伪狂犬病毒标记神经环路的研究进展
罗振 潘建青 边晔 王立平
摘 要 伪狂犬病毒(PRV)作为一种亲神经性的病毒，它以其自我复制、跨突触、特异性传递的三大优势在揭示神经系统中功能性神经元之间的连接发挥着重大的作用。经基因重组后的伪狂犬病毒不但继承了原有病毒的优势，同时还延伸出其它特异性的功能。本文即对目前应用伪狂犬病毒标记神经环路的一些技术和应用进行综述。
关键词 伪狂犬病毒；神经环路
1 神经环路标记概述
在上世纪九十年代以前，在揭示神经环路中神经元之间的连接主要是通过注射一种染料或蛋白来标记神经元。这种方法需要很多的动物，才能明确最简单的环路，同时大量与实验无关的神经环路被标记，此外这种方法不可能注射特异性的示踪剂到神经元。病毒示踪的价值在于它能够在同种生物体内标记完整的神经环路。由于病毒能够在神经细胞中自我复制，不像化学物质或蛋白很容易被扩散同时能够通过突触的极少。近年来用重组病毒在生物体内表达荧光蛋白的方法使得神经环路的标记更加简单化和直观化，并且能够在活体长期存在。
2 伪狂犬病毒标记神经环路
野生型的伪狂犬病毒由于毒性太强，对神经元的破坏性极强，很容易导致实验动物的死亡[1,2,3]，因此使用效果不是很好。目前使用的伪狂犬病毒毒株都是减毒后的病毒，它的优点在于病毒能够在体内长期，使实验动物并无明显病症，从而可以标记完整的神经环路。目前成功的应用于跨突触感染的伪狂犬病毒毒株有PRV-Bartha[4]。伪狂犬病毒感染神经元的传递方式是由突触后到突触前的逆行感染方式。荧光蛋白作为一种新型的标记物，在各个领域已得到广泛的应用。利用基因重组技术，将表达荧光蛋白的基因插入到伪狂犬病毒的非必须基因中，从而使得被感染的细胞内表达有荧光蛋白，被感染的组织可以在共聚焦显微镜下直接观察，从而省去很多实验的下游步骤。
3 条件复制型重组伪狂犬病毒
通过直接的大脑内注射伪狂犬病毒能够揭示中央神经系统环路，这种立体定位的注射能够提供一种精确的轴突终端的剂量依赖性感染，伪狂犬病毒粒子较大，直径约200nm，很容易吸附到细胞外基质上的蛋白，因此病毒粒子不会从注射位点扩散。精确的描绘中央神经系统环路需要很好的控制感染，为了达到这个目的DeFalco和他的同事构建了一个PRV-Bartha的衍生毒株，这种毒株不能自主表达胸苷激酶(TK)基因，而TK基因的表达受阻会导致病毒不能自主复制，当被感染的细胞能够表达Cre重组酶时，这种病毒的TK基因表达抑制被解除，能够表达TK基因同时绿色荧光蛋白[5,6]，此时病毒能够复制并且传递到所有突触连接的神经元细胞。
4 伪狂犬病毒在标记视网膜环路的应用
当PRV-Bartha被注射到眼球玻璃体，病毒最后被传递到另外一只眼的视网膜神经胶质细胞上，在这个模式中，PRV通过眼窝肌肉和睫状肌副交感神经和交感神经分布传递到中央神经系统，通过交感神经逆行感染导致视交叉上核的感染，并且从这里传递到对侧眼球的视网膜神经节细胞[7]。最近的研究中，Viney和他的同事利用这种模式，研究一种内在的光敏感的视网膜神经节细胞的局部环路，发现PRV对少数光敏感的视网膜神经节细胞的标记是专有的[8]。
5 伪狂犬病毒示踪的新应用
PRV能够量化动态的神经元连接，在大脑发育过程中，通过测量PRV侵入大脑皮层的程度，神经元之间的连接能够被观察。通过比较出生后1~8天的小狗幼仔被间歇障碍隔离或与母亲的间歇分离来观察这种处理对后代的CNS发育过程中的影响，小狗幼仔胃腹侧被注射PRV-Bartha，感染后63~66小时病毒传递到脑干和脑皮层时被并分析。处理组的纹状体、中心
杏仁核、岛皮质的感染与没有处理组的相比较极其不
明显[9]。PRV在这方面的传递差异可能是由于8天内的处理对于突触构造的形成产生的差异[10]。
类似的研究还有，它用来确定移植组织的神经分布，作为一个潜在的视网膜疾病的治疗方法，Seiler等人，将视网膜片移植到不同类型的视网膜退化的鼠的眼睛，用来确定移植的组织与宿主之间的突触连接是否形成[11]。PRV-Bartha被注射到手术后2~9个月的鼠的上丘，上丘这个区域被认为是移植位点的投射区。基于组织空间定位和溴脱氧尿苷的宿主染色，研究人员鉴定出一些鼠的移植视网膜神经元细胞被PRV感染，表明PRV的感染可以通过移植的组织与宿主之间形成的突触连接传递。
6 小结
总之，伪狂犬病毒是一种极好的神经突触示踪剂，尽管如此使用伪狂犬病毒还存在许多的问题需要解决。如：PRV的传递是直接通过，还是通过附近的突触传递？PRV 功能性的神经元连接之间的传递需要什么样的分子机制？有没有神经元不会被PRV感染？神经元的激活会不会影响PRV的传递？在面对细胞病变的感染，PRV-Bartha感染的神经元是怎样使细胞维持一个相对正常的电生理现象？进一步减毒后的PRV能不能维持快速的跨突触传递？这些问题的解决将会使得伪狂犬病毒在神经生物学领域的应用更加广泛。
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作者简介
罗 振研究助理，毕业于湖北大学分子生物学专业，现主要从事慢病毒及重组伪狂犬病毒的
包装及相关分子生物学的研究。
潘建青作者简介见本期第43页。
边 晔研究助理，毕业于陕西师范大学分子生物学专业，现主要从事腺病毒包装以及肿瘤的基
因治疗方向的研究。
王立平作者简介见本期封2页。
伪狂犬病毒上海株糖蛋白G (gG )基因的克隆及序列分析 黄伟坚1,2,姜焱1,陈德胜1,芦银华1,张雪莲1,陈溥言13 (11南京农业大学农业部动物疫病诊断和免疫重点开放实验室,江苏南京210095; 21广西大学动物科学技术学院,广西南宁530005) 摘要:应用PCR 方法从PRV SH (上海株)病毒培养物扩增了gG 基因,克隆入pcDNA3质粒,并进行了序列测定。结果表明,扩增的gG 基因片段长1719bp ,包含一个1491 bp 的开放阅读框(ORF ),在起始密码子上游有TA TAAAA 盒,在终止密码子下游有AA TAAA 的poly (A )尾,编码由496个氨基酸组成的蛋白质。与Rice 株相应的gG 片段相比,核苷酸序列同源性达9711%。但推导的氨基酸序列同源性仅有8716%,主要是在编码区内插入和缺失核苷酸,出现了突变和移码,导致氨基酸序列同源性降低。gG 具有膜蛋白的结构特点。 关键词:伪狂犬病毒;gG 基因;PCR 扩增;核苷酸序列;氨基酸序列 中图分类号:S852165+911 文献标识码:A 文章编号:10002030(2003)01010704 Cloning ,sequence analysis of the gG gene of Pseudorabies virus SH strain HUAN G Wei 2jian 1,2,J IAN G Yan 1,CHEN De 2sheng 1,L U Y in 2hua 1, ZHAN G Xue 2lian 1,CHEN Pu 2yan 13 (1.Key Laboratory of Animal Disease Diagnosis and Immunology ,Ministry of Agriculture , Nanjing Agric Univ ,Nanjing 210095,China ; 2.College of Animal Science and Technology ,Guangxi Univ ,Nanning 530005,China ) Abstract :The gG gene of PRV SH strain was am plified by PCR technique and cloned into pcDNA3,moreover ,it was sequenced by Sanger ′s sequencing technique 1The amplified DNA fragment was 1719bp included an ORF which encoded a protein of 496amino acids with a characteristics of TA TAAAA box in u pstream and AA TAAA poly (A )in downstream of codon 1Compared with gG gene of Rice strain ,the homology of nucleotides sequence was 9711%,however ,because of inserts or deletion in the nu 2cleotides sequence of ORF ,the homology of the deduced amino acids between PRV SH strain and Rice strain was onl y 8716%1The gG was one of membrane proteins 1 K ey w ords :Pseudorabies virus ;gG gene ;PCR amplification ;nucleotide sequence ;amino acids sequence 伪狂犬病毒(PRV )又称猪疱疹病毒Ⅰ型,引起多种家畜及野生动物的伪狂犬病,对猪的危害最为严重。PRV 基因组为长150kb 的线性双链DNA 分子,可编码70～100种蛋白质。其中最受关注的是位于病毒表面的糖蛋白,其不仅与病毒的吸附、复制、释放有关,而且与病毒的毒力、诱发机体产生免疫有密切关系[1]。糖蛋白G (gG 旧称gX )是伪狂犬病毒在体外复制的非必需蛋白,是惟一分泌到病毒外的糖蛋白[2],可刺激机体产生抗体。gG 与病毒的毒力无关,其缺失不会导致毒力下降,且缺失gG 对病毒免疫原性的影响比缺失gE 要小[3]。但对gG 在PRV 的生命活动过程中的作用了解甚少。在有些α2疱疹病毒中,如HSV 21中已发现g G 在病毒侵入细胞过程中有重要作用[4]。在BHV 1中影响病毒在宿主细胞内有效增殖、细胞间扩散及细胞凋亡[5]。g G 具有很强的抗原性[6],且在自然界没有发现g G 缺 收稿日期:20020203 基金项目:上海市农委重点攻关课题(998057) 作者简介:黄伟坚(1963),副教授,在职博士生,从事动物分子病毒学研究。3通讯作者Corresponding author ,E 2mail :aid @ njau 1edu 1cn 南京农业大学学报 2003,26(1):107～110Journal of N anjing A gricultural U niversity
实验三伪狂犬病的诊断 一．实验目的： ⒈熟悉伪狂犬病的临诊特点。 ⒉熟悉伪狂犬病的诊断方法。 二．实验原理： 利用分离的伪狂犬病毒注射实验兔，病毒在动物机体繁殖一段时间后，会影响实验动物的神经系统，实验兔会出现强烈的痒觉，根据这些症状来判断是否含有伪狂犬病毒。 三．内容及方法 1. 伪狂犬病的临床特点 本病发生于牛、绵羊，犬、猫、鼠及猪。野生动物亦可发生。牛、绵羊、犬及猫感染本病后症状很特殊而明显。主要表现为某部皮肤的强烈痒觉。常使劲地于墙柱上摩擦，直到皮肤撕碎，仍不断摩擦，病畜像疯狂一样，用力制止亦无效果。体温可达40℃以上。常发病后48小时内死亡。成猪一般为隐性感染，怀孕母猪可发生流产、死胎、木乃伊胎儿。仔猪，尤于新生仔猪病情极严重，常可发生大批死亡。主要侵害神经系统，表现为神经症状。 2. 实验室诊断 2.1 病料的采集与处理 分离病毒的材料于发热期最好采取中脑、桥脑及延脑，或采取病总部之水肿液、侵入部神经干及脊髓。病料用培养液制成1:10组织悬浮液。 2.2 兔体接种试验上述悬液经2000r/min离心1Omin，取上清液1~2ml经腹侧皮下或肌肉接种家兔，通常在36-48h后注射部位出现剧痒，病兔啃咬注射部位皮肤，皮肤脱毛、破皮和出血，继之四肢麻痹，体温下降，卧地不起，最后角弓反张，抽搐死亡。但这种症状只维持几小时，一般常于夜间死亡，可见死兔口内有接种部位咬下的被毛。亦可脑内接种小鼠，症状可维持12小时，但其敏感性不如兔。亦可用细胞培养来分离病毒。许多种哺乳动物细胞均能繁殖本病毒，但最常用的是猪肾传代细胞。 2.3 兔、猪及牛肾原代细胞培养。病料接种细胞后最早经18小时出现病变(病毒量大)，一般经48小时，病毒量很低时要到96小时。其典型的病变是出现巨细
V IROLOGICA S INICA, August 2007, 22 (4):316-325 Received: 2007-04-04, Accepted: 2007-05-18 * Foundation item: Key technologies R&D program (2006BAD06A01) from the Ministry of Science and Technology of China. ** Corresponding author. Tel: +86-27-87199239, E-mail: wanghz@https://www.doczj.com/doc/f59433461.html,
ZHUAN et al. Rapid Construction of Recombinant Viruses of PRV Genome 317 functional domains within the proteins (9). Such studies often require establishment of large numbers of recombinant viruses which are usually created by homologous recombination in infected cells relying on the cellular recombination and repair machinery. However, this can be a laborious and sometimes impossible task, especially if the mutant has a severe growth disadvantage compared to the wild-type virus. Bacterial artificial chromosomes (BACs), single copy F-factor-based plasmid vectors of intermediate insert capacity (15), have now enabled the cloning of complete herpesvirus genomes and infectious virus genomes can be shuttled between Escherichia coli (E. coli) and eukaryotic cells. While herpesvirus BAC DNA engineering in E. coli requires neither restriction sites nor cloning steps and allows the introduction of a wide variety of DNA modif- cations, the large size of these bacmids precludes the use of rapid in vitro methods of manipulation commonly employed for construction of small plasmids. Tn7, a site-specific transposon, transposes almost exclusively to a distinct attachment site named attTn7 within the E. coli genome (1). By introducing this attTn7 sequence into a BAC, Tn7 can serve as an insertion vehicle (4). This is particularly useful if numerous genes and constructs need to be tested for their expression in the context of viral genome. Tn7-mediated transposition has been well exploited for research on functional genomics of baculoviruses (4). Recently, this technology has been applied to bacmid-cloned cytomegalovirus (CMV), a member of the Gammaherpesvirinae subfamily, for rapid recombinant virus construction (2). In this paper, we report the development of a technology employing Tn7-mediated transposition as a rapid and reliable method for recombinant PRV construction. A lacZα-mini-attTn7 region was inserted into the intergenic region between the gG and gD genes in an attempt to maintain every gene and element of the parental virus. Then green fluorescent protein (GFP) gene was introduced to test the utility of this transposition system and the stability of mini-Tn7 insertions in cell culture. The technology should greatly facilitate the detailed mutagenic studies of PRV. MATERIALS AND METHODS Plasmids, strains, and reagents Plasmids pGS284 and pBecker3, strains GS500 and S17λπ were provided by Lynn W. Enquist, Princeton University, USA. The pGEM-T Easy was purchased from Promega Co. (Maddison, USA), and plasmid pEGFP-N1 from Clonetech Laboratories, Inc. (Mountain View, USA). DNA restriction enzymes, T4 DNA ligase, alkaline phosphatase, exTaq hot start DNA polymerase and 2×GC buffer I were the products of TaKaRa Biotechnology Co., Ltd. (Dalian, China). Plasmids pFBCMV-GFP and pZFBΔtk were constructed and stored in our lab. Strains DH5α and DH10B were stored in our lab. Lipofectin reagent and Delbecco’s Modified Essential Medium (DMEM) were purchased from Invitrogen Co. (Carlsbad, USA), and fetal bovine serum (FBS) from Hangzhou Sijiqing Biological Engineering Materials Co., Ltd. (Hangzhou, China). Virus and cells The wild-type PRV used was vBecker3, generated by transfection of pBecker3 into Vero cells (18). Mutant PRVs (vBeckerZF1 and vBeckerZF2) were
十一、伪狂犬病检测方法 伪狂犬病病毒分离鉴定 1 材料准备 DMEM培养基、BHK-21细胞、新生犊牛血清、青霉素、链霉素溶液、0.22ul 微孔滤膜、细胞培养瓶、CO2培养箱、倒置显微镜。溶液配制见附录A(标准的附录) 2 操作步骤 2.1病料的采集对于刚死亡或活体送检并处死的动物，无菌采取肝、脾、肺、肾及其脑组织，尤其是三叉神经节、嗅球，4℃送实验室检测。 2.2样品处理待检组织在灭菌乳钵内剪碎，加入灭菌玻璃砂研磨，用灭菌生理盐水或DME培养基制成1：5乳剂，—70℃反复冻融后，经3000rpm离心30分钟后，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后，加入青链霉素溶液至最终浓度为100U/mL，—70℃保存作为接种材料。 2.3 病料接种将病料滤液接种已长成单层的BHK-21细胞，接种量为培养基量的10%，37℃恒温箱中吸附1小时后，加入含10%新生犊牛血清（经过56℃水浴灭活30分钟，过滤除菌，无支原体）的DMEM培养基，置37℃温箱中培养。 2.4观察结果接种后24—48小时，BHK-21细胞应出现典型的细胞病变效应（Cyto pathogenic effect, CPE），表现为细胞变圆，脱落。如第一次接种不出现CPE，应将细胞培养物冻融后盲传三代，如仍无CPE，则判为伪狂犬病病毒阴性。 2.5病毒的鉴定将出现CPE的细胞培养物反复冻融后，用聚合酶链式反应、荧光抗体试验等两种方法中任一方法作进一步鉴定。 伪狂犬病聚合酶链式反应 1 材料准备:待检组织、组织匀浆器、蛋白酶K，十二烷基磺酸钠（SDS），苯酚、氯仿，异戊醇（分析纯）、TEN缓冲液。溶液配制见附录C(标准的附录) 引物：扩增伪狂犬病病毒基因中434—651bp之间217bp基因片段，由上海生物工程公司合成。 序列为，上游引物P1：5’-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3’， 下游引物P2：5’-GTCCACGCCC-CGCTTGAAGCT-3 仪器设备有：凝胶电泳紫外线检测仪，PCR扩增仪，电泳仪 2操作步骤： 2．1 样品的采集：对于病死或扑杀动物，取脑组织；对于待检活猪，用已灭菌的棉签，伸入猪鼻腔中，采取鼻粘液，即为鼻拭子，冷藏条件送实验室检测。2.2样品处理所采病料经组织研磨器充分研磨，按1:5用TEN缓冲液悬浮收集于离心管内，-70℃反复冻融3次，7000r/min离心5min，如样品为鼻试子，则加入2ml TEN缓冲液，充分挤压，取出棉签，7000rpm，离心5分钟，取上清液。取上清液472.5μl,加入25μl 10％SDS和2.5μl的20mg/ml 蛋白酶K，50℃水浴摇床上放置2h后加入等量的饱和酚500μl，涡旋20s。离心取上清液，加等量的酚：氯仿：异戍醇（25:24:1）抽提一次，再用氯仿：异戍醇（24：1）抽提一次，最后用乙醇沉淀，真空抽干后加入20μl双蒸水溶解，-20℃贮存备用。
猪伪狂犬病的流行现状及防控措施 伪狂犬病（pseudorabies，pr又名aujeszky's disease，ad）是当前我国猪场最常见的传染病之一，给养猪业造成严重的经济损失。伪狂犬病是由猪疱疹病毒i型所引起的猪、牛、羊等多种家畜、家禽和野生动物的一种以发热、奇痒（猪外除）及脑脊髓炎为主症的一种急性传染病。本病是典型的自然免疫性疾病，猪是该病最主要的储存宿主和传染源。据报道，全世界已有40多个国家和地区发生过该病的流行。 由于伪狂犬病疫苗成熟及其病原本省的特点，曾经许多养猪企业都将猪伪狂犬病的净化列入了短期目标，并实现了这个目标。但2011年以来，猪群的无序流动以及疫苗等多方面的原因，猪场伪狂犬病野毒感染率逐年升高。全国相当部分的阴性猪场一夜之间转阳，严重的甚至出现母猪流产、仔猪神经症状并死亡等典型伪狂犬症状，持续数月不能恢复。本文就伪狂犬病在猪场中的流行现状及防控措施进行简要论述。 1 伪狂犬病的流行情况 1.1 2011年前的流行情况 2011年之前全国不同区域都有伪狂犬病的发生，但是主要以散养户和小型养殖场发病为主，主要原因可能是发病猪场伪狂犬免疫不规范、引种来源复杂等。 1.2 2011年至今的流行发病情况 2011年至今伪狂犬的流行区域不断扩大，暴发不再局限于散养户和小型养殖场，大型养殖场也有发生，且表现典型的临床病症。 1.3临床表现 一是母猪流产，母猪群因为狂犬病流产的比例大约为5%。 二是10日龄内死哺乳仔猪淘率高，达15%或更高，主要表现毛松打堆，高烧，部分猪死亡前有神经症状。而初生3～4 d的仔猪，有时整窝死亡，损失很大。 三是中大猪呼吸道问题严重，临床表现为咳嗽、喘气等。常见并发传染性胸膜肺炎，导致急性死亡。 1.4 共同的病变特征 通过剖检发现，他们共同的病变特征就是扁桃体的白色坏死点。伪狂犬是疱疹病毒，疱疹病毒的特点就是对组织细胞的致死性，它引起的病变主要是脏器（扁桃体、肝、脾、肾等）的白色坏死点为主。 2 伪狂犬流行原因的探讨 2.1 毒力变异 首先免疫原性基因和独立基因的变化，使原有疫苗免疫保护力下降，其次疫苗保护时间缩短，长期超剂量免疫，免疫频繁，免疫压力造成毒株变异。 2.2 腹泻可能是伪狂犬病重新流行的原因之一 首先，腹泻导致整个猪群的免疫抑制，影响了伪狂犬疫苗的正常免疫效果，使其免疫保护周期变短，容易出现免疫空白期。其次，很多猪场因为腹泻做返饲或自家苗，如果过程处理不当，极易导致伪狂犬病毒扩散。 2.3 免疫不合理及疫病关注点下降 有两种常见的情况：一是不停的更换不同毒株的疫苗；二是不免疫仔猪和肉猪，只免疫母猪。这都是免疫不科学、免疫意识松懈、免疫程序不合理所导致的。 2.4猪场中猪群带毒 种猪带毒率偏高是伪狂犬病持续流行的重要原因。引用公猪精液、相互引种，都会传播本病。 3 伪狂犬病的总体防控措施 3.1坚持自繁自养
详解某猪场猪伪狂犬的病例治疗过程及其预防措施 近几年来，伪狂犬发病已无明显季节性，发病率升高，已成为除蓝耳病以外危害母猪繁殖性能的第二大传染病。该病引起母猪繁殖障碍易被临床诊断忽略，延误治疗，严重影响猪场的经济效益。因此，做好伪狂犬病的诊断与防治对提高猪场母猪生产性能和仔猪成活率来说意义重大。现兽医师根据其临床病例和查阅诸多资料后整理出以下关于猪伪狂犬病的诊断要点和防治措施，希望能为广大养殖户提供参考。 1. 临床诊断要点： 母猪：临床症状不明显。主要引起引起母猪顽固性不发情，母猪流产。伪狂犬病引起的流产在母猪妊娠各期均会发生，但以妊娠前期和妊娠中期最易发，且多为木乃伊胎和死胎。 仔猪：主要危害3-7日龄新生仔猪，可谓“九死一生”。病猪多呈现出体温升高，出现神经症状，如头后仰、口吐沫、四肢泳动。四肢软而无力，多见于后肢，眼睑肿大，拉黄色稀粪（用抗生素类药物无效）。 保育猪：少数发生，死亡率低。主要表现的神经症状，猪歪头。 2. 剖检病变： 发病仔猪的解剖病理变化有：肝、脾出现黄白色针尖大小的坏死点；脑膜出血；肾脏点状出血；扁桃体出血坏死。注意和猪瘟的鉴别诊断：猪瘟表现为新生仔猪肾脏不仅有点状出血，且肾脏凹凸不平；扁桃体大面积的出血坏死。 3 治疗与预防： 根据新联大实施的猪场伪狂犬净化系统方案，结合临床实际应用效果开出以下治疗和预防方案： (1) 2000斤饲料添加： 倍能佳或食达旺 1袋 氟奇康泰 2袋 替妙 6袋连用7天 清热散 1袋 <联毒克 3袋如果采食量下降请酌情添加，如有病毒感染请添加> (2) 使用疫苗对伪狂犬病进行防控： 免疫接种：
●后备猪应在配种前实施至少2次伪狂犬疫苗的免疫接种，2次均可使用基因 缺失弱毒苗。 ●经产母猪应根据本场感染程度在怀孕后期（产前20-40天或配种后75-95天） 实行1-2次免疫。母猪免疫使用灭活苗或基因缺失弱毒苗均可，2次免疫中至少有1次使用基因缺失弱毒苗，产前20-40天实行2次免疫的妊娠母猪，第一次使用基因缺失弱毒苗，第二次使用蜂胶灭活苗较为稳妥。 ●哺乳仔猪免疫根据本场猪群感染情况而定。本场未发生过或周围也未发生过 伪狂犬疫情的猪群，可在30天以后免疫1头份灭活苗；若本场或周围发生过疫情的猪群应在19日龄或23-25日龄接种基因缺失弱毒苗1头份；频繁发生的猪群应在仔猪3日龄用基因缺失弱毒苗滴鼻。 ●疫区或疫情严重的猪场：保育和育肥猪群应在首免3周后加强免疫1次。
猪伪狂犬病的预防与用药 -----本文由深圳安多福整理 最近，河南的一养殖户，使用成都天邦的疫苗，却死了3000多头母猪。是成都天邦的伪狂犬疫苗有问题,还是母猪已经感染了强毒或是母猪在注射后被蓝耳病和其他病致死的？相信不久，真相就会揭晓。 那么猪伪狂犬是怎么样的一种病，发病有哪些症状，怎么样去预防和治疗呢？ （一）综述 猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒引起家畜和野生动物的一种急性传染病。特征为成年猪呈隐性感染或有上呼吸道卡他性症状；妊娠母猪发生流产死胎；哺乳仔猪出现脑脊髓炎（神经症状）和败血症状（发热），最后死亡。没有明显的季节性，但以寒冷的冬季发病较多。 本病主要通过与病猪和带毒猪接触，经呼吸道、消化道、损伤的皮肤感染，也可通过配种、哺乳感染，妊娠母猪感染后，可感染胎儿。（二）症状 本病潜伏期3～11天。临床症状随猪年龄不同而有很大差异。妊娠母猪常发生流产，产出的弱胎通常在3～4天死亡，流产率可达50%；适龄母猪表现为不育症，返情率高，但屡配不孕。成年猪一般为隐性感染，即使有症状也是轻微的，只表现为一般性发热，精神沉郁，有的有呕吐、咳嗽、一般4～8天恢复；可引起新生仔猪大量死
亡，主要表现为刚生下的仔猪第一天无异常，常从第二天开始发病，3～5天内达到死亡高峰，表现明显的神经症状，病猪昏睡、鸣叫、呕吐、拉稀、流涎、发抖、痉挛，有时不自主地前冲、后退或转圈运动；随着病情的发展，发现四肢麻痹，倒地侧卧，头向后仰，四肢乱动或划水样运动，最后昏迷死亡；可引起断奶仔猪发病死亡，发病率在20%～40%，死亡率在40%～60%，主要症状表现为神经症状，拉稀，呕吐等。 （三）病理变化 剖检主要表现为脑膜充血，水肿、出血，脑脊液增多，淋巴结肿大，胃肠黏膜可见卡他性炎症，胃底部有明显出血区，上呼吸道黏膜及扁桃体出血，水肿，并有纤维素性坏死性伪膜覆盖。有的肾脏布满针尖样出血点，有的出现肺水肿。肝肾有特征性坏死灶，中央灰白色，外周有红色晕圈，具有诊断意义。流产胎儿的肝、脾及胎盘绒毛膜有凝固性坏死。 （四）防治 1、种猪每6个月背颈皮下注射伪狂犬病基因缺失油佐剂苗3毫升，母猪在产前1个月左右加强免疫一次；种用仔猪28～35日龄注射一次1.5毫升，4～6周重复注射一次，育肥仔猪30日龄注射1.5毫升。 2、严格执行消毒措施。猪舍地面、墙壁、设施及用具等每周定期消毒1次，粪便放发酵地或沼气池处理。发生疫情时则2～3天消毒1次，消毒液可用安多福万金水按1：500稀释。
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910244928.7 (22)申请日 2019.03.28 (71)申请人 中国科学院武汉物理与数学研究所 地址 430071 湖北省武汉市武昌区小洪山 西30号 (72)发明人 贾凡 徐富强 李莉 缪欢 吕培 施祥玮 (74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所 42001 代理人 王敏锋 (51)Int.Cl. C12N 7/01(2006.01) C12N 15/85(2006.01) A61K 49/00(2006.01) A61K 35/76(2015.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种高亮表达红色荧光蛋白的逆向神经环 路示踪的重组伪狂犬病毒的制备方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种高亮表达红色荧光蛋白 的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒的制备 方法和应用，包括（1）制备表达红色荧光蛋白的 重组伪狂犬病毒；（2）在标记神经环路中的应用， 该平台成功制备高亮表达红色荧光蛋白的重组 伪狂犬病毒。本发明成功获得高亮表达红色荧光 蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒，在 神经环路标记、药物筛选平台的建立、药物抑制 病毒作用机制、病毒疫苗和诊断试剂的研发、动 物模型的建立、病毒复制和致病机制的分析等方 面具有广泛的应用价值。 权利要求书1页 说明书5页序列表8页 附图2页CN 109943539 A 2019.06.28 C N 109943539 A
权 利 要 求 书1/1页CN 109943539 A 1.一种高亮表达红色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒的制备方法，包括下述步骤： 1)具备高亮表达红色荧光蛋白能力的克隆：以pCDNA3.1(+)为载体，采用同源重组的方式将SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5顺次插入到载体，获得克隆命名为pCDNA3.1(+)-CAG-兔β-globin-mRuby3-F2A-mRuby3-T2A-mRuby3-WPRE-BGHpA； 2)构建高亮表达红色荧光蛋白的重组伪狂犬病毒：将SEQ ID NO.16插入到经过MluI和ClaI双切的pCDNA3.1(+)-CAG-兔β-globin-mRuby3-F2A-mRuby3-T2A-mRuby3-WPRE-BGHpA，从而获得质粒pCDNA3.1(+)-left arm-CAG-兔β-globin-mRuby3-F2A-mRuby3-T2A-mRuby3-WPRE-BGHpA；将SEQ ID NO.19插入到经过AscI单切的pCDNA3.1(+)-left arm-CAG-兔β-globin-mRuby3-F2A-mRuby3-T2A-mRuby3-WPRE-BGHpA，从而获得质粒pCDNA3.1(+)-left arm-CAG-兔β-globin-mRuby3-F2A-mRuby3-T2A-mRuby3-WPRE-BGHpA-right arm；将所得的质粒转染BHK21细胞后感染伪狂犬病毒Bartha株，收集细胞培养基上清；纯化后即获得高亮表达红色荧光蛋白的重组伪狂犬病毒。 2.权利要求1所述制备方法制得的重组伪狂犬病毒在建立伪狂犬病毒的药物筛选平台中的应用。 3.权利要求1所述制备方法制得的重组伪狂犬病毒在研究药物抑制伪狂犬病毒作用机制中的应用。 4.权利要求1所述制备方法制得的重组伪狂犬病毒在伪狂犬病毒感染的动物模型的建立中的应用。 5.权利要求1所述制备方法制得的重组伪狂犬病毒在伪狂犬病毒病毒复制和致病机制的分析中的应用。 6.权利要求1所述制备方法制得的重组伪狂犬病毒在对哺乳动物的脑神经环路进行示踪中的应用。 2
狂犬病毒的作用原理？是对人的神经起作用还是？ 狂犬病（rabies）又称恐水症（hydrophobia），为狂犬病病毒引起的一种人畜共患的中枢神经系统急性传染病。多见于狗、狼、猫等食肉动物。人多因被病兽咬伤而感染。临床表现为特有的狂躁、恐惧不安、怕风恐水、流涎和咽肌痉挛，终至发生瘫痪而危及生命。 [病原学] 狂犬病病毒属核糖核酸型弹状病毒。狂犬病毒具有两种主要抗原。一种为病毒外膜上的糖蛋白抗原，能与乙酰胆碱受体结合使病毒具有神经毒性，并使体内产生中和抗体及血凝抑制抗体。中和抗体具有保护作用。另一种为内层的核蛋白抗原，可使体内产生补体结合抗体和沉淀素，无保护作用。从患者和病兽体内所分离的病毒，称自然病毒或街毒（stree virus），其特点是毒力强，但经多次通过兔脑后成为因定毒（fixed virus），毒力降低，可制做疫苗。 狂犬病毒易被紫外线、甲醛、50～70%乙醇、升汞和季胺类化合物（新洁尔灭）等灭活。其悬液经56℃30～60分钟或100℃2分钟即失去活力，对酚有高度抵抗力。在冰冻干燥下可保存数年。 [流行病学] 狂犬病在世界很多国家均有发生。我国解放后由于采取各种预防措施，发病率明显下降。近年因养狗逐渐增多，故发病率有上升的趋势。 （一）传染源发展中国家的狂犬病主要传染源是病犬，人狂犬病由病犬传播者约占80～90%，其次为猫和狼，发达国家由于狗狂犬病被控制，野生动物如狐猩、食血蝙蝠、臭鼬和浣熊等逐渐成为重要传染源。患病动物唾液中含有多量的病毒，于发病前数日即具有传染性。隐性感染的犬、猫等兽类亦有传染性。 （二）传播途径主要通过被患病动物咬伤、抓伤，病毒自皮肤损伤处进入人体。粘膜也是病毒的重要侵入门户，如眼结合膜被病兽唾液沾污，肛门粘膜被狗触舔等，均可引起发病。此外，亦有经呼吸道及消化道感染的报道。 （三）传播途径人对狂犬病普遍易感，兽医、动物饲养者与猎手尤易遭感染。一般男性多于女性。冬季发病率低于其他季节。 [发病机理与病理变化] 狂犬病病毒对神经组织有很强的亲和力。发病原理分为三个阶段：①局部组织内小量繁殖期。病毒自咬伤部位入侵后，在伤口附近横纹细胞内缓慢繁殖，约4～6日内侵入周围神经，此时病人无任何自觉症状。②从周围神经侵入中枢神经期。病毒沿周围传入神经迅速上行到达背根神经节后，大量繁殖，然后侵入脊髓和中枢神经系统，主要侵犯脑干及小脑等处的神经元。但亦可在扩散过程中终止于某部位，形成特殊的临床表现。③向各器官扩散期。病毒自中枢神经系统再沿传出神经侵入各组织与器官，如眼、舌、唾液腺、皮肤、心脏、肾上腺髓质等。由于迷走神经核、舌咽神经核和舌下神经核受损，可以发生呼吸肌、吞咽肌痉挛。临床上出现恐水、呼吸困难、吞咽困难等症状。交感神经受刺激，使唾液分泌和出汗增多。迷走神经节、交感神经节和心脏神经节受损时，可发生心血管系统功能紊乱或猝死。
中国畜牧兽医 ２０１７，４４（４）：１１７５－ １１８１Ｃｈｉｎａ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ ＆Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｄｏｉ：１０．１６４３１／ｊ ．ｃｎｋｉ．１６７１－７２３６．２０１７．０４．０３３猪伪狂犬病病毒ｇＢ蛋白表达及免疫原性分析 贾 刚１， 樊梅娜２＊，谷 巍１（１． 山东宝来利来生物工程股份有限公司研究院，泰安２７１０００；２．泰安大凡神农制药有限公司研究院，泰安２７１０００）摘 要：本试验旨在研究猪伪狂犬病病毒（ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ，ＰＲＶ）ｇＢ蛋白的表达并分析其免疫原性，以ＰＲＶ病毒液为模板，设计特异性引物，扩增大小为６１２ｂｐ的保守片段并测序，将其克隆到表达载体ｐＥＴ－２８ａ中，转化表达菌ＢＬ２１（ＤＥ３），经诱导表达、纯化得到目的蛋白，进行Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析验证并分析免疫原性。结果表明，表达的ｇＢ蛋白大小为３０ｋｕ，主要以包涵体形式存在，复性后浓度为１０６μｇ／ｍＬ，且具有良好的反应原性。应用市售试剂盒检测到样品中含１３份ＰＲＶ阳性血清和１６份阴性血清，利用检出的阳性血清，初步可建立以ＰＲＶ ｇＢ蛋白为包被抗原的ＰＲＶ抗体ＥＬＩＳＡ检测方法。 关键词：猪伪狂犬病病毒；ｇ Ｂ蛋白；原核表达；免疫原性中图分类号：Ｓ８５２．６５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７１－７２３６（２０１７）０４－１１７５－ ０７收稿日期：２０１６－０７－ ０６基金项目：国家８６３计划专项基金（新型抗感染功能型微生态制剂的研制与应用）（２０１３ＡＡ１０２８０６）作者简介：贾 刚（１９８８－），男，山东泰安人，硕士，研究方向：动物微生态学，Ｅ－ｍａｉｌ：ｇａｎｇ ０７１２＠１６３．ｃｏｍ＊通信作者： 樊梅娜（１９８７－），女，河南南阳人，硕士，研究方向：动物微生态学，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｕｅｍｅｉ４１２．ｃｏｍ＠１６３．ｃｏｍＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ Ｖｉｒｕｓ ｇＢ ＰｒｏｔｅｉｎＪＩＡ Ｇａｎｇ１， ＦＡＮ Ｍｅｉ－ｎａ２＊，ＧＵ Ｗｅｉ １ （１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｂａｏｌａｉ－ｌｅｅｌａｉ Ｂｉｏ－ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｇｒｏｕｐ，Ｔ ａｉ’ａｎ２７１０００，Ｃｈｉｎａ；２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔａｉａｎ ＤａＦａｎＳｈｅｎＮｏｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔａｉ’ａｎ２７１０００，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ（ＰＲＶ）ｇＢ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｏｆ ＰＲＶ ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ａｎｄ ｔｈｅ ６１２ｂｐ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ，ｔｈｅｎ ｉｔ ｗａｓｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＥＴ－２８ａａｎｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３），ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｆｔｅｒ ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｔｏａｎａｌｙｓｅ ｉｔｓ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｇＢ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ３０ｋｕ，ｗｈｉｃｈ ｍａｉｎｌｙ ｅｘ－ｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｒｍ ｏｆ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ，ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ １０６μｇ／ｍＬ，ｗｉｔｈｗｅｌｌ ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．１３ＰＲＶ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ １６ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｒｕｍ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｐ ｌｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄｕｓｉｎｇ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ ｏｎ ｓａｌｅ，ｕｓｉｎｇ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｒｕｍ，ｔｈｅ ＰＲＶ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｉｎｉｔｉａｌｌｙｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＰＲＶ ｇＢ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓ ａｎｔｉｇｅｎ ｐａｃｋａｇ ｅ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｐｏｒｃｉｎｅ ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ；ｇＢ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ 伪狂犬病，又称Ａｕｊｅｓｚｋｙ’ ｓ病，是一类由疱疹病毒科α疱疹病毒亚科伪狂犬病病毒（ｐ ｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓ，ＰＲＶ） 引起的危害家畜及多种野生动物的急性传染病［１］ ，主要感染猪等动物，可造成怀孕母猪流 产或死胎，新生仔猪发热，出现神经症状等，极大地 影响了中国养殖业的健康发展［２－ ４］。该病传播快、传 播范围广、传播途径多、死亡率高，已成为危害养猪 业最为严重的疾病之一，需要加以重视［ ５］ 。ＰＲＶ作为一种猪疱疹病毒， 基因组为双链线性ＤＮＡ，其病毒粒子脂质囊膜由多达１６种糖蛋白组成［６］ 。其中，ｇＢ蛋白是ＰＲＶ最主要的保护性抗原蛋白，是ＰＲＶ复制、感染必不可少的囊膜组分，不仅能够诱导宿主产生免疫应答，而且也是病毒入侵 增殖和在细胞间传播的必需组分［７－ ９］。ｇＢ基因位于
详解猪伪狂犬的病理过程及其防治 核心提示：本文详细阐述猪伪狂犬病的临床表现、发病过程及诊断要点。 猪伪狂犬病病（PPV）是由疱疹病毒属的伪狂犬病毒引起的疾病。在猪群中该病毒能够通过妊娠从上一代传递到下一代的垂直传播，还能够通过猪只之间互相接吻以及蚊蝇叮咬而水平传播，属于乙型传播疫病。主要经呼吸道传播，病毒感染后首先在鼻咽部、扁桃体中增殖，再经神经侵袭脑、脊髓的同时，也可由鼻腔粘膜经呼吸道侵入肺泡。这是临床初生仔猪无其他明显症状，但若发生抽搐后迅速死亡的主要原因。 一、临床表现 感染早期体重25kg以上的商品猪，病毒侵袭导致猪的肝脏的胆汁分泌机能亢进，突然增多的大量胆汁刺激十二指肠和幽门壶腹部，病猪表现胃肠痉挛和粪便发黑，阵发性腹痛，频频排粪，采食量下降；体温39-41℃。进入4-10天的感染中期，由于十二指肠和幽门壶腹的持续痉挛，幽门突红肿，溃疡，形成胆汁排泄障碍和向胃部的逆流；同时，由于持续增值的病毒对外周淋巴的侵袭引起的全身发热，水排泄的增强，继发胆汁粘稠，胆囊内壁充血、出血和胆囊壁增厚等炎症变化。与此同时，大量胆汁进入胃部，打破胃内容物的酸碱平衡，使pH值上升，直接引发病猪发生呕吐。pH值偏高的胃液长时间的浸润，一方面使得胃神经反射机能麻痹，呕吐很快停止，病猪出现采食量下降，这是饲养密度过大或观察不及时，个体发病后不易被发现的主要原因；另一方面，贴近胃壁的高pH值胃液直接损伤胃底粘膜，引起胃底充血、出血和穿孔、胃痛，形成病猪有食欲，但采食量下降或呈间断性采食（即添加饲料时猪反映明显，但采食数口后停顿下来，稍后继续采食，并再次发生采食停顿）、粪便发黑的现象。到了10-15天（部分单一性病例可达20天）的感染中后期，由于胃底损伤严重，病猪采食量下降至正常采食量的1/5-1/8，甚至
猪伪狂犬病净化方案 （见农业部《伪狂犬病防治技术规范》） 我国种猪场伪狂犬病净化方案内容由6个不同阶段组成，即：调查阶段、强化免疫控制、检疫淘汰、全部或部分清群、监测认证阶段和维持阶段。种猪场根据本场实际情况，分阶段逐步实施。 一、材料准备 疫苗：使用国家批准的基因缺失疫苗。 抗体检测试剂盒：检测伪狂犬病全病毒抗体或gB抗体试剂盒、区分免疫猪和感染猪的抗体鉴别检测试剂盒。试剂盒必须获得国家相关批准文号。 待净化猪群的确定：应选择健康、生产成绩稳定的种猪群开展伪狂犬病的净化。在初次开展本病净化的大型种猪场中，可先选定500-1000头母猪群开展净化，逐步推进。 二、净化方案 1、调查阶段 如果种猪群母猪大于500头，按照种母猪群数量的10%、种公猪全群采血。分离血清，用gE-ELISA检测，根据野毒抗体阳性率高低，确定种猪群（种母猪和种公猪）伪狂犬病野毒感染状态。如果母猪数量小于500头，可一次采集全部种猪的样品，检测gE抗体，根据检测结果，确定进入何种净化阶段。 1.1如果所抽检样品全部为gE抗体阴性，则种猪群全群逐头检测，如所有血清样品均为阴性，可确认种猪群为伪狂犬病野毒抗体阴性，直接进入“监测与认证”阶段； 1.2如果血清样品的gE抗体阳性率低于10%，可进入“检测淘汰”—“监测与认证维持”的净化方案； 1.3如果gE抗体阳性率在10%-20%，可实行“强化免疫控制”—“检测淘汰”—“监测与认证维持”的净化方案； 1.4如果gE抗体阳性率大于30%，则实行“全群或部分清群”措施，暂不考
虑实施净化； 1.5在全部种猪群gE抗体阴性时，可直接进入“监测与认证维持”阶段。 2.强化免疫控制阶段 使用伪狂犬病gE基因缺失疫苗免疫该猪群，同时采取生物安全和灭鼠等综合措施，达到控制的目的。 2.1免疫程序的制定 2.1.1种母猪（种公猪） 每年普免3-4次。或者母猪配种前和产前4周分别免疫一次。普免时，避免在分娩前7天内接种疫苗，以减少接种应激对分娩的影响，但可于母猪分娩后补免。 公猪每年3次免疫，采用集中普免的方式。 2.1.2仔猪 分别测定仔猪在50日龄、60日龄和70日龄时的伪狂犬病抗体（gB抗体或全病毒抗体），每个阶段抽样30份，样品来自10窝猪，每窝3头，确保采样的均衡性。根据抗体水平确定仔猪的免疫日龄。猪场可根据产房小猪和保育猪是否出现伪狂犬病(如腹泻、神经症状等)，使用出生猪滴鼻免疫的方式，克服母源抗体干扰，并以提高局部的黏膜免疫力。 2.2实验室评估 仔猪免疫后3周，检测30份血清gB或全病毒抗体和gE抗体。当gE抗体阴性时，如果85%的样品为gB抗体或全病毒抗体阳性，即可认为群体免疫合格。 2.3 临床评估 主要考察猪群的生长成绩。母猪无繁殖障碍，哺乳仔猪无尖叫、腹泻和转圈，最后死亡等现象；保育猪无神经症状，育肥猪无伪狂犬病病毒引起的呼吸道症状。 2.4配套的生物安全措施 2.4.1如需引种，只能引进伪狂犬病gE抗体阴性的后备种猪； 2.4.2对进出猪场的车辆和外来人员进行消毒； 2.4.3无害化处理病死猪和流产死胎等； 2.4.4定期灭鼠。 3、检测淘汰阶段