第五章酶与细胞固定化技术

第五章酶与细胞的固定化技术

教学目的：使学生了解并掌握固定化酶（细胞、原生质体）的概念及意义，掌握酶的常用固定化技术，了解固定化酶的性质。

教学重点、难点：固定化酶（细胞、原生质体）的范畴，各种固定化技术。固定化酶（细胞、原生质体）的范畴,半透膜包埋法。

教学方法：讲授

教学手段：多媒体

第一节概述

一、游离酶使用中的局限性:

1.提取纯化繁琐,价格昂贵

2.难以重复使用

3.稳定性差

二、固定化酶研究

克服游离酶缺点的方法之一

50年代开始

60年代后期，固定化技术迅速发展

1969年，千田一郎首次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL-AA连续生产L-AA实现酶应用史上的一大变革

三、基本概念

1、固定化酶（1971第一次国际酶工程学术会议）

（Immobilized Enzyme)

指在一定空间范围内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复利用。包括酶与不溶性载体结合的“固相酶”“水不溶性酶”及包埋在凝胶或超滤装置中的酶。

2、固定化细胞（原生质体）

指被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定空间范围内，但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力。

四、固定化酶优点

增加了酶的稳定性

能降低酶的总体费用

酶的分离和回收变得容易，并可重复使用

使反应过程的连续操作成为可能

反应产物也易于提取纯化

有利于过程设计和优化

拓广了酶的应用范围（多酶系统的酶反应，非水相酶反应，生物传感器探头等）

第二节、酶的固定化方法

一、酶的固定化方法

1、酶的固定化方法（四大类方法）

1）吸附法

2）包埋法

3）交联法

4）化学共价法

其它（酶的逆胶束包囊法）

一、酶的固定化方法

2、选择方法依据：

⑴酶的性质

⑵载体的来源、价格、机械性能、载体的功能基团和交联度等

⑶制备方法简便易行

⒊衡量依据：

⑴测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回收率；

⑵研究它的最适反应条件（底物浓度、pH 值、温度、离子强度等）；

⑶稳定性和不稳定原因的探究；

⑷对酶进行人工修饰，使其与载体的结合达到较为理想的构型和相容性。

（一）吸附法

1、原理：主要是利用细胞与载体之间的吸引力（范德华力、离子键和氢键），使细胞固定在载体上，常用的吸附剂有玻璃、陶瓷、硅藻土、多孔塑料、中空纤维等。

此外还可利用专一的亲和力来固定细胞，例如伴刀豆球蛋白Ａ与ａ一甘露聚糖具有亲和力，而酿酒酵母细胞壁上含有ａ一甘露聚糖，故可将伴刀豆球蛋白Ａ先连接到载体上，然后把酵母连接到活化了的伴刀豆球蛋白上。

2、酶材料：酶或结合在菌体（死细胞）及细胞碎片上的酶或酶系。

3、优缺点：操作简便，条件温和，不会引起酶的变性失活，载体廉价易得，且可反复利用；

缺点是蛋白质与载体之间的结合相当弱,而且很多情况下,酶的非特异性吸附常常会引起部分或全部失活,高浓度的盐溶液或底物溶液又将加速蛋白质的脱附.因此当要求酶的固定绝对牢靠时,采用吸附法是很不可靠的.

4、常用吸附剂

各种矿物质以及无机载体(氧化铝，氧化铁，氧化钛，硅藻土，多空陶瓷，多空玻璃，羟基磷灰石等)，及天然高分子载体淀粉、白蛋白等，最常用的吸附剂是离子交换剂羧甲基纤维素，DEAE----纤维素、DEAE----葡萄糖，合成的阴离子和阳离子交换剂离子交换剂主要靠静电吸引，缺点是当离子强度增加或介质的pH、温度变化时，这种结合发生分解。

5、举例：

将伴刀豆球蛋白A-琼脂糖4B 50ml（在10mM PBS pH 7.4 含0.5M NaCl,1mM CaCl2和1mM MnCl2）与酶液(10mg/ml) 5ml,在4℃，搅匀过夜，便成琼脂糖复合物，用10mM NaAc pH4.5（1mMCaCl2 和1mMnCl2）充分洗涤，直至测不出活性为度，最后再悬浮于10ml NaAc PBS 中备用。

（二）包埋法

1、概念：指将酶或含酶菌体包埋在各种多空载体中，使酶固定的方法。可分为凝胶包埋法

（网格型）和半透膜包埋法（微囊型）两种。

2、优缺点：一般不需酶的AA残基进行结合反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高；

缺点是包埋时发生化学聚合反应，酶易失活，须巧妙设计反应条件。另外网格结构影响底物和产物的扩散，有时，这种扩散会导致酶动力学行为的改变，所以此法只适合于小分子底物和产物的酶。

3、海藻酸盐包埋法

海藻酸钠与Ca2+,Mg2+,Al3+等多价离子间的转移凝胶作用,形成固定化细胞颗粒

缺点:

在高浓度电介质（K+,Na+）溶液中,固定化颗粒变得不稳定.

Ca2+等多价离子在磷酸缓冲溶液中易形成沉淀,固定化颗粒溶解

优点:

海藻酸盐价格便宜

包埋条件温和

4、角叉菜糖包埋法

K-角叉菜是一种含有许多硫酸根基团的多糖化合物.在K+离子存在下，它能立即生成凝胶.

缺点:

对高浓度的Na+离子敏感

固定化温度高,需要在37℃~55℃

5、聚丙烯酰胺凝胶

在含酶(或细胞)的水溶液中，加入一定比例的单体丙烯酰胺和胶联剂N,N’-甲撑双丙烯酰胺.然后在催化剂(二甲氨基丙腈)和引发剂(过硫酸钾)的作用下低温(冰浴)聚合,形成凝胶

缺点:

丙烯酰胺对酶具有变性作用

6、聚乙烯醇（PVA）包埋法

磷酸盐硬化法,循环冷冻法,硼酸硬化法

硼酸硬化法:

将聚乙烯醇在70℃~ 80℃进行水浴加热至完全溶解,然后冷却至35℃,与酶溶液(细胞悬浮液)混匀,滴加到饱和硼酸溶液中

优点:

原材料价格便宜

条件温和

无毒害作用

循环冷冻法

硼酸硬化法

7、半透膜包埋法

7.1 界面沉淀法

利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成被膜将酶包埋。

操作：酶液在油溶性表面活性剂存在下在水不互溶的有机相中乳化形成油包水的微滴，再将溶于有机溶剂的高聚物加入乳化液中，然后加入一种不溶解高聚物的有机溶剂，使高聚物在油-水界面上沉淀析出，形成膜将酶包埋，最后在乳化剂帮助下由有机相移入水相。

7、半透膜包埋法

7.2界面聚合法

利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合的原理包埋酶。

例:

将含10%血红蛋白的酶液与1，6己二胺的水溶液混合，立即在含1%司盘-85的氯仿-环己烷中分散乳化，再加入溶于有机相的葵二酰氯后，便在油-水界面上发生聚合反应，形成尼龙膜，将酶包埋。

（三）交联法

基本原理：酶分子和多功能试剂之间形成共价键得到三向的交联网架结构，以戊二醛使用最广泛OHC（CH2）3CHO，使载体的氨基和酶蛋白中的氨基交联形成席夫碱（基）Shiff 碱将酶固定化。含氨基的载体，可用氯乙基纤维素（纤维素-OCH2CH2NH2），二乙氨乙基纤维素（DEAE-纤维素）。双功能试剂除了戊二醛外，还有乙撑二异氰酸酯OCN（CH2）6NCO。交联剂的特点：①带有二个以上的功能基团。②反应比较剧烈条件比较严格。③操作方便，活力回收不高。

固定化分两步进行，第一步形成可溶性分子间交联络合物，第二步是快速反应导致固化。交联法有5种形式：

①酶直接交联法

在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH 和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。此法操作简单，一种多功能试剂可制备许多酶衍生物，但缺乏选择性，难于避免分子内交联，活力回收往往不高。

②酶辅助蛋白交联：为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起失活，可使用第二个“载体”蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联。实用中，当酶蛋白、无酶活性蛋白与戊二醛混合（戊二醛最终浓度0.7%）后，混合液粘度开始提高时，立即铺膜，或者在酶蛋白戊二醛与辅助蛋白混合后，经-30℃低温处理，再预热至4℃而得泡沫状蛋白质共聚物。这种固定化酶为多孔性，活力回收比酶直接交联高，机械性能也有改进。

③吸附交联法：先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联。用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。此法用于胞外酶的固定化较好，尤其是从发酵液和粗酶制剂中直接固定化时，载体的选择性吸附有一定纯化作用，而酶分子之间的共价交联又保证酶分子紧紧地结合于载体上，而且酶分子仅存在于载体表面，使固定化酶与底物接触良好。由于载体本身有较好机械性能，所以产生的固定化酶装柱流动性能好，缺点是必须保证酶吸附在载体上。

④载体交联法：

用多功能试剂的一部分功能基团化学修饰高聚物载体，而其中另一部分功能基团偶连酶蛋白。也可利用多功能试剂的一部分功能基团与一种聚合物的单体反应，反应后再与酶一起共聚。

⑤交联包埋法：

把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合体，然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。这样避免颗粒太细的缺点，同时制得的固定化酶稳定性好

戊二醛交联法

缺点：

双功能基团试剂与酶蛋白的交联作用，常引起蛋白质高级结构的改变，使酶失活。

为了避免或减少酶在交联过程中失活，可在被交联的酶蛋白溶液中添加一定量的辅助蛋白。

（四）化学共价法

1、概念

所谓共价法就是使酶蛋白的非必需基团（-NH2,-OH,-COOH,-SH,酚基，咪唑基，吲哚基）通过共价键和不溶性载体形成不可逆的联接。要使载体与酶形成共价键，必需首先使载体活化，接上一活泼基团，再与酶反应

2、用于共价法固定的酶蛋白上的功能基团:

1）氨基-赖氨酸上的ε-氨基以及多肽链N末端氨基酸上的α- 氨基;

2）羧基-双羧基氨基酸:门冬氨基酸和谷氨酸上的游离羧基,以及多肽链末端的α- 羧基;

3）酪氨酸上的苯酚环;

4）半胱氨酸上的巯基;

5）羟基-丝氨酸,苏氨酸以及酪氨酸上的羟基

6）组氨酸上的咪唑基;

7）色氨酸上的吲哚基

其中以氨基和羧基为最常用

3、一般认为共价法的特点如下：

①酶和载体的结合比较牢固，酶不易脱落。故使用的半衰期较长。

②制备条件复杂，反应剧烈，易引起酶蛋白高级结构发生变化。

③制备得到的固定化酶，活力回收一般在50%左右。

④载体不会引起蛋白质的变性，经得起一定的pH，浓度的改变。

4、常用载体

⑴天然高分子。如纤维素，葡聚糖凝胶（Sephadex），琼脂糖（Agarose Sepharose），卡那胶，淀粉以及它们的衍生物。（利用-OH）

⑵人工合成的高聚物，如聚丙烯酰胺，聚苯乙烯，聚乙烯醇，氨基酸共聚物等。（利用-NH2）

⑶无机载体，如多孔玻璃，硅胶等。（要加上一个基团）

5、技术要点

⑴将所选用的载体上的有关基团活化，然后和酶蛋白上有关基团发生偶联反应。（直接

活化或另接一反应基团）

⑵在选用的载体上接上一个双功能试剂，然后将酶蛋白和双功能试剂偶联。（接手臂）

6、分类：

⑴重氮法；⑵叠氮法；⑶缩合法；

⑷烷化反应法；⑸硅烷化反应法；

⑹溴化氰法。

⑴重氮法

目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等，用这些载体制备了不少固定化酶。

方法原理如下：

①用双功能试剂β - 硫酸酯乙砜基苯胺（SESA），连接于被活化（-OH）的纤维素等载体上制备成ABSE-纤维素，琼脂糖等。

②在盐酸和亚硝酸钠处理下把ABSE-纤维素变成重氮盐。

③把酶偶联于ABSE-纤维素上

⑵叠氮法

是在酶分子与载体间形成肽键的固定化方法。

主要是含羧基载体，转变成酰基叠氮氯化物，异氰酸盐等活化形态的衍生物，然后与酶的游离氨基反应，从而形成肽键。

例：用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白酶，步骤如下：⑴酯化：CM-纤维素依次用水、乙醇、乙醚洗涤干燥，然后悬于无水甲醇中，在冰浴中通入HCl 气体，进行酯化反应；最后用甲醇、乙醚洗涤，空气干燥。⑵肼解:把酯化后的CM-纤维素悬于甲醇中，再加入80%水合肼回流反应1 小时，过滤，甲醇洗涤干燥。⑶叠氮化:肼解后的CM-纤维素（1g）加入150ml 2% HCl 在冰浴中混合，搅拌滴加9ml 3% NaNO2反应20min，过滤用冷蒸馏水洗涤，同时加酶，防止戊二醛的另一醛再与载体上另一个

-NH2反应。(4) 偶联：经叠氮化后的载体加入0.05N pH 8.0 磷酸缓冲液（内含250-500mg 酶），5℃搅拌2-3 小时，过滤用0.001N HCl，水洗涤，即为固定化胰蛋白酶（冻干保存）

⑶缩合法（对含-NH2,-COOH 载体的另一种方法）主要利用具有羧基或氨基的载体，加入到酶液中，在缩合剂碳化二亚胺（双环己基碳酰胺）作用下，使载体的羧基或氨基和酶蛋白上的NH2 或COOH 形成肽链而被固定。

含羧基的载体有羧甲基纤维素，羧甲基交联葡聚糖等。

含氨基的载体有氨乙基纤维素，多孔玻璃氨基硅烷衍生物。

⑷烷基化反应法。将含有卤素官能团试剂与非水溶性的纤维素载体进行烷化反应，然后和酶进行偶联制得固定化酶。一般常用三氯三嗪基试剂活化纤维素，然后偶联酶（交联葡聚糖，琼脂糖，多孔玻璃等）。

⑸硅烷化法：多孔玻璃特点：①机械强度好，表面积大。②耐有机溶剂和微生物破坏。

载体可以再生，寿命长等。

一般常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。

这些多孔玻璃的孔径在250～1000 埃之间，含SiO2 96%，由于粒度很细，每1 克所拥有的表面积达100 平方米（氧化钠，氧化硼，氧化硅经热处理原子重组而成，是优良载体，但必须加以改造）。

本法进行酶的固定化可分三个步骤：①将本体接上一个结合剂（也即硅烷化）；②接上功能基团；③把酶共价结合于载体。

⑹溴化氰法-异脲键合法

本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数（大孔网状结构）。用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶

目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。

上述这些载体在高pH 条件下（pH11 左右），溴化氰和多糖一类物质形成一种环化的活泼的亚氨碳酸盐，该化合物对蛋白质上的NH2反应十分敏感，生成N-取代异脲，N-取代亚氨碳酸酯和N-取代氨基甲酸酯。其中主要产物为N-取代异脲，反应式如右：

例：胰蛋白酶的固定--均在4℃时进行。

⑴活化：称取琼脂糖凝胶100mg（Sepharose 4B），用0.5M NaCl 和H2O 洗涤，除去保护剂和防腐剂，然后按1ml 沉淀凝胶加入50～300mgCNBr。立即用2N NaOH 调pH 值10～11，维持pH 值11，pH 值不再下降，直到反应终止。反应在25℃通风橱内进行，反应仅需10 分钟，这样CNBr 将载体全部活化，生成活泼的亚氨碳酸盐。反应完毕后，用冰水和冷0.1MpH9.5 NaHCO3洗涤（注意：切忌用带有-NH2基的缓冲液来洗涤，因为亚氨碳酸盐对NH2-敏感，在酶偶联时，活性部位被NH2占领，酶偶联不上），去除多余CNBr 和杂蛋白。

⑵偶联：用偶联缓冲液（0.025M pH 10.2 硼酸缓冲液-0.02M CaCl2或NaHCO3平衡洗涤，抽干，加入5ml 缓冲液（内含16mg 酶）温度降至4℃，搅拌反应4 小时，最后分别用0.1M pH8.5 硼酸缓冲液-1M NaCl 洗涤即成10.2M pH 4.0 醋酸缓冲液去除各种杂质

第三节细胞的固定化方法

一、吸附法

同酶的方法，（1）酵母细胞带负电荷，在pH3-5的条件下能吸附在多孔陶瓷或多孔塑料等载体表面，制成固定化细胞（2）霉菌的菌丝可吸附在多孔塑料、金属丝网等载体上来固定化（3）植物细胞可吸附在中空纤维外壁上固定化（4）动物细胞大多具有附壁生长特性，须依附在固体表面才能生长，可吸附在容器壁，微载体（颗粒细小的载体，直径100-200um

）和中空纤维外壁等载体上来固定（培养液在中空纤维内流动）。

二、包埋法

同酶包埋法

例：海藻酸钙-聚赖氨酸（ALG-PLL）包埋技术

动物细胞先用海藻酸钙凝胶包埋→聚赖氨酸处理，使胶粒外层包上一层聚赖氨酸薄膜→柠檬酸钠溶液处理，使海藻酸钙凝胶溶解→聚赖氨酸膜包被的近乎透明的微囊型固定化动物细胞。

三、原生质体固定化

可解决胞内酶的生产

利于氧的传递，营养成分的吸收

一般采用凝胶包埋法

包括原生质体的制备和固定两个步骤

1 原生质体的制备

要求：保持膜的完整性，不能使细胞内部的结构遭到破坏

制备：对数期细胞的收集→高渗溶液中加酶破壁→分离除去细胞碎片、完整的细胞及酶（密度梯度离心）→原生质体

2 原生质体的固定

原生质体→等渗缓冲液中配成一定浓度的原生质体悬浮液→凝胶包埋

角叉菜胶固定化

含渗透压稳定剂的缓冲液与角叉菜加热溶解配成3%-8%的凝胶→灭菌→冷却到50℃左右与等体积的原生质体悬浮液混合均匀→滴入到一定浓度的预冷的氯化钾溶液中→球状的固定化原生质体

2 原生质体的固定

光交联树脂固定化法

用含有渗透压稳定剂的缓冲液配制30%-60%浓度的光交联树脂预聚体，加热溶解后，在50℃左右，加入1%光敏剂，与等体积的原生质体悬浮液混合均匀，摊成薄层，经紫外光照射2-3mm，聚合后切成一定形状的小块，制成片状的固定化原生质体。

第四节固定化酶的评价

一、相对酶活力

具有相同酶蛋白量的固定化酶与游离酶活力的比值称为相对酶活力,它与载体的体结构、颗粒大小、底物分子量大小及酶的结合效率有关。相对酶活力低于75%的固定化酶,一般没有实际应用价值。

二、酶的活力

固定化的单位定义为：转化底物的量/固定化酶的单位重量（单位面积）/单位时间,单位是：μmol/mg(cm2)/min。

将酶进行固定化时,总有一部分酶没有与载体结合在一起,测定酶的活力回收率可以确定固定化的效果。

活力回收=固定化酶总活力/被固定化游离酶总活力×100%，或称偶联效率、活力保留百分数。

一般情况下,活力回收率应小于1,若大于1,可能由于固定化活细胞增殖或某些抑制因素排除的结果。

三、固定化酶的半衰期

即固定化酶的活力下降为初始活力一半所经历的时间。它是衡量固定化酶操作稳定性的关键，其测定方法与化工催化剂半衰期的测定方法相似,也可以通过长期实际操作,也可以通过较短时间的操作来推算。

第五节固定化酶的性质

一、酶活力的变化

固定化酶的活力在多数情况下比天然酶的活力低，专一性也可能发生变化，其原因可能是：①酶的构象的改变导致了酶与底物结合能力或催化底物转化能力的改变；②载体的存在给酶的活性部位或调节部位造成某种空间障碍，影响酶与底物或其他效应物的作用；③底物和酶的作用受其扩散速率的限制。在个别情况下，固定化酶由于抗抑能力的提高使得它反而比游离酶活力高。

二、酶稳定性提高

酶稳定性包括热稳定性、对各种有机试剂的稳定性、对pH的稳定性、对蛋白水解酶的抗性及储存稳定性等。

三、最适pH值的变化

酶固定化后，催化底物的最适pH值和pH活性曲线常发生变化，引起变化的因素主要有两个

1、载体带电性质：载体带负电荷时，会吸引反应液中的H+，致使酶附近反映区域pH比周围反应液低，须提高反应液pH；反之，降低反应液pH。

第五节固定化酶的性质

2、产物性质：由于载体的扩散障碍，产物为酸性时，产物积累在固定化酶所处的催化区域内，使此区域的pH降低，须提高须提高周围反应液pH；反之，降低周围反应液pH。

四、最适温度的变化

一般情况下，固定化后的酶的最适作用温度与游离酶差别不大，但有时由于固定化方法和载体的影响，固定化酶的最适作用温度可能降低，也可能升高，须加以注意，最适温度提高是有利的，可以降低酶的失活速率。

五、动力学常数的变化(随载体性质变化)：

由于分配效应：ρ=[Si]微环境/[S]宏观环境

对简单的固定化酶系统，其动力学性质一般服从米氏方程：

⑴载体与底物带相同电荷，[Si]<[S],则ρ<1,Km’>Km 固定化酶降低了酶的亲和力。

⑵载体与底物电荷相反，静电作用，[Si]>[S]，ρ>1,Km’

六、底物特异性：对于作用于小分子底物的酶，变化不明显；但对于可作用于小分子底物又可作用于大分子底物的酶来说，由于载体空间位阻作用，大分子底物难以接近酶分子而使催化速度大大降低，如固定在羧甲基纤维素上的胰蛋白酶，对二肽或多肽作用保持不变，对酪蛋白的作用仅为游离酶的3% 左右。

第六节固定化辅酶

一、辅酶固定化的意义

辅酶类物质是一些“全酶”的组成成分，参与催化反应。同时当其与某些高分子物质结合时，可以大大提高催化效率。因此，将其固定化，一方面是固定化酶的必需，另一方面，固定化酶可以提供亲和色谱的吸附剂。此外，还可能为研制“人工酶”提供实验模型，甚至可以将某些酶的催化性质加以改变，例如改变其底物特异性和热稳定性。

辅酶物质固定化一般采用共价偶联法，或将其进行适当的化学修饰后进行包埋。酶常用的固定化载体，有琼脂糖、纤维素、合成高分子材料及微孔玻璃等不溶性物质；也有用葡聚糖、

聚氨基酸或聚乙烯胺等不溶性材料的，还有用海藻酸的。固定化反应常用重氮化反应，卤代烷基化反应和

BrCN反应等。

二、按作用机理可将辅酶分成二大类

⑴辅基型辅酶（酶内传递）：它与酶结合牢固，难以解离，是酶活性中心的组成部分，在反应终止时再生成原形。

⑵底物型辅酶（酶间载体）：它与酶结合不牢固，容易解离，在酶反应中它由酶Ⅰ从底物AX 接受还原单位或化学基团X，转移到酶Ⅱ，然后将X 传递给底物B 后再生成原形。因此，可将它看作是一种特殊的共同底物。

三、需辅酶的酶的亲和固定化

需辅酶的酶，其酶蛋白和辅酶之间，有较强的亲和力，因此这类酶的固定化，可以用溴化氰活化法或重氮化法或烷基化法，直接将酶蛋白共价结合于载体。为维持正常的催化作用，必需不断向反应系统补充辅酶，另一种方法是将辅酶固定化，然后将酶蛋白亲和吸附上去。

四、保留辅因子方法

1、在系统中不断加入辅因子

2、固定化增殖细胞加入法

3、固定化酶辅因子方法

4、加入辅因子共价结合法。

附：固定化酶与生物传感器

近年来，生物传感器的发展非常迅速，它是用生物活性物质作敏感器件，配以适当的换能器所构成的分析工具可分为: 酶传感器，微生物传感器，免疫传感器，场效应晶体管传感器。

酶传感器是间接型传感器，利用酶的催化作用，在常温、常压下将各类生物分子氧化或分解，然后通过测定与反应有关物质的浓度，进而换算成相应物质的浓度。目前，国际上已研制成功的酶传感器有几十种，其中最为成熟的是葡萄糖传感器。

第五章习题

1、固定化酶、固定化细胞（原生质体）

2、酶固定化的方法有哪些？

3、为什么要进行原生质体固定化？

4、界面沉淀法和界面聚合法固定化酶的原理。

5、举例说明酶传感器的工作原理？

6、评价固定化酶的指标有哪些？

7、简述固定化酶的性质。

如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！

各种酶固定方法

一、D380(功能基团为伯氨基)为载体戊二醒交联固定化α一淀粉酶 1、固定化载体的预处理 吸附树脂采用乙醇、丙酣、蒸馏水交替处理，最后用蒸馆水冲洗至中性备用；离子交换树脂先用蒸馆水漫泡胀润、去杂，然后用 HCl 、NaOH 交替处理，最后用蒸锢水冲洗至中性，置于 4 "C冰箱保存备用。 2、载体选择 取处理后载体(湿态)约1.0g，分别加入 20mL 酶液摇匀，在摇床上室温 (25°C摄氏度),100r/min 振摇，过夜(12h)，弃去上清，并以磷酸缓冲液反复洗涤至洗涤液中无蛋白检出。分别测定固定化酶和上清液的酶活，并计算固定化得率。根据其酶活和得率进行筛选。 ３、固定化条件的优化 取处理后载体(湿态)1.0g左右，加入一定量戊二醒，在摇床上定温(25°C) , 100r/min 振摇一定时间，弃去上清，蒸馏水反复冲洗至无戊二醛残留。处理后加入酶液进行固定化，条件同载体选择。 4、蛋白质含量测定 采用 Bradford 的方法，以牛血清蛋白为标准曲线。 5、酶活收率 指实际测定的总的固定化酶活与固定化时所用的全部游离酶活之比。 6、酶活测定 以 20.0mL 的 2% 可溶性淀粉为底物，加入 5.0mL 的缓冲液。在

60 °C预热 5min 后加入适量固定化酶或稀释至适当浓度的酶液，准确反应 5min 后，立即取出1.0mL 反应液置于稀腆液5.0mL 中摇匀显色。以稀腆液为空白，于 660nm 波长下测定其吸光度值。 二、D301 树脂固定化假丝酵母脂肪酶 1、固定化载体及其预处理 选择 7 种工业应用广泛的吸附和离子交换树脂： D301、D113、AB-8、D3520、D4020、D290、D280, 购自南开大学化工厂。其中 D301 为大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂,D113 为大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂, AB-8、D3520 和 D4020 为大孔吸附树脂, D290 和 D280 为大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。大孔吸附树脂: 采用乙醇、丙酮、蒸馏水交替处理,最后用蒸馏水冲洗至中性备用; 阳离子交换树脂:将树脂用水洗至流出清水后,用 2%-4% NaOH 浸泡4-8h 后用水洗至中性,再用 5%盐酸浸泡 4-8h,用水洗至 pH=6,待用;阴离子交换树脂:将树脂用水洗至流出清水后,用 5%盐酸浸泡 4-8h 后,用水洗至 pH=6,再用 2%~4%NaOH 浸泡 4~8h,用水洗至 pH 7-9,待用。 2、脂肪酶的固定化 采用单因素对比试验分别进行载体选择、5%戊二醛溶液的加入量、酶液浓度、pH 环境和反应时间等条件的优化试验。称取一定量脂肪酶粉溶解于 100 mL 设定 pH 值的磷酸缓冲液中,并倒入 250 mL 具塞三角烧瓶中, 再加入设定量的载体,在 5 °C-8 °C 低温冷却液循环

酶固定化方法及载体特性

酶固定化一般方法及载体特性 酶是重要的生物催化剂，具有专一性强、催化效率高、无污染、反应条件温和等特点，在制药、食品、环保、酿造、能源等领域都得到了广泛的应用。但在实际应用中，酶也存在许多不足，如大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活，不够稳定；与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用，这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产；并且分离纯化困难，也会导致生产成本的提高等。固定化酶（immobilized enzyme）这个术语是在1971 年酶工程会议上被推荐使用的。随着固定化技术的发展，出现固定化菌体。1973年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。固定化酶技术为这些问题的解决提供了有效的手段，从而成为酶工程领域中最为活跃的研究方向之一。 1酶固定化的传统方法 关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研究、改进，酶载体推荐创科催化酶载体树脂。 1.1 吸附法 吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。显著特点是：工艺简便及条件温和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶失活后可重新活化，载体也可再生。但要求载体的比表面积要求较大，有活泼的表面。 1.2包埋法 包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子结构或微囊结构等多空载体中，而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接触。这个方法比较简便，酶分子仅仅是被包埋起来，生物活性被破坏的程度低，但此法对大分子底物不适用。 1)网格型 将酶或包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法。 2)微囊型 把酶包埋在由高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。

2017高考生物一轮复习教案：专题27考点二 固定化酶和固定化细胞 含解析 精品

考点二固定化酶和固定化细胞 基础点 1固定化酶 (1)应用实例——果糖生产：葡萄糖异构酶将葡萄糖转化为果糖。 (2)固定化酶技术：将酶固定在颗粒状的载体上，再将酶颗粒装到反应柱内，反应柱底端的孔应满足酶颗粒无法通过而反应溶液可以自由通过。 2固定化细胞技术 (1)概念：利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。 (2)方法：包埋法、化学结合法和物理吸附法。 (3)制备固定化酵母细胞的操作流程：酵母细胞的活化→配制0.05 mol/L CaCl2溶液→配制海藻酸钠溶液→海藻酸钠溶液与酵母细胞混合→固定化酵母细胞→冲洗→发酵。 重难点 1制备固定化酵母细胞及用固定化酵母细胞发酵 2直接使用酶、固定化酶和固定化细胞的比较

易错警示(1)固定化技术对酶的影响：固定化酶改变了酶的存在状态，不改变酶的特性，因此利用固定化酶仍要严格控制温度、pH 等环境条件，以利于酶发挥作用。 (2)正确理解固定化酶的优点：固定化酶能够连续使用，但不是永久使用。酶是具有生物活性的大分子，因此随着使用次数的增多，酶活性也会降低，如果酶活性降低到一定程度，就会失去使用价值。 1．思维辨析 (1)反应产物对固定化酶的活性没有影响。( ) (2)固定化细胞可以催化各种反应底物的一系列反应。( ) (3)从酶的固定方式看，物理吸附法比化学结合法对酶活性影响小。( ) (4)将海藻酸钠凝胶珠用无菌水冲洗，目的是洗去CaCl 2和杂菌。( ) (5)刚溶化的海藻酸钠应迅速与活化的酵母菌混合制备混合液。( ) (6)利用固定化酵母细胞进行发酵，糖类的作用只是作为反应底物。( ) 答案 (1)× (2)× (3)√ (4)√ (5)× (6)× 2．酶在大规模产业化应用中的核心问题是固定化技术，而酶固定化所依据的基本原理在于酶具有( ) A ．热稳定性 B ．催化高效性 C ．催化特异性 D ．可反复使用性 答案 D 解析 固定化酶是利用物理或化学方法处理水溶性的酶使之变成不溶于水或固定于固相载体的但仍具有酶活性的酶衍生物。在催化反应中，它以固相状态作用于底物，反应完成后，容易与水溶性反应物分离，可反复使用。固定化酶不但仍具有酶的高度专一性和高催化效率的特点，且比水溶性酶稳定，可较长期使用，具有较高的经济效益。

第 三 章 酶(试题与答案)

第三章酶 【测试题】 一、名词解释 1．酶13．最适pH 2．固定化酶14．不可逆性抑制 3．同工酶15．可逆性抑制 4．酶的特异性16．激活剂 5．酶的活性中心17．抑制剂 6．酶原及酶原激活18．核酶 7．抗体酶19．变构酶 8．活化能20．酶的共价修饰 9．诱导契合假说21．酶的Vmax 10．初速度22．结合酶 11．Km值23．酶活力 12．最适温度24．比活力 二、填空题 25．酶是由产生的对特异底物起高效催化作用的。 26．酶加速反应的机制是通过降低反应的，而不改变反应的。 27．结合酶，其蛋白质部分称，非蛋白质部分称，二者结合其复合物称。 28．酶活性中心与底物相结合那些基团称，而起催化作用的那些基团称。 29．当Km值近似ES的解离常数K S时，Km值可用来表示酶对底物的。 30．酶的特异性包括特异性，特异性和特异性。 31．米曼二氏根据中间产物学说推导出V与[S]的数学方程式简称为，式中的..为米氏常数，它的值等于酶促反应速度达到一半时的。 32．在其它因素不变的情况下，[S]对酶促反应V作图呈线，双倒数作图呈线，而变构酶的动力学曲线呈型。 33．可逆性抑制是指抑制剂与酶进行结合影响酶的反应速度，抑制剂与酶的活性中心结合，抑制剂与酶的活性中心外的必需基团结合。 34．反竞争性抑制剂使酶对底物表观Km ，Vmax 。 35．无活性状态的酶的前身物称为，在一定条件下转变成有活性酶的过程称。其实质是的形成和暴露过程。 36．丙二酸是酶的抑制剂，增加底物浓度可抑制。 37、同工酶是指催化化学反应，而酶蛋白分子结构、理化性质及免疫学性质的一组酶。 38．辅酶与辅基的区别在于前者与酶蛋白，后者与酶蛋白。 39．肌酸激酶的亚基分型和型。 40．最适温度酶的特征性常数，它与反应时间有关，当反应时间延长时，最适温度可以。 41．某些酶以形式分泌，不仅可保护本身不受酶的水解破坏，而且可输送到特定的部位与环境转变成发挥其催化作用。 42．不可逆抑制剂常与酶以键相结合使酶失活。 43．当非竞争性抑制剂存在时，酶促反应动力学参数如下Km ，Vmax 。 44．当酶促反应速度为最大反应速度的80%时，底物浓度是Km的倍。 三、选择题 A型题 45．关于酶概念的叙述下列哪项是正确的 A.所有蛋白质都有酶的活性 B.其底物都是有机化合物 C.其催化活性都需特异的辅助因子 D.体内所有具有催化活性的物质都是酶 E.酶是由活细胞合成具有催化作用的蛋白质

固定化酶

固定化酶的制备及应用 摘要：本文主要从酶的固定化载体、固定化方法等方面介绍了固定化酶制备中的研究进展情况，并且从医药、食品、环保、等方面其在其中的新应用出发，对固定化酶在新领域中的应用作了综述，给固定化酶研究的发展前景进行了展望，并且指出了今后酶固定化研究的主要方向是多酶的固定化及制备高活性、高负载、高稳定性的固定化酶。 固定化酶是20世纪60年代发展起来的一项技术。以往用的酶绝大多数是水溶性性的酶。这些水溶性的酶催花结束后，极难回收，因而阻碍了酶工业的进一步发展。60年代后，在美学研究领域内涌现出固定化酶，最早被称为“水不容酶”或“固相酶”，此技术将水不溶性的自然酶与不溶性载体相结合，成为不溶于水的酶的衍生物。固定化酶（immobilized enzyme）这个术语是在1971 年酶工程会议上被推荐使用的。 利用固定化技术，解决了酶应用过程中的很多问题，为酶的应用开辟了新的前景。如可使所使用的酶、细胞能反复使用，使产物分离提取容易，并在生产工艺上可以实现连续化和自动化，故在20世纪70年代后得到迅速发展。其新的功能和新的应用正在迅速不断地扩展，是一项研究领域宽广、应用前景极为引人瞩目的新研究领域和新技术。 1固定化酶的优缺点 1.1 优点 （1）同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用；

（2）固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同时也省去了热处理使酶失活的步骤； （3）稳定性显著提高； （4）可长期使用，并可预测衰变的速度； （5）提供了研究酶动力学的良好模型。 （6）酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保证，成本低。 1.2缺点 （1）酶固定化时酶的活力有所损失，同时也增加了固定化的成本。 （2）比较适应水溶性底物和小分子底物。 （3）不适于多酶反应，特别是需要辅酶的反应。 2.固定化酶的制备原则 （1 ）必须注意维持酶的催化活性及专一性。酶的催化反应取决于酶本身蛋白质分子所特有的高级结构和活性中心， 为了不损害酶的催化活性及专一性，酶在固定化状态下发挥催 化作用时，既需要保证其高级结构，又要使构成活性中心的氨 基酸残基不发生变化。这就要求酶与载体的结合部位不应当是 酶的活性部位，应避免活性中心的氨基酸残基参与固定化反应； 另外，由于酶蛋白的高级结构是凭借疏水键、氢键、盐键等较 弱的键维持的，所以固定化时应采取尽可能温和的条件，避免 那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件，如高温、强酸、强

第三章 固定化酶与固定化细胞

?第三章固定化酶与固定化细胞 ?第一节概述 ?第二节固定化酶的性质及其影响因素 ?第三节固定化酶的制备 ?第四节固定化细胞 ?第五节固定化辅酶和原生质体 ?第六节酶反应器和固定化酶（细胞）的应用 ?第一节概述 ?什么是固定化酶？ ?第一节概述 二．固定化酶的优缺点 ?多次使用 ?可以装塔连续反应 ?优点：纯化简单 ?提高产物质量 ?应用范围广 ?缺点：首次投入成本高 ?大分子底物较困难 ?第一节结束 ?点击返回 ?第二节固定化酶的性质及其影响因素 ?一．影响固定化酶性质的因素 ?二．固定化后酶性质的变化 ?三．评价固定化酶的指标 ?一．影响固定化酶性质的因素 1．酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。 ?二．固定化后酶性质的变化 ?1．固定化对酶活性的影响： ?酶活性下降，反应速度下降 2．固定化对酶稳定性的影响 ?稳定性提高（原因） ?3．pH的变化（原因） ?载体带负电荷，pH向碱性方向移动。 ?载体带正电荷，pH向酸性方向移动。 ?催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离 ?酶的pH值高；反之则低 ?固定化后酶稳定性提高的原因： ? a. 固定化后酶分子与载体多点连接。 ? b. 酶活力的释放是缓慢的。 ? c. 抑制自身降解，提高了酶稳定性。 ?PH 对酶活性的影响： ?（1）改变酶的空间构象 ?（2）影响酶的催化基团的解离

?（3）影响酶的结合基团的解离 ?（4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。 ?4．最适温度变化 一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。 5．底物特异性变化 ?作用于低分子底物的酶特异性没有明显变化 ?既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 ?特异性往往会变化。 6．米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化 （链接） ?米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化 由于分配效应：ρ=[Si]微环境/[S]宏观环境 Km'=Km/ρ(表观米氏常数) ?（1）载体与底物带相同电荷，Si]<[S],ρ<1,Km’>Km固定化酶降低了酶的亲和力。 ?（2）载体与底物电荷相反，静电作用，[Si]>[S]，则ρ>1,Km'

3.2制备和应用固定化酶

第三章酶的应用技术实践 3.2制备和应用固定化酶 探究目的： 1说出固定化酶和固定化细胞的作用和原理 2、尝试制备固定化酵母细胞，并利用固定化酵母细胞进行酒精发酵。探究预习： 固定化酶技术的发展也促进了固定化细胞技术的发展。20世纪70年代后期出现了固定化细胞 技术。通过各种方法将细胞与一定的载体结合，使细胞仍保持原有的生物活性，这一过程称为细胞固定化。固定化细胞仍能进行正常的生长、繁殖和代谢，由于保留了细胞内原有的多酶系统，这对多步催化的连续反应优势就更加明显。细胞固定化的方法也有多种，主要是吸附法和包埋法两大类。 吸附法是制备固定化动物细胞的主要方法。动物细胞大多数具有附着特性，能够很好地附着在容器壁、微载体和中空纤维等载体上。吸附法制备固定化植物细胞，是将植物细胞吸附在泡沫塑料的大孔隙或裂缝之中，也可将植物细胞吸附在中空纤维的外壁上。 包埋法是指将细胞包埋在多孔载体的内部而制成固定化细胞的方法。凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法，适用于各种微生物、动物和植物细胞的固定化。凝胶包埋法所使用的载体主要有琼脂、海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶等。 海藻酸钠凝胶包埋法制备固定化细胞的操作简便，条件温和，对细胞无毒性。通过改变海藻酸钠的浓度可以改变凝胶的孔径，适合于多种细胞的固定化。用海藻酸钠凝胶制备的固定化细胞已用于多种酶的发酵生产与研究。 固定化细胞技术可以取代游离的细胞进行发酵，生产各种物质。 材料用具：干酵母，聚乙烯醇，海藻酸钠，无水CaC2，蒸馏水，烧杯，玻璃棒，酒精灯，三 角架，石棉网，注射器等。 探究过程： 探究反思： 固定化酵母菌技术有哪些优点? 探究示例： 请参照细胞固定化技术的相关基础知识，完成下列问题。 （1）细胞固定化技术一般采用包埋法固定化，采用该方法的原因是 （2）包埋法固定化是指___________________________________ 。 （3）_____________________________________________________________________ 包埋法固定化细胞常用的载体有 ________________________________________________________________ _______________________ 。（答出三种即可） （4）与固定化酶技术相比，固定化细胞技术的优点是 （5）制备固定化酵母细胞的步骤为: 【解析】（1）固定化细胞的方法有包埋法、化学结合法和物理吸附法，一般来说多采用包埋法固定化，因为个大的细胞难以被吸附或结合，且不易从包埋材料中漏出。 （2）（3）包埋法固定化即将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中。常用的载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠等。 （4）与固定化酶技术相比，固定化细胞技术的成本更低?操作更容易。 （5）制备固定化酵母细胞的程序为：酵母细胞的活化T配制CaC2溶液T配制海藻酸钠溶液T海藻酸钠溶液与酵母细胞混合T固定化酵母细胞。 【答案】（1 ）细胞个大，不易从包埋材料中漏出；（2）将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多 孔性载体中；（3）明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素、聚丙烯酰胺等；（4）成本更低，操作更容易；（5）①酵母细胞的活化②配制CaC2溶液③配制海藻酸钠溶液④海藻酸钠溶液与酵 母细胞混合⑤酵母细胞的固定化。 【矫正反馈】 1?固定化酶和固定化细胞是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术，其中适合细胞固定的方法是（） A.包埋法 B.物理吸附法 C.化学结合法 D.高温冷却法 2.与固定化酶相比，固定化细胞制备的特点是（） A.成本高，但操作更容易 B.成本低，但操作更复杂 C.成本高，且操作更复杂 D.成本低，且操作更容易 3.固定化细胞技术在废水处理中有着重要作用，用于处理含氮、氨丰富的废水的固定化微生物通常是（） ①酵母菌②青霉菌③硝化菌④反硝化菌 ①③D.②④ 让酵母细胞在缺水状态下休眠 让处于休眠状态的酵母细胞重新恢复正常的生活状态 5.下面为制备固定化酵母细胞的步骤，其正确的操作程序是 （） ①海藻酸钠溶液与酵母细胞混合②配制海藻 酸钠溶液③酵母细胞的活化 ⑤配制物质的量浓度为0.05 mol/L的CaC2溶液 A.①②③④⑤ B.③①②⑤④ C.③⑤②①④ 6 .试分析下图中，哪一种与用海藻酸钠作载体制备的固定化酵母细胞相似（ 7 .下列有关固定化酵母细胞制备步骤叙述，不恰当的是（） A.应使干酵母与水混合并搅拌，以利于酵母菌活化 B.配制海藻酸钠溶液时要用小火间断加热的方法 C.向刚溶化好的海藻酸钠溶液中加入已活化的酵母细胞，充分搅拌并混合均匀 D.将与酵母混匀的海藻酸钠溶液注入CaC2溶液中，会观察到CaC2溶液中有球形的凝胶珠形成 8.用固定化酵母细胞发酵葡萄糖溶液时，为了能产生酒精，下列措施错误的是（） A.向瓶内泵入氧气 B.应将装置放于适宜的条件下进行 C.瓶内应富含葡萄糖等底物 D.将瓶口密封，效果更好 探究步骤探究记录结论或解释1.实验准备准备各种实验药品和器具。 2?制备麦芽汁称取一定质量的干麦芽粉，加入其质量4倍的水，在58~65C下 糖化3-4 h。每隔一定的时间用碘液测定，如果仍显蓝色，说明糖化还不完全，继续糖化直至不显色为止，得到麦芽汁。煮沸、冷却麦芽汁后用纱布过滤，再调节pH至6.0，在121 C下灭菌15min，制成无菌麦牙汁。 3.活化酵母菌细胞称取1g干酵母放入50 mL的小烧杯中，加入蒸馏水10 mL。用玻璃棒搅拌酵母菌液，使其活化1h左右。 4.制备固定化细胞称取4g聚乙烯醇（PVA）和0.2 g海藻酸钠，加入无菌水40 mL，适当加热至完全溶化，将溶液冷却至45 C，加入预热至35C的 酵母菌培养液，混合均匀形成酵母菌谒藻酸钠胶液；将酵母菌- 海澡酸钠胶液倒入带有孔径为 2 mm喷嘴的小塑料瓶或吸入注 射针筒中；以恒定的速度滴入预先盛有50 mL饱和硼酸-氯化钙 溶液的烧杯中，采用磁力搅拌器或手摇的方法使溶液不停地旋转；酵母菌-海藻酸钠胶液在溶液中逐渐形成凝胶珠。待凝胶珠在溶液中浸泡30 min后，取出用无菌水洗涤3次备用。 5.发酵麦芽汁将固定化酵母菌细胞凝胶珠加入300 mL无菌麦芽汁中，置于 25C下发酵7~9 d。待发酵结束后品尝其味道。A.①② B.③④ C. 4 .酵母细胞的活化是指（） A.让酵母细胞恢复运动状态 B. C.让酵母细胞内酶活性加倍 D. ④固定化酵母细胞 D.③②⑤①④ ）

第五章酶与细胞固定化技术

第五章酶与细胞的固定化技术 教学目的：使学生了解并掌握固定化酶（细胞、原生质体）的概念及意义，掌握酶的常用固定化技术，了解固定化酶的性质。 教学重点、难点：固定化酶（细胞、原生质体）的畴，各种固定化技术。固定化酶（细胞、原生质体）的畴,半透膜包埋法。 教学方法：讲授 教学手段：多媒体 第一节概述 一、游离酶使用中的局限性: 1.提取纯化繁琐,价格昂贵 2.难以重复使用 3.稳定性差 二、固定化酶研究 克服游离酶缺点的方法之一 50年代开始 60年代后期，固定化技术迅速发展 1969年，千田一郎首次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL-AA连续生产L-AA实现酶应用史上的一大变革 三、基本概念 1、固定化酶（1971第一次国际酶工程学术会议） （Immobilized Enzyme) 指在一定空间围呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复利用。包括酶与不溶性载体结合的“固相酶”“水不溶性酶”及包埋在凝胶或超滤装置中的酶。 2、固定化细胞（原生质体） 指被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定空间围，但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力。 四、固定化酶优点 增加了酶的稳定性 能降低酶的总体费用 酶的分离和回收变得容易，并可重复使用 使反应过程的连续操作成为可能 反应产物也易于提取纯化 有利于过程设计和优化 拓广了酶的应用围（多酶系统的酶反应，非水相酶反应，生物传感器探头等） 第二节、酶的固定化方法 一、酶的固定化方法 1、酶的固定化方法（四大类方法） 1）吸附法 2）包埋法

3）交联法 4）化学共价法 其它（酶的逆胶束包囊法） 一、酶的固定化方法 2、选择方法依据： ⑴酶的性质 ⑵载体的来源、价格、机械性能、载体的功能基团和交联度等 ⑶制备方法简便易行 ⒊衡量依据： ⑴测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回收率； ⑵研究它的最适反应条件（底物浓度、pH 值、温度、离子强度等）； ⑶稳定性和不稳定原因的探究； ⑷对酶进行人工修饰，使其与载体的结合达到较为理想的构型和相容性。 （一）吸附法 1、原理：主要是利用细胞与载体之间的吸引力（德华力、离子键和氢键），使细胞固定在载体上，常用的吸附剂有玻璃、瓷、硅藻土、多孔塑料、中空纤维等。 此外还可利用专一的亲和力来固定细胞，例如伴刀豆球蛋白Ａ与ａ一甘露聚糖具有亲和力，而酿酒酵母细胞壁上含有ａ一甘露聚糖，故可将伴刀豆球蛋白Ａ先连接到载体上，然后把酵母连接到活化了的伴刀豆球蛋白上。 2、酶材料：酶或结合在菌体（死细胞）及细胞碎片上的酶或酶系。 3、优缺点：操作简便，条件温和，不会引起酶的变性失活，载体廉价易得，且可反复利用； 缺点是蛋白质与载体之间的结合相当弱,而且很多情况下,酶的非特异性吸附常常会引起部分或全部失活,高浓度的盐溶液或底物溶液又将加速蛋白质的脱附.因此当要求酶的固定绝对牢靠时,采用吸附法是很不可靠的. 4、常用吸附剂 各种矿物质以及无机载体(氧化铝，氧化铁，氧化钛，硅藻土，多空瓷，多空玻璃，羟基磷灰石等)，及天然高分子载体淀粉、白蛋白等，最常用的吸附剂是离子交换剂羧甲基纤维素，DEAE----纤维素、DEAE----葡萄糖，合成的阴离子和阳离子交换剂离子交换剂主要靠静电吸引，缺点是当离子强度增加或介质的pH、温度变化时，这种结合发生分解。 5、举例： 将伴刀豆球蛋白A-琼脂糖4B 50ml（在10mM PBS pH 7.4 含0.5M NaCl,1mM CaCl2和1mM MnCl2）与酶液(10mg/ml) 5ml,在4℃，搅匀过夜，便成琼脂糖复合物，用10mM NaAc pH4.5（1mMCaCl2 和1mMnCl2）充分洗涤，直至测不出活性为度，最后再悬浮于10ml NaAc PBS 中备用。 （二）包埋法 1、概念：指将酶或含酶菌体包埋在各种多空载体中，使酶固定的方法。可分为凝胶包埋法 （网格型）和半透膜包埋法（微囊型）两种。 2、优缺点：一般不需酶的AA残基进行结合反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高； 缺点是包埋时发生化学聚合反应，酶易失活，须巧妙设计反应条件。另外网格结构影响底物和产物的扩散，有时，这种扩散会导致酶动力学行为的改变，所以此法只适合于小分子底物和产物的酶。 3、海藻酸盐包埋法 海藻酸钠与Ca2+,Mg2+,Al3+等多价离子间的转移凝胶作用,形成固定化细胞颗粒

固定化酶和固定化细胞技术

张 海 龙 山东教育学院 生物系 Shan Dong Institute of Education 第九章　第九章　固 固定化酶与固定化细胞技术

第一节固定化酶 ?固定化酶：是指在在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复利用。 ?酶的固定化是将酶与水溶性载体结合，制备固定化酶的过程。

固定化酶的特点（与游离酶相比） ?（1）极易将固定化酶与底物、产物分开，产物溶液中没有酶的残留，提纯工艺简化； ?（2）能够在较长时间 进行反应，便于实现连续化和自动化； ?（3）大多数情况下，能够提高酶的稳定性； ?（4）酶的反应过程能够严格控制； ?（5）酶的利用率提高，生产成本降低； ?（6）能够进行多酶反应； ?（7）可以增加产物收率，提高产物的质量； ?（8）增加了生产的成本； ?（9）只能用于可溶性小分子底物，对大分子的底物适应性差，与完整的菌体细胞相比，不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应。

一、固定化酶的制备方法 ?根据不同应用目的和不同应用环境选择不同的方法，遵循如下原则： –（1）必须维持酶的催化活性以及专一性； –（2）有利于实现连续化和自动化； –（3）固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近，以便提高产品的质量； –（4）酶与载体必须结合牢固，便于回收贮存，反复利用； –（5）固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不应与产物或反应液发生化学反应； –（6）成本要低，以便于工业使用；

实践中，可根据酶的性质，反应特征选择合适的方法。?（一）包埋法： –1、网格型 –2、微囊型：界面沉淀法、界面聚合、二级乳化法、脂质包埋法?（二）吸附法： –1、物理吸附法 –2、离子吸附法 ?（三）、共价偶联法 ?（四）、交联法 ?（五）、共价结合法 –1、结晶法 –2、分散法

高中生物第三章酶的应用技术实践第二节固定化酶的制备和应用学案苏教版选修1

第二节固定化酶的制备和应用 学习导航明目标、知重点难点 固定化酶和固定化细胞的应用。(重点) 固定化酶与固定化细胞的制备方法。(难点) [学生用书P43] 一、阅读教材P63分析固定化酶 1．概念：是指用物理学或化学的方法将酶与固相载体结合在一起形成的仍具有酶活性的酶复合物。 2．优点：在催化反应中，它以固相状态作用于底物，反应完成后容易与水溶性反应物和产物分离，可被反复使用，且保持了酶的催化性能，可实现酶促反应的连续化和自动化。 3．制备固定化酶的常用方法 目前，制备固定化酶的方法主要有物理吸附法、化学结合法、包埋法等。 二、阅读教材P64～65分析固定化细胞技术的应用 1．应用：固定化细胞可以取代游离的细胞进行发酵，生产各种物质。 2．优点 (1)固定化细胞技术无须进行酶的分离和纯化，减少了酶的活力损失，同时大大降低了生产成本。 (2)固定化细胞不仅可以作为单一的酶发挥作用，而且可以利用细胞中所含的复合酶系完成一系列的催化反应。 (3)对于活细胞来说，保持了酶的原始状态，酶的稳定性更高。 (4)细胞生长停滞时间短，反应快等。 3．缺点 (1)固定化细胞只能用于生产细胞外酶和其他能够分泌到细胞外的产物。 (2)由于载体的影响，营养物质和产物的扩散受到一定限制。 (3)在好氧性发酵中，溶解氧的传递和输送成为关键的限制因素。 4．酵母菌细胞的固定化技术的主要流程 准备各种实验药品和器材 ↓ 制备麦芽汁 ↓

活化酵母菌细胞 ↓ 配制物质的量浓度为0.05 mol/L的氯化钙溶液 ↓ 制备固定化细胞 ↓ 浸泡凝胶珠，用蒸馏水洗涤 ↓ 发酵麦芽汁 判一判 (1)酶在催化时会发生变化，不可反复利用。(×) (2)某种固定化酶的优势在于能催化一系列生化反应。(×) (3)固定化细胞所固定的酶都在细胞外起作用。(×) (4)制备固定化细胞的方法主要有包埋法、化学结合法和物理吸附法。(×) 连一连 固定化酶技术[学生用书P44] 由于酶的分离与提纯有许多技术性难题，造成酶制剂来源有限、成本高、不利于大规模使用。人们针对酶的这种不足寻着改善的方法之一是固定化酶技术的应用。结合教材P63内容完成以下探究。 (1)图A为物理吸附法，它的显著特点是工艺简便且条件温和，在生产实践中应用广泛。 (2)图B为化学结合法，它是利用多功能试剂进行酶与载体之间的交联，在酶和多功能试剂之间形成共价键，从而得到三维的交联网架结构。 (3)包埋法是将酶包埋在能固化的载体中。将酶包裹在聚丙烯酰胺凝胶等高分子凝胶中(如图C)，包埋成格子型；或包裹在硝酸纤维素等半透性高分子膜中(如图D)，包埋成微胶囊型。 各种固定化酶方法的比较

酶与细胞固定化技术样本

第五章酶与细胞固定化技术 教学目：使学生理解并掌握固定化酶（细胞、原生质体）概念及意义，掌握酶惯用固定化技术，理解固定化酶性质。 教学重点、难点：固定化酶（细胞、原生质体）范畴，各种固定化技术。固定化酶（细胞、原生质体）范畴,半透膜包埋法。 教学办法：讲授 教学手段：多媒体 第一节概述 一、游离酶使用中局限性: 1.提取纯化繁琐,价格昂贵 2.难以重复使用 3.稳定性差 二、固定化酶研究 克服游离酶缺陷办法之一 50年代开始 60年代后期，固定化技术迅速发展 1969年，千田一郎初次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL-AA持续生产L-AA实现酶应用史上一大变革 三、基本概念 1、固定化酶（1971第一次国际酶工程学术会议） （Immobilized Enzyme) 指在一定空间范畴内呈闭锁状态存在酶，能持续地进行反映，反映后酶可以回收重复运用。涉及酶与不溶性载体结合“固相酶”“水不溶性酶”及包埋在凝胶或超滤装置中酶。 2、固定化细胞（原生质体）

指被限制自由移动细胞，即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定空间范畴内，但细胞仍保存催化活性并具备能被重复或持续使用活力。 四、固定化酶长处 增长了酶稳定性 能减少酶总体费用 酶分离和回收变得容易，并可重复使用 使反映过程持续操作成为也许 反映产物也易于提取纯化 有助于过程设计和优化 拓广了酶应用范畴（多酶系统酶反映，非水相酶反映，生物传感器探头等） 第二节、酶固定化办法 一、酶固定化办法 1、酶固定化办法（四大类办法） 1）吸附法 2）包埋法 3）交联法 4）化学共价法 其他（酶逆胶束包囊法） 一、酶固定化办法 2、选取办法根据： ⑴酶性质 ⑵载体来源、价格、机械性能、载体功能基团和交联度等 ⑶制备办法简便易行 ⒊衡量根据： ⑴测定固定化酶活力，以拟定固定化过程活力回收率；

第五章酶与细胞固定化技术之令狐文艳创作

第五章酶与细胞的固定化技术 令狐文艳 教学目的：使学生了解并掌握固定化酶（细胞、原生质体）的概念及意义，掌握酶的常用固定化技术，了解固定化酶的性质。 教学重点、难点：固定化酶（细胞、原生质体）的范畴，各种固定化技术。固定化酶（细胞、原生质体）的范畴,半透膜包埋法。 教学方法：讲授 教学手段：多媒体 第一节概述 一、游离酶使用中的局限性: 1.提取纯化繁琐,价格昂贵 2.难以重复使用 3.稳定性差 二、固定化酶研究 克服游离酶缺点的方法之一 50年代开始 60年代后期，固定化技术迅速发展 1969年，千田一郎首次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL-AA连续生产L-AA实现酶应用史上的一大变革 三、基本概念

1、固定化酶（1971第一次国际酶工程学术会议）（Immobilized Enzyme) 指在一定空间范围内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复利用。包括酶与不溶性载体结合的“固相酶”“水不溶性酶”及包埋在凝胶或超滤装置中的酶。 2、固定化细胞（原生质体） 指被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定空间范围内，但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力。 四、固定化酶优点 增加了酶的稳定性 能降低酶的总体费用 酶的分离和回收变得容易，并可重复使用 使反应过程的连续操作成为可能 反应产物也易于提取纯化 有利于过程设计和优化 拓广了酶的应用范围（多酶系统的酶反应，非水相酶反应，生物传感器探头等） 第二节、酶的固定化方法 一、酶的固定化方法 1、酶的固定化方法（四大类方法） 1）吸附法

2）包埋法 3）交联法 4）化学共价法 其它（酶的逆胶束包囊法） 一、酶的固定化方法 2、选择方法依据： ⑴酶的性质 ⑵载体的来源、价格、机械性能、载体的功能基团和交联度等 ⑶制备方法简便易行 ⒊衡量依据： ⑴测定固定化酶的活力，以确定固定化过程的活力回收率； ⑵研究它的最适反应条件（底物浓度、pH 值、温度、离子强度等）； ⑶稳定性和不稳定原因的探究； ⑷对酶进行人工修饰，使其与载体的结合达到较为理想的构型和相容性。 （一）吸附法 1、原理：主要是利用细胞与载体之间的吸引力（范德华力、离子键和氢键），使细胞固定在载体上，常用的吸附剂有玻璃、陶瓷、硅藻土、多孔塑料、中空纤维等。 此外还可利用专一的亲和力来固定细胞，例如伴刀豆球蛋白Ａ与ａ一甘露聚糖具有亲和力，而酿酒酵母细胞壁上含

固定化酶与固定化细胞

固定化酶 水溶性酶经物理或化学方法处理后，成为不溶于水的但仍具有酶活性的一种酶的衍生物。在催化反应中以固相状态作用于底物。 固定化酶（immobilized enzyme），酶本身还是溶于水的，只是是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在其中，使得酶在水中溶性凝胶或半透膜的微囊体从而导致流动性降低。酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。便于运输和贮存，有利于自动化生产，但是活性降低，使用范围减小，技术还有发展空间。 酶的固定化(Immobilization of enzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内,仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。与游离酶相比,固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时,又克服了游离酶的不足之处,呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃,得到迅速发展和广泛的应用,而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。 固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。 物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留。但是,由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用,因此对一些反应不适用。 化学法包括结合法、交联法。结合法又分为离子结合法和共价结合法。是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上,使用偶联剂通过 酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法. 其中吸附法和共价键法又可统称为载体结合法。 具体方法 吸附法 利用各种吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定的方法。通常有物理吸附法和离子吸附法。 常用吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。 采用吸附法固定酶，其操作简便、条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可反复使用。 载体结合法 最常用的是共价结合法，即酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接。在温和的条件下能偶联的蛋白质基团包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基。参加和载体共价结合的基团，不能是酶表现活力所必需的基团。以中国首先采用的双功能团试剂“对位-β-硫酸酯乙砜基苯胺”偶联载体和酶为例，载体结合的步骤如下页反应式。

固定化酶的四种方法

1吸附法:利用各种吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定的方法。通常有物理吸附法和离子吸附法。常用吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。 采用吸附法固定酶，其操作简便、条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可反复使用。该方法最显著的优点是操作简便，但酶与载体结合不牢，极易脱落，所以它的使用受到一定的限制。因此，人们不断尝试使用新的载体来解决这易脱落的问题。通常，吸附法分为物理吸附法和离子吸附法。 物理吸附法:酶被载体吸附而固定的方法称为物理吸附法。从载体对酶的适应性来看，这个方法效果是好的，酶蛋白的活性中心不易受破坏，酶的高级结构变化也不明显，但其缺点是酶与载体的相互作用较弱，被吸附的酶极易从载体表面上脱落下来，不能获得较高活力的固定化酶。该方法常用的载体有活性炭、多孔陶瓷、纤维素及其衍生物、甲壳素及其衍生物等。离子吸附法:将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合的固定化方法。该方法的处理条件温和，且酶的高级结构和活性中心的氨基酸很少发生变化，因而可 以得到较高活性的固定化酶。采用此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、B一淀粉酶、纤维素酶等。 2交联法是用双功能试剂或多功能试剂进行酶分子之间的交联，使酶分子和双功能试剂或多功能试剂之间形成共价键。常用的交联剂是戊二醛，但单用戊二醛等试剂交联制备的固定化酶活力较低，因此常将此法与吸附法、包埋法结合使用，可以达到既提高固定化酶的活力，又起到加固的效果.酶蛋白的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。 3载体结合法 最常用的是共价结合法，即酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接。在温和的条件下能偶联的蛋白质基团包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基。参加和载体共价结合的基团，不能是酶表现活力所必需的基团。此法曾先后用于3′-核糖核酸酶、5′-磷酸二酯酶和葡萄糖淀粉酶等的固定化。此外酶通过物理吸附或离子吸附于载体制备固定化酶也是常用的方法。共价键结合法:共价键结合法是将酶与水不溶性载体以共价键结合的一种方法。此法研究较为成熟，其优点是酶与载体问连接牢固，即使用高浓度底物或离子强度的溶液进行反应，也不会导致酶和载体的分离，因此具有良好的稳定性及重复使用性。缺点是反应条件比较苛刻，常常会引起酶蛋白高级结构发生改变，导致酶的活性中心受损。 4包埋法是将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进剂的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化。包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，很少改变酶的空间构象，酶活回收率较高，因此可以应用于许多酶的固定化。但是此法只适用于小分子底物和产物的酶催化反应，因为只有小分子反应底物或产物，才可以通过高分子聚合物进行扩散。包埋法制备固定化酶除包埋水溶性酶外还常包埋细胞，制成固定化细胞，例如可用明胶及戊二醛包埋具有青霉素酰化酶活力的菌体，可连续水解帤基青霉素，工业生产6-氨基青霉烷酸。 酶经过固定化后，比较能耐受温度及pH的变化，最适pH往往稍有移位，对底物专一性没有任何改变，实际使用效率提高几十倍（如5′-磷酸二酯酶的工业应用）甚至几百倍（如青霉素酰化酶的工业应用）。本实验中为什么选用石英砂来固定化酶？ 本实验中为什么选用石英砂来固定化酶？答：固定化酶有许多方法，本实验中采用的是吸附法。吸附法有物理交换法和离子交换法两种。其中本实验采用的又是物理交换法。该方法是将酶蛋白的分子吸附在惰性载体上，但要选择不引起变性且能保持一定酶活力的载体，且对蛋白质要有高度吸附能力。自然界中有机硅胶、活性炭和石英砂等都可以被用于做载体。现已了解其中石英砂对固定化α-淀粉酶、胰蛋白酶作用较好。

高二生物酶的固定化

第四节 酶的固定化 【课标要求】 1．掌握固定化酶和固定化细胞的作用和原理 2．尝试制备固定化酶，并检验酶的活性 【知识梳理】 （向下移动位置） 实践案例：木瓜蛋白酶的固定化 1．木瓜蛋白酶的作用：可以使蛋白质水解成 ，供酵母菌 所需，从而 发酵时间，提高啤酒 ，使酒质 醇和。 2．材料器具：见课本49页 3．活动程序： （1）酶的固定化 方法： ↓ 载体： 经一系列操作后，即可得到 。 （2）检验酶的活性 最适宜温度 ↓ 双缩脲试剂A 液和B 液 1号烧杯颜色： 2号烧杯颜色： 原因 （3）酶的再利用 3号烧杯颜色 ↓ 说明了 。 （向下移动） （4）结果记录 小结： 和 技术的应用，大大提高了酶在生产上的利用率。 定义：通过 或 的方法，将水溶性的 与不溶性的 结合，使酶固定在 上，并在一定的空间范围内进行 ， 这样制成的酶称为 。 ① ：将酶通过 以 结合到 等 上。 方法 ② :将酶均匀 在 等多孔性的 中的固定化方法。 ③ ：将酶吸附在载体表面上而被固定。 优点：固定化酶活性 ，可以 使用 次。 工业生产可以实现 、 、 极大降低生产成本。 1．固定化酶 2．固定化细胞 定义：利用适当的 将合成酶的 固定起来。 方法：多采用包埋固定法。（原因：细胞个大，而酶分子较小；个大的细胞难以被吸附或结合，而个小的酶容易从包埋材料中漏出。 优点：操作更容易更 ，使用 更长。 固定化细胞不需要酶的提取，减少了酶活力的损失和操作。

探究活动：大肠杆菌细胞的固定化 1．用培养基培养大肠杆菌，取1ml 加入烧杯中，再加入8ml 和体积分数为9%的1．6ml，搅拌均匀，待凝固后，切成小块，用和洗涤，即得到固定化大肠杆菌细胞。 2．胰凝乳蛋白酶的固定化 从提取，并以为载体，将胰凝乳蛋白酶固定化。 【复习指要】 1．学法指导：本节课应初步学会固定化酶的方法，引导学生理解固定化细胞和固定化酶这两种技术的区别与联系，辩证地认识这两种技术的优势与不足。本节课的固定化酶的方法和制备固定木瓜蛋白酶的操作过程应引起重视，在高考选择题和实验题中都有可能体现。 2．疑难解析： 辩证地认识固定化细胞和固定化酶两种技术的优势与不足。如：固定化细胞操作容易，对酶活性的影响更小，可以催化一系列的反应，容易回收等，但由于大分子物质难以自由通过细胞膜，因此固定化细胞的应用也受到限制。 【典题解析】 1．关于固定化酶技术说法正确的是（） A．固定化酶技术就是固定反应物，将酶依附着载体围绕反应物旋转的技术 B．固定化酶的优势在于能催化一系列的酶促反应 C．固定化酶中的酶无法重复利用 D．固定化酶是将酶固定在一定空间的技术 [解析]固定化酶是利用物理或化学方法将酶固定在一定空间内的技术，其优点是酶被固定在一定装置内可重复利用，不足是无法同时解决一系列酶促反应。 [答案]D 2．研究认为，用固定化酶技术处理污染物是很有前途的。如将从大肠杆菌得到的磷酸二酯酶固定到尼龙膜上制成制剂，可用于降解残留在土壤中的有机磷农药，与用微生物降解相比，其作用不需要适宜的（） A．温度B．PH C．水分D．营养 [解析] 固定化酶技术是利用物理或化学方法将酶固定在一定空间内的技术,利用了酶的高效性和专一性．酶与微生物比较来说,它的活性发挥不需要营养． [答案]D 【聚焦高考】