多聚赖氨酸 10X
Poly-L-Lysine 货号：
货号规格备注
GT100605 5ml
GT100615 15ml
GT100650 50ml
GT100611 100ml
产品简介：
抗原修复过程中，由于高温、高压、微波辐射等
外界因素的影响，极易造成脱片。经多聚赖氨酸处理
过的载玻片可有效防止脱片的发生。
包装：
组分数量备注
多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine） 1 10X浓缩液
使用说明书 1
产品应用：
1、按1：10的比例用去离子水或蒸馏水稀释多聚赖
氨酸。（注：1份多聚赖氨酸加9份水）
2、将洗净、干燥的载玻片放入稀释好的多聚赖氨酸
溶液，浸泡5分钟，沥干。
3、室温下晾干（12-24小时）或50℃烘箱内干燥。
稀释后的溶液在4℃保存条件下可反复使用一个月。
产品保存：
2-8度保存，并在有效期末前使用。
仅供研究，不用于临床诊断
Rev:V2.0/2012-03-28
多聚赖氨酸溶液(10×PLL,1mg/ml,无菌) 简介： 多聚赖氨酸溶液英文名为Poly-L-lysine Solution 简称PLL 。Leagene Poly-L-lysine 为Poly-L-lysine hydrobromide ，分子式为L-Lys-(L-Lys)n-L-Lys ?xHBr ，分子量为150,000～300,000，CAS Number 25988-63-0。 PLL 是一种粘附剂，常用于载玻片的包被,可以直接稀释后用于细胞或组织培养方面的实验。分子量大于70,000的多聚赖氨酸可以促进细胞贴壁生长，本产品可以用于促进细胞的贴壁生长和核酸杂交，制备好的载玻片可4℃保存半年。 组成: 操作步骤(仅供参考)： 1、 用于细胞培养 ①_x0001_ 根据实验需要Poly-L-lysine Solution 稀释至适当浓度溶液后即可使用。不同的细胞，Poly-L-lysine Solution 包被(Coating)的时间和浓度，甚至稀释液的选择有所不同，请自行参考相关文献进行适当的包被。 ②Poly-L-lysine Solution 用于细胞培养时，包被至少5min ，有些实验需要包被1～2h ，有些情况则需要包被过夜。 ③包被完成后，吸Poly-L-lysine Solution ，干燥培养器皿，至肉眼观察完全干燥。通风橱内吹风数分钟即可完成干燥，对于有些实验则需要干燥2h 或更长时间。干燥时间较长通常会更加有利于后续的细胞粘附。 ④进行细胞培养，也可以用水、PBS 或培养液等适当溶液润洗后再进行细胞培养。 2、 用于核酸杂交 ①_x0001_ 方法一：取事先准备好的载玻片或盖玻片经冷却至室温，在Poly-L-lysine Solution 上下浸蘸几下，自然干燥，4℃备用，亦可室温保存1个月。 ②_x0001_ 方法二：Poly-L-lysine Solution 涂于玻片上，自然干燥后即可使用，可用于细胞涂片和切片。 ③_x0001_ 方法三：滴加5～10μl Poly-L-lysine Solution 至玻片上，用另一盖玻片以血涂片方法推片或用另一玻片紧贴于其上，相互摩擦以使两玻片相对的一面涂布上明胶包被溶液。 编号 名称 IH0095 Storage Poly-L-lysine Solution(1mg/ml,无菌) 10ml -20℃ 避光 使用说明书 1份
配制0.01%的多聚赖氨酸: 首先买来sigma 公司的多聚赖氨酸，如是25mg，就需要250ml三蒸水，用移液管将少量三蒸水加到多聚赖氨酸的小塑料瓶中，然后将溶解的多聚赖氨酸加到200ml左右三蒸水中，(已置烧杯中)。最后加三蒸水达250ml，过滤除菌分装与小瓶中即可。保存于-20度，近期用的话可放于4度冰箱内保存。注意每一小瓶的量不要太满，若20ml的瓶子，只装15ml可，若太满，放于-2度有可能会将瓶子弄碎，因冻后体积增加。(我就有这个教训) 另外烧杯，小瓶、移液管都要灭菌处理的，泡酸高压什么的。我们用的是一种用注射器过滤的过滤器，一次性的。一个能最多有效过滤200ml。 铺板的操作:首先要在消毒实验室，包括超净台，紫外消度20-30分钟。消毒后30分钟进入实验室。事先准备100ml三蒸水，经高压灭菌处理。具体细节就不多说了。 首先打开板子，用消毒好的试管将0.01%的多聚赖氨酸加入每一孔中，大概每孔3-4滴吧。将板子盖好放到培养箱中(37度 5%CO2)30分钟。 取出板子，用吸管将多聚赖氨酸吸出。换吸管，加入三蒸水，冲洗三次，即将每孔内加入三蒸水，没过底，多点也行。再将水吸出来。反复三次。注意换吸管，要无菌操作的。 最后将铺好的板子放于培养箱待用。 如果你做免疫组化，需要放小的玻片到孔内，就在加多聚赖氨酸之前用无菌的镊子将无菌的玻片夹到孔内即可。 我曾用过多聚赖氨酸包被培养瓶,但浓度是0.1mg/ml,我都是放一夜,第二天吸 掉晾干就用,当然要紫外消一下.我觉得时间长点没什么大碍。 我们这里的老师说，多聚赖氨酸不能用紫外线照射。
1.用赖氨酸包被培养板和培养瓶时，应该选用多聚左旋赖氨酸(分子量为15-30万) ； 2.感觉你“浓度为50ng/1ml”有些低，我一般最后多聚赖氨酸使用浓度达到20－30ug/ml； 3.包被时间一般为6－7h，或者过夜也可； 4.使用时应该先用灭菌水洗三次＋PBS（起平衡盐作用）洗一次，洗液的量应该大于包被液的量； 5.“多聚赖氨酸可以在培养瓶中放多长时间，太长了会有影响吗？”，我包被时间最长的经历有过48h,最后只是多聚赖氨酸随着时间延长蒸发一些而量变少了，但是对细胞生长并无大碍，这是我曾经有过的经历，所以我会负责地告诉你； 6.“多聚赖氨酸能在4度冰箱里放多久？”，最好置于－20度保存，放置数月 乃至半年都可以。 我问过博士德公司，他们分装的多聚赖氨酸是用来作免疫组化的，没有做过细胞培养实验，他们不保证能否用在细胞培养中，建议你买其他公司的吧，有固体的，分子量为15-30万，我们实验室用浓度0.01%的来促进神经细胞贴壁。 我们用的多聚赖氨酸浓度为100ug/ml,一般包被3-4小时即可用.我们包被完后 一般放在培养箱里,临用时拿出来洗三次，吹干即可．如果不急着用，放在培养箱里较长时间也没关系，把瓶盖拧紧即可，我最长放了２星期也没有问题。 左旋和右旋的多聚赖氨酸都可以用于包被细胞培养器具,主要看你的细胞贴壁能力如何,左旋的更利于细胞贴壁.我们一般使用0.01%浓度的,包被过夜,第二天 用双蒸水洗两三次,超净台紫外照射,风干。可以直接买sigma的原装粉剂自己配。还有,配好的多聚赖氨酸在4度时间不能放置太久,大概就一两周吧。存放于-20度中的一般为0.1%的,而且不能反复冻融,只能融化一次。最好是配好后分装。
赖氨酸发酵生产 摘要：赖氨酸是人体必需的八大氨基酸之一，能促进人体发育、增强免疫功能，并有提高中枢神经组织功能的作用。赖氨酸为碱性必需氨基酸。由于谷物食品中的赖氨酸含量甚低，且在加工过程中易被破坏而缺乏，故称为第一限制性氨基酸。将赖氨酸添加到食品中能大大提高蛋白质的利用率，又是一种优良的食品强化剂。因此研究赖氨酸的生产有着很高的价值。关键词： 简介： 赖氨酸是一种碱性氨基酸，是仅次于谷氨酸的第二大氨基酸产品，是谷物蛋白的第一限制性氨基酸，在谷物食料中添加适量的赖氨酸，其蛋白质的生物价大大提高。 赖氨酸的应用范围很广。①作为食品强化剂；②作为药物可用作肝细胞再生剂，对改善肝功能，治疗肝硬化、高氨症，增进食欲、改善营养状况有明显的疗效；③作为饲料添加剂，在畜、禽类的饲料中添加少许的赖氨酸，对家禽、家畜的日增重、料肉比、家禽的产卵量等方面效果尤为显著。 1．赖氨酸发酵机制 赖氨酸合成途径的调节机制 （1）谷氨酸优先合成，谷氨酸合成过剩就会抑制谷氨酸脱氢酶（GD）的活性，使得生物合成的代谢流转向天门冬氨酸。天门冬氨酸的过剩也会抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性，使得天门冬氨酸不致大量积累。 （2）赖氨酸的前体物质天门冬氨酸与乙酰辅酶A的生成形成平衡合成，乙酰辅酶A的增加能逆转天门冬氨酸对其自身合成的反馈抑制。 （3）天门冬氨酸激酶（AK）受赖氨酸与苏氨酸的协同反馈。AK是一个变构酶，催化天门冬氨酸和ATP形成α-天门冬氨酸磷酸，有两个变构位置可以接受末端产物。AK受赖氨酸与苏氨酸的协同抑制，当只有赖氨酸或苏氨酸与变构位置结合时，酶活影响不大，当赖氨酸与苏氨酸同时结合到两个变构位置时，酶活受到强烈的抑制。此外，AK是赖氨酸合成途径中唯一的反馈调节点。 （4）赖氨酸亮氨酸的生物合成之间存在着代谢互锁，赖氨酸分支途径的初始酶二氢吡啶二
各种氨基酸的生产工艺 1、谷氨酸 (1)等电离交工艺方法——从发酵液中提取谷氨酸，即将谷氨酸发酵液降温并用硫酸调PH值至谷氨酸等电点(pH3.0- 3.2)，温度降到10 以下沉淀，离心分离谷氨酸，再将上清液用硫酸调pH至1.5上732强酸性阳离子交换树脂，用氨水调上清液pH10进行洗脱，洗脱下来的高流分再用硫酸调pH1.0返回等电车间加入发酵液进行等电提取，离交车间的上柱后的上清液及洗柱水送去环保车间进行废水处理。 该工艺方法的缺点是：废水量大，治理成本高，酸碱用量大。 (2)连续等电工艺——将谷氨酸发酵液适当浓缩后控制40℃左右，连续加入有晶种的等电罐中，同时加入硫酸，控制等电罐中PH值维持在3.2左右，温度40℃进行结晶。 该工艺方法废的优点是：水量相对较少；缺点是：氨酸提取率及产品质量较差。 (3)发酵法生产谷氨酸的谷氨酸提取工艺——谷氨酸发酵液经灭菌后进入超滤膜进行超滤，澄清的谷氨酸发酵液在第一调酸罐中被调整pH值为3.20～3.25，然后进入常温的等电点连续蒸发降温结晶装置进行结晶，分离、洗涤，得到谷氨酸晶体和母液，将一部分母液进入脱盐装置，脱盐后的谷氨酸母液一部分与超滤后澄清的谷氨酸发酵液合并；另一部分在第二调酸罐中被调整pH值至4.5～7，蒸发、浓缩、再在第三调酸罐中调pH值至3.20～3.25后，进入低温的等电点连续蒸发降温结晶装置，使母液中的谷氨酸充分结晶出来，低温的等电点连续蒸发降温结晶装置排出的晶浆被分离、洗涤，得到谷氨酸晶体和二次母液。(4)水解等电点法 发酵液-----浓缩（78.9kPa，0.15MPa蒸汽）----盐酸水解（130 ℃，4h ）----过滤-----滤液脱色-----浓缩-----中和，调pH至3.0-3.2（NaOH或发酵液） -----低温放置，析晶-------谷氨酸晶体 此工艺的优点：设备简单、废水量减少、生产成本低、酸碱用量省 (5)低温等电点法 发酵液-----边冷却边加硫酸调节pH4.0-4.5-----加晶种，育晶2h-----边冷却边加硫酸调至pH3.0-3.2------冷却降温------搅拌16h------4 ℃静置4h------离心分离 --------谷氨酸晶体 此工艺的优点：设备简单、废水量减少、生产成本低、酸碱用量省 (6)直接常温等电点法 发酵液-----加硫酸调节pH4.0-4.5-----育晶2-4h-----加硫酸调至pH3.5-3.8------育晶2h------加硫酸调至pH3.0-3.2------育晶2h------冷却降温------搅拌16-20h------沉淀2-4h-------谷氨酸晶体 此工艺的优点：设备简单、操作容易、生产周期短、酸碱用量省。 2、L-亮氨酸 （1）浓缩段 原料：蒸汽 将一次母液通入浓缩罐内，通入蒸汽，温度120度，气压-0.09Mpa，浓缩时间6h，结晶。终点产物：结晶液（去一次中和段） （2）一次中和段 辅料：硫酸，纯水 结晶液进入一次中和罐，通入硫酸，纯水，温度80，中和时间4h，过滤 终点产物：1，滤液（回收利用）2，滤渣（去氨解段）
目录 摘要................................................................ VI Abstract ............................................................... VII 第一章绪论. (1) 1.1赖氨酸简介 (1) 1.2赖氨酸的性质 (1) 1.3赖氨酸的发展现状 (2) 1.4赖氨酸的作用及缺乏症 (2) 1.5赖氨酸的生产方法 (2) 1.4.1二步发酵法 (2) 1.4.2直接发酵法 (3) 1.6赖氨酸的提取与精制 (3) 1.7电渗析的原理 (3) 1.8生物工业下游技术的一般工艺过程 (4) 第二章赖氨酸的生产工艺流程 (6) 2.1赖氨酸生产工艺概述 (6) 2.2赖氨酸生产工艺流程图 (6) 2.3原料预处理及淀粉水解糖的制备 (6) 2.3.1赖氨酸的发酵生产法 (6) 2.3.2原料的预处理 (8) 2.3.3淀粉水解糖的制备 (8) 2.4种子扩大培养 (8) 2.5赖氨酸发酵工艺条件控制 (9) 2.6赖氨酸的提取 (10) 2.7赖氨酸的精制 (10)
第三章工艺计算 (11) 3.1物料衡算 (11) 3.1.1工艺技术指标 (11) 3.1.2赖氨酸发酵车间物料衡算 (12) 3.1.3年产4000t赖氨酸厂发酵车间物料衡算结果汇总 (14) 3.1.4年产4000t赖氨酸提取车间物料衡算 (16) 3.2热量衡算 (17) 3.2.1淀粉液化工序的热量衡算 (17) 3.2.2液化液糖化过程的热量衡算 (18) 3.2.3发酵车间热量衡算 (19) 3.2.4赖氨酸溶液浓缩结晶过程的热量衡算 (21) 3.2.5赖氨酸干燥过程的热量衡算 (23) 3.2.6年产4000t赖氨酸厂热量衡算结果汇总 (24) 3.3过程水的衡算 (25) 3.3.1糖化工序用水量 (25) 3.3.2连续灭菌工序的用水量 (25) 3.3.3发酵工序的用水量 (26) 3.3.4提取工序的用水量 (26) 3.3.5中和脱色工序的用水量 (26) 3.3.6精制工序的用水量 (26) 3.3.7动力工序的用水量 (26) 3.3.8年产4000t赖氨酸水量衡算结果汇总 (26) 3.4无菌空气消耗量的计算 (27) 3.4.1无菌空气消耗量计算的方法和步骤 (27) 3.4.2年产4000t赖氨酸厂无菌空气计算 (29)
Poly-lysine-coated tissue culture surfaces 1. To coat coverslips: Prepare a stock solution by dissolving 25 mg/ml polylysine in 4.73 ml water (both poly-L-lysine and poly-D-lysine are used to coat tissue culture surfaces; check specific protocol for choice of isomer) and filter sterilize through a 0.22-μm filter. Store in 100-μl aliquots at -20°C. When ready to use, dilute one aliquot in 40 ml water to prepare 13 μg/ml working solution. Sterilize coverslips by autoclaving prior to coating. Dip coverslips in the working solution, then incubate 15 min to several hours in a humidified 37°C, 5% CO2 incubator. Allow surface to dry. 2. To coat culture dishes: 多聚赖氨酸包被培养皿/板 Prepare a stock solution by dissolving 100 mg poly-lysine in 100 ml water (both poly-L-lysine and poly-D-lysine are used to coat tissue culture surfaces; check specific protocol for choice of isomer) and filter sterilize through a 0.22-μm fil ter. 配制1mg/ml储存液 Store in 5-ml aliquots at -20°C. 分装保存在-20度 When ready to use, dilute 1 part stock solution with 9 parts water to prepare 100 μg/ml working solution. 使用前按1：10稀释成100μg/ml工作浓度。用5-10ml一次性无菌注射器和0.22μm 滤器过滤除菌，备用。 Fill tissue culture dishes or slide wells with the working solution and incubate 1 hr in a humidified 37°C, 5% CO2 incubator, then remove solution by vacuum aspiration and allow surface to dry.
本技术涉及发酵领域，具体提供了一种L赖氨酸的发酵方法，在赖氨酸一级种子培养基、赖氨酸二级种子培养基和赖氨酸发酵培养基中添加醋酸 盐，并优化了上述各培养基的配方和发酵工艺。本技术所提供的发酵方法，能够促进产赖氨酸菌体的生长和赖氨酸的合成，显著提高终点赖氨酸含 量、总酸量及糖酸转化率，并显著缩短发酵周期。 技术要求 1.一种L-赖氨酸的发酵方法，其特征在于，在赖氨酸一级种子培养基、赖氨酸二级种子培养基和赖氨酸发酵培养基中添加醋酸盐。 2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)赖氨酸一级种子培养：赖氨酸摇瓶种子接入赖氨酸一级种子培养基在一级种子罐中培养，一级种子罐中硫酸铵的初始浓度为8-12g/L，当一级种 子培养基中总糖浓度下降至8-15g/L时，停止培养，得成熟赖氨酸一级种子液； (2)赖氨酸二级种子培养：将成熟赖氨酸一级种子液接入赖氨酸二级种子培养基在二级种子罐中培养，二级种子罐中硫酸铵的初始浓度为10- 15g/L，当二级种子培养基中还原糖浓度下降至5-8g/L时，停止培养，得成熟赖氨酸二级种子液； (3)赖氨酸发酵培养：将成熟赖氨酸二级种子液接入赖氨酸发酵培养基中，在流加葡萄糖溶液和硫酸铵溶液的条件下，在发酵罐中发酵培养，发酵 罐中的硫酸铵初始浓度为9-14g/L，培养40-44小时，得到L-赖氨酸。 3.根据权利要求1或2所述的发酵方法，其特征在于，所述赖氨酸一级种子培养基包括：蔗糖20-40g/L，硫酸镁0.5-1.5g/L，磷酸二氢钾0.5-1.5g/L， 硫酸铵8-12g/L，酵母浸粉5-10g/L，苏氨酸0.4-0.6g/L，蛋氨酸0.4-0.6g/L，味精7-10g/L，丙酮酸钠0.5-0.8g/L，醋酸盐1-3g/L。 4.根据权利要求1或2所述的发酵方法，其特征在于，所述赖氨酸二级种子培养基包括：葡萄糖60-80g/L，硫酸镁0.5-1.5g/L，磷酸二氢钾0.5- 1.5g/L，硫酸铵10-15g/L，玉米浆水解液1-1.5g/L，毛发水解液1-1.5g/L，甜菜糖蜜10-15ml/L，苏氨酸0.4-0.6g/L，蛋氨酸0.4-0.6g/L，醋酸盐1-3g/L。 5.根据权利要求1或2所述的发酵方法，其特征在于，所述赖氨酸发酵培养基包括：葡萄糖20-40g/L，硫酸镁0.5-1.5g/L，磷酸0.3-0.5ml/L，硫酸铵9- 14g/L，玉米浆水解液0.5-1g/L，毛发水解液0.5-1g/L，甜菜糖蜜10-15ml/L，甜菜碱0.5-0.8g/L，醋酸盐1-3g/L。 6.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，步骤(3)流加葡萄糖溶液和硫酸铵溶液的方法为：发酵培养过程中每2-4h取样测发酵液的还原糖浓 度和氨氮浓度，当发酵液中的还原糖浓度下降至4-8g/L时，开始流加质量体积浓度为50-60％葡萄糖溶液并维持发酵液的还原糖浓度为4-8g/L，当 发酵液中的氨氮浓度下降为1-2g/L时，开始流加质量体积浓度为40-45％硫酸铵溶液并维持发酵液中的氨氮浓度为1-3g/L。 7.根据权利要求6所述的发酵方法，其特征在于，流加质量体积浓度为40％的硫酸铵溶液。 8.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，步骤(1)赖氨酸摇瓶种子的接种量为赖氨酸一级培养基体积的1-3‰，培养过程中控制溶氧30％- 50％。 9.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，步骤(2)成熟赖氨酸一级种子液的接种量为赖氨酸二级培养基体积的2-5％，培养过程中控制溶氧 30％-50％。 10.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，步骤(3)成熟赖氨酸二级种子液的接种量为赖氨酸发酵培养基体积的10-15％，培养过程中控制溶 氧25％-40％。 技术说明书 一种L-赖氨酸的发酵方法 技术领域 本技术属于微生物发酵领域，具体地说，涉及一种发酵生产L-赖氨酸的方法。 背景技术 L-赖氨酸为碱性必需氨基酸，同时也是人体和动物所不能合成的八种必需氨基酸中最重要的一种，故常称为第一限制性氨基酸。人体必需通过日常饮食和补赖氨酸含量甚低，且在加工过程中易被破坏，造成赖氨酸缺乏。 L-赖氨酸在医药工业、食品工业、畜牧饲料等领域都有着广泛的应用。在谷类为主的食品中添加一定量的L-赖氨酸，可提高其蛋白质的吸收率和营养价值；在高饲料的利用率；在医药工业上，L-赖氨酸一般被用作氨基酸输液，可以作为治疗铅中毒的药物、利尿的辅助治疗剂、血栓预防剂。
多聚赖氨酸的配置、保存、使用 一、常用的多聚赖氨酸包被可以用三蒸水，或者PBS，浓度一般为用 0.1 mg/ml进行包被。 二、其他常用包被方法比较(以各种免疫分析为例)： .snap 三、我配成1mg/ml的储存液，用Mini-Q(超纯水)配制，放在－20℃储存，使用时稀释10倍（也用超纯水），即终浓度100ug/ml，过滤后使用。工作液过滤使用，如一次用不完，放在4℃储存。 多聚赖氨酸在水溶液中易分解，所以一次不要配太多工作液。 四、我现在要配多聚赖氨酸,书上写的用PBS配,但没写PH,浓度，向各位请教。 答： PH应该在 7.0~ 7.4，PBS： 取氯化钠 7.650 g，无水磷酸氢二钠 0.724 g，磷酸二氢钾 0.210g溶于蒸馏水1000 mL中，以1N氢氧化钠溶液调pH值为 7.0~ 7.4，经121℃灭菌15分钟
五、我准备用多聚赖氨酸涂片培养细胞,不知道多聚赖氨酸涂过的玻片如何灭菌？能否干烤灭菌？ 答： Sigma的产品说明书上写的很xx的。 另外，有本书上是这么写的，供参考： Poly-lysine-coated tissue culture surfaces To coat coverslips: Prepare a stock solution by dissolving 25 mg/ml polysine in 4.73 ml water (both poly-L-lysine and poly-D-lysine are used to coat tissue culture surfaces; check specific protocol for choice of isomer) and filter sterilize through a 0.22-μmfilter. Store in 100-μlaliquots at?20° C. When ready to use, dilute one aliquot in 40 ml water to prepare 13μg/mlworking solution.Sterilize coverslips by autoclaving prior to coating. Dip coverslips in the working solution, then incubate 15 min to several hours in a humidified 37°C, 5% CO2 incubator. Allow surface to dry.To coat culture dishes or 8-well chamber slides: Prepare a stock solution by dissolving 100 mg poly-lysine in 100 ml water (both poly-L-lysine and poly-D-lysine are used to coat tissue culturesurfaces; check specific protocol for choice of isomer) and filter sterilize through a 0.22-μmfilter.Store in 5-ml aliquots at ?20° C. When ready to use, dilute 1 part stock solution with 9 parts waterto prepare 100μg/mlworking solution. Fill tissue culture dishes or slide wells with the working solution and incubate 1 hr in a humidified 37°C, 5% CO2 incubator, then remove solution by vacuum aspiration and allow surface to dry. Store coated tissue culture ware up to 3 months at 4°
1TPM赖氨酸分离提取工艺设计 学生姓名： 学号： 指导教师： 专业名称：生物工程 完成时间： 2011年11月
目录 目录 (1) 第一章项目总论 (3) 1.1赖氨酸的简介 (3) 1.2赖氨酸的性质 (3) 1.3赖氨酸的作用 (3) 1.4赖氨酸的生产方法 (4) 1.4.1二步发酵法 (4) 1.4.2直接发酵法 (4) 1.5赖氨酸的提取精制 (4) 1.6生物工业下游技术的一般工艺过程 (5) 1.7离子交换原理 (5) 第二章技术方案 (1) 2.1产品方案 (1) 2.2发酵工艺流程示意图 (1) 2.3发酵过程工艺流程 (1) 2.3.1发酵法 (1) 2.3.2发酵液的预处理 (2) 2.3.3赖氨酸的提取 (2) 2.3.4浓缩和结晶 (2) 2.4工艺技术指标及基础数据 (2) 2.4.1主要技术指标如下表： (2) 2.4.2主要原材料质量指标 (3) 2.4.3二级种子培养基 (3) 2.4.4发酵培养基 (3) 2.5赖氨酸发酵车间的物料衡算 (3) 2.6热量衡算 (1) 2.6.1发酵过程中的冷却水耗量计算 (1) 2.6.2发酵过程中的无菌空气耗用量的计算 (1) 第三章发酵车间设备设计与选型 (1) 3.1发酵罐的选型 (1) 3.1.1发酵罐容积和台数的确定 (1) 3.1.2主要尺寸的计算 (1) 3.1.3发酵罐冷却面积的计算 (1) 3.1.4发酵罐搅拌器的设计 (1) 3.2电机的确定 (1)
3.2.1 计算Re m (1) 3.2.2计算不通气时的搅拌轴功率P O (1) 3.2.3计算通风时的轴功率Pg (1) 3.2.4求电机功率P电 (1) 3.3发酵罐设备结构的工艺设计 (1) 3.3.1空气分布器 (1) 3.3.2档板 (1) 3.3.3密封方式 (1) 3.3.4 冷却管布置 (1) 3.3.5发酵罐设备材料的选择 (1) 3.4种子罐的选型 (1) 3.4.1种子罐容积和数量的确定 (1) 3.4.2种子罐主要尺寸确定 (1) 3.4.3种子罐型号确定 (1) 3.5赖氨酸提取的树脂设计 (1) 第四章防污措施 (1) 4.1废水的处理 (1) 4.3废渣的处理 (1) 第五章结语 (1) 参考文献 (1)
兽医科技 收稿日期:2008-12-21;修回日期:2008-10-31 基金项目:中国农科院兰州畜牧与兽药研究所基金项目(MY JJ05-3) 作者简介:魏小娟(1976-),女,助理研究员,硕士. 用多聚赖氨酸作载体制备I VM 人工抗原的研究 魏小娟,张继瑜,张 梅,李剑勇,周绪正,李金善,牛建荣 (中国农业科学研究院兰州畜牧与兽药研究所中国农业科学院新兽药重点开放实验室,甘肃兰州730050)中图分类号:S852.4+ 3 文献标识码:B 文章编号:1004-7034(2009)01-0065-02 关键词:伊维菌素;人工抗原;多聚-L-赖氨酸 摘 要:采用N -羟基琥珀酰亚胺活性酯法和混合酸酐法,将伊维菌素(I V M )分别与多聚-L-赖氨酸(PLL)和卵清蛋白(OVA )连接制备人工免疫原5-O -(单)琥珀酰I V M -PLL 和包被原5-O -(单)琥珀酰I VM -OVA,经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析证实人工抗原合成成功。 伊维菌素(Lver m ecti n ,I V M )是大环内酯类杀虫、杀螨剂,由于其具有杀菌活性强以及杀菌谱广等特点已被广泛地应用于畜禽及水产养殖业,也是农业生产上广泛使用的一种杀虫剂。但此类药物在动物性产品中的残留严重影响到我国农产品的国际竞争力,同时也对人及环境存在潜在的威胁。 随着人们对I VM 残留的毒性及环境风险的日益关注,迫切需要简单、快速、高效的I V M 残留检测方法,但目前常用的H PLC 法检测的灵敏度较低,无法满足农产品中I V M 及其有毒代谢物的残留分析要求。为此,笔者根据I V M 的结构特点,采用N -羟基琥珀酰亚胺活性酯法和混合酸酐法将伊维菌素与载体蛋白偶联,成功地制备了伊维菌素完全抗原,为畜禽产品中伊维菌素残留的ELISA 检测奠定了基础。1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 伊维菌素 白色粉末,有效成分含量>98%(其中B 1a 含量约为92%,B 1b 含量约为18%),浙江海正药业有限公司提供。1.1.2 主要试剂 牛血清白蛋白(BSA )、卵清蛋白(OVA )、多聚-L -赖氨酸(PLL)、乙基二甲氨基碳化二亚胺盐酸盐(EDC ),Sig m a 公司产品;二甲基甲酰胺(DMF )、咪唑、琥珀酸酐、吡啶,北京化工厂生产;N -羟基琥珀酰亚胺(NH S)、叔丁基二甲基氯硅烷(t-Bu M e 2S i-C l),天津化学试剂公司生产;硅胶GF254(200~400目),青岛海洋化工厂生产;羊抗兔I gG-HRP ,北京鼎国生物公司生产。1.1.3 主要仪器 透析膜(Sig m a)、Sartorious 电子天平、95-1型磁力恒温搅拌器、DDY -6B 型电泳 仪、凝胶成像系统及分析软件(Syngene 公司)。1.1.4 试验动物 新西兰成年白兔,体重1.7~2.0kg ,购自中牧集团兰州生物制药厂。1.2 试验方法1.2.1 半抗原5-O -(单)琥珀酰I V M 的合成 以C 5-OH 为反应位点,在无水吡啶的催化下进行反应。取0.1g I VM 加2.0m L 无水吡啶溶解,加入0.05g 琥珀酸酐,45e 、磁力搅拌下避光反应12h ,反应物在3.6%HC l 和乙酸乙酯间分配,收集酯层减压浓缩;用二氯甲烷复溶残留物,TLC 分离产物(GF 254,展开剂C H 2C 12B TH F B HAC (90B 9.5B 0.5),共有4个条带,Rf 分别为1.0,0.5,0.3,0.2;分别刮取4条带,以乙酸乙酯淋洗,收集洗脱液,减压浓缩,真空干燥。1.2.2 人工抗原的合成 免疫抗原5-O -(单)琥珀酰I V M -PLL 的合成(NH S 法):取12m g 半抗原5-O-(单)琥珀酰I V M,加0.4mL D M F 溶解,再依次加入2.7m g NH S 和4.7m g EDC -HC l 混合,20e 避光搅拌10h ,将上述反应液逐滴加至6mL 含20m g PLL 的硼酸盐缓冲液(0.2mm ol/L ,p H 值为9.4)-10%DM F ;溶液开始略显混浊,最后有少量沉淀出现,继续搅拌1h ,再转至4e 条件下搅拌12h,产物经PBS (0.01m o l/L ,p H 值为7.2)透析72h,Sephdex G -200纯化。 包被原5-O -(单)琥珀酰I V M -OVA 的合成(混合酸酐法):取10m g 5-O-(单)琥珀酰I V M,用1mL D M F 溶解,加入15L L 氯甲酸异丁酯,20e 搅拌45m i n ,制成A 液;称取30m g 的OVA 溶于10m L 0.2m ol/mL 硼酸盐缓冲液(pH 值为9.4)中制成B 液。将A 液逐滴加入B 液,边加边搅拌,之后在4e 搅拌反应12h ,然后将混合物装入事先处理并在0.01m o l/m L PBS(p H 值为7.4)中浸泡过夜的透析袋中,在4e 、0.01m o l/mL PBS(p H 值7.4)中透析3d ,每天换2次透析液。1.2.3 半抗原和人工抗原的结构鉴定 半抗原的结 65 5黑龙江畜牧兽医62009年第1期
聚赖氨酸的研究进展 食品的腐败变质主要是指由于微生物的作用而导致食品质量下降或失去食用价值的一切变化，它直接影响食品的品质和消费者的健康。全世界每年约有10％～20％的农副产品、水产品、果蔬会腐败变质，经济损失巨大。如何防止食品的腐败变质越来越引起人们的重视，有关食品防腐剂的研究也日趋完善。 目前使用的防腐剂品种很多，美国有50多种，日本有43种，中国香港特区27种，主要为丙酸及盐类、山梨酸及钾盐、苯甲酸类、噻菌灵、对羟基苯甲酸酯类、以及新型生物防腐剂聚赖氨酸、鱼精蛋白、乳酸、链球菌素等。我国允许使用的约18种，主要品种有：苯甲酸钠、山梨酸及其钾盐、丙酸钙等，生物防腐剂的开发和应用尚处于起步阶段。苯甲酸系列、山梨酸系列、丙酸盐等这些防腐剂均为化学合成的防腐剂，对人体健康有一定影响。随着人们生活水平的日益提高，迫切需要更安全的防腐剂。日本开始使用聚赖氨酸、Nisin等以微生物发酵法生产的天然防腐剂替代传统的化学合成的防腐剂。 作为新型的天然防腐剂，ε-聚赖氨酸已于2003年10月被FDA批准为安全食品保鲜剂。迄今为止，ε-聚赖氨酸的微生物发酵在日本已实现工业化，年产千吨ε-聚赖氨酸的现代化工业装置已建成投产。但该技术在国内还处于实验室阶段，ε-聚赖氨酸生物防腐剂的开发和生产还处于起步阶段，如果能重点扶持这一技术，将会在未来几年创造出可观的经济效益。 1聚赖氨酸的性质 1977年日本学者S．Shima和H．Sakai在从微生物中筛选Dragendo~Positive(简写为DP)物质的过程中，发现一株放线菌No．346能产生大量而稳定的DP物质，通过对酸水解产物的分析及结构分析，证实该DP物质是一种含有25—30个赖氨酸残基的同型单体聚合物，称为ε-多聚赖氨酸(8一 PL)。研究证明由于ε-PL比α-PL有更强的抑菌活性，而且仅一多聚赖氨酸有一定毒性，目前在国际市场上ε-多聚赖氨酸作为食品防腐剂已经取代了α-多聚赖氨酸。其分子式如下： 1．1 ε-聚赖氨酸的理化性质 ε-聚赖氨酸为淡黄色粉末、吸湿性强，略有苦味，是赖氨酸的直链状聚合物。它不受pH值影响，对热稳定(120℃，20min)，能抑制耐热菌，故加入后可热处理。但遇酸性多糖类、盐酸盐类、磷酸盐类、铜离子等可能因结合而使活性降低。与盐酸、柠檬酸、苹果酸、甘氨酸和高级脂肪甘油酯等合用又有增效作用。分子量在3600—4300之间的ε-聚赖氨酸其抑菌活性最好，当分子量低于1300时，ε-聚赖氨酸失去抑菌活性。由于聚赖氨酸是混合物，所以没有固定的熔点，250℃以上开始软化分解。￡一聚赖氨酸溶于水，微溶于乙醇。对其表征进行红外光谱分析表明：在1680～1640cm -1和1580—1520cm-1有强吸收峰。 1．2 ε-聚赖氨酸的生物学性质 ε-聚赖氨酸是一种具有抑菌功效的多肽，这种生物防腐剂在80年代初由日本学者腾井正弘，平木纯首次应用于食品防腐。ε-聚赖氨酸能在人体内分解为赖氨酸，而赖氨酸是人体必需的8种氨基酸之一，也是世界各国允许在食品中强化的氨基酸。因此8一聚赖氨酸是一种营养型抑菌剂，安全性高于其他化学防腐剂，其急性口服毒性为5g/kg。 ε-聚赖氨酸抑菌谱广，对于酵母属的尖锐假丝酵母菌、法红酵母菌、产膜毕氏酵母、玫瑰掷孢酵母；革兰氏阳性菌中的耐热脂肪芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌；革兰氏阴性菌中的产气节杆菌、大肠杆菌等引起食物中毒与腐败的菌有强烈的抑制作用。刘慧等研究也表明：ε-聚赖氨酸对革兰氏阳性的微球菌，保加利亚乳杆菌，热链球菌，革兰氏阴性的大肠杆菌，沙门氏菌以及酵母菌的生长有明显抑制效果，聚赖氨酸与醋酸复合试剂对枯草芽胞杆菌有明显抑制作用。
附件1 ε-聚赖氨酸等4种食品添加剂新品种 一、ε-聚赖氨酸 英文名称：ε-polylysine 功能：防腐剂 （二）质量规格要求 1.生产工艺 由小白链霉菌( Streptomyces. Albulus)PD-1经过液体深层有氧发酵制得的食品添加剂ε-聚赖氨酸。 2.技术要求 2.1感官要求：应符合表1的规定。
附录 A 检验方法 A.1 安全警示 试验方法规定的一些试验过程可能导致危险情况。操作者应采取适当的安全和防护措施。 A.2 一般规定 本标准所用试剂和水，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和GB/T 6682—2008中规定的三级水。试验中所用标准滴定溶液、杂质测定用标准溶液、制剂及制品，在没有注明其他要求时，均按GB/T 601、GB/T 602、GB/T 603的规定制备。试验中所用溶液在未注明用何种溶剂配制时，均指水溶液。 A.3 鉴别试验 易溶于水，略带苦味。 A.4 ε-聚赖氨酸含量的测定 A.4.1 试剂和材料 A.4.1.1 硫酸钠溶液：0.30 mol/L。称取42.6 g硫酸钠溶解并定容至1000 mL，用乙酸调pH为4.0。 A.4.1.2 ε-聚赖氨酸标准贮备溶液：10.0 mg/mL。称取1.0 g ε-聚赖氨酸标准样品，溶解并定容至100 mL。 A.4.1.3 ε-聚赖氨酸标准溶液：1.0 mg/mL。移取10.0 mL ε-聚赖氨酸标准贮备溶液于100 mL容量瓶中，定容至100 mL。 A.4.2 仪器和设备 凝胶渗透色谱仪：配有紫外检测器。 A.4.3参考色谱条件 A.4.3.1凝胶柱：水相凝胶过滤色谱（7.8 mm ×300 mm）。 A.4.3.2检测温度：30 ℃。 A.4.3.3检测波长：210 nm。 A.4.3.4流速：0.5 mL/min。 A.4.3.5进样量：20 μL。 A.4.3 分析步骤 A.4.3.1 标准曲线的绘制 分别移取0.00 mL、5.00 mL、10.00 mL、15.00 mL、20.00 mL、25.00 mL ε-聚赖氨酸标准溶液至25 mL容量瓶中并定容，溶液经0.22 μm微孔滤膜过滤。打开色谱仪，并调至工作状态，待基线平稳后，依次将上述ε-聚赖氨酸标准溶液注 入凝胶柱中，进样量为20 μL，记录峰面积，以标准溶液中ε-聚赖氨酸的质量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。 A.4.3.2 试样测定 准确称取0.1 g试样，溶解定容至100 mL。配好的试样溶液经0.22 μm微孔滤膜过滤，进样量为20 μL，进行凝胶渗透色谱检测，记录峰面积，并根据标准曲线查得试样中ε-聚赖氨酸的质量。 A.4.4 结果计算 ε-聚赖氨酸含量的质量分数w，按公式（A.1）计算：
多聚赖氨酸溶液(10×PLL,1mg/ml) 简介： 多聚赖氨酸溶液英文名为Poly-L-lysine Solution 简称PLL 。Leagene Poly-L-lysine 为Poly-L-lysine hydrobromide ，分子式为L-Lys-(L-Lys)n-L-Lys ?xHBr ，分子量为150,000～300,000，CAS Number 25988-63-0。 PLL 是一种粘附剂，常用于载玻片的包被,可以直接稀释后用于细胞或组织培养方面的实验。分子量大于70,000的多聚赖氨酸可以促进细胞贴壁生长，本产品可以用于促进细胞的贴壁生长和核酸杂交，制备好的载玻片可4℃保存半年。 组成: 操作步骤(仅供参考)： 1、 用于细胞培养 ①_x0001_ 根据实验需要Poly-L-lysine Solution 稀释至适当浓度溶液后即可使用。不同的细胞，Poly-L-lysine Solution 包被(Coating)的时间和浓度，甚至稀释液的选择有所不同，请自行参考相关文献进行适当的包被。 ②Poly-L-lysine Solution 用于细胞培养时，包被至少5min ，有些实验需要包被1～2h ，有些情况则需要包被过夜。 ③包被完成后，吸Poly-L-lysine Solution ，自然干燥培养器皿，至肉眼观察完全干燥。通风橱内吹风数分钟即可完成干燥，对于有些实验则需要干燥2h 或更长时间。干燥时间较长通常会更加有利于后续的细胞粘附。 ④进行细胞培养，也可以用水、PBS 或培养液等适当溶液润洗后再进行细胞培养。 2、 用于核酸杂交 ①_x0001_ 方法一：取事先准备好的载玻片或盖玻片经160℃冷却至室温，在Poly-L-lysine Solution 上下浸蘸几下，自然干燥，4℃备用，亦可室温保存1个月。 ②_x0001_ 方法二：Poly-L-lysine Solution 涂于玻片上，自然干燥后即可使用，可用于细胞涂片和切片。 ③_x0001_ 方法三：滴加5～10μl Poly-L-lysine Solution 至玻片上，用另一盖玻片以血涂片方法推片或用另一玻片紧贴于其上，相互摩擦以使两玻片相对的一面涂布上明胶包被溶液。 编号 名称 IH0091 IH0091 Storage Poly-L-lysine Solution(1mg/ml) 10ml 50ml -20℃ 避光 使用说明书
赖氨酸的发酵调控研究 一、实验目的 1、了解赖氨酸发酵常用的发酵菌种。 2、掌握L-赖氨酸发酵的工艺控制过程和方法。 3、能熟练运用发酵过程的基本原理，根据实验的不同要求，正确的设计实验方 案，并按照实验方案进行实验研究 二、实验原理 赖氨酸的生产方法有水解法(已淘汰)、合成法、酶法和直接发酵法。直接发酵法合成的赖氨酸是一种次级代谢产物。微生物合成赖氨酸是诱导物的诱导调节、自身产物的反馈调节、自身产物的分解调节、以及细胞膜透性的调节等次级代谢调节综合作用的结果。谷氨酸棒杆菌合成赖氨酸的自身产物调节作用如图1所示。 图1 谷氨酸棒杆菌合成赖氨酸的自身产物调节作用
三、材料与分析方法 1、菌种 谷氨酸棒杆菌（编号10065，中国微生物菌种保藏管理中心）。 2、培养基 （1）斜面培养基：牛肉膏1.1%，蛋白胨1.0%，葡萄糖0.5%，NaCl 0.5%，琼脂0.2%，pH7.0，在0.1Mpa压力下灭菌20min。 （2）种子培养基：糖蜜2.0%，豆饼水解液0.5%，(NH4)2SO4 0.4%，CaCO3 0.5%，K2HPO4 0.1%，MgSO4 0.04%，pH7.0,，于250mL三角瓶内装25mL种子培养基, 在0.1Mpa压力下灭菌20min。 （3）发酵培养基：糖蜜20%，豆饼水解液1.0%，玉米浆（氮源）0.6%，(NH4)2 SO4 2%，K2HPO4 0.1%，MgSO4 0.05%，FeSO4 0.2%，MnSO4 0.2%，pH7.0，于250mL三角瓶装液25mL发酵液，在0.1Mpa压力灭菌20min。 3、分析方法 （1）丝氨酸的测定 采用变色酸-分光光度法测定（见附录1）。 （2）赖氨酸的测定 发酵液中赖氨酸含量的测定采用茚三酮比色法，并加以改进。吸取发酵液4mL, 6000r/min离心10min去菌体及杂质。取上清液2mL，加茚三酮试剂（A液：茚三酮1.25g溶于94mL乙二醇甲醚中；B液：CuCl2·2H2O 1.97g溶于32mL 0.1mol/L柠檬酸溶液中；将A、B两液混合，用蒸馏水定容到250mL）4mL，混合，在沸水浴加热20min，冷却后测定475nm处的吸光度值，通过查赖氨酸标准曲线得知发酵液中赖氨酸的浓度。 （3）菌体形态观察、菌种培养特性和菌种主要生理生化特性检查 参照《工业微生物试验技术手册》的方法.。 （4）高丝氨酸脱氢酶活力的测定 从图1 可知，天冬氨酸半醛在高丝氨酸脱氢酶的作用下可以转化为丝氨酸，因此，本实验以一定反应条件下，单位时间内生成的丝氨酸的量所需的酶作为一个酶活力单位（U）1U=1ug/min。 ①粗酶液的制备 取5ml发酵液5500g离心15min，用pH 7.5的0.25mmol的Tris-HCL缓冲液洗涤两次，超声波破碎10min，10000g离心15min得上清液即为粗酶提取液；