微生物菌种选育与保藏
本章知识概要
第一节菌种分离与筛选
第二节菌种选育
第三节菌种保藏
第一节菌种分离与筛选
1、采样
原则：
材料来源越广泛，越有可能获得新的菌种。
可寻找已适应各种环境压力的微生物类群。
土壤、水、空气、动植物体都含有微生物。
土壤由于具备了微生物所需要的营养、水分、空气。是微生物最集中的地方从土壤中几乎可以分离所需要任何菌株。
细菌（108）＞放线菌（107）＞霉菌（106）＞酵母菌（105）＞藻类（104）＞原生动物（103）
②采样方法：
选择适当地点和场所、用无菌器皿取样十克，装入袋中，记录采样地点、时间、环境等等。
2、富集培养：
在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，是目的微生物在最适的环境下，迅速生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下劣势种变成人工环境下的优势种，以利于分离到所需要的菌株。
A：控制营养条件----纤维素酶产生菌
B：控制培养条件----施加压力、pH、温度、氧气、根据特殊生理特征、
C：添加特殊抑制剂---抗生素
3、纯种分离：
富集培养而得到微生物，并不能达到纯化标准，杂菌并没有死亡、还需要进一步纯化----纯培养
粗放型：菌落纯
精细型：菌种纯
划线分离法
A：粗放型涂布分离法
稀释分离法
平板划线分离法：
接种针挑取含有微生物样品，在固体培养基表面上划线，适当条件培养后，挑取单菌落。
稀释分离法
用1ml无菌吸管精确地吸取1ml大肠杆菌悬液放入10-1的试管中，使其混合均匀。另取一支吸管自10-1试管吸1ml放入10-2试管中……其余依次类推。
涂布分离法
用涂棒蘸取培养液，在固体培养基表面均匀涂平，获得单菌落。
精细型：
毛细管分离法：利用培养皿或凹玻片等分离小室进行细胞分离。也可以利用复杂的显微操作装置进行单细胞挑取。
流式细胞仪：流式细胞仪（Flow CytoMeter, FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析和检测、筛选技术。
筛选方案：
4、性能鉴定：
平皿快速检测
生产性能测定
平皿快速检测法
第二节优良菌种选育
自然选育
诱变育种
一、自然选育
1、自然选育：菌种在生产过程中不经过人工处理，利用微生物自身碱基突变而进行的菌种筛选过程。
①多因素低剂量的诱变效应：辐射、H2O2、O2－
②互变异构：DNA分子的碱基，存在酮式-烯醇式或氨式-亚胺式互变异构。不同的互变异构体形成氢键的方向和能力不同，有可能导致复制时出现错误。例如在正常情况下，A（氨式结构）与T（酮式结构）配对；当A以亚胺式存在时（几率非常小），则与C配对。
2、诱变育种
利用各种被称为诱变剂的物理因素和化学试剂处理微生物细胞，使菌体负责遗传作用的DNA分子中的碱基对产生突变，进而采用简便、快速和高效的筛选方法，获得所需要的高产优质菌种的方法。
诱变育种原理：基因突变
染色体畸变：染色体或DNA片段发生缺失、易位、
重复等现象
基因突变：DNA碱基发生变化
诱变剂：物理、化学、生物三大类。
（1）物理诱变剂
紫外线、X-射线、γ-射线、激光、快中子、超声波、同位素等等
紫外线诱变机制：造成DNA链断裂或是DNA分子或分子间发生交联。核酸物质的最大紫外线吸收峰值在265nm波长处。
（2）化学诱变剂
化学诱变剂的种类有许多，但具有高效诱变作用的并不多，常用的化学诱变剂根据其作用方式不同分为三种类型。
①与核酸碱基化学反应的诱变剂
此类型主要有烷化剂、亚硝酸和羟胺等。
A：烷化剂，带有一个或多个活性烷基，带一个活性烷基称单功能烷化剂，带二个或多个的分别称为双功能或多功能烷化剂。
它们的诱变作用是其与DNA中的碱基或磷酸作用。
常见的烷化剂有硫酸二乙酯(DES)、甲基磺酸乙酯(EMS)、亚硝基胍(NTG)、亚硝基甲基脲(NMU)、氮芥、乙烯亚胺和环氧乙酸等。
B：亚硝酸----亚硝酸的作用主要是使碱基氧化脱氨基，如使腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)分别脱氨基成为次黄嘌呤(H)、尿嘧啶(U)和黄嘌呤(X)。复制时，次黄嘌呤、尿嘧啶和黄嘌呤分别与胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)配对。
（2）、诱变育种的方法步骤
2.1 制定筛选目标
①高产量
②生长速度快、产孢子多；
③消除某些色素或无益组分；
④能有效利用廉价的发酵原材料；
⑤改善发酵工艺中的某些缺陷(如泡沫过多、对温度波动敏感、菌丝太多、自溶早、过滤困难等)。
2.2 制定育种方案
诱变筛选的典型流程见后图，除了增加了诱变处理，其他与前面所讲的自然选育过程基本相似。
菌株选育典型流程
出发菌株（砂土管或冷冻管）小试
原种特性考擦
斜面或摇瓶培养24h 培养基优化
单孢子悬液菌悬液挑出高产菌株
诱变处理摇瓶复筛
处理前后计数
稀释涂平板传种斜面观察单菌落形态
挑选单菌落转种斜面保藏菌株
对照组比较
摇瓶初筛挑出高产斜面
①出发菌株的选择
用来进行诱变实验的菌株就是出发菌株，对它的选择是诱变育种工作成败的关键，挑选出发菌株有以下几点原则：
a. 来源于自然界直接分离的野生菌株.
b. 有利于发酵产物合成的性状，出发菌株应具有生产上所需要的代特征。
c. 要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性状大部分是隐性的，特别是高产基因。
d.生产或科研上经过多次诱变改造的菌株。
③诱变剂的选择
诱变剂复合处理及其协同效应
④突变株筛选
诱变处理后遗传性能发生变化：营养缺陷型、抗性、代、呼吸缺陷、形态变异、生长繁殖、
温度敏感性突变株。
ⅰ粗筛方法：
A：菌体形态观察法：形态与产量并没有完全相关性，形态特征变化可能引起产量变化，阿舒假囊酵母-VB2高产菌落深黄色，浅黄色、白色低产。
B：平皿快速检测法a：纸片显色法，浸有指示剂滤纸。b：变色圈法；c：透明圈法；d：生长圈法；e：抑制圈法。
ⅱ复筛摇瓶培养法：
a、抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株的筛选
常用的筛选方法为：
1）抗末端产物结构类似物突变株。
2）利用营养缺陷型回复突变筛选抗反馈突变株。
例如：谷氨酸棒杆菌的肌苷酸脱氢酶的回复突变株对其终产物鸟苷酸的反馈调节不敏感，从而提高了鸟苷酸的产量。
b、抗性突变株的筛选
这包括抗生素、金属离子、温度、噬菌体等抗性突变株的筛选。方法是在平板中（分离培养基）和初筛培养基中加入不同的抗性物质，能够很好生长的菌株就为抗性突变株。
选择能和抗生素或合成中间体结合的对菌体生长有毒性作用的抑制剂,如二价金属离子加入培养基中，当抑制剂达到一定浓度时，抗生素低产菌株不能够生存，可以得到高产菌株。
c、组成型突变株的筛选
(1)通过加入诱导酶合成抑制物筛选组成酶的突变株。如邻硝基-β-D-岩藻糖苷抑制β-半乳糖苷酶的合成。
(2)利用交替培养法使组成型突变株处于优势。
(3)显色法筛选组成型突变株生产酶。
如邻硝基苯半乳糖苷用于筛选β-半乳糖苷酶组成型突变株，刚果红用于筛选纤维素酶组成型突变株。
d、营养缺陷型的选育*
营养缺陷型是指通过诱变育种，出发菌株发生基因突变，致使细胞组成成分的合成途径出现某些缺陷，在只含有最低限度营养物质的基本培养基上不能生长，必须在此中培养基中加入某些有机营养物才能正常生长。
氨基酸、维生素和碱基
与营养缺陷型对应的是野生型。
能满足野生型菌株正常生长的培养基称基本培养基(MM minimal medium)；
在基本培养基中有针对性地补加某一种或几种营养成分，以满足相应的营养缺陷型菌株生长需要（其他营养缺陷型仍不能生长）的培养基补充培养基(SM supplemental medium)；可满足该菌各种营养缺陷型菌株营养需要的天然或半合成培养基完全培养基(CM complete medium)，如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。
营养缺陷型的用途：
营养缺陷型在生产上和科学研究上用途很大。目前生产氨基酸、核苷酸的菌种都是各种类型的缺陷型。要研究代途径，育种技术都必须有营养缺陷型的菌株为材料。
筛选营养缺陷型的步骤
菌种诱变
淘汰野生型
检出缺陷型
营养缺陷型的鉴定
二、淘汰野生型
原理：野生型能在MM中生长，而缺陷型不能，于是将诱变处理液在MM中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。
①抗生素法：
由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相应加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。一般细菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。
②菌丝过滤法：
对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过。
③添加化学试剂法：
青霉属、链霉菌属、芽孢杆菌属菌株可用25-50mg/mL五氯酚处理发芽孢子。适当亚硫酸对霉菌发芽孢子有选择杀死作用
④差别杀菌法：
芽孢耐热性强，萌发后的菌体细胞不耐热，通过加热杀死营养体细胞，芽孢保存。
三、营养缺陷型菌株的检出
1、逐个检出法：把经诱变处理的细胞群涂布在完全培养基的琼脂平板上，待长成单个菌落后，用接种针或灭过菌的牙签把这些单个菌落逐个整齐地分别接种到基本培养基平板和另一完全培养基平板上，使两个平板上的菌落位置严格对应。经培养后，如果在完全培养基平板的某一部位上长出菌落，而在基本培养基的相应位置上却不长，说明此乃营养缺陷型。
2、夹层培养法：先在培养皿底部倒一薄层不含菌的基本培养基，待凝，添加一层混有经诱变剂处理菌液的基本培养基，经培养后，对首次出现的菌落用记号笔一一标在皿底。然后再加一层完全培养基，培养后新出现的小菌落多数都是营养缺陷型突变株。
3、限量补充培养法：把诱变处理后的细胞接种在含有微量（＜0.01%）蛋白胨的基本培养基平板上，野生型细胞就迅速长成较大的菌落，而营养缺陷型则缓慢生长成小菌落。若需获得某一特定营养缺陷型，可再在基本培养基中加入微量的相应物质。
4、影印平板法：将诱变剂处理后的细胞群涂布在一完全培养基平板上，经培养长出许多菌落。用特殊工具--“印章”把此平板上的全部菌落转印到另一基本培养基平板上。经培养后，比较前后两个平板上长出的菌落。如果发现在前一培养基平板上的某一部位长有菌落，而在后一平板上的相应部位却呈空白，说明这就是一个营养缺陷型突变株。
四、营养缺陷型的鉴定
生长谱法。生长谱法是指在混有供试菌的平板表面点加微量营养物，视某营养物的周围有否长菌来确定该供试菌的营养要求的一种快速、直观的方法。
具体操作：
把生长在完全培养液里的营养缺陷型细胞经离心和无菌水清洗后，配成适当浓度的悬液（如107～108个／ml），取0.1ml与基本培养基均匀混合后，倾注在培养皿，待凝固、表面干燥后，在皿背划几个区，然后在平板上按区加上微量待鉴定缺陷型所需的营养物粉末（滤纸片），例如氨基酸、维生素、嘌呤或嘧啶碱基等。经培养后，如发现某一营养物的周围有生长圈，就说明此菌就是该营养物的缺陷型突变株。
五、基因重组育种
基因重组育种：采用结合、转化、转导、原生质体融合、有性杂交及准性生殖的遗传学的方法和技术使微生物细胞发生基因重组，增加优良性状的组合或者导致多倍体的出现，从而获得优良菌株的一种育种方法。
（一）原核生物的基因重组育种：
1、结合
供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触，把F质粒或其携带的不同长度的核基因组片段传递给后者，使后者获得若干新遗传性状的现象。
大肠杆菌中存着致育因子F，有F因子为F+，没有F因子称F-。
F因子存在于细胞中形式：游离状态(F+细胞)；整合状态，即F因子插入胞核质的一定位置上(Hfr细胞)。
F因子有明显的感染性，大肠杆菌的接合，实质上是F因子的转移，所以F+和Hfr称供体菌，而F-称受体菌。
2、转导
通过转导噬菌体的媒介，把供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象。
转导子
转导噬菌体
普遍转导和局限性转导
3、转化
受体菌直接吸收供体菌的DNA片段而获得了供体菌部分遗传性状的现象。
转化子
感受态：遗传性、菌龄、生理状态、培养条件
CaCl2 冰冷电击
（二）放线菌的杂交育种
基因重组过程近似于细菌，但其育种方法有许多与霉菌相似。
1、杂交原理
放线菌基本上有四种遗传体系。
（1）异核现象
有些放线菌的营养缺陷型在混合培养或杂交过程中，经菌丝之间的接触和融合而形成异核体。
异核体形成的菌落在表型上是原养型的，无重组体出现。
（2）结合现象
不同基因型的细胞核在双方增殖过程中，发生部分DNA的转移或遗传信息的交换，形成部分合子。
（3）异核系的形成
当部分合子形成后，经过一次单交换而产生异核系染色体组。
（4）重组体的形成
异核系不稳定，在菌落生长过程中，在染色体重叠区域不同的部位再次发生交换后，能产生重组体孢子。
也可由部分合子不经过异核系，直接经过双交换形成重组孢子。
2 杂交方法
(1) 混合培养法：要求两亲本菌株必须为互补的营养缺陷型。将两菌株接种到完全培养基上培养至孢子长出，然后将孢子在选择培养基上进行筛选，能长出的菌株为重组菌株。
(2) 平板杂交法：将菌株一在完全培养基上培养至产生孢子，用影印法将菌落孢子印至已铺有另一菌株孢子的完全培养基上，等长出孢子后，用基本培养基筛选重组菌株。
三、霉菌的杂交育种
构巢曲霉--准性杂交
不经过减数分裂就能导致基因重组的生殖过程
四、酵母菌的杂交育种
性细胞间的结合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种育种技术。
子囊孢子的形成
子囊孢子的分离
杂种的获得
(三)原生质体融合
分别酶解两个不同遗传性状的菌株细胞壁，在高渗环境中释放出只有原生质体膜包被的原生质体，将它们混合，然后通过物理、化学或生物学方法使他们互相聚集，通过遗传性状不同的两亲本原生质体融合，接着发生染色体交换、重组而达到杂交目的。并筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定重组体。
六、基因工程育种
基因工程：用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质DNA分子提取出来，在离体条件下进行切割，获得代表某一性状的目的基因，把该目的基因与作为载体的DNA分子连接起来，然后导入某一受体细胞中，让外源基因在受体细胞中进行正常的复制和表达，从而获得目的产物。
一个完整的基因克隆过程包括以下步骤
１、获得待克隆的DNA片段（基因）；
２、目的基因与载体在体外连接；
３、重组DNA分子导入宿主细胞；
４、筛选、鉴定阳性重组子；
５、表达筛选。
（一）载体系统：携带目的基因并将其转移至受体细胞，进行复制和表达的运载工具。1、特征:一般为环状，具有体外酶切和连接能力，与目的基因结合成环状---转化---受体细胞中---复制表达能力
2、载体具备性质：
①在宿主细胞具有自主复制和表达能力。
②能与外源DNA片段结合而不影响本身的复制能力。
③具有两个以上限制性切酶单一位点。
④具有两个易检测的遗传标记，赋予宿主细胞不同的表型，便于检测和分离。
⑤载体分子量尽可能小，便于与较大基因结合，不易受到机械剪切。
⑥易于转化到宿主细胞。
3、常用质粒载体
pBR322 质粒载体
p plasmid
BR 构建者Boliver 和Rodriguez
322 实验标号
pUC 质粒载体
Plasmid University California
宿主：JM101细菌细胞（突变体）
限制性核酸切酶（限制酶）
限制性核酸切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列(4~8bp), 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类切酶。
（四）目的基因的获取
1、通过建立基因文库分离靶基因
2、化学合成法制备DNA片段
从蛋白质肽链的氨基酸顺序可以知道它的遗传密码，再依照密码合成基因。
3、聚合酶链反应法扩增基因片段
对于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通过聚合酶链反应（PCR），以基因组DNA 或cDNA模板扩增得到目的基因片段。
(五)重组DNA导入宿主菌
体外连接的重组DNA分子必须导入适当的受体细胞中才能大量的复制、增殖和表达。根据所采用的载体的性质，将重组DNA分子导入受体可有不同的方法。
1、转化
指以细菌质粒为载体，将外源基因导入受体细胞的过程。转化时，细菌必须经过适当的处理使之处于感受态－即容易接受外源DNA的状态,然后利用短暂热休克使DNA导入细菌宿主中。
此外还可用电穿孔法转化细菌，它的优点是操作简便、转化效率高、适用于任何菌株。
2、转染和感染
利用噬菌体DNA作为载体时可经两种方式导入受体菌。
一种是感染，即在体外将噬菌体DNA包装成病毒颗粒，然后使其感染受体菌。
另一种方式是转染，即在DNA连接酶作用下使噬菌体DNA环化，再象重组质粒一样地转化进受体菌。但习惯上常把以噬菌体DNA为载体构建成的重组子导入细胞的过程统称为转染。
（六）重组克隆的筛选与鉴定
基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落，并鉴定重组子的正确性。
通过细菌培养以及重组子的扩增，获得所需的基因片段的大量拷贝。进一步研究该基因的结构、功能，或表达该基因的产物。
种子制备
将保存在沙土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面，活化后再经过扁瓶、摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种培养过程。
工业发酵种子的制备
种子质量的控制
发酵阶段的条件控制
一、概述
（一）种子扩大的目的3
1、为每次发酵罐投料提供一定数量代旺盛的种子
2、有利于缩短发酵时间、提高罐利用率。
3、减少杂菌污染机会
（二）优良种子必须具备条件
1、菌种细胞生长活力强，接种于发酵罐后迅速生长，延迟期短。
2、生理状态稳定，以得到稳定的菌体生长过程。
3、具有适宜的菌体总量及浓度，满足大容量发酵需要。
4、无杂菌及噬菌体污染，保证整个发酵正常进行。
5、保持稳定的生产能力，使最终产物高产、稳产。
（三）种子扩大培养的工艺流程
①将砂土管或冷冻抱子接种到斜面培养基中进行活化培养；
②将斜面抱子或菌丝体转接到扁瓶固体培养基或摇瓶液体培养基中进行扩大培养，制备实验室种子；
③将扩大培养的孢子或菌丝体按种到一级种子罐，制备生产用种子，一级种子再接种至二级种子罐进行扩大培养，完成生产车间种子的制备；
④制备好的生产种子转接到发酵罐中进行发酵生产。
（四）种子进罐的方法：
1、孢子进罐法：先在固体培养基上生长、繁殖成大量孢子，将孢子直接接入种子罐扩大培养。发酵生产方向，细、霉、放线菌采用，工艺简单、种子易于保存、减少污染机会，沙土管冷冻管用量较大。
2、菌丝摇瓶进罐法：将固体培养基上繁殖的孢子接入摇瓶液体培养基中，使菌丝生长，再将摇瓶菌丝接入种子罐扩大培养或发酵。生长、发育缓慢放线菌、节约沙土管冷冻管用量，菌丝不易保存，批次之间差异大，污染机会多。
二、工业发酵种子的制备
实验室种子制备：孢子制备、固体培养基扩大培养、摇瓶液体培养。
生产车间种子制备：摇瓶液体种子制备、种子罐扩大培养
（一）实验室种子制备
孢子制备----发酵工序开端
1、放线菌孢子制备：
培养基一般采用琼脂和其他一些适合孢子生长的成分。麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨、牛肉膏和一些无机盐等，其中的碳源和氮源不要太丰富(碳源约为1％，氮源不超过0.5％)。碳氮比例大一些为好，这样避免菌丝的大量形成，有利于产生大量孢子。一般情况下，干燥和限制营养可直接或间接诱导。
2、霉菌孢子制备：
培养基一般使用大米、小米、玉米、麦麸等天然农产品为培养基原料。适合霉菌的生长繁殖、这类培养基的表面积较大，可获得大量的孢子。
制备大(小)米培养基，要严格控制灭菌后培养基的含水量，使其不粘不散。接种时，先将砂土管或冷冻管中的菌种制成悬浮液，再把一定量的悬浮液直接接人大(小)米培养基上，培养成熟后称为“亲米”，由亲米再转至大(小)米培养基上，培养成熟后称为“生产米”。用“生产米”制成孢子悬浮液，最后转入种子罐。
培养温度25～28℃，一般培养时间4～14天。
3、细菌类孢子制备
制备细菌类孢子，斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。牛肉膏，蛋白胨是常用的有机氮源。细菌培养温度大多数为37℃，少数为28℃。细菌菌体培养时间一般为1～2d，产芽孢的细菌则需培养9～10d。
摇瓶液体种子制备
种子罐种子制备
1、摇瓶液体种子制备
某些孢子发芽和菌丝繁殖速度缓慢的菌种，需要将孢子经摇瓶液体培养成菌丝后再接人种子罐，这就是摇瓶种子。
将斜面孢子接种到体积较小的摇瓶（母瓶）中，经培养后形成大量菌丝体后，再转接到较大的摇瓶(子瓶)中培养，这种摇瓶培养方法称为母瓶-子瓶两级培养、摇瓶进罐法常采用母瓶-子瓶两级培养。
2、种子罐种子制备
种子罐的级数是指制备种子需要逐级扩大培养的次数。种子罐种子制备的工艺过程，因菌种不同而有差异，一般可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。
孢子(或摇瓶菌丝)被接种到体积较小的种子罐中，经培养后形成大量的菌丝，这样的种子称为一级种子。把一级种子转入发酵罐发酵，称为二级发酵。如果将一级种子接入到体积较大的种子罐中，经培养后形成更多的菌丝，这样的种子称为二级种子。把二级种子转入发酵罐发酵，称为三级发酵。
一般应根据菌种生长特性、孢子发芽和繁殖速度以及所采用的发酵罐容积来确定种子罐的级数.
抗生素生产中，放线菌的细胞生长繁殖速度较慢，常采用二级种子扩大培养，即三级发酵，一般50t发酵罐多采用三级发酵，有的甚至采用四级发酵。
谷氨酸类氨基酸发酵所采用的菌种是细菌，生长繁殖速度很快，采用二级发酵。
☆种子异常的分析
1、菌种生长发育缓慢或过快
这种现象是指在各项工艺参数正常的情况下，出现整个代过程过慢或过快。菌种在种子罐中生长发育缓慢或过快和孢子质量以及种子罐的培养条件有关。一般情况下，通入种子罐中无菌空气的温度较低或者培养基的灭菌质量较差是种子生长、代缓慢的主要原因。
3、菌丝贴壁
所谓菌丝粘壁是指在种子培养过程中．菌丝正常发育生长，但再继续培养时菌丝逐步粘附在罐壁上。
当菌丝繁殖速度低于被罐壁粘附的速度时，培养液中菌丝浓度愈来愈小，最后就可能形成菌丝团。
搅拌效果不好
搅拌时泡洙过多
以及种子罐装料系数过小等原因造成。
在以真菌为产生菌的种子培养过程中，发生菌丝贴壁的机会较多。
4、生理生化代异常
如糖、氮代过快或过慢，pH过高或过低，种子罐发酵单位低等。
第四节菌种保藏和复壮
一、菌种退化：生产菌株遗传标记的丢失及生产能力的下降
退化表现：
产量下降，腾仓赤霉产赤霉素能力下降。
菌落和细胞形态发生变化，云金芽孢杆菌—芽孢伴孢晶体变小而少。
对宿主寄生能力下降，白僵菌对宿主致病能力下降。
退化原因：
基因突变，控制细胞性状的基因发生突变
当控制产量的基因发生负突变，就会引起产量下降；当控制孢子生成的基因发生负突变，则使菌种产孢子性能下降。
分离现象
遗传育种获得菌株如果是多核的细胞或菌丝体，基因突变只发生在一个核上，在传代过程中会发生分离现象。
退化防止：
尽可能使用单核菌株或孢子，避免对多核细胞处理，诱变后要进行充分的筛选。
控制传代次数，随着传代次数的增加，退化现象增加。
创造良好的培养环境，适合微生物的培养。
采用有效的菌种保藏方法。
二、菌种的保藏
（一）目的
使微生物菌种保持原来的性状和活力不退化、不死亡、不被污染，便于研究、交换和使用。
（二）原理
挑选典型培养物（typical culture）的优良纯种，并创造最有利于休眠的环境条件，使微生物处于代不活泼、生长受抑制的休眠状态。
措施
?低温：生长温度低限约为-30℃，水溶液中酶促反应温度低限-140℃
?干燥
?缺氧
?避光
?缺乏营养
?添加保护剂：甘油、脱脂牛奶、血清白蛋白
?添加酸度中和剂
（三）菌种保藏方法
1、斜面保藏法
?方法：接种适宜斜面培养基→培养→4℃保藏
措施：低温：4℃
适用：各大类
保藏期：1~6个月
?用橡皮塞代替棉塞，可适当延长保藏时间
2、液体石蜡保藏法
?方法：斜面或半固体接种→ 培养→ 加无菌液蜡高出培养基1cm→4~15℃保藏措施：低温，隔氧
适用：不能利用石油的各大类
保藏期：1~2年
?优点：简便
3、载体保藏法（砂土管保藏法）
?方法：孢子或芽孢悬液→加入无菌砂土管中→干燥→封口→保藏
措施：无营养，缺氧，干燥
适用：产孢子（芽孢）微生物
保藏期：1~10年
4、冷冻干燥保藏
?方法：菌种培养→用保护剂悬浮→加入安醅管中→低温冻结（-25—-40℃）→抽真空（至0.01mmHg）→真空封口→检查真空度→保藏措施：低温、干燥，缺氧，有保护剂
适用：各大类
保藏期：5~15年或更长
5、甘油悬液低温冷冻保藏法
?方法：菌种培养→15~30%甘油缓冲液悬浮→加入保藏管中→置-70℃冰箱保藏
措施：低温（-70℃）、保护剂（15~50%甘油）
适用：细菌、酵母菌
保藏期：约10年
6、液氮保藏法
?方法：菌种培养→保护剂悬浮→加入保藏管中→置液氮瓶中
措施：超低温（-196℃）、保护剂
适用：各大类
保藏期：>15年
（四）菌种保藏机构（国际知识产权组织承认的法定保藏机构28家）
1、中国微生物菌种保藏管理委员会CCCCM
普通微生物菌种保藏中心CGMCC(归属于中国科学院)微生物研究所，大学中国典型培养物保藏中心（CCTCC）。
中国农业微生物菌种保藏中心ACCC(归口中国农业科学院)
中国农业科学院土壤与肥料研究所(ISF)
中国工业微生物菌种保藏中心CICC(归口轻工业总会)
中国食品发酵工业研究所(IFFI)
中国医学微生物菌种保藏中心CMCC(归口卫生部)
中国医学科学院皮肤病研究所(ID)，
卫生部药品生物制品检定所(NICPBP)
中国预防医学科学院病毒研究所
中国抗生素微生物菌种保藏中心CACC(国家医药管理局)
中国医学科学院医药生物技术研究所
抗生素研究所(SIA)，
华北制药厂抗生素研究所(IANP),
中国兽医微生物菌种保藏中心CVCC(归口农业部)
农业部兽药监察研究所(NCIVBP)
中国林业微生物菌种保藏中心CFCC(归口中国林业科学院)
2、美国典型培养物收藏中心ATCC
3、美国北部开发利用研究部NRRL
4、荷兰霉菌中心保藏所CBS
5、英国国立标准菌种保藏所NCTC
6、日本大阪发酵研究所IFO
工业微生物菌种的选育、保藏与培养 自然环境中的微生物是混杂生长的，要想得到生产某一目的产物的野生菌株，就需要采取一定的方法将它们分离出来。菌株分离（separation）就是将混杂着各种微生物的样品按照实际需要和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对它们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。菌株分离和筛选是获得目的菌种的两个重要环节。菌株的分离要根据生产实际需要、目的代谢产物的性质、可能产生所需目的产物的微生物种类、微生物的分布、理化特性及生活环境等，设计选择性高的分离方法，才能快速地从环境或混杂了多种微生物样品中获得所需菌种。筛选方法也很重要，在设计筛选方案时有两点必须注意，即所采用方法的选择性和灵敏度。微生物细胞内含物及其周围的培养基成分非常复杂，目标产物往往又含量极低。因此，需要建立灵敏度高、快速、专一性强的检测方法。 菌种收集和筛选途径： （1）向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。 （2）由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。 （3）从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌等。该类发酵制品经过长期的自然选择，具有悠久的历史，从这些传统产品中容易筛选到理想的菌株。 发酵工业对菌种的要求如下：①能在廉价原料制成的培养基上生长，且生成目的产物产量高、易于回收；②生长较快，发酵周期短；③培养条件易于控制；④抗噬菌体及杂菌污染的能力强；⑤菌种不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定；⑥对放大设备的适应性强；⑦菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。 菌种筛选主要步骤： 调查研究及查阅充分的资料筛选 ↓↓ 设计实验方案初筛（1株1瓶）↓确定采集样品的生态环境↓ 采样复筛（1株3～5瓶） ↓确定特定的增殖条件↓结合初步工艺条件摸索增殖培养再复筛（1株3～5瓶）↓确定特殊的选择培养基及可能的↓ ↓定性或半定量快速检出法3～5株平板分离↓ ↓单株纯种分离原种斜面↓生产性能试验及毒性试验↓确定发酵培养基础条件菌种鉴定 一、菌种的分离筛选 一）样品采集与预处理 总的原则是：样品的来源越广泛，获得新菌种的可能性越大。特别是在一些极端的环境中，如高温、高压、高盐等极端环境中，可找到能适应苛刻环境压力的微生物类群。 1、从土壤中采样 土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方。从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。一般情况下，土壤中含细菌数量最多，且每克土壤的含菌量大体有如下的递减规律：细菌（108）>放线菌（107）>霉菌（106）>酵母菌（105）>藻类（104）>原生动物（103），其中放线菌和霉菌指其孢子数。但各种微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。因此，在分离菌株前要根据分离筛选的目的，到相应的环境和地区去采集样品。
第5章生产菌种的制备与保藏 本节课的重点 1、种子制备过程 2、种子质量的控制措施 本节课的难点 影响种子质量的因素 第一节生产菌种的制备过程 种子扩大培养的概念 发酵工业生产过程中的种子必须满足的条件 1) 菌体的纯种培养物总量适宜，以保证在发酵罐中有适当的接种量； 2）微生物菌种的生命力旺盛，移接到发酵罐中后能够迅速生长，利于缩短延滞期，提高设备的利用率； 3）菌种能保持稳定的生产性能，生理状态稳定； 4）无杂菌和噬菌体的污染。 种子扩大培养任务：要为每只发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子。 对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长繁殖速度快慢决定种子扩大培养的级数。抗生素类产品的生产采用放线菌，一般采用三级或四级种子扩大培养；谷氨酸等氨基酸产品，以及部分酶制剂类产品生产，采用细菌，采用二级种子扩大培养。 一、菌种扩大培养的目的 1.提供大量而新鲜的、具有较高活力的菌种。 目的就是：a、缩短发酵周期 降低能耗、减少染菌的机会（空气过滤设备有效时间是有限的）
b、为了使培养菌在数量上取得绝对的优势，抑制杂菌的生长。 从对数残留定律上看，任何灭菌过程都不能够做到绝对无菌，抑制杂菌生长除了严格环境以外，在数量上让培养菌占绝对优势也是一种方法，往往是一种行之有效的方法。例如：啤酒的发酵…… 2.让菌种从固试管、液体试管……，逐步适应， 例如：啤酒发酵 3.菌种经过扩大培养，可以提高生产的成功率，减少“倒罐”现象。 许多生产菌种往往都是“溶原性”的？ 通过连续的扩大培养，每一级都要进行严格的检查，对于不合格的严禁使用，无疑增加了生产的可靠性。 二、扩大培养的方法 通常有两种方法：固体法：用于酿造业（酱油、白酒等），也是源于酿造业，有霉菌 的纯培养，也有混合培养如：大曲 液体法：液体深层培养，适合于众多发酵行业 1.液体扩培流程 固体试管三角瓶大三角瓶一级种子二级种子 三级种子 发酵罐 2.固体扩培流程 固体试管三角瓶种曲麸曲（机械通风制曲）
菌种保藏方法 中国工业微生物菌种保藏管理中心 微生物菌种保藏对于微生物菌种的研究和利用至关重要。以下是中国工业微生物菌种保藏管理中心整理的目前国际国内常用的菌种保藏方法，包括：定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、80℃冰箱冻结法、液氮超低温冻结法，各种菌种保藏方法都有详细的步骤说明。 定期移植法 亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。 操作步骤如下： 1 培养基制备 1.1 器皿准备 培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。 1.2 溶解培养基配料 先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。 1.3 调pH值 配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。 1.4 加凝固剂 配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断
搅拌至融解，再补足所蒸发水分。 1.5 过滤分装 在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。 1.6 包扎标记 将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。 1.7 灭菌 根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。 1.8 斜面摆放 灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。 1.9 无菌检查 将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。 2接种 2.1 斜面接种 2.1.1 点接 把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。 2.1.2 中央划线 从斜面中央自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。 2.1.3 稀波状蜿蜒划线法 从斜面底部自下而上划“之”字形线。适用于易扩散的细菌，也适用于部分真菌。2.1.4 密波状蜿蜒划线法
实验15 微生物菌种保藏方法 一、实验原理 为了保持微生物菌种原有的各种优良特征及活力，使其存活，和丢失，不污染，不发生变异。根据微生物自身的生物学特点，通过人为的创造条件，使微生物处于低温、干燥、缺氧的环境中，以使微生物的生长受到抑制，新陈代谢作用限制在最低范围内，生命活动基本处于休眠状态，从而达到保藏的目的。 常用简易保藏法包括常规转接斜面低温保藏法、半固体穿刺保藏法、液体石蜡保藏法、含甘油培养物保藏法及沙土管保藏法等。由于这些保藏方法不需要特殊实验设备，操作简便易行，故为一般实验室及生产单位所广泛采用。 常规转接斜面低温保藏法和半固体穿刺保藏法是将在斜面或半固体培养基上已生长好的培养物置于4-5℃冰箱中保藏，并定期移植。这两种方法都是利用低温抑制微生物生长繁殖，从而延长保藏时间。 液体石蜡保藏法是在新鲜的斜面培养物上，覆盖一层已灭菌的液体石蜡，再置于4-5℃冰箱中保藏。液体石蜡主要起隔绝空气的作用，使外界空气不与培养物直接接触，从而降低对微生物氧的供应量。培养物上面的液体石蜡层也能减少培养基水分的蒸发。故此法是利用缺氧及低温双重抑制微生物生长，从而延长保藏时间。 含甘油培养物保藏法是在液体的新鲜培养物中加入15%已灭菌的甘油，然后再置于-20或-70℃冰箱内保藏。此法是利用甘油作为保护剂，甘油透入细胞后，能强烈降低细胞的脱水作用，而且，在-20或-70℃条件下，可大降低细胞代谢水平，但却仍能维持生命活动状态，达到延长保藏时间的目的。 沙土管保藏法，将待保藏菌种接种于适当的斜面培养基上，经培养后，制后孢子悬浮液，无菌操作将孢子悬浮液滴入已灭菌的沙土管中，孢子即吸附在沙土上，将沙土管置于真空干燥器中，通过抽真空达到吸干沙土管中水分，然后将干燥器置于4℃冰箱中保存。此法利用干燥、缺氧、缺乏营养、低温等因素综合抑制微生物生长繁殖，从而延长保藏时间。 二、操作步骤 (一) 斜面传代保藏法 l．贴标签取各种无菌斜面试管数支，将注有菌株名称和接种日期的标签贴上，贴在试管斜面的正上方，距试管口2～3cm处。 2．斜面接种将待保藏的菌种用接种环以无菌操作法移接至相应的试管斜面上，细菌和酵母菌宜采用对数生长期的细胞，而放线菌和丝状真菌宜采用成熟的袍子。 3．培养细菌37℃恒温培养18～24h，酵母菌于28～30℃培养36～60h，放线菌和丝状真菌置于28℃培养4～7d。
第一章菌种选育 第一节工业常用微生物及要求 一、常见微生物 （一）细菌（bacteria） 发酵工业中常用的细菌主要是杆菌,主要有： 醋杆菌属（Acetobacter） 乳杆菌属（Lactobacillus） 杆菌属（Bacillus）:α-淀粉酶，蛋白酶，肌苷、鸟苷等核苷。其中最为重要的是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 短杆菌属（Brevibacterium）：谷氨酸 棒杆菌属（Corynebacterium）：谷氨酸 （二）放线菌（actinomyces） 属原核微生物（有菌丝体，无横隔，不具完整的核。）最大的经济价值在于产生多种抗生素（antibiotic）。 链霉菌（Streptomyces）：红，金，土，氯，链霉素 小单孢菌属（Micromonospora）：庆大霉素 （三）霉菌（mould） 亦称丝状真菌（不是分类学上的名词，凡在营养基质上形成绒毛状，网状或絮状菌丝的真菌统称霉菌。） 1.曲霉属（Aspergillus） 黑曲霉（A. niger）产蛋白酶，淀粉酶，果酸酶，变异菌株产柠檬酸 米曲霉（A. oryzae）产淀粉酶，蛋白酶，酿酒的糖化曲和酱油曲 黄曲霉（A. flavus）产黄曲霉毒素 米曲霉和黄曲霉均为半知菌。 2.青霉属（Penicillum）：例如桔子上的绿色斑点 桔青霉（P. citrinum）：产生5’－磷酸二酯酶，降解核糖核酸为四个单核苷酸。 3.根霉属（Rhizopus）接合菌
米根霉（R. oryzae） 华根霉（R. chinensis） 酒药和酒曲中含有米根霉或华根霉。 4.红曲霉属（Monascus） 淀粉酶，麦芽糖酶，蛋白酶，柠檬酸等。可生产食用红色素。 （四）酵母（yeast） 单细胞真核微生物，低等真菌。 ①酵母属（Saccharomyces） 啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） ②假丝酵母属（Candida） 产朊假丝酵母（Candida utilis）生产饲料酵母，其蛋白质和维生素含量都比啤酒酵母高。可利用糖蜜，土豆淀粉废液生产人畜可食用蛋白质。 ③毕赤酵母属（Pichia） 产膜酵母，在液面形成白膜，是酿造物和酒类饮料的污染菌。 （五）其它微生物 1.担子菌（basidiomycetes） 即菇类（mushroom）担子菌资源的利用已经引起人们的重视。可用于多糖及抗癌药物开发。 2. 藻类（alga）是分布极广的一类自养微生物资源，许多国家把它用作人类保健 食品和饲料。从蛋白质产率看，螺旋藻是大豆的 28倍，每公顷珊列藻所得蛋白质是小麦的20～35倍。 （六）噬菌体（phage）凡用细菌和放线菌为生长菌株的发酵工业，均存在噬菌体的危害问题。噬菌体在自然界分布极为广泛。其三大特点是： ①体积比细菌小的多，可以通过细菌滤器。 ②没有细胞结构，由核酸的蛋白质构成。 ③营专性活物寄生，即只能在特异性寄主细胞中增殖。 烈性噬菌体——引起寄主细胞迅速裂解。受感染的细菌称敏感性细菌。 温和噬菌体——随寄主细胞的繁殖而繁殖。含温和噬菌体的细菌称溶原性细菌。
菌种保藏 （一）、菌种保藏的目的 微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡，因而常常造成菌种的衰退，并有可能使优良菌种丢失。菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。 （二）、菌种保藏的原理 无论采用何种保藏方法，首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。其次，应根据微生物生理、生化特点，人为地创造环境条件，使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。这些人工造成的环境主要是干燥、低温和缺氧，另外，避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏效果。 （三）、菌种保藏的方法 1、斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种。放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保存6个月左右，无芽孢的细菌可保存1个月左右，酵母菌可保存3个月左右。如以橡皮塞代替棉塞，再用石蜡封口，置于4℃冰箱中保藏，不仅能防止水分挥发、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。这一改进可使菌种的保藏期延长。该法的优点是简便易行，容易推广，存活率高，故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法。其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。 2、石蜡油封藏法 此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端lcm，使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。使用的液体石蜡要求优质无毒，化学纯规格，其灭菌条件是：150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高压蒸汽灭菌60～80min，再置于80℃的烘箱内烘干除去水分。 由于液体石蜡阻隔了空气，使菌体处于缺氧状态下，而且又防止了水分挥发，使培养物不会干裂，因而能使保藏期达1～2年，或更长。这种方法操作简单，它适于保藏霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等，对霉菌和酵母菌的保藏效果较好，可保存几年，甚至长达10年。但对很多厌氧性细菌的保藏效果较差，尤其不适用于某些能分解烃类的菌种。 3、砂土管保藏法
菌种保存方法： 一.菌种保藏方法大致可分为以下几种： 1．传代培养保藏法 又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。 2．液体石蜡覆盖保藏法 是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。 3．载体保藏法 是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 4．寄主保藏法 用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。 5．冷冻保藏法 可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。常用的有甘油菌保存： 取灭过菌的1.5ml EP管，按照60%—80%甘油的加入量，保存零下80度。例：取37°培养过夜的菌液2-4ml甘油6-8ml，充分混匀后分装于1.5ml EP管中，置于-80°冰箱即可。 6．冷冻干燥保藏法 先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。 有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。二.常用的器材 所要保存的微生物； 肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙； 灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。 三.各操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点 1．斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。 保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2—4个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。 此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、
第二章生产菌种的扩大培养、选育与保藏 目前工业规模的发酵罐容积已达到几十立方米或几百立方米。如按百分之十左右的种子量计算，就要投入几立方米或几十立方米的种子。要从保藏在试管中的微生物菌种逐级扩大为生产用种子是一个由实验室制备到车间生产的过程。其生产方法与条件随不同的生产品种和菌种种类而异。如细菌、酵母菌、放线菌或霉菌生长的快慢；产孢子能力的大小；及对营养、温度、需氧等条件的要求均有所不同。因此，种子扩大培养应根据菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得代谢旺盛、数量足够的种子。这种种子接入发酵罐后，将使发酵生产周期缩短，设备利用率提高。种子液质量的优劣对发酵生产起着关键性的作用。 种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。 发酵工业生产过程中的种子的必须满足以下条件： （1）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短； （2）生理形状稳定； （3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求； （4）无杂菌污染； （5）保持稳定的生产能力。 第一节种子的制备过程 在发酵生产过程中，种子制备的过程大致可分为两个阶段： （1）实验室种子制备阶段 （2）生产车间种子制备阶段 一、实验室种子的制备 实验室种子的制备一般采用两种方式： 对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌。对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液
体培养法。 （一）孢子的制备 1，细菌孢子的制备 细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。培养温度一般为37℃。细菌菌体培养时间一般为1~2天，产芽孢的细菌培养则需要5~10天。 2，霉菌孢子的制备 霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。培养的温度一般为25~28℃。培养时间一般为4~14天。 3，放线菌孢子的制备 放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。培养温度一般为28℃。培养时间为5~14天。 （二）液体种子制备 1，好氧培养 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌（S. griseus）、产卡那霉素的卡那链霉菌（S. Kanamuceticus）可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。其过程如下： 试管→三角瓶→摇床→种子罐 2，厌氧培养（略） 二、生产车间种子制备 实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不同菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。 1，种子罐的作用： 主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。 2，种子罐级数的确定 种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数，取决于： （1）菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度； （2）所采用发酵罐的容积。 比如： 细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。 茄子瓶→种子罐→发酵罐 霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液→一级种子罐（27℃,40小时孢子发芽，产生菌丝）→二级种子罐（27℃，10~24小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）→发酵罐
菌种传代与保藏作业指导书 1.标准菌的来源 标准菌株必须购买具备资质的菌种保藏中心提供的冷冻干燥菌种（0代）（提供菌种证书）。 2.标准菌的验收 从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。储存于2～ 8 ℃，有效期为3个月。 3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备 3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3.2培养基 改良马丁琼脂培养基:用于霉菌复苏、复壮. 营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。 3.3操作步骤： a.打开洁净工作台。
b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。 c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。 d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取 0.5～0.8 ml到安瓿中。 e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。 f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。 g.根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度30～35℃，培养18～24小时；真菌培养温度23～28℃，培养3～5天。观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。 h.取经复苏后的上述细菌菌液8-10ml至液体培养基中按g项操作对菌种进行复壮。以无菌技术向复壮后的菌种中加入100ml20%的无菌甘油混匀，1-2ml/管分装于冻存管。每个菌种制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。黑曲霉的h项下洗脱液按h项下方法进行复壮，制成复壮后的孢子悬液20ml。以无菌技术向复壮后的菌种中加入20ml 、30%的无菌甘油混匀，1-2ml/管封存于冻存管。制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。内容包括：菌种名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有
菌种选育和发酵培养基如何配制 如何选育菌种? 自然界中微生物资源异常丰富,土壤、水、空气、腐败的动植物残骸,都是微生物的主要集居和生长繁衍的场所.其种类之多,至今仍然是一个难于估测的未知数.以其集居环境(包括特殊和极端环境)、营养类型、生存方式、生理类型、代谢途径、合成能力等比较,均居生物界之冠.因此,微生物资源的开发和应用是当今世界瞩目的重大课题. 菌种的分离,不仅是把混杂的各类微生物有效地分开,得到纯种,更重要的是依着生产实际的要求,有的放矢、快速、准确地将能产生所需产物,或具有某种生化反应性能的菌种,从大量的微生物中挑选出来.有时是设计一种在分离阶段便能识别所需菌种的方法,更多的是利用特定的方法分离,获得所需菌种后,再进行识别.为了使获得的菌种能满足工业生产的需要,须考虑各种性能指标.因此,菌种分离和筛选的方法和策略就十分重要. 一般的菌种分离纯化和筛选步骤可分为采样、增殖与分离、发酵与性能测定等几个步骤.步骤和方法如下图所示: 发酵培养基如何配制? 首先需了解微生物需要的营养物质. (1)微生物需要的营养物质 营养物质应满足微生物的生长、繁殖和完成各种生理活动的需要.它们的作用可概括为形成结构(参与细胞组成)、提供能量和调节作用(构成酶的活性和物质运输系统). 微生物的营养物质有六大类要素,即水、碳源、氮源、无机盐、生长因子和能源.
①水 水是微生物的重要组成部分,在代谢中占有重要地位.水在细胞中有两种存在形式:结合水和游离水.结合水与溶质或其他分子结合在一起,很难加以利用.游离水(或称为非结合水)则可以被微生物利用. ②碳源 碳在细胞的干物质中约占50%,所以微生物对碳的需求最大.凡是作为微生物细胞结构或代谢产物中碳架来源的营养物质,称为碳源. 作为微生物营养的碳源物质种类很多,从简单的无机物(CO2、碳酸盐)到复杂的有机含碳化合物(糖、糖的衍生物、脂类、醇类、有机酸、芳香化合物及各种含碳化合物等).但不同微生物利用碳源的能力不同,假单孢菌属可利用90种以上的碳源,甲烷氧化菌仅利用两种有机物:甲烷和甲醇,某些纤维素分解菌只能利用纤维素. 大多数微生物是异养型,以有机化合物为碳源.能够利用的碳源种类很多,其中糖类是最好的碳源. 异养微生物将碳源在体内经一系列复杂的化学反应,最终用于构成细胞物质,或为机体提供生理活动所需的能量.所以,碳源往往也是能源物质. 自养菌以CO2、碳酸盐为唯一或主要的碳源.CO2是被彻底氧化的物质,其转化成细胞成分是一个还原过程.因此,这类微生物同时需要从光或其他无机物氧化获得能量.这类微生物的碳源和能源分别属于不同物质. ③氮源 凡是构成微生物细胞的物质或代谢产物中氮元素来源的营养物质,称为氮源.细胞干物质中氮的含量仅次于碳和氧.氮是组成核酸和蛋白质的重要元素,氮对微生物的生长发育有着重要作用.从分子态的N2到复杂的含氮化合物都能够被不同微生物所利用,而不同类型的微生物能够利用的氮源差异较大. 固氮微生物能利用分子态N2合成自己需要的氨基酸和蛋白质,也能利用无机氮和有机氮化物,但在这种情况下,它们便失去了固氮能力.此外,有些光合细菌、蓝藻和真菌也有固氮作用. 许多腐生细菌和动植物的病原菌不能固氮,一般利用铵盐或其他含氮盐作氮源.硝酸盐必须先还原为NH+4
菌种保存方法 未知 微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。 低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。 保藏方法大致可分为以下几种： 1．传代培养保藏法 又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。 2．液体石蜡覆盖保藏法 是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。 3．载体保藏法 是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 4．寄主保藏法 用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。 5．冷冻保藏法 可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。 6．冷冻干燥保藏法 先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水 分（真空干燥）。
有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。 三、器材 细菌、酵母菌，放线菌和霉菌； 肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙； 灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。 四、操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点 下列各法可根据实验室具体条件与需要选做。 1．斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。 保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2—4个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。 此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。 2．液体石蜡保藏法 （1）将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌30分钟，然后放在40℃温箱中，使水汽蒸发掉，备用。 （2）将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。 （3）用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准（图Ⅶ-12），使菌种与空气隔绝。
微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。 素而设计的。 一、保藏方法大致可分为以下几种： 1、传代培养保藏法 2、液体石蜡覆盖保藏法 是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。 3、载体保藏法 是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。 4、寄主保藏法 用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。 5、冷冻保藏法 6、冷冻干燥保藏法 先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。 有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。 二、器材: 细菌、酵母菌，放线菌和霉菌； 肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙； 灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。 三、操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点 下列各法可根据实验室具体条件与需要选做。 1、斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保
《食品微生物学》授课教案 第六章微生物的遗传变异与菌种选育 教学目的： 1、掌握微生物基因突变的类型、特点和机制。 2、掌握微生物分离纯化的方法步骤。 3、掌握营养缺陷型突变菌株的筛选方法和具体应用。 教学重点与难点：掌握微生物分离纯化的方法步骤。 教学课时：2学时 教学方法：多媒体教学 教学内容： 微生物在遗传上特点：1、微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系。2、很多常见微生物都易于人工培养，快速、大量生长繁殖。3、对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。大多是无性生殖，变异易保留。 一、微生物遗传变异的物质基础 1、证明经典实验 1）转化实验 2）噬菌体T2的感染实验 3）病毒拆开与重建实验 2、遗传物质在细胞中存在方式 1）细胞水平 2）核水平（plasmid）
3）染色体水平 4）核酸水平 5）基因水平（遗传功能单位） 6）密码子水平（遗传信息单位） 7）核苷酸水平（最低突变或交换单位） 质粒种类： 1）F因子（致育因子）：大肠杆菌中发现，含质粒为F+（♂）；无质粒为F-（♀）；质粒DNA整合到染色体上为Hfr. 2）R因子（耐药性）：痢疾杆菌，多价耐药性，耐药信息携带在质粒上。 3）Col因子（大肠杆菌素产生因子） 4）青霉素酶质粒 5）Ti质粒（诱癌质粒）：植物根癌，植物基因工程重要载体。 6）降解质粒：Pseudomonas 二、微生物的基因突变 突变是指遗传物质核酸中的核苷酸顺序突然发生了可遗传的变化。包括基因突变（点突变）和染色体畸变 （一）基因突变 1、类型 形态突变型、生化突变型 营养缺陷型：由基因突变引起某酶合成能力丧失，必须在原有培养基中添加相应的营养成分才能生长。 致死突变型：基因突变导致个体死亡。
菌种保藏的方法 菌种是国家重要的生物资源，鉴于其自身的遗传性和变异性，在菌种保藏过程中，如何降低菌种的衰亡速度，防止杂菌污染，保持菌种遗传性状不变异，使优良高产菌株长期在生产中应用，成为食用菌领域一项重要的课题。为适应群众性生产的需要，为适应群众性生产的需要，本文介绍了几种简单易行、实用效果好的菌种保藏方法。 一、菌种保藏基本原理 通过低温、干燥、缺氧和饥饿等手段来达到最大限度降低菌丝体的生理代谢。首先要挑选优良纯菌种，包括菌丝体和它们的孢子；其次，根据其生理、生化特点，人为创造低温、干燥或缺氧等条件，抑制微生物的代谢作用，使其生命活动降低到极低的程度或处于休眠状态，从而延长菌种生命以及使菌种保持原有的性状，防止变异。 二、菌种保藏的方法 试管斜面菌种系列保存方法 1低温定期移植保藏法 将需要保藏的菌种接种在适宜的斜面培养基上，适温培养，当菌丝健壮地长满斜面时取出，放在3~5℃低温干燥处或4℃冰箱中保藏，每隔3~6个月移植转管1次，具体应根据菌种特性决定。保藏时要注意环境湿度不能太高，以防霉菌通过棉塞进入管内。因此，若用棉塞，可用干净的塑料薄膜或牛皮纸包扎棉塞，也可用无菌的白胶塞，并用石蜡涂封，即可减少污染的机会，也可防止培养基干燥。除草菇外，大多食用菌菌种都能采用此法保藏。 2液体石蜡保藏法
取化学纯液体石蜡装于三角瓶中高压灭菌后，放入40℃恒温箱中，蒸发其中水分，至石蜡油完全透明为止。将处理好的石蜡油移接在空白斜面上，28～30℃下培养2～3d，证明无杂菌生长方可使用。然后将母种接在斜面培养基上，当菌丝在斜面上生长丰满后，将液体石蜡注在斜面上，注入量以高出斜面1cm为宜，使菌种与空气隔绝，降低其新陈代谢能力。管口用灭过菌的白胶塞塞紧，并用石蜡涂封，直立放在室内干燥处或冰箱内保藏。一般可保存1年以上，在低温下保藏时间还可延长。使用时从斜面上挑取菌丝少许，移接到新鲜斜面培养基上，经培养即可。由于菌丝体沾有液体石蜡而影响其生长，需再经1次移接才能恢复正常生长。 3白胶塞封口保存法 选择与试管口径相符的白胶塞，用%煤酚皂溶液洗涤，浸泡在酒精内待用。当试管斜面长满菌丝后，在无菌条件下拔去棉塞，取浸泡的白胶塞1个，通过火焰迅速塞入试管口内，并用石蜡熔封。此法能达到与石蜡油封存相似的效果。用该法保存菌种可存活1～3年，但以每年移植1次为好。 4蒸馏水保藏法 将8成熟试管菌种放在接种箱内，注入蒸馏水，将培养基斜面全部淹没至管口2cm。管口用白胶塞塞紧，并用石蜡涂封，常温下置于阴凉处立放，可以保藏1年左右。 非斜面固体菌种系列保存法 1麦麸保藏法 将麦麸和水按∶1充分拌匀后，装入试管高压灭菌，经无菌检查合格后接种，适温下培养至菌丝体发育好后，将试管放入真空干燥器内，用真空泵将麦麸培养基内水分抽干，然后移入盛有硅胶的干燥器内，用凡士林密封在常温下保存，可保藏3～5年。
几种菌种的保存及复苏方法（含扩增方法） 定期移植法，亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。 操作步骤如下： 1 培养基制备 1.1 器皿准备 培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。 1.2 溶解培养基配料 先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。 1.3 调pH值 配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。 1.4 加凝固剂 配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。 1.5 过滤分装 在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。 1.6 包扎标记 将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。 1.7 灭菌 根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。 1.8 斜面摆放 灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。 1.9 无菌检查 将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。 2 接种 2.1 斜面接种 2.1.1 点接 把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。2.1.2 中央划线 从斜面中央自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。 2.1.3 稀波状蜿蜒划线法 从斜面底部自下而上划“之”字形线。适用于易扩散的细菌，也适用于部分真菌。 2.1.4 密波状蜿蜒划线法 从斜面底部自下而上划密“之”字形线。能充分利用斜面获得大量菌体细胞，适用于细菌和酵母菌等。 2.1.5 挖块接种法 挖取菌丝体连同少量培养基，转接到新鲜斜面上。适用灵芝等担子菌类真菌。
实验十 微生物菌种保藏方法 [日期：2009- 5-30]来源： 作者：孔庆学 [字体：大 中 小] 实验十微生物菌种保藏方法 菌种是一种重要的生物资源，菌种保藏是重要的微生物基础工作。菌种保藏就是利用一切条件使菌种不死、不衰、不变，以便于研究与应用。 (一)常规保藏方法 1 目的 1.1 了解菌种保藏的基本原理 1.2 掌握几种常用的菌种保藏方法。 2 原理 菌种保藏的方法很多。其原理却大同小异，不外乎为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境,即干燥、低温、缺乏氧气和养料等。使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。依据不同的菌种或不同的需求，应该选用不同的保藏方法。一般情况下，斜面保藏、半固体穿刺,石蜡油封存和砂土管保藏法较为常用，也比较容易制作。 3 材料 3.1菌株 待保藏的适龄菌株斜面 3.2培养基 肉汤蛋白胨斜面，半固体及液体培养基。 3.3 试剂 10%HCl无水氯化钙、石蜡油、五氧化二磷。 3.4 器具 用于菌种保藏的小试管(10*100毫米)数支、5毫升无菌吸管、l毫升无菌吸管等、灭菌锅、真空泵、干燥器、冰箱无菌水、筛子(40目、120目)、标签、接种针、接种环、棉花、牛角匙等等。 4 流程 斜面保藏→半固体穿刺保藏→石蜡油封存→砂土管保藏
5 步骤 5.1斜面保藏 5.1.1流程 标记试管→接种→培养→保藏 5.1.2步骤 5.1.2.1贴标签 取无菌的肉汤蛋白胨斜面数支。在斜面的正上方距离试管口2-3厘米处贴上标签。在标签纸上写明接种的细菌菌名、培养基名称和接种日期。 5.1.2.2斜面接种 将待保藏的细菌用接种环以无菌操作在斜面上作划线接种。 5.1.2.3培养 置37恒温箱中培养48小时。 5.1.2.4保藏 斜面长好后，直接放入4℃的冰箱中保藏。这种方法一船可保藏三个月至半年。 5.2半固体穿刺保藏 5.2.1流程 标记试管→穿刺接种→培养→保藏 5.2.2 步骤 5.2.2.1贴标签 取无菌的半固体肉汤蛋白等直立柱数支，贴上标签，注明细菌菌名、培养基名称和接种日期。 5.2.2.2穿刺接种 用接种针以无菌方式从待保藏的细菌斜面上挑取菌种，朝直立柱中央直刺至试管底部，然后又沿原线拉出。 5.2.2.3培养 置37恒温箱中培养48小时。 5.2.4保藏 半固体直立柱长好以后，放入4℃的冰箱中保藏。这种方法一般可保藏半年至一年。
第三章菌种选育与培养 教学目的：1、熟悉工业发酵常用微生物种类；2、掌握菌种分离、筛选和选育的方法；3、掌握种子扩大培养方法和质量控制方法；4、掌握常规的菌种保藏方法。 教学方法：讲授 教学手段：使用多媒体课件 教学内容： 第一节重要工业微生物的分离及菌种要求 1、微生物资源非常丰富，广泛分布于土壤、水和空气中，尤以土壤中最多。 2、有的微生物从自然界中分离出来就能被利用，有的需要对分离到的野生菌株进行人工诱变，得到突变株才能被利用。 3、当前发酵工业所用的菌种总趋势是从野生菌转向变异菌，自然选育转向代谢育种，从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。 4、由于生物工业本身的发展以及遗传工程的介入，藻类、病毒等也正在逐步变为工业生产用的微生物。 一、工业生产常用的微生物 1、细菌（bacteria）：枯草芽胞杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等，用于生产淀粉酶、乳酸、醋酸、氨基酸和肌苷酸等； 2、酵母菌（yeast）：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等，用于酿酒、制造面包、生产脂肪酶以及可食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等； 3、霉菌（mould）：根霉、毛霉、犁头霉、红曲霉、曲霉、青霉等，用于生产多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等； 4、放线菌（actinomycetes）：链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等，常用菌种来自链霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属等； 5、担子菌（basidiomycetes）：通常所说菇类（mushroom）微生物，用于多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发； 6、藻类（algae）：用作人类保健食品和饲料，如螺旋藻、栅列藻；可通过藻类将CO2转变为石油，或获取氢能。 二、微生物工业对菌种的要求 目前，随着微生物工业原料的转换和新产品的不断出现，势必要求开拓更多新品种。尽管微生物工业用的菌种多种多样，但作为大规模生产，对菌种有下列要求： 1、原料廉价、生产迅速、目的产物产量高； 2、易于控制培养条件，酶活性高，发酵周期较短； 3、抗杂菌和噬菌体的能力强； 4、菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。 三、重要工业微生物的分离 分离是指从含微生物的样品（如土壤、水等）中获得纯的或混合的培养物，是筛选具有潜在工业应用价值的微生物的第一个阶段，接着才能从以上分离物中筛选出那些能产生所需产物或具有某种生化反应的菌种。