念，合理利用和整合现有的各个优势资源，快速达到实验目标。 案例分析：目前成功的间充质干细胞培养液主要包含DMEM+FBS+谷氨酰胺+双抗。其中FBS的品牌和批次对细胞都会有不同的影响；无菌技术不成熟的新手，或者无菌条件不完善的实验室，最好使用双抗。最后，各成分的配比也有较大影响：大部分间充质干细胞适用低糖，加约10%的FBS等等，对不以寻找配方为目的的干细胞研究人员，我们建议直接使用经过不断优化和严格质量检测的百恩维干细胞培养基，提高科研效率。
细胞外基质与心血管病 细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）是由成纤维细胞、间质细胞、上皮细胞等体内各种组织和细胞合成和分泌的一类大分子物质。主要分为胶元、非胶元糖蛋白、蛋白聚糖和弹性蛋白等四大类，主要分布和聚集在细胞表面和细胞间质，多成复杂网络结构，故称细胞外基质（间质）。它们是细胞和组织赖以生存、活动和调节的外环境：一方面为细胞和组织提供支持、联结、固定、保水、缓冲等物理性的保护作用，另一方面又是细胞与外环境进行物质交换、信息传递和汇集的中介。它可通过各种信号传递系统，调节细胞生长、增殖、迁移、分化、粘附、代谢、损伤修复、组织重构等各种生理功能。被称为是人体细胞和组织内稳态的主要调节者（The Central Regulator of Cell and Tissue Homeostasis）。 细胞外基质的成分十分复杂，除了各型胶元以外，还有各种粘连蛋白（FN）、层连蛋白（LN）、氨基聚糖（GAG）、蛋白聚糖（PG）、弹性蛋白（Elastin）、内动素（Cytotatin）、血栓结合素（Thrombospondin）、整合素（Integrin）、玻连蛋白（Vitronetin VN）、连结蛋白（Connexins）、钙粘素（Cadherins）、选择素（Selectin）、粘附素（细胞粘合素）、细胞粘合素（Cytotatin）等几十个类别。每一种类别又有几种至十几种亚型。细胞不同产生和分泌的基质成分亦不同；组织不同所含的细胞外基质的成分和比例亦不同；即使同一种细胞，同一种组织，在不同的生理、病理和反应条件下，细胞外基质的成分、结构和构型亦不同；结构和构型不同，细胞外基质的功能和作用亦不同；同一类型的细胞外基质，它还可分解成不同的降解片段，也有不同的生理功能。随着基因和蛋白质组生物学的研究进展，新的细胞外基质分子还在不断诞生，其类型、构型、构像还有更多发现，其功能亦在不断的扩展，构成了一个十分复杂的细胞外基质的网络家族和体系。 细胞外基质虽然来源、成分、分型和功能不同，各司其责，但在结构和功能上，它们又排列有序、疏密相间、相互联结、彼此协同，在细胞间质、组织间隙和器官内，形成各种复杂的相对固定的形式和分层网状结构，形成许多不同的功能结构区域，如在血管，可以形成内膜表面的粘附保护层、内膜下层、基底膜层、内弹力层、外弹力层、血管中层和外层系膜结缔组织等等。每一个结构区域都具有其复杂的成分、结构和各自的功能，形成多重通道、支架、隔栅、巢穴或屏障，保护和调节着血管的完整的功能。细胞外基质来源于器官和组织内的不同细胞。细胞不同，产生和分泌的基质亦不同，如在心脏，肌肉细胞可以产生胶元IV、
?小专论?脂肪组织源性干细胞研究进展3 李惠侠 屈长青 罗 肖 杨公社△ (西北农林科技大学动物脂肪沉积与肌肉发育实验室,陕西杨凌712100) 摘要 增加具有完整功能的种子细胞数目是细胞移植的首要环节。近来研究发现,成体动物脂肪 组织中含有大量的具有多向分化潜能的间充质干细胞,在特定条件下可分化为多种组织细胞,如脂 肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌细胞及神经星状细胞等,且具有极强的自我复制能力,有望成为组 织工程理想的种子细胞。本文综述了脂肪组织源性干细胞(ADSCs)的发现、生物学特性、多向分化 潜能、应用前景及存在的问题。 关键词 脂肪源性干细胞;细胞分化;组织工程 中图分类号Q81 白色脂肪组织在哺乳类动物整个生命过程中始终处于动态变化之中,不仅在机体整个能量调节中发挥重要作用,而且在胰岛素抵抗和2型糖尿病的发病机制中占有重要地位[1]。随着组织工程的迅速发展,Zuk等[2]2001年首次从人脂肪组织中发现了大量类似于干细胞的细胞,这些细胞在合适诱导剂的作用下可向成骨、软骨、脂肪和成肌等细胞分化。这样,对脂肪组织的研究不再局限于脂肪细胞。这些具有多向分化潜能的干细胞被称为脂肪组织源性干细胞(adi pose2derived ste m cells,ADSCs)。 一、AD SC s的发现 2001年以来,随着脂肪基质细胞分离和培养技术的完善,人们发现脂肪组织中除了能向脂肪与脉管细胞分化的细胞外,还存在着一些与骨髓间充质干细胞(bone marr ow mesenchy mal ste m cells,BM2 SCs)相似的具有多向分化能力的细胞。不同文献中,分别命名为抽脂处理细胞(p r ocessed li poas p irate cells,P LA),脂肪基质微管碎片细胞(str omal2vas2 cularfracti on cells,S VF),脂肪组织源基质细胞(adi2 pose2tissue derived str omal cells,ATSCs),脂肪源中胚层干细胞(adi pose2derived mes oder mal ste m cells, ADMSCs)等。这些不一致的名称均指从脂肪组织中分离的、可在体外大量扩增并具有多向分化潜能的细胞。Guilak等(2006)分离了人S VF细胞,然后通过细胞表面标记选择单一来源的ADSCs,传4代单克隆培养扩增细胞。出现45个克隆时在特异性诱导剂诱导下,发现可以向成脂、成骨、软骨和神经原细胞等分化。其中成骨分化率为48%,软骨43%,神经元细胞占52%,12%为脂肪细胞。进一步证明了ADSCs确实有多向分化潜能,是一类重要的成体干细胞。目前已经证实从人、鼠、猪及兔子等不同物种脂肪组织中均可获得这种细胞,本文通称这种细胞为ADSCs。 二、AD SC s的优点及分子标记 从人类医学角度讲,获取ADSCs比BMSCs容易,给患者带来的痛苦小。皮下脂肪切除术是一种普通的外科手术,其安全性高。其次,脂肪组织比骨髓中所含的间充质干细胞(mesenchy mal ste m cells, MSCs)比率大。成纤维细胞集落形成单位(fibr o2 blast oid2like col onies,CF U2F)试验表明,脂肪组织中干细胞数目至少是骨髓的500多倍[3]。我们以鼠和猪为实验动物,胶原酶消化获得大鼠腹股沟及仔猪肩胛部ADSCs,体外培养观察到ADSCs为梭形、呈平行排列;经过多次传代,细胞增殖速度无明显减慢,衰老和死亡细胞所占比例少,表明脂肪组织蕴含丰富的ADSCs。最后,从经济和社会效益看,从脂肪组织中获取ADSCs可将原本认为是废弃物的脂肪,如临床上脂肪抽吸术后的脂肪组织及动物屠宰后废弃的内脏脂肪等变为干细胞库的重要来源,具有极大的经济与社会效益。 一般认为ADSCs与BMSCs具有相似的生物学特性。ADSCs和BMSCs均表达4种通用多向分化潜能干细胞标记CD105、ST RO21、CD166及CD117。其中CD117是一种干细胞因子受体,在全能或多能 3国家重点基础研究发展计划(973计划)(2004CB117506)资助课题 △通讯作者
碳纳米管已经在神经组织工程的几个方面被用于探测和增强细胞的行为，以标记和追踪的亚细胞组分，并研究神经网络的发展和组织。最近的报告表明，碳纳米管能够维持和促进培养细胞的神经元网络的电活动，但它们会影响细胞功能的方法仍然知之甚少。这里，我们表明，用单细胞电生理技术，电子显微镜分析和理论模型，认为碳纳米管提高神经元的形成有可能有利于近端和神经元的末端隔室之间的电快捷细胞膜紧密接触的响应。我们提出了“电紧张假说”来解释细胞与纳米管之间的物理相互作用，以及如何碳纳米管可能会影响培养的神经元网络的集体电活动的机制。这些因素提供了一个视角，使我们能够预测的神经元和碳纳米管之间或工程师的相互作用 Carbon nanotubes have been applied in several areas of nerve tissue engineering to probe and augment cell behaviour, to label and track subcellular components, and to study the growth and organization of neural networks. Recent reports show that nanotubes can sustain and promote neuronal electrical activity in networks of cultured cells, but the ways in which they affect cellular function are still poorly understood. Here, we show, using single-cell electrophysiology techniques, electron microscopy analysis and theoretical modelling, that nanotubes improve the responsiveness of neurons by forming tight contacts with the cell membranes that might favour electrical shortcuts between the proximal and distal compartments of the neuron. We propose the ‘electrotonic hypothesis’ to e xplain the physical interactions between the cell and nanotube, and the mechanisms of how carbon nanotubes might affect the collective electrical activity of cultured neuronal networks. These considerations offer a perspective that would allow us to predict or engineer interactions between neurons and carbon nanotubes. 在这里，我们鉴定了一类新的生物膜离子通道阻断剂称为单壁碳纳米管（单壁碳纳米管）。单壁碳纳米管直径分布最高达到≤0.9和1.3纳米，C60富勒烯，多壁碳纳米管（多壁碳纳米管），和hyperfullerenes（纳米“洋葱”），合成了几种技术和适用于异源表达在哺乳动物细胞中不同的信道类型。外部的，捏造和纯化的单壁碳纳米管受阻K·通道亚单位中的剂量依赖性。堵塞是依赖于所使用的纳米颗粒的形状和尺寸，并不需要任何电化学相互作用。单壁碳纳米管比球形富勒烯更有效，而为两个，直径是决定因素。这些调查结果推断的新用途用于生物应用的单壁碳纳米管和提供意想不到的见解的理事离子通道的相互作用机制当前视图与阻断分子 Here we identify a novel class of biological membrane ion channel blockers called single-walled carbon nanotubes (SWNTs). SWNTs with diameter distributions peaked at 0.9 and 1.3 nm, C60 fullerenes, multi wall nanotubes (MWNTs), and hyperfullerenes (nano-“onions”) were synthesized by several techniques and applied to diverse channel types heterologously expressed
ADSC s 的分离与纯化关于ADSCS勺获取方法很多，但不管哪种方法所得到的并非单一的脂肪干细胞，是一组具有干细胞特性的细胞群。目前应用最广泛的分离方法是酶胶原消化法。首先将无菌条件下切取的脂肪组织块剪成细小的颗粒，PBS夜冲洗干净后，用0. 1%的胶原酶在37C下振荡消化48 90mi n,再用含10%胎牛血清的等体积DME培养基终止。1200r /min离心5~10min,弃上清液及悬浮的脂肪组织，重悬细胞后经过细胞筛过滤，所得细胞按2—4X 105/cm接种于50ml培养瓶内。37C 条件5%的CO饱和湿度培养箱内培养，2d后首次换液，以后3d换液一次，至细胞达70%?8O%融合时用0. 25%胰酶消化，并传代。经过提取获得的以脂肪干细胞为主的细胞群接种后数小时即开始贴壁生长，24h内完成贴壁。细胞的形状与成纤维细胞相似，体积较小，核浆比较大,随后细胞体积渐增大,克隆形成。经传代后,细胞的形态及排列才趋于一致。由于目前尚未发现脂肪干细胞表面存在特异性的分子标记物, 因此无法利用分子表型来分离纯化。然而可通过纯化脂肪组织块来间接达到纯化脂肪干细胞的目的。流式细胞仪检测显示：传至第 3 代时,可达95%以上的细胞纯度。 ADSCS勺生物学特性
ADSC s 的分离与纯化1. ADSCS的鉴定
在ADSCS鉴定上，现阶段尚无特异性鉴定方法。用免疫荧光法和流式细胞术检测结果均显示ADSCs表达特异性分子CD44 OCT一4，E—eadherin ，流式细胞术检测细胞周期显示绝大多数细胞是处于静止期的干细胞，传代后生长迅速，随机挑选来源标本，对细胞进行染色体核型分析显示ADSC具有遗传稳定性。 ADSC分泌多种生长因子 在生理功能方面，脂肪干细胞能分泌相当数量的细胞因子，包括肝细胞生长因子（HGF）、血管内皮生长因子（VEGF）胎盘生长因子（PGF）、转化生长因子一B（TGF- B）、成纤维细胞生长因子（FGF 一2）等，低表达的因子有Ang 一2C。 2. ADSCS的多向分化能力 与骨髓间充质干细胞相比，脂肪干细胞具有储量丰富、取材容易、扩增迅速、不宜衰老、排斥反应低等优点。在特定培养基和特异的诱导剂作用下可分化为特定的体细胞，在组织修复、细胞移植、基因治疗等领域有着潜在价值。 向脂肪细胞分化：在特定培养基中加入一定浓度地塞米松、胰岛素、 吲哚美辛及1 一甲基一3?异丁基一黄嘌呤，3周后发现ADSCS向脂肪细胞分化，可检测出ADSCs表达许多脂肪细胞的特异性标记：脂蛋白脂肪酶、脂肪酸结合蛋白aP2、PPAR—r2、leptin（瘦素）、Glut4（葡萄糖转运蛋白等。镜下观察可见胞内有空泡形成。这些特点是脂
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 骨髓基质干细胞及其应用的研究进展骨髓基质干细胞及其应用的研究进展( 作者： 张秀云发表时间： 2019 年 11 月 ) 【摘要】骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，又称骨髓基质干细胞，是骨髓中非造血实质细胞的干细胞，具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，可分化成多种细胞。 【关键词】骨髓干细胞骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells， MSCs)，又称骨髓基质干细胞，是骨髓中非造血实质细胞的干细胞，具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，可分化成多种细胞。 近来研究表明它可以向三个胚层的多种组织分化，如来源于外胚层的神经元、神经胶质细胞等， MSCs 移植为脑缺血患者开辟了一种新的治疗方法。 本文对MSCs 移植治疗脑缺血的研究综述。 1 骨髓基质细胞的生物学特性 1.1 目前发现至少存在 3 种形态的 MSCs。 Colter 等从培养的人骨髓细胞中分离出 MSCs 后，发现来自单细胞的克隆中除了含有小的梭形和大的扁平 MSCs 外，还有一种非常小的圆形细胞，这种小圆形细胞有更强的折光性，它们比大的 1 / 9
MSCs 能更快分裂、增殖，并且有更强的多向分化潜能，当将 MSCs 放在不同的微环境内时，它们可相应地分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞或成肌细胞等。 MSCs 具有多向分化的潜能，MSCs 经静脉途径或局部注射移植到不同的组织时， MSCs 即可在相应的组织内分化形成该类组织细胞。 1.2 MSCs 的易粘附、易贴壁生长，易增殖特性使得它们经过数次换液和传代后得到分离、纯化。 2 骨髓基质细胞在体外诱导分化为神经元和胶质细胞最近研究发现，在特定的实验条件下可将人、大鼠及小鼠等的MSCs 在体外诱导分化为神经元样和胶质细胞样细胞，Sanchoz Ramos 等发现，表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)或脑源性营养因子(brain-derived neuotrofic factor， BDNF)可诱导人及小鼠的少数 MSCs 分化为神经元样及胶质细胞样细胞，它们表达神经前体细胞的标志物巢素蛋白(nestin)及其 RNA、神经元标记物神经元特异性核蛋白(neuron specific nuclear protein，NeuN)、星形胶质细胞标记物胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein， GFAP)。 将人或小鼠的 MSCs 与胚胎大鼠中脑或纹状体神经元共培养时，部分 MSCs 分化为 NeuN 阳性的神经元样细胞及 GFAP 阳性的星形胶质细胞样细胞，因此，除了可能通过营养因子和细胞因子传递信号外，细胞与细胞的直接接触还可能在 MSCs 的分化中发挥重要作用。 3 MSCS 移植治疗局灶性脑缺血的可行性及原理
BD BioCoat TM细胞外基质 细胞与细胞外基质的相互作用对细胞行为的调节起着重要的作用，可促进细胞的增殖与分化。BD的不同细胞外基质成分为细胞提供模拟体内的细胞环境，可用于细胞的形态、生化功能、迁移或侵袭及基因表达等研究。 BD Matrigel TM基底膜基质 促进多种细胞的分化 形成基底膜三维胶质结构 提高人肿瘤细胞在裸鼠上的生长速度 建立评估肿瘤细胞侵袭能力的模型 BD Matrigel是从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中提取出基底膜基质，其主要成分有层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。在室温条件下，Matrigel聚合形成具有生物学活性的三维基质，模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于体外细胞的培养和分化，可用于对细胞形态、生化功能、迁移、侵染和基因表达等的研究。 BD Matrigel基底膜基质形成的三维培养基质，可促进上皮细胞、肝细胞、Sertoli细胞、黑色素瘤细胞、血管内皮细胞、甲状腺细胞及毛囊细胞等的贴壁与分化。同时，Matrigel还能影响乳腺上皮细胞的蛋白表达，支持外周神经的新生和牛输卵管上皮细胞的分化。 不同配方的BD Matrigel可以满足不同的实验要求。低生长因子（GFR）的Matrigel基底膜基质适用于对基质成分要求严格的实验，如细胞信号通路和细胞因子的研究等。不含酚红的Matrigel适用于荧光检测或显色反应等分析。高浓度的Matrigel适用于研究血管生成、肿瘤细胞迁移和体内肿瘤模型的建立等。 产品描述数量特点货号报价 5ml标准型356234 1880 BD Matrigel TM基质基底膜 BD Matrigel TM Basement Membrane matrix 10ml354234 3320 5×10ml356235 14940 10ml高浓度（HC）354248 5200 10ml标准型356237 3360 BD Matrigel TM基底膜基质，无酚红 BD Matrigel TM Matrix Phenol Red-free 10ml高浓度（HC）354262 6000 5ml标准型356230 2560 BD Matrigel TM基底膜基质,低生长因子 Growth factor reduced(GFR)Matrigel matrix 10ml标准型354230 4608 10ml高浓度（HC）354263 6320 BD Matrigel TM基底膜基质,GFR，无酚红10ml标准型356231 3600 来源：EHS小鼠肿瘤
大鼠的骨髓间充质干细胞提取 第一步，SD大鼠麻醉处死，75%乙醇皮肤消毒，无菌条件下迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉，取股骨及胫骨，浸泡在PBS中。 心得体会：①鼠龄4周，重量在160-200g之间的雄性SD大鼠。老鼠太老了，骨髓都分化的太厉害，没有年幼老鼠的骨髓这么有活力。雌的也行，但是雌的比较厉害，咬人。Wistar 大鼠行不行，也行，但是就品种而言，SD的生存力更强大。 ②我个人认为引颈处死不人道。麻醉药品为氯胺酮、安定、阿托品各一支混到一起，腹腔麻醉，保证30秒老鼠躺倒，安乐死。如果你水平够高，可以直接用注射器抽取心脏内的血液，可以减少手术中老鼠出血较多而影响术野不清的问题。 ③老鼠的两支前肢取下来也行，但老鼠太小，前肢更小，如果你的确需要大量的细胞取下来也无妨。浸泡的15ml的一次性离心管中（也可以用培养皿），管中提前加好含有青链霉素的PBS 10ml就行了，青链霉素的浓度为500U／ml，这样是区别于生长液中青链霉素浓度，组织抑菌是200-500U／ml，生长液抑菌是20-100U／ml。就当初步的消毒吧！ ④整个手术过程要快，一般控制在20分钟之内，时间长了，骨髓会凝，不利于后期的冲洗。老鼠浑身都是宝，可以叫上研究脂肪的，嗅鞘的，心肌的其他人员一起来，把剩下不要的老鼠尸体给别人，做实验要巧花钱。一般老鼠一条腿的一根股骨就够种在一个60mm的皿里了，具体根据个人经验而言。 第二步，⑴将装有骨头的离心管置于紫外线下消毒30分钟后移至超净台，倒掉PBS后，再用含青链霉素的PBS清洗骨头三遍。 ⑵去掉骨头两侧的骨骺端，暴露出骨髓腔，用5ml的一次性注射器吸取5.2ml的细胞生长液，用针头插到骨头的一端冲洗，然后换另一端接着冲。将骨髓冲出的细胞生长液至60mm 培养皿中（皿最好倾斜45度），冲洗数次直至将绝大部分骨髓冲出。 ⑶换1ml注射器的针头，反复在培养皿中吹吸细胞悬液2-3次后再全部吸到无菌容器中，大约此时的细胞悬液为5ml。 心得体会： ①离心管中得骨头要用无菌的镊子夹取，放到一次性培养皿的皿盖上，皿是用来承装细胞悬液的，这样可以节省一个皿。 ②5.2ml的细胞生长液经过冲骨髓后或多或少都会有一些残留在骨髓中，所以到最后可能就剩下5ml细胞悬液了，甚至更少，如果不够5ml，可以加至5ml，这样是方便你计数用的。冲洗的过程中以骨腔颜色变白为标准，基本3-4次就差不多。培养皿倾斜45度是为了在冲洗和吹打过程让较大的杂质停留，方便去除的，相对保持细胞悬液的清晰度。 ③换用1ml的针头是为了能更好的打散细胞，当然这个过程要轻柔，避免用力破坏细胞。无菌容器最好是光滑的，因为在转移细胞悬液的时候会存在细胞的丢失，临床上经常使用的抗生素瓶子就非常好用，但是要经过严格的清洗和消毒。 ④以上的细胞生长液5ml具体配制为 DMEM(90%)+胎牛血清(10%)+L-VC(忽略不计)+青链霉素(忽略不计) 低糖DMEM液（含有glutamine的，Gibco公司的，500ml一瓶，大约60元）浓度90%，5ml细胞生长液中大约需要4.5ml