神经干细胞体外诱导分化为胆碱能神经元的研究进展
硕士研究生孙晓静导师孙莉
传统的观点认为，“中枢神经细胞不可再生”，然而自1992年Reynolds等从成年鼠脑纹状体和海马中首次分离出了神经干细胞（NSC）,且它与多能干细胞一样具有自我更新、分裂增殖、多向分化的潜能，此后人们开始深入了解神经干细胞。Erikson等于1998年也证实了人脑中同样存在神经干细胞，随后的研究发现成年脑中神经干细胞主要存在于侧脑室外侧壁脑室下区和海马齿状回中。随着近年来对中枢神经系统的损伤或病变部位实行细胞替代或移植治疗的研究深入，为中枢神经系统损伤、神经系统变性疾病或神经退行性疾病等的治疗提供了新的方向。
阿尔茨海默病（AD）是老年人常见的一种慢性进行性神经系统变性疾病。长期以来认为前脑胆碱能投射系统（尤其是Meynert基底核）胆碱能神经元变性、细胞数量减少等导致AD认知功能不可逆的减退。目前就其病因有多种学说：如基因学说（APP基因[ 1 ]、早老蛋白基因[ 2 ] 、ApoE基因[ 3 ] ）、胆碱能假说、雌激素水平下降学说[4] 、氧化应激学说[ 5 ] 、铝中毒学说、炎症学说[6 ] 、神经营养因子学说[7 ] 等。此外，AD还可能与年龄、种族、社会心理因素及各种疾病史等多种因素有关。
综上所述, 多因素参与AD 发病, 但目前为止确切的发病机制尚不清楚。其治疗方法包括对于轻度和中度AD 予以乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂以提高认知功能, 以及N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)拮
抗剂对重度AD 的治疗[8],其他药物如脑循环改善药物剂、AChE 抑制剂、M1 胆碱受体激动剂、乙酰胆碱释放促进剂、神经生长因子、抗氧化药物和抗β-淀粉样药物等。这些治疗手段虽能减轻AD 的症状, 但无法补充大脑皮层和海马大量丢失的神经细胞,因而对中、晚期AD 患者的疗效有限。神经干细胞(NSCs)的广泛研究及重大进展为AD 的治疗提供了一个更有前景的治疗策略，NSC移植治疗AD等退行性疾病成为近年来的研究热点。然而不管是诱导、促进内源性NSCs增殖分化，产生相应的神经细胞代替缺损变性的细胞，还是体外培养需要的NSCs移植入体内，如何诱导NSCs定向分化为胆碱能神经元都是一个至关重要的问题。
神经干细胞增殖、分化相关因素
神经干细胞的增殖、迁移、分化与多种因素相关。目前的研究认为决定神经干细胞定向分化的机制有两种：一种是细胞自身基因调控；另一种是外来因素调控，主要为各类细胞因子家族，如神经营养因子、生长因子、细胞黏附因子等均可影响神经细胞的分化，其影响机制各不相同。不同的细胞因子诱导分化出的神经元不同。研究最多有生长因子如：表皮生长因子（EGF）家族、碱性成纤维细胞生长因子（FGF）家族、β-转导生长因子（β-TGF）超家族、神经营养因子、脑源性生长因子及化学诱导剂及药物等。
一、生长因子
碱性成纤维生长因子(FGF)在神经干细胞增殖的早期阶段发挥促有丝分裂的作用, 使神经干组胞获得对另一作用更强的促有丝分裂
因子表皮生长因子（EGF）的反应性;而表皮生长因子在神经干细胞增殖后期发挥作用[9]。两种因子对神经干细胞分化方向的作用也不相同, 碱性成纤维生长因子能增加干细胞向神经元分化的比例, 而表皮生长因子敏感的干细胞生成的神经元常常少于1%, 绝大多数是星形胶质细胞, 且这两种生长因子作用的神经干细胞分化形成的神经元多为γ- 氨基丁酸能神经元[10]。Tarasenko 等[9]比较碱性成纤维生长因子、表皮生长因子和外源性白血病抑制因子联合及单独应用对培养的人胚神经干细胞的影响, 发现上述 3 种生长因子联合应用对人胚神经干细胞的扩增最有效, 人胚神经干细胞在有碱性成纤维生长因子, 肝素及层粘连蛋白的联合作用下往胆碱能神经元方向分化。
二、转化生长因子β超家族
骨形成蛋白是转化生长因子β超家族中最大成员。在原肠胚期, 骨形成蛋白首先表现为抑制神经外胚层的形成; 在神经管期,不同浓度的骨形成蛋白和其他细胞因子共同促进神经管背部不同类型神经细胞的分化; 在发育晚期, 作用于腹侧区的神经前体细胞, 抑制这些细胞分化为神经元及少突胶质细胞, 促进其分化为星形胶质细胞,同时也作用于非腹侧区的神经前体细胞, 促进其存活及分化[11]。骨形成蛋白 2 可以明显抑制Oligr2(促进神经前体细胞向神经元和少突胶质细胞分化的一种重要转录调控因子)的表达, 从而抑制少突胶质细胞分化[12]。V arley 等试验研究证明骨形成蛋白 2 是神经嵴细胞向肾上腺素能神经元分化的有效调节物[13]。在中枢神经系统发育中,
骨形成蛋白2 在室管膜区表面有表达, 可以启动VZ 内的新皮层前体神经细胞向神经元分化。体外培养的神经上皮细胞在骨形成蛋白 2 作用24 h 之后, 可以增加分化产物中神经元数目, 提示骨形成蛋白
2 能够促进神经干细胞向神经元分化。
三、神经营养因子、脑源性生长因子
神经营养因子刺激鸟类神经管前体细胞分化为运动神经元, 但对分化的离体运动神经元的存活总数则无明显影响。但是神经营养因子对细胞分化的影响似乎是通过促进已分化的神经细胞的成熟, 而不是使未分化的多能干细胞向神经元分化。脑源性生长因子、胰岛素样生长因子、血小板源性生长因子等被证实增加神经干细胞向神经元表型方向的分化。睫状神经营养因子和白血病抑制因子作用于多潜能神经干细胞, 诱导它们分化成星形胶质细胞;而甲状腺素T3 则促使其分化为少突胶质细胞[14]。Kim 等[15]研究表明, 粒- 巨噬细胞集落刺激因子可促进神经祖细胞增殖, 抑制其分化及凋亡。另外, 参与神经干细胞诱导分化的细胞因子有细胞因子白细胞介素类, 如白介素1α具有诱导人神经干细胞向多巴胺神经元分化的作用, 联合应用白介素1α、白介素11、白血病抑制因子和胶质细胞源性神经营养因子对人神经干细胞向成熟的多巴胺神经元分化具有协同作用[16]。
四、化学诱导剂及药物
化学诱导剂被引进神经干细胞体外诱导实验中并被证实有效, 邓红等[17]分离培养新生大鼠纹状体脊髓神经干细胞, 观察不同浓度
全反式视黄酸对脊髓神经干细胞的影响, 结果发现全反式视黄酸诱导脊髓神经干细胞向神经元方向分化, 其作用在一定范围内呈剂量依赖性, 脊髓神经干细胞的RARβ基因的表达对全反式视黄酸存在剂量依赖性和时间依赖性。王飞等[18]用不同浓度(0.5 μmol/L、1μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L)的全反式维甲酸在体外诱导人胚胎神经干细胞, 全反式维甲酸能显著提高人胚胎神经干细胞分化为神经元的比例, 其中1 μmol/L的维甲酸诱导人胚胎神经干细胞分化为神经元的比例最高。
目前已知，细胞因子、生长因子以及内环境等因素的作用可诱导神经干细胞向不同的终末神经细胞分化，诸如成纤维细胞生长因子诱导神经干细胞的主要分化方向是γ-氨基丁酸能神经元；鼠胶质细胞源性生长因子于中枢神经系统可诱导出多巴胺神经元，于周围神经系统可产生施万细胞；白细胞抑制因子与多巴胺能神经元生成相关[19 ] 。胶质源性神经营养因子GDNF在NSC分化为多巴胺神经元中起重要作用[ 20 ] .神经营养因子家族中BDNF能增加EGF诱导增殖的神经前体细胞向GABA（γ-氨基丁酸）能神经元分化，并且也能刺进神经前体细胞向胆碱能神经元分化。
中枢胆碱能神经系统是中枢胆碱能神经元及其纤维投射分布的部位，乙酰胆碱（Ach）作为中枢胆碱能神经系统的一种重要递质，参与学习和记忆等相关的生理活动。大脑退行性变的疾病常引起中枢胆碱能神经系统受损并导致学习和记忆等高级神经功能障碍，这是AD等疾病重要的发病机制。
胆碱能神经相关的细胞因子
一、神经营养因子（NGF）
NGF由中枢胆碱能神经系统合成、分泌，反过来支持和营养中枢神经系统，因此对神经营养因子对胆碱能神经的保护和维持作用的研究很多。NGF在脑内的主要作用部位是基底前脑胆碱能神经系统,能促进胆碱能神经元发育,增强突触的可塑性和神经元的功能,使胆碱能神经细胞中的Ach、ChA T 和AchE等活性增强,并促进其存活和纤维的延伸[21 ,22]。研究表明,若注射NGF抗阻断NGF与其受体的结合,基底前脑胆碱能神经元的ChA T 和AchE活性会明显下降[22]。此外Calza 等[23]在损毁基底前脑胆碱能神经元后, 于侧脑室注射EGF 和bFGF 14 d后, 再改用NGF 注射14 d, 结果除发现基底前脑胆碱能神经元受损大鼠的学习记忆功能得到明显改善外, 形态学也证实脑内海马等处有较多的神经干细胞被NGF 诱导分化为胆碱能神经元。也有实验结果[24]发现NGF 可诱导皮层和隔区来源的神经干细胞向成熟的AChE 阳性的胆碱能神经元分化。且隔区来源的神经干细胞比皮层来源的神经干细胞更易于向AChE 阳性神经元分化, 这可能是因为隔区来源的神经干细胞具有更易于向胆碱能神经元分化的区域特异性。
BDNF作为一种重要的神经营养因子亦有众多的研究报导，神经干细胞的增殖首先需要有丝分裂原的作用,表面生长因子( EGF)和碱性成纤维细胞生长因子( bFGF)是神经干细胞体外增殖的重要的有丝分裂原,并且多数研究认为bFGF与EGF分别在胚胎发育早晚期
促进神经前体细胞的增殖,并可促神经干细胞向神经前体细胞、胶质前体细胞分裂[ 25 ],而BDNF在定向祖细胞分化成终末细胞中起重要作用[ 26 ]。BDNF在体外可促进NSC的存活和促进其向神经元分化。诸如林玲等人[ 27]通过体外培养出生2～3d大鼠脑皮质的神经干细胞,应用免疫荧光术分别观察BDNF组和对照组中β2tubulin 阳性神经元数,结果发现BDNF组阳性细胞数明显多于对照组,且神经元的突起明显较对照组长。谢青松等人[ 28 ]利用孕14d大鼠胚胎脑组织中的神经干细胞在体外加入BDNF诱导分化1、3、和5d 后行流式细胞仪检测发现: BDNF组神经元的比例较对照组各时段的比例提高了1倍。中枢神经系统的功能主要依赖于神经元,不同类型的神经元其功能也不同,而神经元的种类是按神经递质来区分的。研究已证实BDNF能增加EGF诱导增殖的神经前体细胞向GABA(γ-氨基丁酸)能神经元分化,并且也能促进神经前体细胞向胆碱能神经元分化。这为外源性神经干细胞移植治疗中枢性疾病提供了依据。
二、骨形态发生蛋白（BMP）
BMPs是转化生长因子β超家族最大的成员，也是影响神经发育的重要基因组之一，BMPs从神经发生到神经系统发育成熟的不同时期、不同脑区均起着相当重要的作用。2000 年, Lgnacio等[ 29 ]报道,在培养的神经细胞中, 骨形态发生蛋白9 (BMP9)直接诱导编码乙酰胆碱转移酶和乙酰胆碱转动囊基因的表达及上调乙酰胆碱的合成, 脑室内注射BMP9 可增加活体的乙酰胆碱水平, 说明BMP9 是胆碱能中枢神经系统的分化因子。BMP家族中的BMP4 也具有相应的效
应。BMPs在不仅神经系统的发育中有多种作用, 且对神经营养因子的作用产生影响[ 30 ]。不同浓度的BMPs对不同时期NSCs 的分化具有不同作用。如在E16大鼠的皮层, 1 - 10ng/ mL BMPs可以促进神经元和星形胶质细胞的分化, 100ng/ mL则使细胞死亡[ 31 ]。常艳[ 32 ]等人所做实验用表皮生长因子( EGF)和成纤维生长因子(FGF)将NSCs 体外扩增进入分化阶段后，再给予一定浓度的BMP4 诱导NSCs的分化方向, 提高ChA T的表达, 促进NSCs 向胆碱能神经元方向的分化。结果显示免疫荧光染色加BMP4培养的实验组的ChA T阳性细胞明显比不加BMP4培养的对照组的阳性细胞多, 而且荧光较强; 流式细胞术的结果也提示实验组ChA T阳性细胞率显著高于对照组( P < 0. 05) ;而ChA T是胆碱能神经元的标志性酶。所以这项实验可提示BMP4对NSCs 确实具有胆碱能诱导分化作用。有实验研究观察发现不同浓度BMP4对端脑胆碱能前体细胞的产生和分化也有不同的影响,研究证实低浓度（20μg/L）BMP4可诱导端脑胆碱能前体细胞发生和分化，而较高浓度（40μg/L）BMP4可抑制其发生和分化[ 33] 。
上述具有胆碱能诱导分化作用的细胞因子的研究进展，对于诱导NSCs定向分化为胆碱能神经元技术的完备有重大意义，是神经干细胞用于治疗AD等引起的脑损伤或神经元缺损很有必要的基础研究。然而如何诱导NSCs在病变部位定向分化为胆碱能神经元，或者如何将保证体外诱导生成的胆碱能神经元的存活率及质量并将其顺利送达神经元损伤部位，这些是研究者们需要更进一步探讨的问题。
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神经干细胞的研究及其应用新进展 [关键词] 神经干细胞研究 健康讯: 崔桂萍天津市脑系科中心医院 300060 1992 年， Reynolds 首次成功地从成年小鼠纹状体中分离出神经干细胞（ neural stem cell, NSC ），于是“神经干细胞”这一概念被正式引入神经科学研究领域。可以总结为具有分化为神经元、星形细胞和少突胶质细胞的能力，能自我更新并足以提供大量脑组织细胞的细胞。不少文献中还提到神经祖细胞和神经前体细胞，目前认为，神经祖细胞是指比 NSC 更有明确发展方向的细胞，而神经前体细胞是指处于发育早期的增殖细胞，可指代 NSC 和神经祖细胞：与 NSC 相比，二者的分裂增殖能力较弱而分化能力较强，是有限增殖细胞，但三者均属 NSC 范畴。 1. NSC 的起源、存在部位及生物学特征中枢神经系统的发育起源于神经沟、神经嵴、神经管；研究发现， NSC 在神经管壁增殖，新生细胞呈放射状纤维迁移至脑的特定位置；主要存在于室管膜区，在成脑生发区以外的区域也广泛分布，即具有高度可塑性的神经前体细胞。现发现 NSC 的生物学特征为：（ 1 ）具有自我更新能力；（ 2 ）具有多向分化潜能，可分化为神经元、星形细胞和少突胶质细胞；（ 3 ）处于高度未分化状态；（ 4 ）终生具有增殖分化能力，在有损伤的局部环境信号变化的刺激下可以增殖分化。其中（ 1 ）和（ 2 ）是 NSC 的两个基本特征。 2. NSC 的基础研究进展 NSC 的增殖和分化调控是目前 NSC 研究的核心问题，最近的研究资料显示， NSC 的增殖、分化、迁移调控受多种相关因素的影响。神经递质神经递质作为细胞外环境的一员，不仅介导神经元之间和神经元与效应器之间的信号传递，还参与 NSC 的增殖和分化。这些神经递质包括谷氨酸（ G1u ）、 5- 羟色胺（ 5-HT ）、 GABA 、甘氨酸（ G1y ）、乙酰胆碱（ Ach ）一氧化氮（ NO ）、肾上腺素与性激素等。 G1u ：在脑的发育过程中有高含量的 G1u 表达， Haydar 等发现， G1u 可以通过大鼠胚胎皮质 AMPA/KAR 的激活调节室周区前体细胞的增殖，但 GLU 对室管膜区（ SZ ）和室管膜下区（ SVZ ）体内细胞的影响是不同的，它可增加 SZ 细胞的增殖，减少 SVZ 细胞的增殖； GLU 还可促进神经元生长和分化。 5-HT ：许多研究表明， 5-HT 在皮质发育、突触形成中起重要作用，抑制 5-HT 合成或选择性损伤 5-HT 神经元则引起齿状回及脑室下区神经元增殖活性下降， 5-HT 可促进胶质细胞分化和髓鞘形成。 GABA ： GABA 是成体脑发育过程中主要
.关于神经干细胞 定义是一类具有多向分化潜能, 能够自我复制, 在特定诱因下, 能够向神经元或神经胶质细胞分化的未分化细胞的总称。它是神经系统形成和发育的源泉。其主要功能是参与神经系统损伤修复或细胞凋亡的更新。 特点⑴自我更新：神经干细胞具有对称分裂及不对称分裂两种方式，从而保持干细胞库稳定。对称分裂由一个神经干细胞产生两个神经干细胞；在特定诱因下进行非对称分裂，会产生神经干细胞和神经胶质细胞（astrocyte,oligodendrocyte)。⑵多向分化潜能：神经干细胞可以向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化，其分化与局部微环境（niche）密切相关。⑶低免疫源性：神经干细胞是未分化的原始细胞，不表达成熟的细胞抗原，可以不被免疫系统识别。⑷良好的组织融合性：可以与宿主（即接受神经干细胞移植的患者）的神经组织良好融合，并在宿主体内长期存活。 发现时间1992年，Reynodls等从成年小鼠脑纹状体中分离出能在体外不断分裂增殖，且具有多种分化潜能的细胞群，并正式提出了神经干细胞的概念，从而打破了认为神经细胞不能再生的传统理论。 产生区域神经干细胞主要产生于脑室周围的室管膜下区(SVZ，subvetricular zone)和海马齿状回的颗粒下区(SGZ,subgranular zone)。成人大脑中每天有3万个神经干细胞产生，按照从脑室周围的室管膜下区（SVZ）通过侧迁移流RMS(rostral migratory)最后到达嗅球 OB(olfactory bulb) 的方向移动。增殖时间为12～28天/代。 2.治疗机理与应用领域
神经干细胞的治疗机理 ⑴患病部位组织损伤后释放各种趋化因子，可以吸引神经干细胞聚集到损伤部位，并在局部微环境的作用下分化为不同种类的细胞，修复及补充损伤的神经细胞。 ⑵由于缺血、缺氧导致的血管内皮细胞、胶质细胞的损伤，使局部通透性增加，另外在多种黏附分子的作用下，神经干细胞可以透过血脑屏障，高浓度的聚集在损伤部位。 ⑶神经干细胞可以分泌多种神经营养因子，刺激原有神经元和神经胶质细胞，促进损伤细胞的修复。 ⑷神经干细胞可以增强神经突触之间的联系，建立新的神经环路，降低脑部氧化性压力。 神经干细胞的应用领域 神经干细胞主要应用于治疗中枢神经系统疾病，包括脑部和脊髓损伤的治疗。面前可以治疗的疾病包括脑瘫，脑膜炎后遗症, 脑发育不良脑, 中风(脑出血,脑梗塞)及后遗症, 脑外伤及脊髓损伤, 运动神经元病, 肌萎缩性侧索硬化症(ALS), 帕金森病, 脑萎缩, 共济失调, 癫痫, 多系统萎缩症(MSA), 老年性痴呆及血管性痴呆, 各种舞蹈症, 急性感染性多发性神经根炎(格林巴利氏病), 神经性耳聋, 面瘫及各类周围神经病。 目前有许多研究结果证明神经干细胞的分化潜能不仅仅局限于所属组织，在特定环境（niche）中，在一些细胞因子和蛋白的作用下，可以跨过神经系统而分化成其他类型的组织细胞，即具有横向分化潜能。如神经干细胞可被诱导分化为肌细胞和造血前体细胞。这无疑在理论上扩大了神经干细胞在今后的应用范围，使得更多用现今医学手段无法治愈的患者看到希望。 3.本公司的神经干细胞
体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能 上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下: 一、鸡胚背根神经节组织块培养 主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。 1、材料和方法 （1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。 （2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气室部蛋壳。 （3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。 （4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。 （5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。 2、结果 鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。而未加NGF的神经节培养24 h, 未见神经突起生长。 二、新生大鼠、新生小鼠及鸡胚背根神经节分散细胞培养 背根神经节（DRG）细胞起源于神经嵴，NGF研究先驱Levi-Montalcini的实验表明，外原性NGF能刺激DRG细胞生长发育并形成广泛的神经网络。在体外，分离培养的神经节在NGF存在的情况下，神经突起的生长在一天之内可长达数
中枢胆碱能系统与学习、记忆密切相关，乙酰胆碱（ACh）是中枢胆碱能系统中重要的神经递质之一，其主要功能是维持意识的清醒，在学习记忆中起重要作用。中枢胆碱能系统可能通过边缘系统和大脑皮层调节学习和记忆过程，在边缘系统中尤其是隔区-海马-边缘叶这条胆碱能通路同学习记忆机能有密切关系，海马的Q节律波与学习记忆有联系，海马参与信息的储存和回忆也与海马的胆碱能系统有关，用ACH刺激隔区可使海马出现Q波；在条件反射形成过程中海马呈现有规律的Q波，可使分化加速；东茛菪碱能消除动物的Q 波，把训练好并很巩固的学习过程完全忘掉，出现近期记忆遗忘症；毒扁豆碱的作用则相反，它加快学习记忆过程，Q波出现的频率增加。 在老年性痴呆患者大脑内主要变化的神经递质是乙酰胆碱；在正常老年脑，特别是海马、ACHE活性和毒蕈碱受体减少。用东茛菪碱等药物可降低正常年轻人短期记忆能力，出现类似老年性痴呆的早期症状，而用新斯的明、槟榔碱等增强突触后胆碱能神经功能的药物，又能增强短期记忆功能，从而提出老年性记忆功能障碍的胆碱能假说，认为老年性健忘很可能是由于脑内胆碱能系统功能衰退所致。 在某些Alzheimer’型老年性痴呆患者，皮层、尾核中ChAC活性显著减少，同时主要发出胆碱能纤维向皮层投射的基底神经节的神经元也受损害，ChAC活性也明显低于对照者，此变化与单侧大脑皮层切除后，大鼠基底神经节中ChAC免疫活性物质减少一致，这些发现对老年性痴呆患者智力减退与胆碱能神经功能下降之间存在着一定的因果关系提供某些依据。临床病理及生化检查发现，正常老年人及早老性痴呆，慢性遗传性舞蹈病（亨廷顿病）患者脑内ChAC活性降低，AChE活力增高和Ach受体活性减弱；也就是说老年性痴呆的病理学基础是脑内胆碱能神经受损或功能下降。 人的脑组织有大量乙酰胆碱，但乙酰胆碱的含量会随着年龄的增加出下降。正常老人比青年时下降30%，而老年痴呆患者下降更为严重，可达70%~80%。 胆碱能神经递质有资料表明, 大鼠训练获得后, 皮层和海马乙酰胆碱(ACh) 和胆碱 转移酶(ChT ) 升高; 拟胆碱能药物能改善学习和记忆功能; 反之, 抗胆碱能药物则损坏学习和记忆功能。另据报道, 新皮层胆碱能通路功能的降低与早 老性痴呆病人的学习和记忆能力丧失有密切关系以含胆碱能递质丰富的胎鼠基底前脑细胞悬浮液移植到乙醇引起记忆损害的大鼠海马和皮质中, 结果该大鼠记忆有所改善, 提示乙醇导致的记忆损害与胆碱能传导阻滞有关。Dunbar 等的实验表明, 增加海马胆碱乙酰转移酶活性, 有助于大鼠空间学习能力的改善, 据此, 作者认为海马胆碱乙酰转移酶活性高低是大鼠空间学习能力好坏的良好标志。M elis 等的在体实验表明, 慢性消耗酒精的大鼠, 采用微渗析枝术检验表明, 其海马乙酰胆碱的释放明显降低, 而这与其记忆功能的降低密切相关。Miranda等通过对特定的新皮层损伤及移植实验发现, 大鼠厌恶性条件反射行为的学习功能的形成和恢复与该区域脑皮层乙酰胆碱的正常释放密切相关。 学习和记忆是脑的高级功能，海马是学习记忆的重要脑区，中枢的乙酰胆碱是参与学习记忆的重要神经递质，海马-边缘系统中有丰富的胆碱能纤维和胆碱敏感细胞及受体，中枢烟碱
神经干细胞的应用前景及研究进展 生科1301班李桐 1330170031 神经干细胞( neuralstem cells, NSCs)是重要的干细胞类型之一，是神经系统发育过程中保留下来的具有自我更新和多向分化潜能的原始细胞,可分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等多种类型的神经细胞。具有很多的特性，如自我更新、多潜能分化、迁移和播散、低免疫原性、良好的组织相容性、可长期存活等。目前神经干细胞的分离与体外培养已取得可喜的进展，有关神经干细胞的研究已经成为国内外神经科学领域的热点。 一、神经干细胞的生物学特性 19世纪80年代提出了神经干细胞的概念，它是指一类多潜能的干细胞，能够长期自我更新与复制，并具有分化形成神经元、星形胶质细胞的能力。神经干细胞的主要特征：未分化、缺乏分化标记、能自我更新并具有多种分化潜能。它并不是指特定的单一类型的细胞，而是具有相类似性质的细胞群。Gage将神经干细胞的特性进一步描绘为以下三点，可生成神经组织或来源于神经系统，具有自我更新能力，可通过不对称法、分裂产生新细胞。神经干细胞经过不对称分裂产生一个祖细胞和另一个干细胞，祖细胞只有有限的自我更新能力，并自主分化产生神经元细胞和成胶质细胞。神经干细胞是具有自我更新和具有多种潜能的母系神经细胞，它能分化成各种神经组织细胞表型，如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞.并能自我更新产生新的神经干细胞，在神经发育和神经损伤中发挥作用。神经干细胞移植、迁移及分化与局部环境密切相关，这种特性为移植及移植后的结构重建和功能恢复提供了依据，为移植治疗不同疾病提供了局可能。 二、神经干细胞的应用前景 1.细胞移植以往脑内移植或神经组织移植研究进展缓慢，主要受到胚胎脑组织的来源、数量以及社会法律和伦理等方面的限制。神经干细胞的存在、分离和培养成功，尤其是神经干细胞系的建立可以无限地提供神经元和胶质细胞，解决了胎脑移植数量不足的问题，同时避免了伦理学方面的争论，为损伤后进行替代治疗提供了充足的材料。研究表明，干细胞不仅有很强的增殖能力，而且尚有潜在的迁移能力，这一点为治疗脑内因代谢障碍而引起的广泛细胞受损提供了理论依据，借助于它们的迁移能力，可以避免多点移植带来的附加损伤。另外，神经干细胞移植也为研究神经系统发育及可塑性的实验研究提供了观察手段，前文提及细胞因子参与调控神经元增殖和分化，通过移植的手段对这些因素的具体作用形式和机制进行探索，为进一步临床应用提供了理论基础。 2.基因治疗目前诱导干细胞向具有合成某些特异性递质能力的神经元分化尚未找到成熟的方法，利用基因工程修饰体外培养的干细胞是这一领域的又一重大进展；另外已经发现许多细胞因子可以调节发育期甚至成熟神经系统的可塑性和结构的完整性，将编码这些递质或因子的基因导入干细胞，移植后可以在局部表达，同时达到细胞替代和基因治疗的作用。 3.自体干细胞分化诱导移植免疫至今为止仍是器官或组织移植的首要问题。前文提到已经证明成年动物或人脑内、脊髓内存在着具有多向分化潜能的干细胞，那么使人们很容易想到通过自体干细胞诱导来完成损伤的修复。中枢神经系统损伤后，首先反应的是胶质细胞，在某些因子的作用下快速分裂增殖，形成胶质瘢。其实在这个过程中也有干细胞的参与，可不幸的是大多数干细胞增殖后分化为胶
近期整理了一些据说可以作为神经干细胞和早期神经元标记物的资料，不知是否可靠，贴出来大家指点一下， 1. ASH1：属于前神经转录因子，与神经元的分化有关。ASH1是转录调控因子bHLH家族的成神经元基因，广泛表达于发育中的中枢和外周神经系统，在神经元特定亚型的选择性分化中发挥中心调控作用。见于细胞核。 2. ATOH1：无调同源物1(atonal homolog 1)，Ath1。无调基因(Atonal)最初是在果蝇中发现的一种原神经基因，负责调控果蝇弦音器的形成；在小鼠的同源物为Math1和Math5。属于转录因子的碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)家族、前神经转录因子，是后脑发育的关键因子之一。缺乏Math1的小鼠有听觉、本体感觉和觉醒系统障碍，生后不久即死于不能呼吸但呼吸道和外周神经正常。见于细胞核。 3. CD133：一种独特的干细胞标志，分子量为120kDa，具有5个跨膜区。CD133+细胞可以分化为神经元和神经胶质，表明这群细胞有自我更新的能力，有多系分化潜能。体外实验证实外周血来源的CD133+ 细胞可以分化为神经细胞。 4. GFAP：胶质纤维酸性蛋白。GFAP是一种中间丝蛋白，主要存在于星形胶质细胞内，有8种不同的isoforms 标记细胞的不同亚群，神经干细胞也能表达GFAP。 5. HES-5：发状分裂相关增强子-5(hairy and enhancer of split-5)。属转录因子的碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)家族、前神经转录因子，与神经元的分化有关。小鼠Hes5特异性在发育中的神经系统中表达，随着神经元分化程度升高，其表达水平降。在脑室区持续高水平表达Hes 5会使神经前体细胞继续留在脑室区而不向外部迁移，严重干扰神经元与胶质细胞的分化。见于细胞核。 6. HuC、HuD：果蝇的胚胎致死与异常视觉基因Elav在人类的同源物被称为Hu抗原，脊椎动物神经元中有三个抗原均能与抗-Hu抗体发生反应，分别是HuD、HuC/ple21和HeI-N1,均是神经元特异性RNA结合蛋白，表达于所有的新生神经元。见于细胞核。 7. L1neural adhesion molecule：L1神经粘附分子，不依赖钙离子的神经粘附分子之一。参与了神经元-神经元之间的粘附、神经突起束化与生长、小脑颗粒细胞迁移等功能，AD小鼠过表达的L1能与Aβ结合而降低AD小鼠的病理特征。见于细胞膜。 8. MAP1B：微管相关蛋白1B，或称微管相关蛋白5(MAP5)。是早期微管相关蛋白，胚胎期及新生动物大脑内细胞质、细胞体、树突均有较高表达。参与促进轴突再生，也是凋亡蛋白caspase和calpain的共同底物。 9. MAP-2：微管相关蛋白-2 (microtubule-associated protein-2)，属于结构性微管相关蛋白家族, 其分子量很大,SDS-PAGE电泳分析可分为MAP-2A和MAP-2B两条带。在正常脑组织中MAP-2主要存在于神经元的胞体、树突和树突棘。是脑内最丰富的蛋白之一，参与突起生长、胞浆蛋白运输、神经元塑形等功能。 10. Musashi-1：musashi-1简称MSI-1，是一种分子量为39KD的RNA结合蛋白。通常在CNS干细胞和前体细胞上表达，在分化后的细胞表达下调。它是一种转录抑制因子，其可以直接调节靶蛋白Numb和P21(CIP-1)的表达。见于神经干细胞，也可见于其它组织的干细胞；最近研究发现musashi-1在缺血性神经损伤中发挥调节细胞凋亡的作用。
神经干细胞体外诱导分化为胆碱能神经元的研究进展 硕士研究生孙晓静导师孙莉 传统的观点认为，“中枢神经细胞不可再生”，然而自1992年Reynolds等从成年鼠脑纹状体和海马中首次分离出了神经干细胞（NSC）,且它与多能干细胞一样具有自我更新、分裂增殖、多向分化的潜能，此后人们开始深入了解神经干细胞。Erikson等于1998年也证实了人脑中同样存在神经干细胞，随后的研究发现成年脑中神经干细胞主要存在于侧脑室外侧壁脑室下区和海马齿状回中。随着近年来对中枢神经系统的损伤或病变部位实行细胞替代或移植治疗的研究深入，为中枢神经系统损伤、神经系统变性疾病或神经退行性疾病等的治疗提供了新的方向。 阿尔茨海默病（AD）是老年人常见的一种慢性进行性神经系统变性疾病。长期以来认为前脑胆碱能投射系统（尤其是Meynert基底核）胆碱能神经元变性、细胞数量减少等导致AD认知功能不可逆的减退。目前就其病因有多种学说：如基因学说（APP基因[ 1 ]、早老蛋白基因[ 2 ] 、ApoE基因[ 3 ] ）、胆碱能假说、雌激素水平下降学说[4] 、氧化应激学说[ 5 ] 、铝中毒学说、炎症学说[6 ] 、神经营养因子学说[7 ] 等。此外，AD还可能与年龄、种族、社会心理因素及各种疾病史等多种因素有关。 综上所述, 多因素参与AD 发病, 但目前为止确切的发病机制尚不清楚。其治疗方法包括对于轻度和中度AD 予以乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂以提高认知功能, 以及N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)拮
抗剂对重度AD 的治疗[8],其他药物如脑循环改善药物剂、AChE 抑制剂、M1 胆碱受体激动剂、乙酰胆碱释放促进剂、神经生长因子、抗氧化药物和抗β-淀粉样药物等。这些治疗手段虽能减轻AD 的症状, 但无法补充大脑皮层和海马大量丢失的神经细胞,因而对中、晚期AD 患者的疗效有限。神经干细胞(NSCs)的广泛研究及重大进展为AD 的治疗提供了一个更有前景的治疗策略，NSC移植治疗AD等退行性疾病成为近年来的研究热点。然而不管是诱导、促进内源性NSCs增殖分化，产生相应的神经细胞代替缺损变性的细胞，还是体外培养需要的NSCs移植入体内，如何诱导NSCs定向分化为胆碱能神经元都是一个至关重要的问题。 神经干细胞增殖、分化相关因素 神经干细胞的增殖、迁移、分化与多种因素相关。目前的研究认为决定神经干细胞定向分化的机制有两种：一种是细胞自身基因调控；另一种是外来因素调控，主要为各类细胞因子家族，如神经营养因子、生长因子、细胞黏附因子等均可影响神经细胞的分化，其影响机制各不相同。不同的细胞因子诱导分化出的神经元不同。研究最多有生长因子如：表皮生长因子（EGF）家族、碱性成纤维细胞生长因子（FGF）家族、β-转导生长因子（β-TGF）超家族、神经营养因子、脑源性生长因子及化学诱导剂及药物等。 一、生长因子 碱性成纤维生长因子(FGF)在神经干细胞增殖的早期阶段发挥促有丝分裂的作用, 使神经干组胞获得对另一作用更强的促有丝分裂
神经干细胞研究介绍 陈晓萍 程君奇 (浙江大学生命科学学院浙江省细胞与基因工程重点实验室浙江杭州310029) 摘要 神经干细胞研究是近年脑科学研究的热点,本文综述了神经干细胞的分离培养方法、脑内迁移路线、发育分化的影响因素以及可能的应用前景。 关键词 神经干细胞 分离 迁移 发育 分化 脑的结构与机能一直是生命科学的研究难题,它以极其错综复杂而又高度易变为特征,至今仍保持着极大的神秘性。近年来科学家对神经干细胞的研究是脑科学领域的重要成果之一,它突破了以往一直认为的成年动物神经细胞不能分裂再生的观念,为神经细胞的发育分化过程,也为神经系统疾病的治疗开辟了一条全新的途径。 1 神经干细胞的分离培养 神经干细胞(N eural stem cells,N SCS)是指具有如下特征的细胞:1)能形成神经组织;2)具有自我繁殖和自我更新能力;3)细胞分裂后能发生分化[1]。 胚胎时期是神经系统快速增长发育的阶段,在这时期脑内的许多部位都存在神经干细胞,这包括大脑皮质、纹状体、小脑等区域。成年后,脑细胞一般不再分裂增殖。以往曾一度认为成年动物神经细胞完全失去了这种能力,但近年科学家在高等哺乳动物(包括人)的脑室管膜下层等区域发现了仍具有增殖分化能力的神经干细胞。另外,在啮齿类动物主管学习记忆的海马区,也发现了神经干细胞的存在[2]。 成年动物脑内的神经干细胞仅仅是保存了能进行分裂增殖的潜能,通常情况下得不到足够的正面刺激信号,因而并不分裂增殖,而是处于静止状态。 从脑组织分离培养神经干细胞需要特殊的条件,目前多采用生长因子刺激和细胞克隆技术。具体有3种方法[3]:1)用无血清培养液将脑细胞分离,再加入具有丝裂原作用的生长因子如表皮生长因子或碱性成纤维生长因子,待原代克隆形成后挑选单个克隆机械分离继续进行亚克隆培养,也可采用单细胞克隆分离;2)用反转录病毒向脑细胞内导入原癌基因,如V2m yc和SV40大T抗原等,部分细胞可因此获得持续分裂的能力;3)从脑组织以外的部位,如胚胎干细胞,经过适当化学因子的诱导,使其定向分化为神经干细胞。 外加化学因子对于维持神经干细胞的分裂增殖能力是必须的。培养液中如撤去外加的化学因子,改用普通培养,神经细胞会很快发生分化,失去分裂增殖能力。 2 神经细胞的发育及脑内迁移路径 神经系统的发育源于胚胎早期的神经管和神经嵴[4],其中的中央管经发育形成脑室系统和脊髓中央管,管腔内表面覆盖的上皮细胞具有活跃的增殖和分化能力,是神经细胞发生的来源。成年后这个区域称为室管膜 室管膜下区。 内径1～2mm的完全闭合的呼吸管。据B landfo rd报道,这种呼吸管中衬有外套膜组织。上述蜗牛的夏眠能从1月持续至6月。同时具有裂口、裂沟和缝合线管的结构有利于气体的循环。在足部和外套膜肌肉运动下,可促使气体交流和循环,贝类学家F ischer曾对冬眠期间的盖罩大蜗牛进行了研究,业已证明其足部和外套膜从未停止过运动。 8)喇叭状口和壳壁上的穿孔 A lycaeinae的种类,其成体的壳口呈喇叭状,其后逐渐缩小成一口颈。在口颈近缝合线的壳壁上有穿孔。A ly caeus属的种类,如A2 ly caeus m ajor壳壁上的孔由内向外通入一覆盖在缝合线上的管。管的截面略呈三角形。此管在缝合线上,略弯曲,呈带状,长约6～7mm,管的末端是盲端,但常破碎,即使不破碎,该管仍可进行气体交换。据分析这个带状结构比通常的贝壳更具通透性。因种类不同,喇叭口的长度有差异,缝合线管内开口到口缘距离也有所不同。喇叭状的壳口可能是为了蜗牛在夏眠期间有一个较大的气室,这与无厣贝类具有的盖膜腔情况相似。由此可以推断A ly caeus和Pup ininae的一些种类缝合线管在内部的开口可能与肺呼吸孔靠得很近。 其他的一些陆生螺类,如R um ina d ecollata和C lausilia的一些种类,在夏眠期间往往胚螺层失去,然而可能也有利于呼吸。破损的一端由内脏分泌的膜封住,这比休眠时螺壳倒下,靠外套膜边缘呼吸更利于气体交换。 (BF) — 8 1 —生 物 学 通 报 2003年第38卷第2期
神经干细胞及其应用研究新进展 摘要：长期以来，人们一直认为成年哺乳动物脑内神经细胞不具备更新能力，一旦受损乃至死亡不能再生。这种观点使人们对中枢神经系统疾病的治疗受到了很大限制。虽然传统的药物、手术及康复治疗取得了一定的进展，但是仍不能达到满意的效果。现在，神经干细胞(neural stem cells，NSCs)不仅存在于所有哺乳动物胚胎发育期的脑内，而且在其成年之后也有，这已为神经科学界所普遍接受。神经干细胞由于具有自我更新和多向分化潜能，使神经系统损伤后的细胞替代治疗成为可能本文综述了神经干细胞的分布、生物学特性、神经干细胞在细胞疗法中的多功能应用，并对神经干细胞临床应用前景做出了展望。 关键词：神经干细胞细胞疗法多向分化潜能转分化性 1、神经干细胞的分布 大量研究表明成年哺乳动物的脑室下区、海马、纹状体、大脑皮质等区域均有NSCs存在，其中侧脑室壁的脑室下层(sub ventricular zone，SVZ)和海马齿状回的颗粒下层(sub granular zone，SGZ)是神经干细胞的两个主要脑区。另外，研究者们还在成年哺乳动物脑内的其他部位发现了神经干细胞的存在，例如在黑质内发现了新生的多巴胺能神经元。 2、神经干细胞在细胞疗法中的多功能应用 2.1细胞替代治疗中外源性NSCs的使用 NSCs可以用来代替因为损伤或神经系统退行性病变而缺失的组织。理想的是重建组织适宜的结构并整合人周围组织；重要的是在这种治疗方案中，几种细胞类型需替代。在移植入成年啮齿动物脑内前，首先需从人胚胎干细胞或胎儿脑内分离出NSCs，并在体外诱导分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。值得注意的是NSCs整合入室管下区的微环境，促成嗅球的神经发生。在海马，移植的神经祖细胞分化为特定区域的神经细胞亚型，并功能性整合入周围的环路。NSCs移植入疾病或损伤的啮齿动物模型中取得了预期的效果。移植入的存活的NSCs首先迁移到病变部位并分化。成年鼠的NSCs移植入多发性硬化大鼠模型后可观察到少突胶质细胞祖细胞、宿主和移植来源的成熟细胞数量增加，病情明显好转。在大鼠脑梗死模型中，移植的NSCs迁移到损伤部位并大部分分化为神经元。在脑出血模型中，由静脉移植的NSCs在损伤部位分化成神经元和星形胶质细胞，并引起了功能的恢复。将富有多巴胺神经元的胚胎腹侧中脑移植入去神经的帕金森鼠中，结果移植物中的多巴胺神经元修复了损害引起的功能缺损。神经干细胞植入大鼠亨廷顿病模型脑内能保护维持运动习惯的能力，受损的运动习性也可重新恢复，表明植入的细胞在体内形成了功能性连接。Mcdona等给胸髓损伤大鼠分别注入单纯培养基、成年小鼠皮层神经元和胚胎干细胞，2周后发现植入干细胞者后肢恢复部分负重与协调能力，明显优于前二者。田增明等报道了人胚胎神经干细胞治疗21例小脑萎缩患者，发现移植后临床症状有改善。 2.2脑损伤激发内源性NSCs 近年研究表明多种神经系统损伤均可激发内源性神经细胞再生。追踪巢蛋白阳性的神经祖细胞定殖在成年脊髓损伤区，可以观察到这种祖细胞扩增并在损伤区分化为神经元；在脊髓挤压伤、局灶性脑缺血中，在有正常神经发生的大脑皮质和海马可观察到NSCs的增生，并可以被外源性神经营养因子所加强。但在病理状态下这种内源性干细胞的修复反应很显然是不够的，大量实验已证实哺乳动
胆碱能神经药物对蟾蜍腹直肌的作用 摘要目的胆碱能神经药物包括激动药和拮抗药，研究它们对肌肉的不同作用，并计算出相应的药效动力学参数，从而研究其具体的作用机制，加深对激动药和拮抗药的认识和理解。方法将蟾蜍腹直肌标本固定在生物信号分析系统——张力传感器上，用不同的药物作用于标本可采集到相应的信号，对信号进行分析可得到相应的试验数据，从而得到结果。结果及分析pA2=6.21225，竞争性抑制药可以使激动药的量-效曲线右移，但是不改变其最大效能。 关键词pA2激动药竞争性拮抗药 激动药（如ACh）与受体具有高亲和力，其本身具有内在活性，故结合后可产生强烈的激动作用。而拮抗药（如筒箭毒碱）与受体结合后，本身并没有内在活性，故不能激动受体。本实验所用蟾蜍腹直肌富含胆碱能受体，乙酰胆碱是其激动药，同时在骨骼肌神经肌肉接头处存在大量的N M受体，筒箭毒碱可与之结合，从而竞争性阻断乙酰胆碱的作用。 1 实验材料 1）实验动物：蟾蜍 2）实验药品：乙酰胆碱，筒箭毒碱，任氏液 3）实验器材：剪刀，蛙板，眼科剪，镊子，支架，氧气瓶，器官浴槽，肌张力传感器，标本板，加样器，丝线，计算机，手术剪。
2 实验方法 1）取蟾蜍一只，用剪刀剪去其头部，并冲洗干净血迹。 2）将蟾蜍固定在蛙板上，用手术剪自耻骨联合其沿腹白线剪开皮，暴露腹直肌，并沿腹白线分离两块腹直肌。 3）用手术剪剪开腹直肌，宽约0.5cm，两端用线结扎，然后剪下了，固定在标本板上。 4）将标本板置于浴槽中，并通入气体，标本的另一端与张力传感器相连，调节好高度，使肌肉负荷为1g，平衡一段时间，必要时可换营养液。 5）待标本平衡好后，用微量加样器准确取药，然后将针尖伸入液面下快速给药，按照半对数摩尔浓度累计给药法，依次加入乙酰胆碱，在每次加药后看到肌张力变化由上升变平缓时，进行下一次加药，并做好记录。 6）待肌张力恢复后，快速注射筒箭毒碱。 7）过一段时间后，按照以上5）的操作重复一次，作好记录。 8）绘制量-效曲线，并算出反应百分率，计算pA2。 3 实验结果 根据以上操作可得到如下表1的结果： 表1 第二组第一组 给 药次数给 药 前 给 药 后 浓度 （D=1 0E-6） 给 药 前 （% ） 给药后 （%） 给 药 次 数 给药 前 给药 后 浓度 （D=10 E-6） 给 药 前 （% ） 给 药 后 （% ）
神经干细胞研究进展 一、引言 神经干细胞(neural stem cell，NSC)是指存在于神经系统中，具有分化为神经神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能，从而能够产生大量脑细胞组织，并能进行自我更新，并足以提供大量脑组织细胞的细胞群[1]。狭义的神经干细胞是指成体神经干细胞，指的是分布于胚胎及成人中枢及周围神经系统的干细胞。简单的说，就是在成年哺乳动物的大脑中分离出来的具有分化潜能和自我更新能力的母细胞，它可以分化各类神经细胞，包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。我们所讲的神经干细胞指的就是成体中存在于脑中的中枢神经干细胞，其实在外周也有一些“神经干细胞”称为“神经嵴干细胞”，可以分化成外周神经细胞、神经内分泌细胞和施旺细胞，还可横向分化成色素细胞和平滑肌细胞[2]。 神经干细胞具有以下特征：（1）有增殖能力；（2）由于自我维持和自我更新能力，对称分裂后形成的两个子细胞为干细胞，不对称分裂后形成的两个自细胞中的一个为干细胞，另一个为祖细胞，祖细胞在特定条件下可以分化为多种神经细胞；（3）具有多向分化潜能，在不同因子下，可以分化为不同类型的神经细胞，损伤或疾病可以刺激神经干细胞分化,自我更新能力和多向分化潜能是神经干细胞的两个基本特征[3]。 需要注意的是，在脑脊髓等所有神经组织中，不同的神经干细胞类型产生的子代细胞种类不同，分布也不同。神经干细胞的治疗机理是：（1）患病部位组织损伤后释放各种趋化因子，可以吸引神经干细胞聚集到损伤部位，并在局部微环境的作用下分化为不同种类的细胞，修复及补充损伤的神经细胞。由于缺血、缺氧导致的血管内皮细胞、胶质细胞的损伤，使局部通透性增加，另外在多种黏附分子的作用下，神经干细胞可以透过血脑屏障，高浓度的聚集在损伤部位；（2）神经干细胞可以分泌多种神经营养因子，促进损伤细胞的修复；（3）神经干细胞可以增强神经突触之间的联系，建立新的神经环路[4]。 二、研究现状
启示神经与基于BSC疗法的导电材料的接口：通过偶合石墨烯加速神经干细胞的生物电功能开发 为了管理在组织工程细胞特异性行为神经修复和再生，更好地理解材料- 细胞相互作用，尤其是生物电功能的，极其important.Graphene已报道是用作支架的潜在候选和神经interfacingmaterial.However，石墨烯这些导电性基板细胞膜的生物电演变在很大程度上仍然没有进行过。在这项研究中，我们使用了神经干细胞（NSC）模型，探讨膜生物电属性E包括增殖和分化conditions.We下休息膜电位和动作电位E和细胞行为上的石墨烯薄膜中使用的组合可能发生的变化 单细胞电生理记录和传统的细胞生物学技术。石墨烯不影响基本膜电参数（电容和输入电阻），但搁在石墨烯衬底细胞膜电位分别更强烈增殖和分化的条件下为负。此外，神经干细胞及其对石墨烯基片表现出的后代与对照相比，在开发过程中增加的动作电位的射击。但是，石墨烯只有轻微影响电动刻画ofmature NSC后代。石墨烯基片上的被动和主动的生物电特性Themodulation伴随着增强NSC分化。此外，棘密度，突触 突触蛋白表达和在.Modeling石墨组所有activitywere增加上导电的石墨烯衬底电场表明由该负电的细胞膜产生的电场大于上即控制它的石墨烯衬底高得多，这可以解释观察到的 通过耦合石墨烯的生物电的发展变化。我们的研究结果表明石墨烯是能够加速在开发过程中的NSC成熟，特别是在生物电发展方面。我们的发现提供对导电材料在调谐膜中的作用的基本理解石墨烯模型中的生物电性能，为未来的发展研究铺平道路方法和材料形成在基于NSC的治疗的可控通道中的膜性质。 石墨烯，碳原子的2维单层，由于材料的独特的电，机械和热特性，一直在纳米技术的最前沿。它最近被认为是一个有前途的候选人制造超快纳米电子器件，透明电极，纳米复合材料和生物医学材料[3]。 它已经用于多种生物医学应用，包括细胞成像和药物递送[4]，生物分析[5]，干细胞研究[6,7]，甚至光热疗法治疗肿瘤 [8]。最近，我们和其他团体发现使用石墨烯作为神经接口材料的可能性，因为它可以促进人类成神经细胞瘤（SH-SY5Y）细胞培养[9]，PC-12细胞[10]，海马原代培养神经元[11]和直接NSC分化神经元[12,13]，促进神经干细胞分化成石墨烯纳米网半导体神经元和形成神经元纤维[14,15]。此外，越来越多的研究表明石墨烯表现出操纵茎的命运的潜在能力细胞。例如，石墨烯基材料能够诱导NSC分化成神经元谱系[7,16]，控制甚至加速间充质细胞的分化干细胞[6,17e22]，并调节其他类型的行为干细胞，包括多能干细胞和胚胎干细胞[23e25]。这些开创性的研究清楚地证明了在细胞治疗中基于石墨烯的材料的巨大潜力。然而，改变细胞行为背后的基础机制，例如增强的分化和促进的细胞增长，仍然很大程度上未知。 细胞功能和细胞之间的强连接膜的生物电性质启发我们调查石墨烯是否可以调节NSC发育和成熟的子代通过影响其生物电特性细胞。在这项工作中，我们研究了石墨烯的影响在NSC 发育期间电生理状态的成熟，包括被动和主动生物电特性和随后的NSC命运的选择。 2。材料和方法2.1。石墨烯膜制备 根据先前公布的CVD方法[26]合成石墨烯样品。简言之，将薄铜箔（5cm×5cm）加热至1000℃并在H 2和Ar气体下退火20分钟，随后暴露于H 2和CH 4下5分钟。然后在H 2和Ar气下将膜从1000℃冷却至室温。通过在硝酸铁水溶液中蚀刻从铜箔上除去石墨烯膜。在铜膜溶解之后，使TCPS基板与石墨烯膜接触，并将其从溶液中拉出以制造石墨烯/ TCPS基板。
神经干细胞综述 长期以来 ,人们一直认为 ,成年哺乳动物脑内神经细胞不具备更新能力 ,一旦受损乃至死亡 ,不能再生 ,这种观点使人们对帕金森病、多发性硬化及脑脊髓损伤的治疗受到了很大的限制。虽然传统的药物及手术取得了一定的进展 ,但是仍不能达到满意的效果。近年来 ,生物医学技术迅猛发展 ,神经生物学的重要进展之一是发现神经干细胞的存在 ,特别是成体脑内神经干细胞的分离和鉴定具有划时代意义。本文对神经干细胞的特点、分布、分化机制及应用等研究进展做一综述。 1 神经干细胞的特点 神经干细胞的特点如下:①神经干细胞可以分化。②通过分裂产生相同的神经干细胞来维持自身的存在 , 同时 ,也能产生子细胞并进一步分化成各种成熟细胞。干细胞可连续分裂几代 ,也可在较长时间内处于静止状态。③神经干细胞通过两种方式生长 ,一种是对称分裂 ,形成两个相同的神经干细胞 ;另一种是非对称分裂 , 由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀的分配 ,使得一个子细胞不可逆的走向分化的终端而成为功能专一的分化 细胞 ,另一个子细胞则保持亲代的特征 ,仍作为神经干细胞保留下来。分化细胞的数目受分化前干细胞的数目和分裂次数控制。 2 神经干细胞与其它类型干细胞的关系 按分化潜能的大小 ,干细胞基本上可分为 3种类型 :第一类是全能干细胞 ,它具有形成完整个体的分化潜能 ,具有与早期胚胎细胞相似的形态特征和很强的分化能力 ,可以无限增殖并分化成全身 2 0 0多种细胞组织的潜能 ,进一步形成机体的所有组织、器官进而形成个体 ;第二类是多能干细胞 ,这种干细胞也具有分化多种细胞组织的潜能 ,但却失去了发育成完整个体的能力 ,发育潜能受到一定的限制 ;第三类是单能干细胞 ,如神经 干细胞等 ,这种细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化。然而横向分化的发现 ,使这个观点受到了挑战 ,神经干细胞可以分化成造血细胞。总之 ,生命体通过干细胞的分裂来实现细胞的更新及保证持续生长。随着基因工程、胚胎工程、细胞工程及组织工程等各种生物技术的快速发展 ,按照一定的目的 ,在体外人工分离、培养干细胞 ,利用干细胞构建各种细胞、组织及器官作为移植来源 ,将成为干细胞应用的主要方向。 3 神经干细胞的分布 神经管形成以前 ,在整个神经板检测到神经干细胞的选择性标记物神经巢蛋白 (nestin),是细胞的骨架蛋白。构成小鼠神经板的细胞 ,具有高效形成神经球的能力。但目前尚不能肯定神经板与神经干细胞是否具有相同的诱导机制。神经管形成后 ,神经干细胞位于神经管的脑室壁周边。关于成脑神经干细胞的分布 ,研究显示成年嗅球、皮层、室管膜层或者室管膜下层、纹状体、海马的齿状回颗粒细胞下层等脑组织中分布着神经干细胞。研究发现脊髓、隔区也分离出神经干细胞 ,这些研究表明 ,神经干细胞广泛存在于神经系统。在中央管周围的神经干细胞培养后亦可形成神经球并产生神经元。脊髓损伤时 ,来自于神经干细胞的神经元新生受到抑制 ,而神经胶质细胞明显增多 ,其机制可能与生成神经元的微环境有关。
小细胞肺癌占肺癌的20 % ~ 25 % , 其生长迅速, 易早期转移, 对放疗和化疗效果高度敏感, 是一种能分泌NSE 的神经内分泌性质的肿瘤。所以, N S E 的测定可对小细胞肺癌提供诊断信息。N SE 在脑内占脑全部可溶性蛋白的1 . 5 % 。灰质中因神经元的富集, 而有高浓度N SE ; 周围神经亦含有N SE , 含量只有中枢神经元的1 % ~ 1 0 % 。故灰质中N S E 最高, 其次为脊髓、周围神经节。 但是红细胞内存在NSE 的量以及溶血对血清NSE 测定结果究竟有多大的影响, 至今未见报道。我们研 究得出, 每溶解红细胞释放1g 血红蛋白量, 就平均测 定出32 . 46μg / L 的NSE , 属假阳性结果。在观察溶血 与NSE 含量关系中看到, 当溶血产生0 . 25 g/ L 血红蛋 白、肉眼观察溶液颜色显微微浅色( 几乎看不到红色) 时, N SE 含量即在8 . 7μg / L ; 溶血产生0 . 5g / L 血红蛋白时, 肉眼观察溶液显微浅红色时, NSE 含量达17 . 2μg/ L , 已超过试剂盒的参考范围( 14 . 0μg/L) , 可见溶血对 实验结果影响很大; 同时正常人和小细胞肺癌患者血 清标本立即测定和放置1 、2 、3d 后再测定, 均显示立即 和各天间NSE 结果差异有极显著意义( P < 0 . 01 ) 。 神经元受到损伤后，NSE在细胞内的分布会有 所变化在缺血-缺氧状态下神经元的存活需要NSE提供大 量ATP以满足核酸的合成，以及NSE的间接产物丙酮酸能够
保护细胞核免受过氧化物损害 神经元特异性烯醇化酶( neuron-specificenolase，NSE) 广泛存在于神经元和神经内分泌细胞胞浆内，对神经元具有营养和保护功能， NeuN是具有46kD和48kD2个亚型，其免疫反应性在神经元分化成熟后即开始表达，阳性强度代表神经元发育的成熟程度［10］ NSE是烯醇化酶基因超家族成员之一，是糖酵解的关键酶，在糖酵解途径中催化-磷酸甘油生成磷酸烯醇式丙酮酸，特异地存在于神经元和神经内分泌细胞胞质内，对维持神经系统生理功能具有重要作用NSE的含量是成熟神经元代谢活性和突触化的标志［5-8］ ［5］ 本资料结果显示，腓浅神经SCV测定异常比率要 高于其他神经NCV异常比率据文献报道，糖尿病周 围神经病变的病理改变主要是有髓神经纤维的髓鞘出现灶性节段失，多数情况为肢体远端神经纤维轴 性，节段性髓鞘脱失［5］，而神经冲动的传导主要是由有髓鞘的神经纤维以跳跃式传导的方式传导兴奋，正常情况下人类下肢感觉神经的有髓神经纤维的数量较上肢少直径也细，神经传导速度下肢 较上肢慢当糖尿病导致神经纤维产生脱髓鞘损伤时，下肢感觉神经必然最早受到影响，所以腓浅神经SCV异常比率高也是符合一般规律的
第十三章影响胆碱能神经系统的药物 掌握： 1.M受体激动剂的结构类型和临床应用 ·结构类型：1）胆碱酯类M受体激动剂 2）生物碱类M受体激动剂 3）选择性M受体亚型激动剂 ·临床应用：M受体激动剂主要用于手术后腹气涨、尿潴留；降低眼内压，治疗青光眼；治疗阿尔茨海默症；大部分胆碱受体激动剂还具有吗啡样镇痛作用，可用于止痛。 2.胆碱酯类M受体激动剂的构效关系 3. 乙酰胆碱酯酶抑制剂的作用机制 通过抑制AchE,使突触处乙酰胆碱浓度增高，增强并延长了乙酰胆碱的作用。（间接拟胆碱药） 4. 茄科生物碱类M受体拮抗剂的结构特点 这些生物碱的化学结构属于酯类： 1）氨基醇部分均含有基本骨架“托烷”（莨菪烷），有两个手性碳原子C1和C5，但由于内消旋而无旋光性。 2）托烷3位有α-羟基取代时称为“托品”（莨菪醇），有3个手性碳原子C1、C3和C5，由于内消旋也无旋光性。 3）托烷和托品都有两种稳定构象，以托品为例，分别为椅式和船式，两者互为平衡。船式能量稍高于椅式，故常写成椅式。
4）某些生物碱（如阿托品）的酸部分是“托品酸”（莨菪酸），天然的为S-(-)-托品酸； 托品酸在分离提取过程中极易发生消旋化。 5）氧桥和羟基的存在与否，对药物的中枢作用有很大影响。氧桥的存在使中枢抑制作用增强；而羟基使分子极性增强，中枢作用减弱。 5. 溴新斯的明、阿托品、苯磺阿曲库铵、泮库溴铵的名称、结构、性质及用途 ·溴新斯的明 1）结构 由氨基甲酸酯、芳环部分和季铵碱部分组成； 2）性质 ①主要代谢物是酯水解产物溴化3-羟基苯基三甲铵，具有与Neostigmine相似但较弱的活性。 ②溴新斯的明在体内与AChE结合后，形成二甲氨基甲酰化酶。其水解释放出原酶和二甲氨基甲酸的速率很慢，导致乙酰胆碱的积聚，延长并增强了乙酰胆碱的作用。（乙酰化酶的水解只需要几十毫秒，二甲氨基甲酰化酶水解释出原酶需要几分钟。） 3）用途：用于重症肌无力和术后腹气胀和尿潴留。 ·阿托品 1）结构