文章编号:1000-5404(2004)20-1845-04论著流式细胞术检测人和小鼠Th细胞亚群
刘莉,张军,方超平,杨佳荟,李闻捷,沈茜(第二军医大学长海医院实验诊断科,上海200433)
提要:目的建立人和小鼠Th1和Th2细胞的检测方法,探讨两者在流式细胞仪检测方面的不同。方法采用PMA和离子霉素共同刺激外周血单个核细胞,观察在不同时间和不同剂量的PMA刺激下外周血T淋巴细胞CD3、CD4、CD8表达的变化;采用多色荧光共同标记分析技术检测外周血单个核细胞IL-4和IFN-C的表达。结果在PMA和离子霉素共同刺激后4h,人外周血T淋巴细胞表面CD4表达迅速下降,而小鼠T淋巴细胞表面CD4表达仅轻度下降;采用多色分析技术可以有效的检测Th1细胞和Th2细胞;采用CD3、CD8设门分析可以有效的区分人Th细胞;采用CD4设门可以有效区分小鼠Th细胞。结论人T h细胞检测宜采用4色染色分析技术,小鼠Th细胞检测采用3色染色技术即可。
关键词:流式细胞术;Th1/Th2;细胞因子
中图法分类号:R392.2;R446.113文献标识码:A
Flow cytometric detection of human and murine Th1/Th2cells
LI U Li,ZHANG Jun,FANG Chao-ping,YANG Jia-hui,LI Wen-jie,SHE N Qian(Department of Laboratory Medicine,Changhai Hospital,Second Military Medical University,Shanghai200433,China)
Abstract:Objective To establish the method for flo w cytometric detection of human and murine Th1/Th2 cells.Methods Peripheral mononuclear cells(PMNCs)were stimulated with phorbolmyristateacetate(PMA)and ionomycin.The expressions of CD3,CD4,and CD8were monitored after stimulation with different c oncentrations of PMA for different time.A multiple color staining of the cells was used to detect the intracelluar expressions of IL-4 and IFN-C.Resu lts Expression of CD4in human PMNCs decreased dramatically at4h after stimulation with P MA and ionomycin and Th cells could be distinguished from other cells using CD3and CD8dot plot gating,but expres-sion of CD4in mice PMNCs decreased slightly after stimulation with P MA and ionomycin and Th cells could be distin-guished from other cells using CD4histogram gating.Conclusion Our results suggest human Th1/Th2cells should be detected by four-color staining method and murine Th1/Th2cells by three-c olor staining method.
Key words:flow cytometry;Th1/Th2cytokine
早在1986年Mosmann等依据小鼠分泌的细胞因子谱的不同首次将Th细胞分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。目前已发现许多感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病以及移植排斥反应等都与Th1/Th2平衡有关。因此建立稳定有效的细胞内因子检测方法对于准确说明Th1/Th2细胞的作用非常重要。目前检测的主要方法有:酶联免疫法、E LISPOT 法、荧光定量法及原位杂交等方法。流式细胞术检测细胞内因子是一种相对快速、重复性好并能准确定量的方法。我们参照国内外的一些文献,对于人和小鼠Th1和Th2细胞的流式检测方法进行了探索,并比较
作者简介:刘莉(1973-),女,重庆市人,技师,主要从事临床免疫检验方面研究。电话:(021)25070641
收稿日期:2004-07-13;修回日期:2004-09-03了两者之间的不同。
由于未活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子极少,因此在检测前需刺激活化。目前国内外推荐的刺激物主要为PMA(佛波酯)和离子霉素(Ionomycin)。淋巴细胞在刺激物的作用下活化,分泌细胞因子到细胞外。由于流式细胞仪只能对细胞表面或内部的抗原进行检测,因此必须阻止细胞因子的分泌。抑制细胞因子分泌的试剂为Brefedlin A或莫能霉素(Monensin)。Th1/ Th2细胞属于C D4+T淋巴细胞,因此如何确定C D4+ T淋巴细胞非常重要,我们主要围绕该问题进行探讨。
1材料与方法
111试剂
PMA(Sigma)
1845
第26卷第20期2004年10月
第三军医大学学报
ACTA ACADE MIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE
Vol.26,No.20
Oct.2004
贮存液:PMA溶于DMSO浓度为011mg/ml-20e保存;工作液:贮存液1B100稀释于RPMI1640培养基中,浓度为1L g/ ml。
Ionomycin(Sigma)
贮存液:Ionomycin溶于DMSO浓度为1mg/ml-20e保存;工作液:贮存液1B20稀释于RPMI1640培养基中,浓度为50 L g/ml。
GolgiStop(内含Monensin,BD Pharmin gen)
Cytofi x/Cytoperm液、Perm/Wash液和FACS Lysing Solution,均购自BD Pharmingen。抗体细胞表面标记抗体:抗人CD3-APC、CD8-PercP、CD8-CYC、CD4-CYC;抗小鼠CD4-C YC、CD8PE;细胞内因子抗体:抗人IL-4-PE、IFN-C-FITC。抗鼠IL-4-PE、IFN-C-FITC。
以上抗体均购自BD Pharmingen。
112仪器
FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)
113实验方法
1.3.1外周血单个核细胞的分离取肝素抗凝正常人或者BALB/c小鼠外周血115ml。在试管内加入淋巴细胞分离液3 ml。将外周血以等体积Hanks液稀释后,轻轻加入淋巴细胞分离液。2000r/min离心20min。取出试管后,轻轻吸取液相交界的单个核细胞,加入Hanks液3ml,混匀后,1500r/min离心5 min。弃去上清,细胞加入015ml RPMI1640培养基(含10%小牛血清,50L g/ml青霉素和50L g/ml链霉素)重悬,血细胞计数仪计数,调整细胞浓度。
1.3.2不同浓度的PMA刺激后人T淋巴细胞CD4、CD8和CD3的表达24孔细胞培养板中,每孔加入约5@105个细胞,加入RPMI1640培养基至总体积1ml。加入不同浓度的PMA(10、20ng和50ng终浓度)和500ng/ml Ionomycin共同刺激人外周血单个核细胞,同时加入017L l Golgistop,37e CO2孵箱刺激4 h。收集单个核细胞,分为三部分,分别加入CD8-CYC、CD4-CYC、CD3-APC单抗各10L l,室温避光孵育30min。加入红细胞裂解液(FACS Lysing Solu tion)1ml裂解残余红细胞,2ml PBS洗涤细胞1次。流式细胞仪(FACSCalibur,Becton Dickinson)检测细胞,Cellquest软件获取分析细胞,每个检测获取10000个细胞。采用前向角(FSC)和侧向角(SSC)散射光散点图设门区分淋巴细胞,以直方图分别表示CD3、CD8和CD4阳性淋巴细胞。
1.3.3不同时间PMA和离子霉素刺激后小鼠T淋巴细胞CD4和CD8的表达24孔细胞培养板中,每孔加入约5@105个细胞,加入RPMI1640培养基至总体积1ml。加入PMA和Iono-mycin使终浓度分别为100ng/ml和1L g/ml,同时加入017L l Golgistop。37e C O2孵箱刺激8、12h分别收集细胞。采用抗小鼠CD4-CYC、CD8PE抗体标记T淋巴细胞,流式细胞仪检测CD4和CD8的表达。
1.3.4流式细胞术检测人外周血Th1和Th2细胞分离外周血单个核细胞,加入20ng/ml P MA和500ng/ml离子霉素刺激4h后,收集细胞。将细胞分为两份,称为对照管和实验管,分别加入CD3-APC,CD8-PercP10L l,混匀,室温放置20min,加入红细胞裂解液1ml,混匀,室温放置10min,1000@g离心5 min,弃上清。加入Cytofi x/Cytoperm液200L l,4e放置20min,使细胞固定穿孔。加入Perm/Wash液1ml,1500r/min离心5 min,弃上清。实验管加入IFN-C-FITC、IL-4-PE各5L l,对照管加入同型对照抗体,4e避光孵育30min。加入Perm/Wash液500 L l洗涤2次。最后以300L l洗涤液重悬细胞。采用FACScom 软件及CD3-APC、CD8-PercP、IFN-C-FITC、IL-4-PE抗体单双标记的淋巴细胞调节仪器的补偿,采用Cellquest软件获取分析细胞。以前向角(FSC)和侧向角(SSC)散射光散点图设门区分淋巴细胞,以CD3和CD8散点图设门区分Th细胞(CD3+CD8-)。最终以IFN-C和IL-4的散点图表示Th1细胞和Th2细胞。
1.3.5流式细胞术检测小鼠外周血Th1和Th2细胞分离外周血单个核细胞,加入100ng/ml PMA和1L g/ml离子霉素刺激5h后,收集细胞。将细胞分为两份,称为对照管和实验管,加入CD4-CYC10L l,混匀,其余步骤同人的检测。调节仪器的补偿,采用Cellq uest软件获取分析细胞。以前向角(FSC)和侧向角(SSC)散射光散点图设门区分淋巴细胞,以CD4直方图设门区分Th细胞(CD4+),以IFN-C和IL-4的散点图表示Th1细胞和Th2细胞。
2结果
211不同浓度的PMA对人外周血T淋巴细胞抗原表达的影响
10、20、50ng的PMA刺激后4h,CD4的表达明显下降,已经不能区分出CD4阳性T淋巴细胞,而CD8和CD3的表达未受明显影响,可以有效的区分阴性和阳性细胞。重复5次检测,典型的检测结果见图1。
212不同时间的PMA刺激对小鼠外周血T淋巴细胞抗原表达的影响
PMA刺激8h后CD4阳性T淋巴细胞的表达没有明显下降,见图2。刺激12h后,CD4阳性T淋巴细胞的表达明显改变。而CD8表达在8h和12h均没有明显改变。重复检测5次。
213正常人外周血Th1细胞和Th2细胞
采用CD3+CD8-的T淋巴细胞为Th细胞,设门分析Th1细胞(IFN-C+)和Th2细胞(IL-4+)的百分比。结果见表1。
214正常B ALB/c小鼠外周血Th1细胞和Th2细胞采用CD4+淋巴细胞为Th细胞,设门分析Th1细胞(IFN-C+)和Th2细胞的百分比(IL-4+)。结果见表1。
表1正常人和BALB/c小鼠外周血Th1和Th2细胞检测结果(n=10,%, x?s)
Tab1Th1and T h2cells detected in the peripheral blood of normal human and B ALB/c m ice(n=10,%, x?s)
Gro up Th1Th2 Normal hum an21.73?2.64 2.37?0.54
BAL B/c mic e 4.56?0.62 1.69?0.43
1846第三军医大学学报第26卷
A,B,and C repres ent the resul ts of CD4expres sions i n normal blood after stimulation with P MA at the doses of 10,20,and 50ng,respectivel y;D,E,and F represent the results of CD8expressions in normal blood after stimulation with PM A at the doses of 10,20,and 50ng,respectivel y;G,H,and I represent the re -sults of CD3expressions in normal blood after stimulation with PMA at the doses of 10,20,and 50ng,res pecti vely
图1 10、20、50ng PM A 和500ng/ml I onomycin 共同刺激4h 后人外周血T 淋巴细胞CD4、CD8和CD3的表达
Fig 1 Expressions of CD3,CD4,an d CD8in normal human peripheral b lood after stimu lation with PMA at the doses of 10,20,50ng and
ionomycin at the dose of 500ng/ml for 4
h
A:Expres sion of CD4on T lymphocytes decreased slightly at 8h after stim -ulation;B:Expres sion of CD4on T lymphocytes dec reased signi ficantly at 12h after stimulation
图2 不同时间的PM A 刺激对小鼠外周血T 淋巴细胞CD4抗原
表达的影响
Fig 2 E ffects of PMA stimulation on the expres sions of CD4
in the peripheral blood of mice
3 讨论
从Rostaing 等[1]发表流式细胞术检细胞内细胞因子的方法后,陆续有人研究了流式细胞术检测细胞内因子方法的可行性及重复性等问题。活化T 淋巴细胞
有各种各样的方法,如:PMA 、PHA 、Con A 、CD3、CD2和
CD28等。目前公认的较好的方法是PMA 和钙离子载体的联合刺激。研究表明在PMA 的刺激后4h,I FN -C 和I L -4的表达就达到一个较高的水平,因而适合进行流式检测。我们的研究结果发现,人的外周血T 淋巴细胞表面的CD4表达受PMA 的影响非常大,在刺激后2h 即明显下降,4h 已经难于区分C D4阳性T 淋巴细胞,因此这就难于确定Th 细胞。虽然国内部分学者认为在PMA 的刺激下,CD4仍可以维持一定的表达[2,3],但是我们的结果和国内部分[4]
及国外的大多数[1,5]
研究结果表明,在PMA 的刺激下,CD4表达迅速下调,此时采用CD4来标记Th 细胞已经不能准确的检测Th 细胞,因而不能准确的反应Th1和Th2细胞的比率。而CD3和CD8的表达受PMA 等刺激因子的影响很小,因此,目前,国外推荐的方法是采用C D3和CD8设门,区分CD4阳性T 淋巴细胞。由于多色荧光标记流式检测技术的发展,笔者认为采用4色标记技术检测人Th 细胞是目前最好的方法。这种方法可以实现一个检测
1847第18期 刘 莉,等1流式细胞术检测人和小鼠Th 细胞亚群
管同时观察Th1和Th2细胞;可以检测C D8+细胞的细胞内因子的表达;还可以观察IL-4和IFN-C双阳性细胞。一个检测管同时染色,节约了抗体和劳动量等检测成本。但是由于多色染色技术对流式的操作者有较高的要求,实施过程要注意补偿调节等具体问题,我们曾经采用C YC标记的CD8和APC标记的CD3联合设门区分Th细胞,由于CYC和APC在BD公司的流式细胞仪上,仪器的补偿调节非常困难,最终放弃该方法,改用PerCP标记的CD8才解决这一问题。目前,国内一些流式细胞仪型号相对落后,不能进行4色染色标记技术,笔者认为可以采用双管标记检测法,即采用CD3、CD8和IFN-C3色标记一管用于检测Th1细胞;采用CD3、CD8和IL-43色标记一管用于检测Th2细胞。采用这种方法的缺陷是每个样品检测管数增加,造成检测成本增高,而且不能同时观察IL-4和IFN-C双阳性细胞。国外有报道采用IFN-C、I L-4和CD3进行3色标记[6],这种方法只能观察T淋巴细胞表达的细胞因子的变化,不能区分CD4+和CD8+细胞,笔者认为是一种不完善的方法。
我们在BALB/c小鼠实验发现在PMA的刺激下, CD4表达虽然下调,但是其表达持续时间比人的持续时间明显增长,在刺激8h后,仍然能维持一个较高的水平,因而能够有效的区分Th细胞。因此,在B ALB/c 小鼠采用CD4和IFN-C、IL-4进行3色标记技术就能有效的检测Th细胞亚群。当然由于CD3和C D8的表达受PMA的影响很小,采用CD3、C D8和I FN-C、IL-4进行4色标记技术也非常有效。另外,由于CD4不仅在T 细胞上表达,还在单核细胞上表达,单独用CD4设门容易受单核细胞的干扰,解决这个问题的一个办法就是采用FSC和SSC散点图来设门区分单核细胞和淋巴细胞,采用CD4直方图区分CD4阴性和阳性细胞,最后采用既位于淋巴细胞区,又位于C D4+区的细胞来定义为Th细胞,这样可以有效的避免单核细胞的干扰。当然采用4色标记也是一种非常有效的避免单核细胞干扰的方法。
由于T淋巴细胞表达的因子非常多,检测其它细胞因子可以参照检测IL-4和IFN-C的方法进行。凡是采用P MA等作为刺激剂的检测方法均应考虑到P MA 等刺激剂对于细胞表面抗原表达的影响,从而选择最佳的荧光抗体标记,这是进行准确的检测的基础。
参考文献:
[1]Rostaing L,Tkaczuk J,Durand M,e t al.Kinetics of intracytoplasmicTh1
and Th2c ytokine producti on asses sed by flo w cytometry following in vitro acti vation of peripheral blood mononuclear cell s[J].Cytometry,1999,35
(4):318-328.
[2]王晓栋,黎莉,沈南,等.顾越英Th1/Th2失衡在初发系统性
红斑狼疮患者中的研究[J].中华风湿病学杂志,2002,6(5):316 -319.
[3]唐志琴,黄繁嫱,韩锋,等.系统性红斑狼疮患者表达IFN-C和
IL-4的CD4+和CD8+细胞的变化[J].上海医学检验杂志,2003, 18(1):24-25.
[4]叶志中,李富荣,庄俊汉,等.系统性红斑狼疮患者Th1/Th2淋巴
细胞类型与疾病活动指数的相关性[J].中华风湿病学杂志,2001, 5(4):216-219.
[5]O.Nei-l Andersen N J,Lawrence D A.Differential modulation of s urface
and intracellular protei n expres sion by T cells after stimulation in the pres-ence of monensin or brefeldin A[J].Clin Diagn Lab Immunol,2002,9
(2):243-250.
[6]Nagy G,Pallinger E,Anta-l Sz al mas P,et al.Measurement of intracellular
interferon-gamma and i nterleukin-4in whole blood T lymphocytes from pa-tients wi th sys te mic lupus erythe matosus[J].Immunol Lett,2000,74(3): 207-210.
(编辑王红)
关于数字的用法
在各种出版物上数字的用法总的原则是:凡是可以使用阿拉伯数字,而且又很得体的地方均应使用阿拉伯数字。以下两种情况必须使用阿拉伯数字:
1公历世纪、年代、年、月、日和时刻例如:公元前5世纪、20世纪90年代、1995年6月8日14时30分。
表示年份要写全称,1995年不能写成95年或.95年;1953-1958年不能写成1953-58年。年月日可以写成1995-06-08。时刻用/:0分隔的形式。如:13时45分8秒可以写成13:45:08。
2计数和计量(整数、小数、分数、百分数、均数)包括序数、编号4位和4位以上的数字采用三位分节法,不用/千分撇0,节与节之间留半个阿拉伯数字的空隙(如20431改为2431)。年份、部分代号、仪器型号等非计量数字不用分节,也不加千分撇。尾数/00多,5位以上的数字,可以用/万0/亿0表示,但不得以十、百、千、百万、十亿等汉字表示,例如3579000可写成357.9万但不能写成3百57万千或357万9千。
本刊编辑部1848第三军医大学学报第26卷
流式细胞术的临床应用 一、在肿瘤学中的应用 这是FCM在临床医学中应用最早的一个领域。首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液，用荧光染料(碘化吡啶PI)染色后对细胞的DNA含量进行分析，PI可以与细胞内DNA和RNA结合，采用RNA抑制剂将RNA消化后，通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。由于细胞周期各时相的DNA含量不同，通常正常细胞的G1 / GO期具有二倍体细胞的DNA含量((2 N)，而G2/ M期具有四倍体细胞的DNA含量((4 N)，而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此，通过流式细胞术PI 染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1 / GO 期，S期和G2/ M期，并可通过特殊软件计算各时相的百分率，DNA含量直接代表细胞的倍体状态，非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。 1、发现癌前病变，协助肿瘤早期诊断 人体正常组织发生癌变要经过一个由量变到质变的漫长过程，而癌前细胞即处于量变过程中向癌细胞转化阶段。人体正常的体细胞均具有比较稳定的DNA二倍体含量。当人体发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变时，在其发生、发展过程中可伴随细胞DNA含量的异常改变，FCM可精确定量DNA含量的改变，作为诊断癌前病变发展至癌变中的一个有价值的标志，能对癌前病变的性质及发展趋势作出估价，有助于癌变的早期诊断。有资料证实，癌前病变的癌变发生率与细胞不典型增生程度有密切关系，增生程度越重，癌变发生率越高。随着细胞不典型增生程度的加重，DNA非整倍体出现率增高，这是癌变的一个重要标志。 2、在肿瘤的诊断、预后判断和治疗中的作用 FCM在肿瘤诊断中的重要作用已经被认可，DNA非整倍体细胞峰的存在可为肿瘤诊断提供有力的依据，FCM分析病理细胞具有速度快、信息量大，敏感度高等优点，已被用在常规工作中。肿瘤细胞DNA倍体分析对病人预后的判断有重要作用，异倍体肿瘤恶性病变的复发率高、转移率高、死亡率也高，而二倍体及近二倍体肿瘤的预后则较好。FCM不仅可对恶性肿瘤DNA含量进行分析，还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化去评估疗效，了解细胞动力学变化，对肿瘤化疗具有重要的意义。临床医师可以根据细胞周期各时相的分布情况，依据化疗药物对细胞动力学的干扰理论，设计最佳的治疗方案，从DNA直方图直接地看到瘤细胞的杀伤变化，及时选用有效的药物，对瘤细胞达到最大的杀伤效果。 3、FCM在细胞凋亡和多药耐药基因的研究中的作用 研究如何用药物诱导癌细胞死亡。通过对细胞体积、光散射、DNA含量及特异性抗原基因(如bcl-2, Fas等)测定分析出细胞凋亡情况。如可用Annexin V结合PI或7- AAD双染色法进行细胞凋亡分析。在凋亡的早期阶段，胞浆膜磷脂的不对称性丧失，导致膜内侧磷脂酞丝氨酸(PS)从细胞膜内层暴露于外层，从而可被PS特异的Annexin- V探针所标记。PS转移到细胞膜外不是细胞凋亡特有的，也可发生在细胞坏死中。但在凋亡的早期细胞膜是完整的，而细胞坏死时细胞膜的完整性被破坏。由于碘化丙锭(PI)或7-AAD对细胞膜完整的活细胞和早期凋亡细胞是拒染的，而对膜完整性被破坏的晚期凋亡细胞或坏死细胞可以染色。因此，Annexin- V结合PI或7-AAD进行双染色可以用于检测活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。正常活细胞不会被染色，凋亡细胞可被标记上Annexin-V，坏死和凋亡晚
流式细胞仪检测技术与质量 控制 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
流式细胞仪检测技术与质量控制 【摘要】流式细胞术（FCM）检测HLA等位基因是最近新建立的方法，与原有的分型技术相比，技术上有很大的改进和突破。流式细胞术已广泛用于临床常规检验中，为保证检验结果的可靠性，提高准确度和室间结果的可比性，流式细胞术质量控制越来越受到重视。它在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选，同传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精密度高、准确性好等特点。 【关键词】流式细胞术；检测技术；质量控制 流式细胞仪检验技术（FCM），即流式细胞术，是以流式细胞仪作为检测手段，以免疫荧光技术作为主要标记方法的一门先进的分析技术。该方法用免疫磁珠作为载体，在同一微孔内进行反应，利用流式细胞仪检测杂交信号和区分探针的种类。本技术使用的免疫磁珠具有一定的特性，磁珠可利用颜色进行标识[1]。当免疫磁珠上两种颜色混合的比例不同时，经流式细胞仪检测后即可区分定义为不同种类的免疫磁珠，目前两种颜色的组合在流式细胞仪上最多可区分成为100种不同的免疫磁珠。
1 材料与方法 1.1 标本收集 收集近3年本院治疗的30例患者，对30例患者行流式细胞仪检测，30例受检者中，男性患者16例，女性患者14例，最大年龄60岁，最小年龄17岁，患者平均年龄39岁。 2 检测方法 2.1 采用特定的免疫磁珠作为载体，将已知序列特异性探针（SSO）固定在免疫磁珠上，每一种特异性探针固定在已知颜色比例的免疫磁珠上。由于免疫磁珠上颜色比例的不同，在流式细胞仪红色激光束下可进行区分，根据事先设计的标记情况，通过流式细胞仪检测后可确认特定颜色比例免疫磁珠上携带的特异性探针的种类，从而达到将探针区分的目的。 2.2利用标记的特异性引物对目的DNA进行扩增，将PCR扩增产物与免疫磁珠上的序列特异性探针（SSO）在同一孔内进行特异性杂交，再加入荧光显色剂，然后利用流式细胞仪绿色激光束检测杂交信号，红色激光束区分探针的种类，利用软件分析杂交结果得出样本HLA基因型别。 3 方法学评价该方法与PCR-SSO有相似的地方，但是技术上有重大的突破。本方法灵敏度非常高，在
机体免疫状态是衡量机体是否患病的重要指标，目前多采用流式细胞术来监测机体的免疫状态，其中最重要的指标是检测T、B和NK淋巴细胞的水平。 T细胞主要包括T辅助细胞（Th）和T抑制细胞（Ts）细胞亚群。CD3+细胞代表外周血中总的成熟T细胞，理论上应约等于CD4+细胞和CD8+细胞的总和，但往往出现CD4+加CD8+细胞之和大于CD3+，这是因为CD4+细胞包括CD3+/CD4+细胞（真正Th细胞）和CD3-CD4+细胞（非Ts细胞），而后者包括CD3-CD8+CD16+56+细胞（一部分NK细胞）和CD3-CD8+CD16+56-（未知细胞）。由此可见，真正的TH细胞是CD3+CD4+细胞，真正Ts细胞是CD3+CD8+细胞。尤其当患者NK细胞明显增加时，会使CD4细胞和CD8细胞的总和远大于CD3+细胞，因此，用三色荧光标记才能分析真正的辅助性T细胞和抑制性T细胞。 首先在淋巴细胞中识别出CD3细胞，然后在CD3细胞中再区分CD4+和CD8+细胞。NK细胞的表面无T细胞和B细胞表面标志，但有CD16和CD56等标志，用CD16+56抗体能鉴定出NK细胞（一定是CD3阴性），CD3-CD16+56+细胞才是真正的NK细胞。根据是否表达CD8，又可将NK细胞分为CD3-CD8+CD16+56+细胞（所占比例小，不影响CD8比例）和CD3-CD8-CD16+56+细胞（主要成分）。 B细胞的表面标志是CD19，理论上CD3-CD19+细胞才是真正的B淋巴细胞。但 CD3+CD19+细胞很少，可忽略不计，所以CD19+细胞就是B淋巴细胞。 在抗肿瘤效应中，CD4和CD8分别是T淋巴细胞的辅助／诱导细胞亚群与抑制/细胞毒细胞亚群，CD4细胞的主要功能是通过其分泌的淋巴因子，增强和扩大免疫应答过程，辅助诱导其它免疫细胞如杀伤性T细胞，B细胞等共同发挥抗肿瘤作用，CD4细胞的减少，导致免疫功能低下。CD4/CD8比值是重要的免疫状态监测指标，其比例的降低与免疫系统损害的程度相关。 CD4降低见于恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷症、艾滋病、应用免疫抑制剂者；CD8降低见于自身免疫性疾病或变态反应性疾病；CD4/CD8比值升高见于恶性肿瘤、自身免疫性疾病、变态反应、病毒感染等；CD4/CD8比值降低见于艾滋病(常小于0.5)。监测器官移植排斥反应时，CD4/CD8比值升高预示可能发生排斥反应。
精品文档，放心下载，放心阅读 流式细胞仪常用的几种检测方法（转载） 一、测定用乙醇固定的DNA的含量 1、培养细胞的DNA含量的测定精品文档，超值下载 制备单细胞悬液于200μl的PBS缓冲液中； 加入2ml预冷的70%乙醇，4℃保存； 附:细胞固定的一般步骤 1) 取单细胞悬液1～2×106个细胞于PBS（PH=7.2）缓冲液中； 2) 300g离心5分钟，弃上清，反复两次； 3) 重悬细胞于0.5ml PBS缓冲液中； 4) 将细胞悬液放置于2～3ml冷70%乙醇中，混匀，保存于4℃，至少30分 钟。在4℃条件下可保存2~3周。 注意： 2根据实验的要求，固定剂也可选用1～3%多聚甲醛； 2将乙醇作为固定剂时，乙醇应预冷至0～4℃； 2细胞在固定时，固定剂应缓慢滴入细胞悬液中，使固定剂的浓度缓慢增加，并不断震摇，以免细胞成团（特别是用乙醇固定时）。 2 300g离心5分钟，去上清，再重悬于400μl PBS中； 2显微镜下观察，若有明显的黏附，须再用筛网过滤； 2加入PI（含Rnase），避光孵育30分钟； 2上机检测。 2、新鲜组织的DNA含量的测定 1) 用200mg湿重组织用机械法制成单细胞悬液； 2) 500g离心5分钟； 3) 弃上清，重悬于10ml染色-去污剂中； 4) 再过滤，用200目的筛网或70~80μm的筛网过滤； 5) 上机检测。 3、石蜡包埋组织切片的DNA含量的测定 1) 从石蜡包埋切取切片50 μm厚，2~3片，制成单细胞悬液； 2) 用PBS缓冲液洗涤，500g离心5分钟，弃上清； 3) 加入PI液1ml室温避光30分钟； 4) 调整细胞浓度为1×106/ml； 5) 上机检测。
一、流式淋巴细胞亚群检测的临床意义 1.了解不同情况下机体免疫功能状态 肿瘤（手术、放化疗患者的免疫功能检测） 感染（脓毒血症、重症监护患者等） 自身免疫病、免疫缺陷病等 不孕不育 某些血液系统疾病 其他：慢性肾病、骨髓移植恢复期等 2.辅助临床疾病的诊断 3.探索疾病的发病机理、病程及预后 4.观察监测疗效，指导临床建立治疗方案 二、淋巴细胞的分类及功能 B细胞(CD19+)：体液免疫 辅助/诱导T细胞(Th):介导和增强免疫应答 (CD4+) 淋巴细胞T细胞(CD3+）细胞毒性(Tc) /抑制性T细胞(Ts): 抗病毒、抗肿瘤 (CD8+) 调节性T 细胞(Treg):抑制免疫应答、维持免疫耐受 (CD4+CD25+) NK细胞：抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节 (CD16+/CD56+) 三、流式淋巴细胞亚群检测的临床应用 淋巴细胞亚群检测与儿科疾病 （一）评估机体免疫功能状态 多种小儿疾病原发或继发疾病均存在T细胞异常，观察T细胞变化，对小儿疾病病因、发病机制以及协助临床诊断与治疗等具有重要价值。 类型指标CD3+ CD4+CD8+CD4+/CD8+细菌性肺炎↓↓↓↓↑↓↓ 支原体肺炎↓↓↓↓↓↓↓↓ 病毒性肺炎↓↓↓↓↓↓↓↓ 传单增多症↑↑↓↓↑↑↓↓ 支气管哮喘↑↓↑
T 细胞CD4、CD8、CD3 检测介入时间-----结合退热、消咳、肺罗音消失时间观察T 细胞变化，特别针对儿科患者可合理调节抗生素使用，改善预后，避免药物损伤. （二）原发性免疫缺陷病的早期识别和干预 1.流式细胞仪分析T细胞亚群(包括CD3+、CD4+和CD8+)、B细胞(CD19+) 和NK细 胞(CD16+/CD56+)比例等主要检查项目,可对大多数原发性免疫缺陷病患儿作出诊断。 2.评估免疫接种前机体免疫状态 案例：T/B细胞联合免疫缺陷患 儿，未评价免疫系统功能，直接 接种灭活疫苗，造成严重感染T 细胞CD4、CD8、CD3 检测介入时间-----结合患儿科反复感染的临床症状及时检测； 在疫苗接种前2-3天作出评估。 淋巴细胞亚群检测在肿瘤临床的应用 恶性肿瘤的发生、发展、转移与人体免疫功能下降密切相关。人体的抗肿瘤免疫以细胞 免疫为主，体内发挥抗肿瘤免疫作用主要由CD4和CD8细胞完成。 （一）评价肿瘤患者的整体免疫功能 1．肿瘤患者处免疫抑制状态，T淋巴细胞降低。 2．肿瘤患者T淋巴细胞与病程相关，随病程逐渐降低。 CD3、CD4、CD4/CD8细胞数下降程度：Ⅳ期> Ⅲ期> Ⅱ期>Ⅰ期3．肿瘤患者T淋巴细胞持续低下，转移率高、易复发
流式细胞仪常用的几种检测方法（转载） 一、测定用乙醇固定的DNA的含量 1、培养细胞的DNA含量的测定 制备单细胞悬液于200μl的PBS缓冲液中； 加入2ml预冷的70%乙醇，4℃保存； 附:细胞固定的一般步骤 1) 取单细胞悬液1～2×106个细胞于PBS（PH=7.2）缓冲液中； 2) 300g离心5分钟，弃上清，反复两次； 3) 重悬细胞于0.5ml PBS缓冲液中； 4) 将细胞悬液放置于2～3ml冷70%乙醇中，混匀，保存于4℃，至少30分 钟。在4℃条件下可保存2~3周。 注意： 2根据实验的要求，固定剂也可选用1～3%多聚甲醛； 2将乙醇作为固定剂时，乙醇应预冷至0～4℃； 2细胞在固定时，固定剂应缓慢滴入细胞悬液中，使固定剂的浓度缓慢增加，并不断震摇，以免细胞成团（特别是用乙醇固定时）。 2 300g离心5分钟，去上清，再重悬于400μl PBS中； 2显微镜下观察，若有明显的黏附，须再用筛网过滤； 2加入PI（含Rnase），避光孵育30分钟； 2上机检测。 2、新鲜组织的DNA含量的测定 1) 用200mg湿重组织用机械法制成单细胞悬液； 2) 500g离心5分钟； 3) 弃上清，重悬于10ml染色-去污剂中； 4) 再过滤，用200目的筛网或70~80μm的筛网过滤； 5) 上机检测。 3、石蜡包埋组织切片的DNA含量的测定 1) 从石蜡包埋切取切片50 μm厚，2~3片，制成单细胞悬液； 2) 用PBS缓冲液洗涤，500g离心5分钟，弃上清； 3) 加入PI液1ml室温避光30分钟； 4) 调整细胞浓度为1×106/ml； 5) 上机检测。 二、细胞凋亡检测及相关分子检测 1、细胞DNA含量分布（由细胞DNA降解方式检测细胞凋亡）
流式细胞仪实验方法 一、实验准备 1．标本制备： 2．最小化非特异性结合： 二、凋亡 1．凋亡的检测方法：网站和其它 2．PI染色法 3．Annexin V 法 4．TUNNEL法 三、细胞因子 1．激活的细胞因子 2．CBA 四、血小板 1．活化 2．活化检测 3．网织血小板 五、红细胞 1．网织红细胞 2．PNH 3．胎儿红细胞 六、肿瘤学 1．DNA 细胞周期 2．蛋白 3．多药耐药 4．微小残留白血病
第一部分标本处理 一、流式细胞术常规检测时的样品制备 (一)直接免疫荧光标记法 取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。 (二)间接免疫荧光标记法 取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。 二、最小化非特异性结合的方法 1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。 2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性的交互作用来降低背景。 3．在使用第一抗体之后，将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。 通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。此步骤适用于很多方面，但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合，或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。 4．使用F(ab’)2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。大多数的第二抗体的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗体的F(ab’)2片段一般是不能利用或很难制作。因此，在NaN3存在的条件下，将新鲜组织或细胞与正常血清一起培育应选择优先加入第一抗体。在此情况下，即使在随后的步骤中用完所有的抗体分子，FC受体决定的背景影响已不再重要。 5．其它：已标记的抗体和其他一些内在的免疫球蛋白或加入实验系统中的其它物质的交叉反应也可能会有背景影响。为了降低背景，在多重标记过程中，所有的已标记的抗体应被吸附，避免其他种类蛋白的交叉反应。
一、目的： 保证流式细胞仪检测外周血中T淋巴细胞亚群检验的工作质量，旨在保证正确的T淋巴细胞亚群检测标准操作程序和控制检测结果的精确度与准确度。 二、修改程序： 本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：质量主管、授权人（科主任），方可改动。 三、适用范围： 外周血中T淋巴细胞亚群的绝对计数检测。 四、实验原理： 人的T淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可分为二大类：辅助/诱导T细胞和抑制/细胞毒T细胞。辅助/诱导T淋巴细胞表达CD3和CD4；抑制/细胞毒T细胞表达CD3和CD8。利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面抗原结合，再配多色荧光染料以及绝对计数管，即可以把T淋巴细胞区分为两种亚型，进面得到各亚群的绝对值。 六、主要试剂： CD4-FITC／CD8-PE／CD3-APC／CD45-PC7 (美国BCs公司；CAT:IM3548)， 七、实验操作： 1、标本采集：使用EDTA-K2抗凝真空采血管，抽取静脉血2ml。 2、染色和固定细胞： （1）标本管编号A，取一只流式专用管A1。 （2）A1管加入CD4-FITC／CD8-PE／CD3-APC／CD45-PC7 20ul。 （3）A1管中再加入全血100ul，混均。 （4）置室温，避光孵育15min。
（5）加入FACSLysing溶血液2.0ml，置室温，避光孵育10min。 （6）300g离心5min，弃上清液。 （7）PBS洗涤细胞两次，300g离心5min，弃上清液。 3、上机检测；分析结果；打印实验报告。 八、参考值： 总T细胞（CD3+）：59.4-84.6 辅助/诱导T细胞(CD3+CD4+): 28.5-60.5 抑制/细胞毒T细胞(CD3+CD8+): 11.1-38.3 Th/Ts: 0.9-3.6 九、临床意义： T淋巴细胞可以分为辅助/诱导T细胞和抑制/细胞毒T细胞。测定CD4和CD8可用于化疗、自身免疫病的免疫监视。在造血干细胞移植患者中，CD4+细胞恢复晚于CD8+细胞，导致Th/Ts比例显著下降。HIV及某些病毒感染（EB病毒、SARS病毒等）患者Th/Ts比例也下降显著。 十、质量控制： 1、先用标准微球调整仪器，正确设置电压、补偿。 2、健康人CD4+细胞加CD8+细胞总数应大约等于CD3总数；免疫病、淋 巴瘤可能有较大差异。 3、收集细胞太少（少于500个）、碎片污染太多（超过10%）、门中淋巴细 胞不纯（小于90%）可能引起实验结果不正确。 4、建议使用逻辑设门方法（CD45-SSC设门与FSC-SSC设门）减少杂质的 干干扰。
流式细胞仪检测技术与质量控制 【摘要】流式细胞术（FCM）检测HLA等位基因是最近新建立的方法，与原有的分型技术相比，技术上有很大的改进和突破。流式细胞术已广泛用于临床常规检验中，为保证检验结果的可靠性，提高准确度和室间结果的可比性，流式细胞术质量控制越来越受到重视。它在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选，同传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精密度高、准确性好等特点。 【关键词】流式细胞术；检测技术；质量控制 流式细胞仪检验技术（FCM），即流式细胞术，是以流式细胞仪作为检测手段，以免疫荧光技术作为主要标记方法的一门先进的分析技术。该方法用免疫磁珠作为载体，在同一微孔内进行反应，利用流式细胞仪检测杂交信号和区分探针的种类。本技术使用的免疫磁珠具有一定的特性，磁珠可利用颜色进行标识[1]。当免疫磁珠上两种颜色混合的比例不同时，经流式细胞仪检测后即可区分定义为不同种类的免疫磁珠，目前两种颜色的组合在流式细胞仪上最多可区分成为100种不同的免疫磁珠。
1 材料与方法 1.1 标本收集 收集近3年本院治疗的30例患者，对30例患者行流式细胞仪检测，30例受检者中，男性患者16例，女性患者14例，最大年龄60岁，最小年龄17岁，患者平均年龄39岁。 2 检测方法 2.1 采用特定的免疫磁珠作为载体，将已知序列特异性探针（SSO）固定在免疫磁珠上，每一种特异性探针固定在已知颜色比例的免疫磁珠上。由于免疫磁珠上颜色比例的不同，在流式细胞仪红色激光束下可进行区分，根据事先设计的标记情况，通过流式细胞仪检测后可确认特定颜色比例免疫磁珠上携带的特异性探针的种类，从而达到将探针区分的目的。 2.2利用标记的特异性引物对目的DNA进行扩增，将PCR扩增产物与免疫磁珠上的序列特异性探针（SSO）在同一孔内进行特异性杂交，再加入荧光显色剂，然后利用流式细胞仪绿色激光束检测杂交信号，红色激光束区分探针的种类，利用软件分析杂交结果得出样本HLA基因型别。 3 方法学评价该方法与PCR-SSO有相似的地方，但是技术上有重大的突破。本方法灵敏度非常高，
流式细胞仪检测细胞凋亡:PI单染色法 基本原理 其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面： 1. 细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。 2. 光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。也可用于活细胞的分类。 试剂与仪器 PBS溶液； PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。用棕色瓶4℃避光保存。 70%乙醇 400目筛网 流式细胞仪 实验步骤 1. 收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去培养液。 2. 3ml PBS洗涤1次。 3. 离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定，4℃，1—2小时。 4. 离心弃去固定液，3mlPBS重悬5min。 5. 400目的筛网过滤1次，500—1000r/min离心5min，弃去PBS。 6. 用1ml PI染液染色，4℃避光30min。 7. 流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激光光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光分析PI荧光强度的直方图也可分析前散射光对侧散射光的散点图。 8. 结果判断：在前散射光对侧散射光的散点图或地形图上，凋亡细胞与正常细胞相比，前散射光降低，而侧散射光可高可低，与细胞的类型有关；在分析PI荧光的直方图时，先用门技术排除成双或聚集的细胞以及发微弱荧光的细胞碎片，在PI荧光的直方图上，凋亡细胞在G1/G0期前出现一亚二倍体峰。如以G1/G0期所在位置的荧光强度为1.0，则一个典型的凋亡细胞样本其亚二倍体峰的荧光强度为0.45，可用鸡和鲑鱼的红细胞的PI荧光强度做参照标准，两者分别为0.35和0.7，可以确保在两者之间的不是细胞碎片而是完整的细胞。 注意事项 细胞凋亡时，其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一，但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低，或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结果时应该注意。
细胞内细胞因子的流式细胞仪检测 一、简介 随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比。目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。 早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。尽管研究应用T 淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1(IL－2，IFN－ )与TH2(IL－4，IL－5，IL－10)，但这些研究很难外推，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。 近来，Jung与Picker采用了monensin、PMA等药物预孵，用Brefeldin(BFA)、Monensin 阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。因为自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。在体外刺激过程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。 胞内流式分析法是用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。具有其它方法难以比拟的优点：
Annexin Ⅴ-FITC 细胞凋亡试剂盒使用（细菌） K：不加菲A：5000ug/L菲B: 500ug/L C: 500ug/L 1、在0,24,48,72h取样3ml，测定OD600 2、在0,24,48,72h取样，三个平行各取1ml,混匀，6000r/min,离心20分钟，弃上清，收集细胞，用5mlPBS轻轻重悬（注意：PBS重悬不能省略，PBS重悬的过程同时也起到了洗涤细胞的作用，可以保证后续Annexin V-FITC的结合。） 3、实验组（4组）：取K、A、B、C组重悬的细胞，加入5mg/ml的溶菌酶2ml,35℃水浴30Min,6000r/min,离心10分钟，弃上清。 4、实验组：各取K、A、B、C组0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml左右,混匀。加入10μl Annexin V-FITC，轻轻混匀；再加入100μl碘化丙啶，轻轻混匀。室温(20～25℃)避光孵育10分钟。 5、阳性对照组：取2份K组菌液0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml左右,混匀。1管放入沸腾的蒸馏水中煮30min（杀死细胞）,然后加入100μl 碘化丙啶（PI）单染，轻轻混匀，另1管加入10ul Annexin V-FITC单染，轻轻混匀。室温(20～25℃)避光孵育10分钟。 6、阴性对照组：另取1份K组菌液0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml，混匀，不加任何染色剂。 7、将样品过400目筛网，进行流式细胞仪检测。 8、Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。 9、因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。 10、用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488 nm; 发射波长Em=530 nm。Annexin V-FITC 的绿色荧光通过FITC 通道（FL1）检测；PI 红色荧光通过PI 通道（FL2 或FL3）检测，建议使用FL3。荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。 二醋酸酯荧光素（FDA）与碘化丙啶的流式细胞术 1、在0,24,48,72h取样3ml，测定OD600 2、在0,24,48,72h取样，三个平行各取1ml,混匀，6000r/min,离心20分钟，弃上清，收集细胞，用5ml PBS轻轻重悬 3、取K、A、B、C组重悬的细胞，加入5mg/ml的溶菌酶2ml,35℃水浴30Min,6000r/min,离心10分钟，弃上清。 4、实验组：各取K、A、B、C组0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml左右,混匀。加入200μl FDA，轻轻混匀；再加入100μl碘化丙啶，轻轻混匀。室温(20～25℃)避光孵育10分钟。 5、阳性对照组：取2份K组菌液0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml左右,混匀。1管放入沸腾的蒸馏水中煮30min（杀死细胞）,然后加入100μl 碘化丙啶（PI）单染，轻轻混匀，另1管加入200ul FDA单染，轻轻混匀。室温(20～25℃)避光孵育10分钟。 6、阴性对照组：另取1份K组菌液0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml，混匀，不加任何染色剂。 7、将样品过400目筛网，进行流式细胞仪检测。
2.2.2.5 流式细胞术检测细胞周期 2.2.2.5.1 实验原理 用流式细胞仪检测细胞周期，通常用碘化丙啶（propidium iodide，PI）染细胞核。PI在一定波长的光下发出荧光，其强度与DNA含量成正比。通过流式细胞仪分析各时期的细胞百分数，可检测细胞的增殖、凋亡。 2.2.2.5.2流式细胞仪检测A549细胞周期步骤 收集对数生长期细胞，计数，以(1~5)×105/孔接种于6孔板，置37℃，5％CO2条件下培养过夜，使细胞贴壁。次日更换培养液，各孔分别加入含有0、80、400、2000、10000 mg/L不同浓度茶氨酸的细胞培养液2 mL/孔，继续常规培养；每24 h同法换液一次。每个浓度设3个重复。 48 h后，中止培养，胰酶消化后，收集细胞于流式管1000 r/min离心5min，弃上，冷PBS洗涤细胞3次，离心去上清； 一边震荡一边向细胞沉淀中加入70%预冷乙醇混匀，4℃固定18 h以上；离心，弃去乙醇上清，加入预冷的PBS洗沉淀1次，离心去上清； 加入RNA酶（50 mg/L）10 μL/孔和PI（50 mg/L）300 μL/孔，震荡混匀。室温、避光反应30 min； 流式细胞仪进行DNA检测，用Modifit软件分析各时相细胞周期的比例。 2.2.2.6流式细胞仪检测A549细胞凋亡 2.2.2.6.1实验原理 在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。AnnexinV 是一种分子量为35～36 kD的Ca2＋依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。 碘化丙啶（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将AnnexinV与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。 2.2.2.6.2 结果判断 凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI 有抗染性，坏死细胞则不能。 细胞膜有损伤的细胞的DNA 可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI 不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象
流式细胞术样品制备技术 流式细胞术对细胞的分析检测必须基于单细胞的基础上，这是流式细胞术的基本要求。因此就必须把实体组织制备成单细胞悬液。在应用FCM技术中，制备出合格的单分散细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。它要求这种分散细胞方法既要使细胞成为单个细胞，又能保持细胞的固有生物化学成分及生物学特性。 流式细胞术样品制备大致可分为下面五个步骤：①取材：取手术或活检组织必须具有代表性，如取手术肿瘤组织，必须取瘤细胞生长旺盛部位；组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜；一般在室温1个小时之处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存；②对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色；③按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储；④再依照软件提供的程序对检测结果进行定量分析；⑤检测分析结果在生物、医学上的意义进行分析和评价。 第1节样本单细胞悬液的制备方法 一新鲜实体组织样本的制备 FCM对单细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上，根据各种组织成分的特点，可选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。尽管标本制备已形成了标准化的程序，但实际操作中总会出现这样或那样的问题。在实体组织分散为单个细胞过程中，解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性质、形态、结构、功能等。所以，在对各种不同组织进行分散选择方法时，应尽量减少对细胞的这种影响。目前常用的分散组织细胞的方法有如下3种。 （一）酶消化法 1 作用原理： 对实体组织分散的作用原理主要有3方面：①可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等；②可以水解组织间的粘多糖等物质；③可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质物质。酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。常用的酶类试剂有：蛋白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子类型的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。不同酶对细胞和细胞间不同组分有特异作用，可根据分散组织类型来确定使用的酶类。 2 注意事项： ①酶需要溶解于适当的溶液中，而这些溶液不致于造成酶效价降低；②要注意酶的使用浓度和消化时间；③要注意酶活性的PH值。如胃蛋白酶在碱性环境中失去活性，胰蛋白酶在中性溶剂中活性不佳等；④要随时注意影响酶活性的其它因素，如酶的生产批号等。 3 方法学程序 （1）将适合于酶消化的组织置于离心管中； （2）将选好的酶溶液1-2ml加入盛有被消化组织的试管中； （3）一般消化20-30分钟（恒温37℃或室温），消化期间要间断振荡或吹打； （4）终止消化，收集细胞悬液，以300目尼龙网过滤，除去细胞团块，以低速成离心除去细胞碎片；
细胞内细胞因子的流式细胞仪检测 点击次数：621 作者：佚名发表于：2008-07-24 15:51转载请注明来自丁香园 来源：51protocol 一、简介 随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比。目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。 早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆">克隆细胞的激活。尽管研究应用T淋巴细胞克隆">）与TH2（IL－4，IL－5，IL－10），但这些研究很难外推，因为T细胞克隆"克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1（IL－2，IFN－>克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。 近来，Jung与Picker采用了monensin、PMA等药物预孵，用Brefeldin（BFA）、Monensin阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。因为自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。在体外刺激过程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。且这些研究清楚地证明，只有
淋巴细胞亚群检测 检测对象 原则：免疫功能受损者均应常规评估淋巴细胞亚群 免疫功能包括： 免疫防御功能 免疫自稳和耐受功能 免疫监视功能 免疫防御功能受损 易发生感染 反复感染 严重感染 多种病原与特殊病原感染 常规治疗效果不佳的感染 除了宿主免疫防御受损容易造成上述少见感染状况之外，感染本身也可造成继发性免疫防御受损，因此免疫评估应注意原发和继发两方面的问题。 免疫自稳和耐受功能受损 过敏性疾病：并非所有这类患者都需要进行淋巴细胞亚群的检测。对于一些严重的过敏患者应考虑淋巴细胞亚群的检测。
①婴幼儿时期全身严重湿疹样表现。 ②嗜酸性粒细胞显著增多 ③血清IgE水平明显增高（IgE>1000IU/L） ④伴有反复、严重感染的患者 自身免疫和自身炎症性疾病 ①存在难以控制的自身免疫反应情况及出现明显的自身免疫性淋巴增殖情况 ②合并反复感染的患者 ③存在自身炎症反应 ④长期免疫抑制药物、生物制剂使用前后 免疫监视功能受损 主要引起肿瘤 血液系统肿瘤：儿童时期最为多见的是血液系统肿瘤 其他肿瘤及实体瘤：其他系统肿瘤患者也应酌情进行淋巴细胞亚群的检测，既可能存在原发性淋巴细胞亚群的异常，也可能出现继发性改变，尤其是进行各种化疗时，淋巴细胞亚群大多会受到影响 其他特殊情况 血常规中淋巴细胞明显异常 家族成员中有免疫缺陷病史
长期使用免疫抑制剂者 淋巴细胞亚群分析结果判读，应对淋巴细胞亚群的相对计数和绝对计数分别进行判别。 结果分析 (一)基本数据判断 1．相对计数的3个基本公式： FCM检测淋巴细胞亚群结果应首先根据下述3个公式进行评估[15]。公式1: CD3＋%＋CD19＋%＋CD16＋/CD56＋%＝100%±5% 公式2：CD4＋%＋CD8＋%＝CD3＋%±5% 公式3：CD4＋/CD8＋比值>1.0(1.5～2.0，新生儿期可达4.0) 2．相对计数基本公式意义： (1) CD3＋%＋CD19＋%＋CD16＋/CD56＋%明显大于或小于100%±5%，提示检测系统异常或存在明显淋巴细胞亚群异常。(2) CD4＋%＋CD8＋%之和明显大于或小于CD3＋%±5%，提示存在双阳性(CD4＋CD8＋)或双阴性(CD4-CD8-)T淋巴细胞。(3)一般情况CD4＋/CD8＋比值>1，年龄越小CD4＋/CD8＋比值越大。CD4＋/CD8＋比值<1，提示T淋巴细胞亚群存在异常。 3.绝对计数的判断： 绝对数标准不同仪器和年龄段及人群存在差别。个体间变化也比较大。各个实验室所采用的标准有所不同。应根据实验室的参考范围进
流式细胞术及其应用教程 The course of flow cytometry and its application 课程简介 该课程包括理论和实习两部分，理论课程重点介绍与流式细胞术密切相关的基本原理、结构及其在临床和科研工作中的应用。内容包括流式细胞术的基本原理、流式细胞仪数据的采集和分析、血细胞分化发育过程、流式细胞术在免疫学、血液学、肿瘤学及科研工作中的应用。通过理论授课使研究生能够掌握上述领域的基本理论和最新研究进展，达到提高研究生流式细胞术应用水平、拓展研究生思路、开阔眼界，为培养复合型人才打下基础。实习内容包括标本制备、仪器的调节与质控、淋巴细胞亚群分析、HLA-B27检测、胞膜、内抗原检测、红细胞CD55、CD59检测、血小板膜糖蛋白分析、DNA倍体分析及细胞因子检测。通过实习使研究生进一步熟悉流式细胞仪的使用程序，操作规程，为今后的工作、学习提高帮助。 This course includes in lecture teaching and practice lesson. The lecture teaching will be focused on flow cytometric basic theory, structure, data collection and analysis, application in clinic and research. The practice lesson will be focused on sample preparation, instrument setting, analysis of lymphocytes, HLA-B27，extracellular antigen and intracellular antigen, analysis of CD55,CD59, DNA ploidy analysis and cytokine detection. 教学大纲 一、课程名称：流式细胞术及其应用教程 二、总学时数：38学时，2学分 理论课18学时 实验课20学时 三、授课对象： 博士生、硕士生，专业不限