第1讲基因工程
[考纲要求] 1.基因工程的诞生(Ⅰ)。 2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)。
3.基因工程的应用(Ⅱ)。
4.蛋白质工程(Ⅰ)。
5.实验：DNA的粗提取和鉴定。
考点一基因工程的基本工具
1．基因工程的概念
(1)供体：提供目的基因的生物。
(2)操作环境：体外。
(3)操作水平：分子水平。
(4)原理：基因重组。
(5)受体：表达目的基因。
(6)本质：性状在受体体内的表达。
(7)优点：克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的遗传性状。
2．DNA重组技术的基本工具
(1)限制性核酸内切酶(简称：限制酶)
①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②作用：识别特定的核苷酸序列并切开特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
③结果：产生黏性末端或平末端。
(2)DNA连接酶
①作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。
②类型：
常用类型E·coli DNA连接酶T4DNA连接酶
来源大肠杆菌T4噬菌体
功能只缝合黏性末端缝合黏性末端和平末端
结果恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
(3)载体
①种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
②质粒的特点????? 能自我复制有一个至多个限制酶切割位点
有特殊的标记基因
1．判断正误：
(1)限制酶只能用于切割目的基因(×)
(2)切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列(×)
(3)DNA 连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来(×)
(4)E ·coli DNA 连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端(×)
(5)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因(×)
(6)每个重组质粒至少含一个限制酶识别位点(√)
(7)限制性核酸内切酶、DNA 连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶(×)
(8)质粒是小型环状DNA 分子，是基因工程常用的载体(√)
(9)载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达(√)
(10)外源DNA 必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制(×)
2．限制性核酸内切酶Mun Ⅰ和限制性核酸内切酶Eco RⅠ的识别序列及切割位点分别是 ↓
—CAATTG —和
↓—GAATTC —。如图表示四种质粒和目的基因，其中箭头所指部位为限制性核酸
内切酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是哪一种？并指明理由。
答案： 适合的质粒是①。由图可知，质粒②上无标记基因，不适合作为载体；质粒③和④的标记基因上都有限制性核酸内切酶的识别位点，使用该酶后将会导致标记基因遭破坏，故均不宜选作载体。
1．确定切割某种目的基因的限制酶的种类
根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类：
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和Eco RⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
2．载体上标记基因的作用
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如下图所示：
基因工程操作工具的四个易错点
(1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。
(2)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。
(3)将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端。
(4)基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。
1．(2018·北京理综)用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是( )
A．图1中两种酶识别的核苷酸序列不同
B．图2中酶切产物可用于构建重组DNA
C．泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物
D．图中被酶切的DNA片段是单链DNA
D[限制酶识别特定的脱氧核苷酸序列，不同的限制酶能识别不同的核苷酸序列，由电泳图可知XhoⅠ和SalⅠ两种酶分别切割时，识别的序列不同，A正确；同种限制酶切割出的DNA片段，具有相同的粘性末端，再用DNA连接酶进行连接，可以构成重组DNA，B正确；Sal Ⅰ将DNA片段切成4段，XhoⅠ将DNA片段切成3段，根据电泳结果可知泳道①为SalⅠ，泳道②为XhoⅠ，C正确；限制酶切割双链DNA，酶切后的DNA片段仍然是双链DNA，D错误。] 2．(2020·四川乐山调研)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、Bam HⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的Eco RⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经Bam HⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________。
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有____________和____________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是____________。
答案：(1)Sau3AⅠ两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端(2)甲和丙甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录(3)E·coli DNA连接酶T4DNA连接酶T4DNA连接酶
限制酶的选择技巧
(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类。(见重难透析)
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类。
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切割位点不是一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
考点二基因工程的基本操作程序
1．目的基因的获取
(1)目的基因：主要是指编码蛋白质的基因。
(2)获取目的基因的方法
①直接分离法：从自然界已有的物种中分离，如从基因组文库或cDNA文库中获取。
②人工合成：
a．如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成；
b．以RNA为模板，在逆转录酶的作用下人工合成。
(3)扩增目的基因：利用PCR技术扩增目的基因。
2．基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)目的：
①使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代；
②使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)组成：启动子＋目的基因＋终止子＋标记基因(如抗生素抗性基因)。
(3)基因表达载体的构建过程：
3．将目的基因导入受体细胞[连线]
提示：①—b ②—a、c、e ③—d
[思考] 将目的基因导入受体细胞整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上，能否稳定遗传？为什么？
提示：一般不能。如果仅把目的基因整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上，由于细胞分裂可能导致目的基因丢失，无法稳定遗传。
4．目的基因的检测与鉴定
类型步骤检测内容方法
分子
检测
第一步
转基因生物的DNA上是否插入了
目的基因
DNA分子杂交技术(DNA和
DNA之间)
第二步目的基因是否转录出了mRNA
分子杂交技术(DNA和
mRNA之间)
第三步目的基因是否翻译成蛋白质抗原—抗体杂交技术
个体生
物学水
平鉴定
抗虫或抗病接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度
判断正误：
(1)设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列(×)
(2)用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列(√)
(3)PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶(×)
(4)将ada(腺苷酸脱氨酶基因)通过质粒pET28b导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个ada(×)
(5)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体(×)
(6)把目的基因导入双子叶植物一般采用农杆菌转化法(√)
(7)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达(√)
(8)检测目的基因是否导入受体细胞可用抗原—抗体杂交技术(×)
(9)应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达(×)
1．基因组文库与部分基因文库
2.PCR技术
(1)原理：体外DNA复制
(2)需要条件：模板DNA、引物、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)
(3)过程：DNA受热(90～95 ℃)变性解旋为单链、冷却(55～60 ℃)后RNA引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下延伸(70～75 ℃)合成互补链。
3．基因表达载体
4．农杆菌转化法原理
植物受损伤时伤口处分泌物可吸引农杆菌→农杆菌中Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA上(若将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上，则目的基因将被一起带入)。
1．(2019·浙江重点中学联考)下图为获得抗除草剂转基因玉米的技术路线，请回答：
(1)构建表达载体选择限制酶时，要求Ti质粒内每种限制酶只有一个切割位点，同时要求酶切后，G基因形成的两个粘性末端序列不相同，这个过程需用________种限制酶，目的是________________。除草剂抗性基因G和Ti质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是________________。
(2)农杆菌转化愈伤组织时，T-DNA携带________插入受体细胞的核DNA。若核DNA中仅插入一个G基因，自交后代含G基因的植株中，纯合子占________。
(3)获得抗除草剂转基因玉米涉及多次筛选，其中筛选含重组质粒的农杆菌应使用含________的选择培养基，使用含________的选择培养基筛选出转化的愈伤组织，再诱导愈伤组织再生出抗除草剂转基因玉米。
解析：：(1)由于题干要求酶切后G基因形成的两个粘性末端序列不相同，因此需要用2种不同的限制酶进行酶切。由于粘性末端不同，因此可以防止酶切产物自身环化。DNA连接酶可催化DNA片段之间形成磷酸二酯键。(2)T-DNA可携带目的基因插入到受体细胞的核DNA中。倘若仅插入一个G基因，培育成的植株相当于单杂合子，自交后代含G基因的植株中，纯合子占1/3。(3)由于抗生素对某些微生物具有抑制作用，因此筛选含重组质粒的农杆菌应使用含抗生素的选择培养基。而对植物细胞的筛选应使用含除草剂的培养基，以筛选出能表达抗除草剂基因的玉米细胞。
答案：(1)2(不同) 防止酶切产物自身环化(意思正确即可) 磷酸二酯键(2)目的基因(抗除草剂基因G) 1/3 (3)抗生素除草剂
2．(2018·江苏高考，有改动)为生产具有特定性能的α-淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α-淀粉酶基因(1 656个碱基对)，利用基因工程大量制备α-淀粉酶，实验流程见下图。请回答下列问题：
(1)利用PCR技术扩增α-淀粉酶基因前，需先获得细菌的________________。
(2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的________端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________。
(3)进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中________的设定与引物有关，________的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)
①变性温度②退火(复性)温度③延伸温度④变性时间⑤退火(复性)时间⑥延伸时间
(4)下图表示筛选获得的工程菌中编码α-淀粉酶的mRNA的部分碱基序列：
图中虚线框内mRNA片段包含________个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有________种。
(5)获得工程菌表达的α-淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下：
缓冲液
50 mmol/L
Na2HPO4—KH2PO4
50 mmol/L
Tris—HCl
50 mmol/L
Gly—NaOH
pH 6.0 6.5 7.0 7.5 7.5 8.0 8.5 9.0 9.0 9.5 10.0 10.5 酶相对
活性%
25.4 40.2 49.8 63.2 70.1 95.5 99.5 85.3 68.1 63.7 41.5 20.8
_______________________________________________________________________。
解析：：(1)利用PCR技术扩增α-淀粉酶基因前，需先获得细菌的基因组DNA作为模板，并依据α-淀粉酶基因两端的部分核苷酸序列合成两条引物。(2)利用PCR技术扩增DNA时，只能从3′端延伸DNA子链，为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5′端加上限制性酶切位点，并且要注意在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，这样既能防止目的基因、载体的自身连接，又能确保目的基因与表达载体的定向连接。(3)PCR技术包括变性、退火(复性)和延伸三步，变性温度决定PCR反应中双链DNA的解链，且时间很短；退火(复性)时引物结合到互补的DNA单链上，退火(复性)温度由引物复性温度决定，其温度设定与引物的长度、碱基组成及浓度等有关；延伸时间与产物片段的长度有关，产物在1 kb以内的延伸时间为1 min左右，3～4 kb的延伸时间为3～4 min。(4)图中虚线框内共含有24个碱基，mRNA上3个相邻的碱基编码1个氨基酸，故共包含8个密码子。虚线框后的第1个密码子的第1个碱基是U，第2和第3个碱基各有4种可能性，因此共有16种可能性。题干表明控制α-淀粉酶的基因有1 656个碱基对，说明图中虚线框后的第1个密码子肯定不是终止密码子(3种终止密码子为UAA、UAG、UGA)，故虚线框后第1个密码子实际最多可能性有16－3＝13(种)。(5)分析表格中的数据，酶相对活性最高为99.5%，对应的条件是pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L Tris-HCl。
答案：(1)基因组DNA (2)5′使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连(3)②⑥(4)8 13 (5)pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L Tris-HCl
考点三基因工程的应用及蛋白质工程
1．基因工程的应用
(1)基因工程的应用：培育转基因植物和转基因动物，生产基因工程药物，进行基因治疗。
(2)抗虫棉的培育
①图示：
②分析：从图中可以看出，目的基因是Bt毒蛋白基因，使用的载体是Ti质粒，将目的基因表达载体导入受体细胞的方法是农杆菌转化法，请写出两种检测目的基因是否表达的方法：抗原—抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫。
(3)基因治疗与基因诊断的不同点
原理操作过程进展基因
治疗
基因表达
将正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正
常性状来治疗(疾病)
临床
实验基因
诊断
碱基互补配对原则
制作特定DNA探针与病人样品DNA混合，分析杂交
带情况
临床
应用
2.蛋白质工程
(1)目标：根据人们的需要对蛋白质的分子结构进行设计，或制造一种全新的蛋白质。
(2)操作对象：基因。
(3)操作过程
写出流程图中字母代表的含义：
A．转录，B.翻译，C.分子设计，D.多肽链，E.预期功能。
(4)结果：改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。
(5)应用：主要集中应用于对现有蛋白质进行改造，改良生物性状。
判断正误：
(1)将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株(√)
(2)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中(×)
(3)由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用(×)
(4)蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质(√)
(5)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构(×)
蛋白质工程与基因工程比较
项目
蛋白质工程基因工程
区别过程
预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质
结构→推测应有的氨基酸序列→找到
对应的脱氧核苷酸序列
获取目的基因→构建基因表达载体→
将目的基因导入受体细胞→目的基因
的检测与鉴定
实质定向改造或生产人类所需蛋白质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类
所需的生物类型或生物产品
结果生产自然界没有的蛋白质一般是生产自然界已有的蛋白质
联系
蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程。对现有蛋白质
的改造或制造新的蛋白质，必须通过基因修饰或基因合成实现
1．(2015·全国卷Ⅱ)已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：
(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的________进行改造。
(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰__________基因或合成________基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括________的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即： _______________________________________ _______________________________________________________________________。
(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过________________和________________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物________进行鉴定。
解析：：(1)从题中所述资料可知，将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸后，该蛋白质的功能发生了改变，此过程是通过对构成蛋白质的氨基酸的排列顺序进行改造，进而改变了蛋白质的结构，从而改变了蛋白质的功能。(2)在蛋白质工程中，目的基因可以以P基因序列为基础，对生物体内原有P基因进行修饰，也可以通过人工合成法合成新的P1基因。中心法则的内容如下图所示：
由图可知，中心法则的全部内容包括：DNA以自身为模板进行的复制，DNA通过转录将遗传信息传递给RNA，最后RNA通过翻译将遗传信息表达成蛋白质；在某些病毒中RNA可自我复制(如烟草花叶病毒)，在某些病毒中能以RNA为模板逆转录合成DNA(如HIV)，这是对中心法则的补充。(3)蛋白质工程的基本途径是预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→合成DNA→表达出蛋白质，经过该过程得到的蛋白质，需要对其生物功能进行鉴定，以保证其发挥正常作用。
答案：(1)氨基酸序列(或结构)(其他合理答案也可)
(2)P P1DNA和RNA(或遗传物质) DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)
(3)设计蛋白质的结构推测氨基酸序列功能
蛋白质工程与基因工程的比较
项目蛋白质工程基因工程
实质定向改造或生产人类所需蛋白质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品(基因的异体表达)
结果生产自然界中没有的蛋白质生产自然界中已有的蛋白质
联系蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，需要通过基因修饰或基因合成实现，基因工程中所需酶也需要蛋白质工程进行修饰、改造以提高其功能
考点四PCR技术和DNA粗提取与鉴定
1．PCR技术
(1)PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。
(2)目的：短时间内大量扩增目的基因。
(3)原理：DNA双链复制。
(4)前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列作为PCR模板；引物；热稳定DNA聚合酶(Taq 酶)；四种脱氧核苷酸。
(5)过程与结果
①过程
②结果：上述三步反应完成后，一个DNA 分子就变成了2个DNA 分子，随着重复次数的增多，DNA 分子就以2n 的形式增加。PCR 的反应过程都是在DNA 扩增仪中完成的。
2．DNA 的粗提取与鉴定
(1)原理
①溶解度
DNA 与蛋白质在不同浓度的NaCl 溶液中溶解度不同。
DNA 不溶于酒精。
②DNA 对酶、高温和洗涤剂的耐受性。
③鉴定：DNA ＋二苯胺试剂――→沸水浴蓝色。
(2)操作流程
1．判断正误：
(1)设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列(×)
(2)用PCR 方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列(√)
(3)PCR 体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA 聚合酶(×)
(4)用不同浓度的NaCl 溶液反复溶解与析出DNA 可去除蛋白质(√)
(5)提取DNA 时，如果没有鸡血材料，可用猪血代替(×)
(6)在DNA 的粗提取与鉴定实验中，将丝状物溶解在2 mol/L NaCl 溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色(×)
2．下图为“DNA 粗提取和鉴定”实验的相关操作，据图分析下列问题：
(1)操作①和④都是加入蒸馏水，其目的一样吗？
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
(2)操作②中加入酒精的目的是什么？此时搅拌要注意什么？
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
答案：(1)不一样。①是使鸡血细胞吸水涨破释放出核物质；②是稀释NaCl溶液使其浓度接近0.14 mol/L，去除溶于低浓度NaCl溶液的杂质。(2)②中加入酒精的目的是析出DNA，去除其中溶于酒精的杂质。这时候搅拌要沿一个方向，轻缓的进行。
1．生物体内DNA复制与PCR反应的区别
项目体内DNA复制PCR技术
场所主要在细胞核内生物体外
酶DNA聚合酶、解旋酶热稳定DNA聚合酶(Taq酶)
条件模板、ATP、常温模板、ATP、引物链、温度变化(90～95 ℃→55～60 ℃→70～75 ℃)
原料四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸
特点形成的是整个DNA分子，一个细胞周期只
复制一次
短时间内形成含有大量目的基因的DNA
片段
项目 2 mol/L NaCl溶液0.14 mol/L NaCl溶液溶解规律
DNA
溶解析出
蛋白质部分发生盐析沉淀溶解NaCl溶液浓度从2 mol/L逐渐降低的过程中，溶解度逐渐增大
加蒸馏水2次①加到鸡血细胞液中，使血细胞吸水破裂
②加到含DNA的2 mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物质的量浓度下降到0.14 mol/L，使DNA析出
用纱布过滤3次①过滤血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液
②滤取0.14mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)
③过滤溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液
4次使用NaCl溶液①加2 mol/L的NaCl溶液，溶解提取的细胞核物质
②用0.14 mol/L的NaCl溶液使DNA析出
③用2 mol/L的NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物
④用2 mol/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA
题组一考查PCR技术
1．聚合酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，PCR过程一般经历下述30多次循环：95 ℃下使模板DNA变性、解链→55 ℃下复性(引物与DNA模板链结合)→72 ℃下引物链延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关PCR过程的叙述中不正确的是( ) A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现
B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成
C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸
D．PCR与细胞内DNA复制相比所需酶的最适温度较高
C[PCR技术实际上就是DNA的复制，因此用的原料是四种脱氧核苷酸，用到的酶为热稳定DNA聚合酶。]
2．PCR是多聚酶链式反应的缩写，利用PCR技术可对目的基因进行扩增。请根据下面PCR 反应原理示意图回答有关问题：
(1)PCR的原理是
_______________________________________________________________________。
(2)PCR技术使DNA解链是通过________实现的，DNA的这种解链现象在一定条件下是________(填“可逆的”或“不可逆的”)。
(3)DNA解链后冷却的目的是
_______________________________________________________________________。
(4)当温度加热至70～75 ℃时，是________________酶把单个脱氧核苷酸通过________键连接到引物上。如此逐渐延伸形成互补链，进而使目的基因加倍。
(5)通过重复循环过程，使目的基因以________形式扩增。
答案：(1)DNA双链复制(2)高温加热可逆的(3)让引物与互补DNA链相结合(4)热稳定DNA聚合磷酸二酯(5)指数
题组二考查DNA的粗提取与鉴定
3．图1、2分别为“DNA的粗提取与鉴定”实验中部分操作步骤示意图，下列叙述错误的是( )
A．图1、2中加入蒸馏水稀释的目的相同
B．图1中完成过滤之后保留滤液
C．图2中完成过滤之后弃去滤液
D．在图1鸡血细胞液中加入少许嫩肉粉有助于去除杂质
A[图1中加入蒸馏水的目的是使鸡血细胞吸水涨破，图2中加入蒸馏水的目的是稀释NaCl溶液，使DNA析出；图1中加入蒸馏水后，DNA存在于滤液中；图2中加入蒸馏水后，NaCl溶液浓度降低，DNA析出，所以弃去滤液；嫩肉粉主要成分是蛋白酶，鸡血细胞液中加入少许嫩肉粉可将蛋白质水解成小分子肽或氨基酸，有利于除去蛋白质。]