微生物数量的测定
1.计数器测定法：
即用血细胞计数器进行计数。取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。由于计数室的容积是一定的(O.1mm3)，因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。本法简便易行，可立即得出结果。
本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。
2、电子计数器计数法:
电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。
该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不含任何碎片。
3、活细胞计数法
常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出活菌数。
此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。使用该法应注意：①一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确；②为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入O．001％2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)；③本法限用于形成菌落的微生物。
广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计数法。
4、比浊法
比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。
此法简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品，不能用此法测定。
5、测定细胞重量法
此法分为湿重法和干重法。湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重；干重法系单位体积培养物经离心后，以清水洗净放人干燥器加热烘干，使之失去水分然后称重。
此法适于菌体浓度较高的样品，是测定丝状真菌生长量的一种常用方法。
6、测定细胞总氮量或总碳量
氮、碳是细胞的主要成分，含量较稳定，测定氮、碳的含量可以推知细胞的质量。此法适于细胞浓度较高的样品。
7、颜色改变单位法（colour change unit,简称CCU）
通常用于很小，用一般的比浊法无法计数的微生物，比如支原体等，因为支原体的液体培养物是完全透明的，呈现为清亮透明红色，因此无法用比浊法来计数，由于支原体固体培养很困难，用cfu法也不容易计数，因此需要用特殊的计数方法，即CCU法。它是以微生物在培养基中的代谢活力为指标，来计数微生物的相对含量的，下面以解脲脲原体为例单介绍其操作：，简
（1）取12只无菌试管，每一管装1.8ml解脲脲原体培养基。
（2）在第一管加入0.2ml待测解脲脲原体菌液，充分混匀，从中吸取0.2ml加入第二管，依次类推，10倍梯度稀释，一直到最末一管
（3）于37度培养，以培养基颜色改变的最末一管作为待测菌液的CCU，也就是支原体的最大代谢活力，比如第六管出现颜色改变，他的相对浓度就是10的6次方CCU/ml.
取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数或做片在显微镜下数，均称为显微镜直接计数法。
用琼脂平板计数，称为菌落计数法
一般来说，比浊法和菌落计数法就可以满足绝大多数细菌的计数，但是对支原体这样比较特殊的微生物，用CCU法比较合适。
微生物细胞大小测定 一、实验目的 了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造和使用原理，掌握微生物细胞大小的测定方法。 二、实验原理 微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。 目镜测微尺（图-1）是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10 mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小方格所代表的相对长度。 镜台测微尺（图20-2）是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将lmm等分为100格，每格长l0μm（即0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将镜台测微尺放在载物台上， 图1目镜测微尺图2 镜台测微尺 由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。 三、实验器材 1．活材料：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、枯草杆菌(Baccillus subtilis)染色标本片。 2．器材：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、擦镜纸。 四、实验方法 1．目镜测微尺的校正把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长l0μm，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。
山东大学实验报告2017年11月27日 ________________________________________ _________________________ 科目：微生物学实验题目：微生物大小与数量的测定姓名：丁志康 一、目的要求 1.学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法。 2.增强微生物细胞大小的感性认识。 3. 明确血细胞计数板计数的原理。 4. 掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。 二、基本原理 一）微生物大小的测定 1.微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定， 需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具——测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。 2.镜台测微尺是中央部分可有精确等分线的载玻片，一般是将1mm等分为100格每格长0.01mm（即 10μm）。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于矫正目镜测微尺每格的相对长度。 3.目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，有等分为50小格 和100小格两种。测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也不一样。因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定大放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞的实际大小。 4.球菌用直径来表示其大小；杆菌则用宽和长的范围来表示。如金黄色葡萄球菌直径约为0.8μm， 枯草芽孢杆菌大小为0.7~0.8×2~3μm。 二）微生物数量的测定 1.微生物数量的测定有多种方法，本次试验中使用显微镜直接计数法。显微镜直接计数法是将少 量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为0.02mm3，而且盖玻片和载波片之间的距离只有0.02mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。（除了用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳的细菌学检查。)显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单。但此法的缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。目前已有一些方法可以克服这一缺点，如结合活菌染色微室培养（短时间）以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的。本实验以血球计数板为例进行显微镜直接计数。 2.用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。该计数板是一块特制的载
姓名班级13级生命基地班学号同组者： 科目微生物学实验题目微生物大小及数量的测定组别3 【实验题目】 微生物大小及数量的测定 【实验目的】 1.了解显微镜测定微生物大小与血球计数板测定微生物数量的原理。 2.学习并掌握显微镜下测定微生物细胞大小的技术，包括目镜测微尺、镜台测微尺的校正 技术与测定细胞大小的技术。 3.了解血球计数板的结构，学习并掌握血球计数板计数微生物数量的技术，包括样品的点 样、菌数计数的方法与计算。 【实验器材】 1、菌种： 酵母菌液，枯草芽孢杆菌 2、试剂： 结晶紫，蒸馏水，香柏油，二甲苯等 3、仪器和用具： 显微镜，目镜测微尺，镜台测微尺，血球计数板、盖玻片、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸，酒精灯等 【实验原理】 一、微生物大小的测定 1、测微尺的构造 微生物细胞的大小，是微生物重要的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。由于菌体很小、只能在显微镜下来测量。显微镜测微尺是由目镜测微尺和镜台接物测微尺组成。 目镜测微尺 目镜测微尺是一块圆形玻璃片，其中有精确的 等分刻度，在5mm 刻尺上分50 份，或把10 mm 长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的 隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量 经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜 组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示 的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小 时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在 图1
姓名 班级 13级生命基地班 学号 同组者： 科目 微生物学实验 题目 微生物大小及数量的测定 组别 3 一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。 镜台测微尺 镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将lmm 等分为100格，每格长l0μm （即0.0lmm ），是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将镜台测微尺放在载物台上，由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。 2、 球菌用直径表示大小；杆菌用宽和长来表示。 二、血球计数板测定微生物数量 镜检计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌泡子可采用血球计数板；一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽(Petroff Hausser)细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，故细菌不易看清。 血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网(图3)。每个方格网共分9大格，其中间的一大格(又称为计数室)常被用作微生物的计数。计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即每个大方格都由400个小方格组成(图4)。 每个大方格边长为1mm ，则每一大方格的面积为1mm 2，每个小方格的面积为1／400mm 2，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm ，所以每个计数室(大方格)的体积为0.1mm 3，每个小方格的体积为l ／4000mm 3。计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml 目镜测微尺 镜台测微尺 图2： 目镜测微尺和镜台测微尺的校准
常见的微生物检测 方法
摘要：微生物的检测，无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义，本文分生长量测定法，微生物计数法，生理指标法和商业化快速微生物检测简要介绍了利用微生物重量，体积，大小，生理代谢物等指标的二十余种常见的检测方法，简要介绍了这些方法的原理，应用范围和优缺点。 概述： 一个微生物细胞在合适的外界条件下，不断的吸收营养物质，并按自己的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量，体积，大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其体积、重量、密度或浓度作指标来衡量。微生物的生长不同于其它生物的生长，微生物的个体生长在科研上有一定困难，一般情况下也没有实际意义。微生物是以量取胜的，因此，微生物的生长一般指群体的扩增。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标，同
时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病，霉腐微生物的防治都和她们的生长抑制紧密相关。因此有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加，因此测定的方法也都直接或间接的以次为根据，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量，能够从其重量，体积，密度，浓度，做指标来进行衡量。 生长量测定法 体积测量法：又称测菌丝浓度法。 经过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10毫升）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5分钟）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。 称干重法：
《环境微生物新技术》课程作业 2.微生物数量测定方法有哪些？空气、水、土壤样品分别适用哪些方法？请举例说明。 常见微生物数量的测定方法 <1> 1.计数器测定法： 即用血细胞计数器进行计数。取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。由于计数室的容积是一定的(O.1mm3)，因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。本法简便易行，可立即得出结果。 本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。2、电子计数器计数法: 电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。 该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不含任何碎片。 3、活细胞计数法 : 常用的有平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出活菌数。
此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。使用该法应注意：①一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确；②为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入O．001％2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)；③本法限用于形成菌落的微生物。 广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计数法。 4、比浊法 比浊法是根据菌悬液的透光量间接地测定细菌的数量。细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比，所以，可用光电比色计测定菌液，用光密度(OD值)表示样品菌液浓度。此法简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜色太深的样品，不能用此法测定。 5、测定细胞重量法 此法分为湿重法和干重法。湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重；干重法系单位体积培养物经离心后，以清水洗净放人干燥器加热烘干，使之失去水分然后称重。 此法适于菌体浓度较高的样品，是测定丝状真菌生长量的一种常用方法。 6、测定细胞总氮量或总碳量 氮、碳是细胞的主要成分，含量较稳定，测定氮、碳的含量可以推知细胞的质量。此法适于细胞浓度较高的样品。
食品中微生物细菌总数的测定 一、实验目的 1学习并掌握细菌的分离和活菌计数的基本方法和原理； 2了解菌落总数测定在对被样品进行卫生学评价中的意义。 二、实验原理 菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落总数。菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。 菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。 三、器材 食品检样营养琼脂培养基无菌生理盐水无菌培养皿，无菌移液管酒精灯等。 四、实验步骤 1取样、稀释和培养 1.1以无菌操作取检样25g（或ml），放于225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振要或研磨制成1:10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000～10000r/min的速度处理1min，制成1:10的均匀稀释液。
1.2用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml 灭菌生理盐水的试管内，振摇试管混合均匀，制成1:100的稀释液。 1.3另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支10ml吸管。 1.4根据标准要求或对污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在制作10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml 稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。 1.5稀释液移入平皿后，将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约 15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml 稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。 1.6待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。 2菌落计数方法 作平皿菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落总数后，求出同稀释度的各平皿平均菌落数。到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不要超过24h。 3菌落计数报告方法 3.1平皿菌落数的选择 选取菌落数在30～300之间的平皿作为菌落总数测定标准。每一个稀释度应采用两个平皿平均数，其中一个平皿有较大片状菌落生长
土壤微生物测定 土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态，可以反映自然或农田生态系统的微小变化。土壤微生物活性的表征量有:微生物量、C/N、土壤呼吸强度和纤维呼吸强度、微生物区系、磷酸酶活性、酶活性等。 测定指标： 1、土壤微生物量(MierobialBiomass，MB) 能代表参与调控土壤能量和养分循环以及有机物质转化相对应微生物的数量，一般指土壤中体积小于5Χ103um3的生物总量。它与土壤有机质含量密切相关。 目前，熏蒸法是使用最广泛的一种测定土壤微生物量的方法阎，它是将待测土壤经药剂熏蒸后，土壤中微生物被杀死，被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解(矿化)而放出CO2，根据释放出的CO2:的量和微生物体矿化率常数Kc可计算出该土样微生物中的碳量。 因此碳量的大小就反映了微生物量的大小。 此外，还有平板计(通过显微镜直接计数)、成份分析法、底物诱导呼吸法、熏蒸培养法(测定油污染土壤中的微生物量—碳。受土壤水分状况影响较大，不适用强酸性土壤及刚施 用过大量有机肥的土壤等)、熏蒸提取法等，均可用来测定土壤微生物量。 熏蒸提取-容量分析法 操作步骤： （1）土壤前处理和熏蒸 （2）提取 -1K2SO 4（图将熏蒸土壤无损地转移到200mL聚乙烯塑料瓶中，加入100mL0.5mol·L 水比为1:4；w：v），振荡30min（300rev·min -1），用中速定量滤纸过滤于125mL塑料瓶中。熏蒸开始的同时，另称取等量的3份土壤于200mL聚乙烯塑料瓶中，直接加入100mlL0.5mol·L -1K2SO4提取；另作3个无土壤空白。提取液应立即分析。 （3）测定 吸取10mL上述土壤提取液于150mL消化管（24mmх295mm）中，准确加入10mL0.018 mol·L -1K2Cr2O7—12mol·L-1H2SO4溶液，加入2~3玻璃珠或瓷片，混匀后置于175±1℃ 磷酸浴中煮沸10min（放入消化管前，磷酸浴温度应调至179℃，放入后温度恰好为175℃）。冷却后无损地转移至150mL三角瓶中，用去离子水洗涤消化管3~5次使溶液体积约为80mL， 加入一滴邻菲罗啉指示剂，用0.05mol·L -1硫酸亚铁标准溶液滴定，溶液颜色由橙黄色 变 为蓝色，再变为红棕色，即为滴定终点。 （4）结果计算
微生物总数检测方法（真菌） 一、检测用培养基配方与培养条件 1.培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA培养基） 配制：以北京路桥PDA培养基为例，按说明上配制需称取培养基4克，加水100毫升。 2. 培养条件：25℃-30℃；时间：72-96小时。 二、检测与计数方法 1. 梯度稀释 称取适量的样品，加入带玻璃珠的三角瓶中，加入100mL的无菌水（无菌水中事先加入了分散剂3—5滴，分散剂可以是吐温，OP—80，用来分散菌团），用玻璃棒搅拌使之溶解吸水均匀后，上旋转式摇床200 r/min充分振荡60 min，,即成母液菌悬液（基础液）。 2. 用10mL无菌移液管分别吸取10mL上述母液菌悬液加入90 mL无菌水中，按1:10进行系列稀释，分别得到1:1×101，1:1×102，1:1×103，1:1×104……1:k稀释的菌悬液（每个稀释度应更换无菌移液管，每一个稀释度瓶种应放有适量的玻璃珠，以保证菌液分布均匀）。 3. 加样及培养 取1个适宜的稀释度，用移液枪吸取菌悬液0.1 mL，加至预先制备好的固体培养基平板上，用无菌玻璃涂布棒将菌悬液均匀地涂于琼脂表面。此稀释度重复3次，同时以空白作对照，于适宜的条件下培养。 4. 菌落识别 根据所检测菌种的技术资料，每个稀释度取不同类型的代表菌落通过涂片、染色、镜检等技术手段确认有效菌。当空白对照培养皿出现菌落数时，检测结果无效，应重做。 5. 菌落计数 以出现20—70个菌落数的稀释度的平板为计数标准，分别统计有效活菌数目和杂菌数目。 有效活菌数按式（1）计算，同时计算杂菌数： nm = x kv1/(m0v2) ×10-8或 nv = x kv1/(v0v2) ×10-8（1） 式中：
实验七酵母菌细胞大小的测定 一、实验目的 1.了解测量微生物大小的原理； 2.学习并掌握接目测微尺的校正方法及微生物大小的测定方法，增强微生物细胞大小的感 性认识。 二、实验材料 1.菌种：啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌悬液，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 染色标本片。 2.仪器或其他用具：显微镜，接目测微尺，镜台测微尺，载玻片，盖玻片 三、实验原理 微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物细胞个体较小，需要在显微镜下借助于特殊的测量工具—测微尺来测定其大小。测微尺包括镜台测微尺和接目测微尺。 镜台测微尺是一张中央部分刻有精确等分线的载玻片，专门用于校定接目镜测微尺每小格的相对长度。通常，刻度的总长是1mm，被等分为100格，每格0.01mm（即10μm）。镜台测微尺不直接用来测量细胞的大小。 接目测微尺是一块可以放入接目镜的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，有等分为50小格和100小格的两种。在测量时将接目测微尺放在目镜的隔板上，即可来测量经显微镜放大后的细胞物象。也有专用的目镜，里面已经安放好了接目测微尺。 由于接目测微尺所测量的是经显微镜放大后的细胞物象，因此，在不同的显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，接目镜测微尺每一小格所代表的实际长度也不一样。所以，在用接目测微尺测量微生物大小之前，必须先用镜台测微尺校定接目镜测微尺，以确定该显微镜在特定放大倍数的目镜和物镜下，接目镜测微尺每一小格所代表的实际长度，然后根据微生物细胞相当于的接目镜测微尺格数，计算出微生物细胞的实际大小。 图7-1测微尺的安装 图7-2目镜测微尺图7-3用镜台测微尺校正接目测微尺
食品微生物检验菌落总数测定方法的效果 发表时间：2019-05-14T11:09:08.123Z 来源：《健康世界》2019年3期作者：赵丽萍[导读] 食品卫生安全关乎国人的健康生活，采用快速、准确的微生物检验方法、制定安全、可靠的食品检验标准是保障饮食安全的重要手段和基本措施。 逊克县疾病预防控制中心 164499 摘要：目的研究分析测试片法（test piece method，TP）、计数琼脂平板法（counting Agar plate method，CAP）及琼脂倾注TTC平板法（2，3，5- chloride three phenyl tetrazole，TTC）对食品微生物菌落总数的测定效果。方法此次研究的对象是选取70例需进行菌落总数测定的食品样本，分别应用测试片法、计数琼脂平板法及琼脂平板法进行测定，对比三种方法的菌落总数超标样品检出率。结果 TTC 法菌落总数超标检出率为24.3%，显著高于测试片法（7.1%）及计数琼脂平板法（11.4%），P<0.05。结论与TP及CAP相比，TTC法对于菌落总数超标样品的检出率更高、灵敏度更好。 关键词：微生物检验；测试片法；计数琼脂平板法；琼脂平板法 [abstract] Objective To study the effects of test piece method（TP），counting Agar plate method（CAP）and agar pouring TTC plate method（2，3，5-chloride three phenyl tetrazole，TTC）on the total number of food microbial colonies. Methods 70 food samples which need to be tested for the total number of colonies were selected for this study. The detection rates of the above three methods were compared by using the test sheet method，the counting agar plate method and the agar plate method respectively. Results The detection rate of TTC method was 24.3%，significantly higher than that of test tablet method（7.1%）and Counting Agar plate method （11.4%），P < 0.05. Conclusion Compared with TP and CAP，TTC method has higher detection rate and better sensitivity for samples whose total number of bacteria exceeds the standard. [keywords] microbiological test；test tablet method；Counting Agar plate method；agar plate method 食品卫生安全关乎国人的健康生活，采用快速、准确的微生物检验方法、制定安全、可靠的食品检验标准是保障饮食安全的重要手段和基本措施。总菌落数可反映加工食品的整体卫生情况，且检验快速、准确性高，可作为食品卫生检验的独立性指标，为了比较TP、CAP、TTC 3种总菌落数计数方法的检验效果，特进行该研究。 1 资料与方法 1.1 一般资料 （1）试验时间：2017年1—9月。（2）试验材料：测试纸片（符合中国SN/T 1897-2007标准、美国AOAC OMA标准：986.33、989.10、990.12）、计数用琼脂培养基PCA（250 g）、TTC培养琼脂（在PCA中添加TTC，培养基中TTC终浓度为0.005%），上述材料、试剂均在效期内使用。（3）检验样本：所有样品由5个食品厂企业提供。 1.2 方法 （1）CAP：测定前对试验所用吸管、容器、耗材进行消毒处理，保证无菌，制作琼脂培养基，取待测样本加入无菌磷酸缓冲液充分混匀后梯度稀释为10倍、100倍、1000倍、10000倍样本均液，选择适于计数的2～3个稀释浓度样本液，接种至无菌琼脂培养皿中恒温培养，并取磷酸缓冲液作对照接种，在（36±1）℃条件培养（48±2）h后，参照GB4789.1-2010规定进行菌落计数、换算。TP：取上述稀释后样本2～3个，将滴加在测试纸片中央，静置5 min后显微镜观察、计数。注意保证操作无菌性、操作台面水平、控制薄膜按压力度。（3）TTC：稀释、培养、计数过程同CAP，区别是向琼脂培养加入TTC观察显色反应并计数。 1.3 观察指标 检出总菌落数：严格按照TP、CAP及TTC 3种菌落计数操作方法对70例样本中的总菌落数（CFU，个/g）进行计数，纳入计数的菌落种类包括艾希大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、霉菌等病原菌（详见GB4789.1-2010[1]中的要求）。（2）样本总菌落数超标率：将3种计数方法测定的总菌落数与国标GB4789.1-2010[1]中对于总菌落数超标标准进行对照，以样本检验总菌落数>1500个/g作为超标判断标准。 1.4 统计方法 采用SPSS17.0软件对3种菌落计数方法的总菌落数超标样品检出率作配对χ2检验，若P<0.05，说明二者差异有统计学意义。 2 结果 在样本平均检出总菌落数（CFU）结果中，TP法检出（326±5）个/g，不合格品检出率为7.1%（5/70）；ACP法检出（334±6）个/g，不合格品检出率为11.4%（8/70）；TTC法检出（368±8）个/g，不合格品检出率为24.3%（17/70）。TP、ACP二者的不合格品检出率差异无统计学意义（χ2=0.763，P=0.382），而TTC对于不合格品的检出率则显著高于TP（χ2=7.766，P=0.005）以及ACP （χ2=3.944，P=0.047）。 3 讨论 近年来，食品安全问题频发、备受社会关注。加工食品中的病原菌如大肠杆菌、沙门氏菌等可引发传染性疾病，危害生命健康，因此对加工食品进行微生物检验，对于保障食品安全必不可少[2]。 总菌落数是评价食品质量的重要指标[3]。TP及CAP属常见总菌落数计数方法[4]，两种计数法的计数结果差异无统计学意义[5]。然而，在样本因素（如颗粒物、固体残渣）[6]、计数精度（如不适于平皿菌落数>200个/g的情况）[7]等影响下，TP、CAP的检出灵敏度及准确度均受到了一定的限制。相对而言，TTC作为灵敏性较高的指示剂，能特异性地对细菌进行染色，而检验人员则能对视野中的染色菌落数直观、准确地统计，并能排除杂质的干扰，因此TTC具有更高的检出灵敏度，更适用于菌落总数较多的样本的计数[8]。而该文的研究结果也显示，TTC法菌落总数超标检出率显著高于TP、CAP法，这也说明在上述3种方法中，TTC法对于总菌落数的计数结果更加精确、受到样品因素的影响也更小，值得在食品检验中加以推广和应用。 综上，与TP及CAP相比，TTC法对于菌落总数超标样品的检出率更高、灵敏度更好。
微生物的大小测定 胡雪芳 201300261033 【实验目的】 1.了解显微镜测定微生物大小的原理。 2.学习并掌握显微镜下测定微生物细胞大小的技术，包括目镜测微 尺、镜台测微尺的校正技术与测定细胞大小的技术。 【实验原理】 微生物细胞的大小，是微生物重要的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。由于菌体很小、只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。 1.目镜测微尺 目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10 mm长度刻成100等分（如图1所示）。 图1 目镜测微尺 测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校
正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。 2.镜台测微尺 镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将lmm等分为100格，每格长l0μm（即0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺的（如图2所示）。 图2 镜台测微尺 校正时，将镜台测微尺放在载物台上，由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。 【实验材料】 1.菌株 酵母菌液， 枯草芽孢杆菌斜面培养物
微生物大小的测定及微生物数量的直接计数法摘要：本文使用了目镜测微尺和镜台测微尺来测量野生酵母的细胞大小，得到的结果是宽在5.78~11之间，长在8.25~20之间。然后用血细胞计数板对酵母菌进行计数，并绘制其生长曲线，有四个时期，分别是延滞期、对数期、稳定期和衰亡期。 关键词：细胞大小血细胞计数板酵母菌生长曲线 前言 生产生活中利用微生物时，需要了解微生物的一些基本物理属性，如菌体的大小形状等。本实验利用显微测微尺对野生酵母进行测量，并用血球计数板对酵母菌进行其生长曲线的测定，了解去生长规律。通过此综合性实验加深对无菌操作的印象，并将其掌握。 1实验材料与仪器 1．1实验材料与试剂 麦芽汁培养基、生理盐水、果汁（自制）、活化的酵母菌、酒精 1．2实验仪器 锥形瓶、试管、接种环、移液枪、显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、盖玻片、载玻片、滴管、血细胞计数板、吸水纸、酒精灯 2实验方法 2．1预准备 2.1.1培养基的制备 麦芽汁培养基（130.1g/L）200ml*4瓶 麦芽汁琼脂培养基（145.1g/L）5ml*2支试管150ml*1瓶 生理盐水9ml*20支 （制备后高压蒸汽灭菌121℃，20min） 2.1.2酵母分离纯化 平板划线分离：先倒制无菌琼脂培养基平板,待充分冷却凝固后,用接种环以无菌沾取少量待分离的含菌样品,在无菌琼脂平板表面进行有规则的划线。划线的方式有连续划线、平行划线、扇形划线或其它形式的划线。通过这样在平板上进行划线稀释, 微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少, 并逐步分散开
来。经培养后,可在平板表面形成分散的单 个菌落。但单个菌落并不一定是由单个细 胞形成的，需再重复划线1-2次, 并结合显 微镜检测个体形态特征, 才可获得真正的 纯培养物。 斜面接种是从已生长好的菌种斜面上 挑取少量菌种移植至另一支新鲜斜面培养基上的一种接种方法。具体操作如下：接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。贴在距试管口约2-3cm的位置。点燃酒精灯。用接种环将少许菌种移接到贴好标签的试管斜面上。操作必须按无菌操作法进行。 简述如下：1)手持试管：将菌种和待接斜面的两支试管用大拇指和其他四指握在左手中，使中指位于两试管之间部位。斜面面向操作者，并使它们位于水平位置。2)旋松管塞：先用有于松动棉塞或塑料管盖，以便接种时拔出。3)取接种环：右手拿接种环(如握钢笔一样)，在火焰上将环端灼烧灭菌。然后将有可能伸入试管的其余部分均灼烧灭菌，重复此操作，再灼烧一次。4)拔管塞：用右手的无名指、小指和手掌边先后取下菌种管和待接试管的管塞，然后让试管口缓缓过火灭菌(切勿烧得过烫)。5)接种环冷却：将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却。6)取菌：待接种环冷却后，轻轻沾取少量菌体或胞子，然后将接种环移出菌种管，注意不要使接种环的部分碰到管壁，取出后不可使带菌接种环通过火焰。7)接种：在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面培养基的底部向上部作“Z”形来回密集划线，切勿划破培养基。有时也可用接种针仅在斜面培养基的中央拉一条直线作斜面接种，直线接种可观察不同菌种的生长特点。8)塞管塞：取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将管塞旋上。塞棉塞时不要用试管去迎棉塞，以免试管在移动时纳入不洁空气。9)将接种环灼烧灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧。
微生物大小及数量的测定 一、实验目的： 1、学习并掌握使用显微镜测微尺测定微生物大小的方法 2、掌握对不同形态细菌细胞大小测定的分类学基本要求，增强对微生物细 胞大小的感性认识 3、学习并掌握使用血细胞计数板测定微生物细胞或孢子数量的方法 二、实验器材 1、菌种： 枯草芽孢杆菌、酿酒酵母 2、溶液和试剂 香柏油、二甲苯、美兰染液 3、仪器和其他用品 目镜测微尺、镜台测微尺、普通光学显微镜、擦镜纸、软布、血细胞计数 板、凹载玻片、盖玻片、接种环、酒精灯、试管、吸管、移液枪 三、实验原理 1、测微尺： 微生物大小的测定，需要借助于特殊的测量工具——显微测微尺，它包括 目镜测微尺和镜台测微尺两个互相配合使用的部件。 镜台测微尺是一个在特制载玻片中央封固的标准刻尺，其尺度总长为1mm，精确分为10个大格，每个大格又分为是10个小格，共100个小格，每个小格长度为0.01mm，即10μm。刻线外有一直径为φ3，粗线为0.1mm的圆，以便调焦时寻找线条。刻线上还覆盖有厚度为0.17mm的盖玻片，可保护刻线久
用而不受损伤。。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜 测微尺每一格的相对长度。 目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻 度，一般有等分为50个小格和100个小格两种。测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不一样，目镜测微尺每小格在不同条件下所代表的实际长度 也不一样。因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞的实际大小。 球菌用直径表示大小，杆菌用长和宽来表示大小 2、显微镜计数： 显微镜计数是将少量待测样品的悬浮液置于一种特定的具有确定容积的载 玻片上（又称计菌器），于显微镜下直接观察、计数的方法。目前国内外常用的 计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，它们可用于各种微生物单细胞（孢子）悬液的计数，基本原理相同。其中血细胞 计数板较厚，不能用油镜，常用于个体相对较大的酵母细胞、霉菌孢子等的计数，
微生物大小及数量的测 定 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT
微生物大小及数量的测定 一、实验目的： 1、学习并掌握使用显微镜测微尺测定微生物大小的方法 2、掌握对不同形态细菌细胞大小测定的分类学基本要求，增强对微生物细胞大小的感性认识 3、学习并掌握使用血细胞计数板测定微生物细胞或孢子数量的方法 二、实验器材 1、菌种： 枯草芽孢杆菌、酿酒酵母 2、溶液和试剂 香柏油、二甲苯、美兰染液 3、仪器和其他用品 目镜测微尺、镜台测微尺、普通光学显微镜、擦镜纸、软布、血细胞计数板、凹载玻片、盖玻片、接种环、酒精灯、试管、吸管、移液枪 三、实验原理 1、测微尺： 微生物大小的测定，需要借助于特殊的测量工具——显微测微尺，它包括目镜测微尺和镜台测微尺两个互相配合使用的部件。 镜台测微尺是一个在特制载玻片中央封固的标准刻尺，其尺度总长为1mm，精确分为10个大格，每个大格又分为是10个小格，共100个小格，每个小格长度为，即10μm。刻线外有一直径为φ3，粗线为的圆，以便调焦时寻找线条。刻线上还覆盖有厚度为的盖玻片，可保护刻线久用而不受损伤。。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每一格的相对长度。 目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，一般有等分为50个小格和100个小格两种。测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不一样，目镜测微尺每小格在不同条件下所代表的实际长度也不一样。因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞的实际大小。 球菌用直径表示大小，杆菌用长和宽来表示大小 2、显微镜计数：
时间：2014年4月21日班级：食检133 学号：1201131344 姓名：袁蕊 实验四酵母菌细胞大小的测定 一、实验目的 1. 了解测量微生物大小的原理； 2. 学习并掌握接目测微尺的校正方法及微生物大小的测定方法，增强微生物细胞大小的感性认识。 二、实验原理 微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物细胞个体较小，需要在显微镜下借助于特殊的测量工具—测微尺来测定其大小。测微尺包括镜台测微尺和接目测微尺。 镜台测微尺是一张中央部分刻有精确等分线的载玻片，专门用于校定接目镜测微尺每小格的相对长度。通常，刻度的总长是1mm，被等分为100格，每格0.01mm（即10μm）。镜台测微尺不直接用来测量细胞的大小。 接目测微尺是一块可以放入接目镜的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，有等分为50小格和100小格的两种。在测量时将接目测微尺放在目镜的隔板上，即可来测量经显微镜放大后的细胞物象。也有专用的目镜，里面已经安放好了接目测微尺。 由于接目测微尺所测量的是经显微镜放大后的细胞物象，因此，在不同的显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，接目镜测微尺每一小格所代表的实际长度也不一样。所以，在用接目测微尺测量微生物大小之前，必须先用镜台测微尺校定接目镜测微尺，以确定该显微镜在特定放大倍数的目镜和物镜下，接目镜测微尺每一小格所代表的实际长度，然后根据微生物细胞相当于的接目镜测微尺格数，计算出微生物细胞的实际大小。 三、实验仪器及试剂 1. 菌种：酵母菌悬液 2. 仪器或其他用具：显微镜，接目测微尺，镜台测微尺，载玻片，盖玻片 四、实验步骤 1. 装接目测微尺：取下显微镜的目镜，换上专用目镜。如果没有专用的目镜，则取下显微镜的目镜，旋下透镜，将接目镜测微尺刻度朝下放在接目镜的隔板上，再旋上目镜透镜，将装有测微尺的目镜装回镜筒。 2. 接目测微尺的标定： 1) 放镜台测微尺：将镜台测微尺刻度面朝上固定在显微镜的载物台上，注意不可放反。 2) 标定：将低倍镜转入光路，镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，当清晰地看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使接目测微尺与镜台测微尺的刻度相平行。利用移动钮移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，然后分别数出两重合线之间镜
环境科学与工程学院 生物工程10（1）班 叶智源 3110007848 实验二 沉降法检测空气中微生物数量 （一） 实验目的 1．学习并掌握用沉降法检测空气中的微生物 2．了解空气中微生物的分布状况 （二）实验原理 在我们周围的环境中存在着种类繁多、数量庞大的微生物。空气中也不例外。虽然空气不是微生物栖息的良好环境。但由于气流、灰尘和水沫的流动，人和动物的活动等原因，仍有相当数量的微生物存在。当空气中个体微小的微生物落到适合于它们生长繁殖的固体培养基的表面时，在适温下培养一段时间后，每一个分散的菌体或孢子就会形成一个个肉眼可见的细胞群体即菌落。观察大小、形态各异的菌落，就可大致鉴别空气个存在的微生物的种类。（三)实验器材 1． 试剂 牛肉蛋白胨培养基配方： 牛肉膏 5.0g, 蛋白胨 10.0g ，NaCl 5g, 水1000ml ，pH 7.2~7.4 马铃薯培养基配方： 马铃薯 200g, 蔗糖 20g, 水1000ml ， pH 7.2 高氏一号培养基配方： 淀粉 20g, 硝酸钾 1.0g, 磷酸氢二钾 0.5g, 硫酸镁0.5g, 氯化钠0.5g, 硫酸亚铁0.01g, 水1000ml, pH 7.2~7.4 2. 仪器及其他用品 高压灭菌锅，操作工作台，三角瓶，培养皿，酒精灯，培养箱等 （四）实验方法 1．倒平板：按常法配置上述培养基，分装于三角瓶中，高压灭菌备用。临用前将培养基熔化，冷却至50℃左右，各倒16个平板备用。 2．暴露取样 在指定的地点草地，一层楼，三层楼，七层楼各放4皿，将平板皿盖打开，在空气中暴露5min 和10min,时间一到，立即合上皿盖。 3． 培养观察： 细菌置于37℃培养，放线菌培养基平板和真菌培养基平板置于28℃培养。细菌培养48h ，真菌和放线菌培养4-6天。计数平板上的菌落，观察各种菌落的形态、大小、颜色等特征。 4.计算1m 3 空气中微生物的数目 奥梅染斯基（Омелянский）曾建议：如面积为100㎝2 的平板培养基，暴露在空气中5分钟，置于37℃培养24小时后所生长的菌落数，相当于10L 空气中的细菌数。 X= X ：每m 3 空气中的细菌数 N ×100×100 πｒ2