细菌产淀粉菌种分离与分子鉴定
摘要：淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，具有重要的经济利用价值。本实验
意在筛选产淀粉酶菌种，并进行16S rDNA的分子鉴定。通过分离纯化rRNA进行
测序，最终在数据库中查找确定所属类别。
关键字：枯草芽孢杆菌；rRNA；PCR法；序列测定
1 引言
土壤中含有各种微生物，其中包含淀粉酶的枯草芽孢杆菌。在淀粉作为唯一碳源的鉴别培养基中，只有能产生淀粉酶利用淀粉的菌体才能成为优势菌种。在含淀粉作为唯一碳源的鉴别培养基上的平板上，具有产淀粉酶能力的枯草芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，若菌落周围能形成淀粉水解圈，表明该菌具有产淀粉酶的能力。对于淀粉酶产生菌的筛选分析，强调注意微生物的安全性，防止筛选到一些对人体有害的病原微生物。细菌中的核糖体RNA分为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA,其中16S rRNA相对分子质量适中。16S rDNA 由可变区和恒定区组成，不同细菌的恒定区序列基本保守，而可变区序列因细菌而异，故可利用恒定区的序列设计引物将16S rDNA扩增出来，利用可变区序列的差异对不同的细菌进行分类。本文旨在筛选自然界中存在的淀粉酶产生菌，并对其16S rDNA进行序列分析得出菌的种属。
2 材料和方法
2.1 仪器与材料
2.1.1 材料
淀粉厂周围土壤
2.1.2 培养基
实验过程中所采用的培养基，自行配置。配置过程如下：
1）产淀粉酶菌分离培养基——可溶性淀粉2%；蛋白胨1%；酵母膏0.5%；
碳酸氢二钠0.5%；氯化钠0.01%；MgSO4·7H2O 0.01%；琼脂粉2%。配置好后维持PH为7.0-7.4,121℃高压灭菌20min。
2）菌体培养培养基——可溶性淀粉2%；蛋白胨2%；酵母膏0.5%；氯化钠0.01%；MgSO4·7H2O 0.01%。配置好后维持PH为7.0-7.4,121℃高压灭菌20min。
2.1.3 仪器
高压灭菌锅、恒温培养箱、pH仪、恒温水浴锅、电子天平、锥形瓶、试管、平板、涂布器、玻璃珠、摇床、革兰氏阳性细菌DHA提取试剂盒、细菌16S rRNA PCR鉴定试剂盒、PCR纯化试剂盒、移液枪。
2.2 方法
2.2.1细菌淀粉酶菌种的分离
按照产淀粉酶菌分离培养基配方制备200ml培养基，121℃高压灭菌30min，无菌室倒平板。称取0.1g土壤，加入装有10ml蒸馏水的三角瓶中（已灭菌），震荡三角瓶分散菌体，后置于80℃水浴约15min。吸取0.5ml菌液加入到4.5ml 蒸馏水当中混匀，得到10-1浓度的菌液，以此类推制备10-2、10-3浓度梯度菌液。分别吸取梯度浓度菌液100微升，均匀涂布在产淀粉霉菌分离平板上，37℃培养箱培养24h，最后取出培养好的平皿，在长出的菌落上滴加碘液，菌落周围若有无色透明圈出现，说明淀粉被水解，即菌株能产生淀粉酶。将产透明圈的菌接种后，摇甁培养进行分子鉴定。将产透明圈的菌点接种到另一淀粉平板，培养后第二天检测透明圈和照相。
2.2.2 细菌的16S rDNA分子鉴定
2.2.2.1革兰氏阳性菌基因组DNA的提取
挑取分离的产淀粉酶单菌落接种到10ml发酵培养基中37℃震荡过夜培养，然后按照革兰氏阳性菌DHA提取试剂盒指导提取细菌基因组DHA。经过琼脂糖凝胶电泳确认细菌的基因组DNA，控制电压在60-80V，电泳时间在45-60min，Marker为100bp Ladder DNA Marker,由11种长度在100bp至2000bp的DNA片段组成。
2.2.2.2 PCR扩增细菌16S rDNA基因片段并纯化
按照TaKaRa宝生物工程大连有限公司细菌16S rDNA菌种鉴定试剂盒说明
书进行，对16S rDNA基因片段进行PCR扩增。使用1%的琼脂糖凝胶进行PCR 产物电泳检测，确认PCR扩增细菌保守基因16S rDNA基因片段。最后按照Omega公司提供的PCR产物纯化试剂盒指导进行PCR产物的纯化，并将纯化产物送至测序公司进行测序。根据所测序列在NCBI数据库中进行同源性对比，所测序序列与数据库中已有的菌种16S rDNA PCR的相似度达99%以上，判断分离菌种属并确定微生物在进化中的位置。
3 结果与讨论
3.1细菌淀粉酶菌种的分离分析
图3-1 产淀粉酶菌种分离图
3.2细菌的16S rDNA分子鉴定分析
1）
图3-2 DNA提取后检测电泳图谱
2）
图3-3 PCR扩增细菌16S rDNA基因片段电泳图谱
3）
图3-4 PCR纯化结果电泳图谱
4）16S rDNA可变区序列的测定结果：
GGGCCATGCTAGCAGCTATAGTGTGAGTCTGAGCGCGACAGATGGGAGCTTGCTCCCT GA TGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATA ACTCCGGGAAACCGGGGCTAA TACCGGA TGGTTGTTTGAACCGCA TGGTTCAGACA TA
AAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGA TGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGA GGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACA CTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAA TCTTCCGC AA TGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGT AAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGT ACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAA TACGTAGGTGG CAAGCGTTGTCCGGAA TTA TTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGAT GTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCA 最终经过NCBI查序可知，实验所得序列与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
相似度极高，鉴定为杆状菌属。
（Bacillus subtilis strain NS178 16S ribosomal RNA gene, partial sequence）
4 总结与体会
经过一周的时间，这个实验算是顺利完成了。通过这样的一种实践形式，有
效地提高了我们的实验操作能力，对我们实验能力以及日后的毕业设计有相当的
促进作用。对于做实验，实验之前应当对实验的目的、原理、方法、操作步骤、
实验内容等有一个全面的了解，在实验过程中才能够有条不紊，顺利完成实验。
另外，对于涉及到一些比较危险的试剂的实验，应当对该试剂的特性有清楚的认
识，了解其操作注意事项，做好相应的预防措施。
参考文献
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从环境中分离产淀粉酶的芽孢杆菌 一、摘要 本文通过对土壤中细菌杀灭营养体芽孢萌发，并用由淀粉充当碳源的选择培养基培养分离，纯培养后通过镜检最后得到能产胞外淀粉酶的芽孢杆菌。 二、实验目的及要求 1、通过本实验的学习，使学生学习掌握从环境中分离产淀粉酶菌株以及菌株初步鉴定的方法； 2、巩固微生物分离纯化、细菌生理生化鉴定、染色观察等实验技能，对所学习过的微生物学实验方法进行综合技能训练； 3、培养学生综合利用微生物学、生物化学等相关知识，自行设计、实施并判断实验结果的能力。 4、要求学生根据所学知识自主设计实验方案，在实验方案通过审核后组织实施，最终要求获得产淀粉酶的菌株并对其进行初步的鉴定。 三、实验仪器设备 主要仪器：超净工作台、生化培养箱、电热干燥箱、高压蒸汽灭菌锅、水浴锅、显微镜、培养接种器具等 主要制剂：富集培养基、选择性培养基、5%的番红水溶液、卢戈氏碘液 四、实验方案设计 （一）实验原理 1、土壤中含有各种微生物，其中产胞外淀粉酶的芽孢杆菌含量在不同土壤中含量也不同，生物在适宜的的环境下生存得好，所以在淀粉厂附近的土壤中，能利用淀粉的微生物含量较高。 2、芽孢是菌体生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，芽孢最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。它帮助菌体度过不良环境，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞。 3、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产保外淀粉酶利用淀粉的的菌体能成为优势菌种。在淀粉选择培养基中，产胞外淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。 4、菌体可经简单染色后在显微镜下被判断出是否为杆菌 5、在含有淀粉鉴定培养基的平板上，具有产淀粉酶能力的芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色
实验六十淀粉酶产生菌株的筛选 实验项目性质：设计性 所涉及的知识点：无菌技术、富集培养、纯种分离、淀粉酶性质、酶活测定 计划学时：8学时 一、实验目的 1．掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。 2．巩固以前所学的微生物学实验技术。 3．掌握产酶微生物筛选的方法。 二、实验原理 α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。从自然界筛选菌种的具体做法，大致可以分成以下四个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定。 1、采样：即采集含菌的样品 采集含菌样品前应调查研究一下自己打算筛选的微生物在哪些地方分布最多，然后才可着手做各项具体工作。在土壤中几乎各种微生物都可以找到，因而土壤可说是微生物的大本营。在土壤中，数量最多的当推细菌，其次是放线菌，第三霉菌，酵母菌最少。除土壤以外，其他各类物体上都有相应的占优势生长的微生物。例如枯枝、烂叶、腐土和朽木中纤维素分解菌较多，厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤中淀粉的分解菌较多，果实、蜜饯表面酵母菌较多；蔬菜牛奶中乳酸菌较多，油田、炼油厂附近的土壤中石油分解菌较多等。 2、增殖培养（又称丰富培养） 增殖培养就是在所采集的土壤等含菌样品中加入某些物质，并创造一些有利于待分离微生物生长的其他条件，使能分解利用这类物质的微生物大量繁殖，从而便于我们从其中分离到这类微生物。因此，增殖培养事实上是选择性培养基的一种实际应用。 3、纯种分离 在生产实践中，一般都应用纯种微生物进行生产。通过上述的增殖培养只能说我们要分离的微生物从数量上的劣势转变为优势，从而提高了筛选的效率，但是要得到纯种微生物就必须进行纯种分离。纯种分离的方法很多，主要有：平板划线分离法、稀释分离法、单孢子或单细胞分离法、菌丝尖端切割法等。 4、性能测定 分离得到纯种这只是选种工作的第一步。所分得的纯种是否具有生产上所要求的性能，还必须要进行性能测定后才能决定取舍。性能测定的方法分初筛和复筛两种。 初筛一般在培养皿上根据选择性培养基的原理进行。例如要测定淀粉酶的活力可以把斜面上各个菌株一一点种在含有淀粉的培养基表面，经过培养后测定透明圈与菌落直径的比值大小来衡量淀粉酶活力的高低。 复筛是在初筛的基础上做比较精细的测定。一般是将微生物培养在三角瓶中作摇瓶培养，然后对培养液进行分析测定。在摇瓶培养中，微生物得到充分的空气，在培养液中分布均匀，因此和发酵罐的条件比较接近，这样，测得的结果更具有实际的意义。 三、实验用品 1．器材 （1）小铁铲和无菌纸或袋。
1. 菌落形态观察 观察菌落的大小、形状、隆起度、边缘、表面性状、颜色与透明度、质地和干湿度。 2. 革兰氏染色 按照革兰氏染色方法进行制片、初染、媒染、脱色、复染、干燥、镜检；干燥后，用油镜观察。 3. 鞭毛染色 挑取18~30 h新鲜平板培养物制备菌悬液，制片，室温自然干燥。滴加硝酸银染色A液覆盖3~5 min，用蒸馏水充分洗去A液，再滴加B液染色约1 min，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。自然干燥后用油镜观察。菌体呈深褐色，鞭毛显褐色。 4. 糖类分解试验 将被检菌接种于糖发酵培养基中，37℃培养2－3天。如果培养基变黄，说明产酸；如变黄的同时，还有气泡，说明既产酸又产气。培养基仍呈蓝色，说明未产酸。选取木糖、葡萄糖、半乳糖和蔗糖。 5. 吲哚（靛基质）试验 将待检菌种接种于邓享氏蛋白质的胨溶液中，37℃培养1－2天。于培养液中加入戊醇或二甲苯2－3ml，摇匀，静置片刻后，沿管壁加入试剂2ml，如出现红色沉淀，表示为阳性。 6. 淀粉水解试验 将LB琼脂加热融化，使冷到50℃，加入淀粉溶液，混匀后，倾注平板。将细菌划线接种于平板上，37℃培养24小时，生长后取出，在菌落处滴加革兰氏碘液少许，培养基呈深蓝色，能水许解淀粉的细菌菌落周围有透明环。 9. V－P试验 将被检菌接种于试验培养基中（葡萄糖、K2 HPO4、蛋白胨各5g，溶于1 000ml 水中，分装于试管中，0.075MPa灭菌10分钟），培养2－7天后，于培养物中加入1ml 10％的NaOH，混匀，再加入3－4滴2%氯化铁溶液。数小时后，培养基表面的下层出现红色者，为阳性。 10.甲基红（M.R）试验 接种细菌，于37℃培养2－7天后，于培养物中加入几滴甲基红酒精溶液（0.1g 甲基经溶于300ml 95%乙醇中，加蒸馏水至500 ml），如呈红色，表示阳性。 11. 柠檬酸盐利用试验 将被检菌接种到Simmons固体柠檬酸盐培养基上，37℃下培养2－4天，能利用柠檬酸盐的细菌表现为有细菌生长，培养基变为蓝色，不能利用柠檬酸盐的细菌不生长，培养基不变色。 12. 硝酸盐还原试验 将被检细菌接种于硝酸盐培养基中，37℃培养1－2天，每管中先加入甲试剂0.1ml，再加乙试剂数滴，如出现红色，表示阳性。 13. 接触酶试验 将1ml 3%的H2O2倾注于生长物（菌落或菌苔）上，有气泡（O2）发生者为阳性。也可于清洁小试管中加少量H2O2（30%），再用清洁无菌的细玻棒（或火焰封口的毛细管或镍铬做成的接种环）醮细菌少许，插入H2O2液面下，有气
实验一淀粉酶产生菌的筛选 一、实验要求： 1、写出完整的分离纯化淀粉酶产生菌的实验步骤； 2、写出分离培养基及其相关试剂所需的量、仪器、器皿所需的量； 3、掌握从土壤分离酵母菌的方法和技术，从样品中分离出所需菌株； 4、学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养淀粉酶产生菌的培养 条件和培养时间。 二、实验原理：用梯度稀释法来分离淀粉酶产生菌 三、实验材料： 1.培养皿、移液管、刮铲、显微镜等, 2.可选取厨房土壤、面粉加工厂和菜园土壤 ; 3.培养基与试剂 :牛肉膏、蛋白胨、NaCl 、可溶性淀粉、蒸馏水、琼脂粉。 四、实验步骤： 1、选定采土点后，铲去表土层2-3cm，取3-10cm深层土壤5g，装入灭过 菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌相的变化。 2、培养基的配置，(1) 分离培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀 粉 即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中再加入15g琼脂粉 pH调至7.2 121℃灭菌15min 待冷却至50℃左右时 于超净工作台倒平板。注: 先将可溶性淀粉加少量蒸馏水调成糊状 再加到溶化好的培养基中 调匀; (2) 分离培养基液体培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉,即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中 pH调至7.2,121℃灭菌15min。 3、取所采的土样5g加入到三角瓶中,加入无菌水45mL,30℃摇床振荡30min制成土 壤悬液 ,此时的稀释度为10-1。另取7支试管 分别记作10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8共8个梯度 每支试管内加入9mL无菌水。用无菌移液管从三角瓶中吸取1mL土壤悬液加入到10-2试管中混匀, 再从此试管中吸取1mL加入到10-2试管中, 依此类推直至10-7试管。分别从10-6、10-7、10-8三个稀释度的试管中吸取100uL悬液, 均匀涂布于分离培养基平板上, 于27℃培养1-2天，等长出菌落后, 将检测试剂卢戈氏碘液加入到平板中, 菌落周围形成水解圈的菌株即是产淀粉酶的菌株, 因淀粉遇碘变蓝色 ,如菌落周围有无色圈说明该菌能分解淀粉。将水解圈直径与菌落直径之比较大菌株,即产酶能力较强的菌株的进行编号。 4、纯化; 将保存的菌株用接种环沾取少量培养物至平板上, 并进行2-3次划线分离, 挑取单菌落至平板上, 培养后观察菌苔生长情况并镜检验证为纯培养。将纯化后产酶能力较强菌株保存至斜面培养基中培养.
实验一淀粉酶产生菌的筛选 及酶活力测定 指导老师：辛树权 生命科学学院08级生物技术（三）班豆豆 同组人：xx xxx 摘要：自然界是微生物的大本营，实验室微生物几乎都是从自然界中选育出来的。我们从学校的花坛中采集一些土壤样本，拿到实验室中，进行淀粉产生菌的筛选。利用土壤制成菌液，将其涂抹在牛肉膏蛋白胨培养基上进行纯化，再用淀粉培养基培养，最后通过淀粉透明圈的大小来判断淀粉产生菌产淀粉的能力。再使用分光光度计精确测量淀粉酶的酶活力。关键词：淀粉酶；分离；纯化；透明圈；酶活力；摇瓶；分光光度计 一、实验目的： 1、学习从土壤中分离微生物的方法； 2、学习淀粉酶产生菌的筛选方法 3、了解分光光度计法测定酶活力的原理及方法。 二、实验原理： 土壤中含有大量的微生物，将土壤稀释液涂在不同类型的培养基上，在适宜的环境中培养几天，细菌或者是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养集中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。故在淀粉培养基上长出的菌便是淀粉产生菌。在培养基上滴碘液，淀粉被分解掉的部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断菌种产淀粉的能力。
淀粉酶是指一类能催化分解淀粉分子中糖苷键的酶的总称，主要包括α－淀粉酶和β-淀粉酶等，α-淀粉酶可从淀粉分子内部切断淀粉的α-1,4糖苷键，形成麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，是淀粉的粘度下降，因此又称为液化型淀粉酶。淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。随着酶的不断分作用，淀粉长链被切断，生成小分子的糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定α-淀粉酶的活力。 三、实验器材及试剂： 1.、材料：长春师范学院家属楼前小菜园 2培养基： （1）分离培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、溶于1000mL蒸馏水中，再加入15g琼脂粉，pH调至7.2，121℃灭菌15min，待冷却至50℃左右时，于超净工作台倒平板） （2）筛选培养基：淀粉培养基（可溶性淀粉 20g, 硝酸钾 1g, 磷酸氢二钾 0.5g, 氯化钠 0.5g, 硫酸镁 0.5g, 硫酸亚铁 0.01g, 琼脂 20g, 水 1000毫升，调整pH值到7.2～7.4。） （3）摇瓶培养：淀粉培养液。 3、试剂： 碘液、2%可溶性淀粉、pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液、 0.5mol/L乙酸、0.85%生理盐水。 4、器材： 培养皿、锥形瓶、高压灭菌锅、超净工作台、恒温水浴锅、分光光度计。
痢疾杆菌的分离与鉴定 濮阳市疾病预防控制中心 许银怀 第一节概述 志贺菌属（Shigellae）细菌又称痢疾杆菌，引起人类及灵长类动物细菌性痢疾。 1899年由日本人志贺首先发现。 全球每年感染人次约为1.65亿，死亡110万，发病率、死亡率居感染性腹泻之首位。 发展中国家发病率较高，如阿根廷990.6／10万、印度972.3／10万；发达国家相对较低，如美国6～12／10万、德国2.7／10万、法国0.3／10万；我国上世纪50～80年代发病率在46.37～1018.93／10万之间。 近20年痢疾发病率在法定传染病中由第一位降至第三位，但在卫生状况不良的地区，发病率仍居高不下。 人群对细菌性痢疾普遍易感，各年龄组均可受到感染，5岁以下儿童发病率最高。 据估计，在临床就诊的腹泻病人中的5%～15%是志贺菌引起的，而因腹泻死亡病例中有75%是志贺菌感染造成的。 发展中国家福氏志贺菌最常见，发达国家以宋内志贺菌为主。美国
宋内志贺菌>75%，但在男-男性行为人群仍以福氏志贺菌常见。 鲍氏志贺菌最先在印度发现，除印度次大陆地区较为常见外，其它地区较为少见。 细菌性痢疾发病有明显的季节性，发病高峰为夏秋季，通常在7～9月份。 细菌性痢疾防治仍需探索、研究内容： 细菌性痢疾在不同地区、不同人群的发病强度、分布特征、病原学特点缺乏全面、准确的数据； 缺乏快速、简便的病原学诊断方法，细菌性痢疾漏诊和误诊现象普遍； 志贺菌耐药性谱的不断扩大，细菌性痢疾抗菌治疗难度加大； 洗手、母乳喂养、安全饮水、粪便无害化处理等行之有效的干预措施的落实需要强化； 目前所用痢疾菌苗免疫保护效果仍需进一步评价。 第二节病原学 一、抗原分类 志贺菌属细菌有菌体（O）抗原，某些新分离菌株有表面（K）抗原。 (一) 菌体（O）抗原 1.型特异性抗原：多糖，光滑型菌株主要抗原；分A、B、C、D 4个群及35个抗原型。 2.群特异性抗原：光滑型菌株次要抗原，主要存在于B群，籍此将菌型分
土壤淀粉酶产生菌的分离纯化及相关性质测定 摘要：为了了解土壤中微生物的种类和特征并从中分离出淀粉酶产生菌，对其进行纯化和培养，并测定其产生的淀粉酶的活性以及对其进行生理生化试验，了解其代谢特征，需要进行一系列的实验，并在此过程中掌握分离纯化微生物、微生物液体培养法、透明圈法测定淀粉酶活力以及生理生化试验的操作方法和原理。主要实验过程如下：从土壤中筛选淀粉酶产生菌后进行复筛，接着进行种子培养，所得发酵液用于淀粉酶活力的测定以及生理生化反应。 关键词：土壤淀粉酶产生菌分离纯化发酵培养透明圈法生理生化试验 正文： 1、土壤淀粉酶产生菌的分离与纯化 1.1 实验原理 在自然条件下，微生物常常在各种生态系统中群居杂聚。为了研究某种微生物的特性，或者大量培养和利用某一种微生物，必须事先从有关的生态环境中分离出所需的菌株，获得纯培养。获得纯培养的方法称为微生物的纯种分离法，也即是从含有多种杂居在一起的微生物材料中，通过稀释分离、划线分离、单孢子分离等方法，使它们分离成为单个个体并在固定培养基的固定地方繁殖成为单个菌落，从单个菌落中挑选所需纯种。不同微生物可用不同培养基和不同培养条件进行单菌分离获得纯种，纯种再经繁殖培养后，可用于进一步研究形态、生理等欲从含有多种微生物的样品中直接辨认出，并且取得某种所需微生物的个体进行纯培养，那是困难的。由于微生物可以形成菌落，而每个单一菌落常常是由一种个体繁殖而成。不同微生物的菌落是可以识别和加以鉴定的。因此将样品中不同微生物个体在特定的培养基上培养出不同的单一菌落，再从选定的某一所需菌落中取样，移植到新的培养基中去，就可以达到分离纯种的目的。这就是纯种分离法的原理。 在微生物的分离和纯种培养过程中，必须使用无菌操作技术。所谓无菌操作，就是在分离、接种、移植等各个操作环节中，必须保证在操作过程中杜绝外界环境中的杂菌进入培养的容器。 淀粉是有葡萄糖通过α-1,4糖苷键构成的直链淀粉和α-1,6位有分支的直链淀粉组成的。按照水解方式的不同，主要的淀粉酶可以分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶4大类。产淀粉酶的微生物有细菌、霉菌和酵母等。利用淀粉遇碘变为蓝色的特性，将分离的微生物接种在含有淀粉的固体培养基表面进行培养，利用滴加碘液后菌落周围出现透明圈，未水解的淀粉呈蓝色，
α-淀粉酶产生菌的研究进展综述 1309030202 刘铭迪 【摘要】：α-淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中,能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等,是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。目前,α-淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业。本文对α-淀粉酶产生菌的研究进展进行了相关综述。 【关键词】：α淀粉酶产生菌；耐受；性质；应用 【正文】：α一淀粉酶(α一1，4一D一葡萄糖一葡萄糖苷水解酶)普遍分布在动物、植物和微生物中，是一种重要的淀粉水解酶。它以随机作用方式切断淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子内的α一1，4葡萄糖苷键，产生麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广的酶制剂之一。它可以由微生物发酵制备，也可以从动植物中提取。不同来源的α淀粉酶的性质有一定的区别，工业中主要应用的是真菌和细菌α一淀粉酶。目前，α一淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业，是一种重要工业用酶。如在淀粉加工业中，微生物α一淀粉酶已成功取代了化学降解法；在酒精工业中能显著提高出酒率。其应用于各种工业中对缩短生产周期，提高产品得率和原料的利用率，提高产品质量和节约粮食资源，都有着极其重要的作用。 1、α一淀粉酶的性质 不同来源的α一淀粉酶的酶学和理化性质有一定的区别，它们的性质对在其工业应用中的应用影响也较大，在工业生产中要根据需要使用合适来源的酶，因此对淀粉酶性质的研究也显得比较重要。目前关于不同来源仅一淀粉酶性质的研究已经很多，但将它们进行完整归纳的比较少，本文将其性质进行总结，为以后α一淀粉酶的应用提高相关依据。 1．1 底物特异性 α一淀粉酶和其它酶类一样，具有反应底物特异性，不同来源的淀粉酶反应底物也各不相同，通常α一淀粉酶显示出对淀粉及其衍生物有最高的特异性，这些淀粉及衍生物包括支链淀粉、直链淀粉、环糊精、糖原质和麦芽三糖等。 1．2 最适pH和最适温度 反应温度和pH对酶活力影响较大，不同来源的α一淀粉酶有各自的最适作用pH和最适作用温度，通常在最适作用pH和最适作用温度条件下酶相对比较稳定，在此条件下进行反应能最大程度地发挥酶活力，提高酶反应效率。因此，在工业应用中应了解不同的酶最适pH和最适温度，确定反应的最佳条件，最大限度地提高酶的使用效率是很重要的。 通常情况下α一淀粉酶的最适作用pH一般在2到12之间变化。真菌和细菌类α一淀粉酶的最适pH在酸性和中性范围内，如芽孢杆菌仅一淀粉酶的最适pH为3，碱性α一淀粉酶的最适pH在9～12。另外，温度和钙离子对一些α一淀粉酶的最适pH有一定的影响，会改变其最适作用范围。不同微生物来源的α一淀粉酶的最适作用温度存在着较大差异，其中最适作用温度最低的只有25c～30℃，而最高的能达到100c～130c。另外，钙离子和钠离子对一些酶的最适作用温度也有一定的影响。 1. 3 金属离子对酶稳定性的影响 α一淀粉酶是金属酶，很多金属离子，特别是重金属离子对其有抑制作用；另外，巯基，N一溴琥珀酸亚胺，p一羟基汞苯甲酸，碘乙酸，BSA，EDTA和EGTA等对α一淀粉酶也有抑制作用。 2、α-淀粉酶的生产
本科学生实验报告 学号： 124120463 姓名： 学院：生命科学学院专业、班级： 12级生物技术班实验课程名称：酶工程实验一 教师：吴倩 云南师范大学教务处编印
实验一淀粉酶产生菌的分离及酶活性测定 一、目的要求 1、掌握从土壤中分离酶产生菌的方法，学会应用微生物生态知识分离产酶微生物。 2、掌握淀粉酶活性测定的原理，学会淀粉酶活性的测定方法。 二、基本原理 （一）淀粉酶产生菌的分离 1.菌种的采集 ①要获得产生某种酶的菌种，可从富含该酶作用底物的场所去采集。 ②胞外酶的稳定性和最适反应条件通常和菌的最适生长条件一致，因此要筛 选具有某一特性的酶时，只要到相应的环境中采样即可。 2.富集培养 ①原理：采集到的样品中如果所需的菌很少，需要先经过富集培养，使所需 的菌大量繁殖，而不需要的菌则不生长或少生长，以利于筛选。 ②富集的方法：控制培养的温度、pH和营养成分等。 3.菌种的分离 ①淀粉与碘液反应会形成蓝色化合物。 ②淀粉酶能使淀粉分解为葡萄糖，而葡萄糖与碘反应不会形成蓝色化合物， 结果可使淀粉酶产生菌周围形成透明圈，从而筛选出淀粉酶产生菌。 （二）淀粉酶产生菌的发酵及葡萄糖标准曲线绘制 1.原理：根据淀粉酶水解淀粉生成还原性糖，还原糖与3，5 -二硝基水杨酸共 热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540nm进行测定。 2.酶活定义：在一定pH5.5、37℃条件下，每分钟内从底物溶液中分解释放 1μmol葡萄糖所需要的酶量为一个酶活单位U/g。 酶活计算公式：酶活（U/g）=A×5×K×N×1000/（T×W） A:样品的OD值(平均值) K:标准曲线的斜率 N:稀释倍数5:0.2毫升反应液转换为1毫升体积 T:反应时间（min）1000:转换因子1mmol=1000μmol W:葡萄糖的分子量（180.2g/mol） 3绘制标准曲线 ①先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波 长下分别测定它们的吸光度A。 ②以A为横坐标，浓度c为纵坐标，则得到一条拟合度较好的直线，称为标 准曲线。 ③然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲 线上找出对应的被测溶液浓度或含量 三、器材
(1)小量提取细菌基因组总DNA a.挑LB平板上新鲜活化的单菌落于5mL LB培养基中，25℃震荡培养24 h； b.转移3mL菌液于5mL离心管中，4℃，12000r/min，离心5min，弃掉上清； c.将细菌沉淀物用0.5mol/L NaCl洗一次，尽量空干上清液； d.将沉淀重悬于1mL 50mmol/L Tris (pH 8.0)缓冲液中，然后加入0.2mL新鲜配置的溶菌酶溶液(10mg/mL in 0.25mol/L Tris，pH8.0)和0.8mL 0.25mol/L的EDTA溶液，混匀后于37℃处理1 h，再加入200μL 10%SDS溶液，混匀后放置于55℃处理5min； e.加入等体积的酚-氯仿(1:1)，盖好上下颠倒混匀3min，12000r/min，离心10min； f.转移上相至新的离心管中，重复上个步骤直到无白色变性蛋白层出现； g.取上清，加入3μL 10mg/mL的去DNase的RNase溶液，37℃水浴1h； h.重复步骤e； i.在上相中加入1/10体积的3mol/L NaAc(pH 5.2)和2倍体积的冷无水乙醇，-20℃放置30min；. j.4℃，12000r/min离心10min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗两次，干燥后溶于100μL的TE中，-20℃保存备用。 (2) PCR扩增16S rDNA序列 a. 以上述细菌基因组总DNA为模板，.扩增所用引物为， 上游引物：5’-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3’；（27F） 下游引物：5’-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3’。（1492R） b. PCR反应体系参见PCR扩增试剂盒说明书 c. PCR反应条件也主要参考说明书 94℃预变性5min，94℃ 45s，56.2℃ 45s，72℃ 90s，30个循环； 72℃ 10min，4℃保温。 d. PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测 e. PCR产物测序。 (3)构建进化树 将菌株16S rRNA的序列与GenBank数据库中序列比对，构建系统发育树。
南昌大学实验报告 淀粉酶产生菌的筛选及酶活力测定 一、实验目的： 1、学习从土壤中分离微生物的方法； 2、学习淀粉酶产生菌的筛选方法 3、了解分光光度计法测定酶活力的原理及方法。 二、实验原理： 土壤中含有大量的微生物，将土壤稀释液涂在不同类型的培养基上，在适宜的环境中培养几天，细菌或者是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养集中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。故在淀粉培养基上长出的菌便是淀粉产生菌。在培养基上滴碘液，淀粉被分解掉的部分不显现蓝色，出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断菌种产淀粉的能力。 淀粉酶是指一类能催化分解淀粉分子中糖苷键的酶的总称，主要包括α－淀粉酶和β-淀粉酶等，α-淀粉酶可从淀粉分子内部切断淀粉的α-1,4糖苷键，形成麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，是淀粉的粘度下
降，因此又称为液化型淀粉酶。淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。随着酶的不断分作用，淀粉长链被切断，生成小分子的糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定α-淀粉酶的活力。 三、实验器材及试剂： 1、培养基： （1）分离培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、溶于1000mL蒸馏水中，再加入15g琼脂粉，pH调至，121℃灭菌15min，待冷却至50℃左右时，于超净工作台倒平板） （2）筛选培养基：淀粉培养基（可溶性淀粉20g,硝酸钾1g,磷酸氢二钾,氯化钠,硫酸镁,硫酸亚铁,琼脂20g,水1000毫升，调整pH值到～。） （3）摇瓶培养：淀粉培养液。 2、试剂： 碘液、2%可溶性淀粉、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、标准糊精溶液、L乙酸、%生理盐水。 3、器材： 培养皿、锥形瓶、高压灭菌锅、超净工作台、恒温水浴锅、分光光度计。 四、实验步骤：
YUNNAN NORMAL U NIVERSITY 本科学生实验报告 学号：124120463 姓名：________________________ 学院：生命科学学院专业、班级：12 级生物技术班 实验课程名称：_________ 酶工程实验一_______________________ 师：________ 吴倩_______________________________ 云南师范大学教务处编印
实验一淀粉酶产生菌的分离及酶活性测定 一、目的要求 1、掌握从土壤中分离酶产生菌的方法，学会应用微生物生态知识分离产酶微生物。 2、掌握淀粉酶活性测定的原理，学会淀粉酶活性的测定方法。 二、基本原理 （一）淀粉酶产生菌的分离 1. 菌种的采集 ①要获得产生某种酶的菌种，可从富含该酶作用底物的场所去采集。 ②胞外酶的稳定性和最适反应条件通常和菌的最适生长条件一致，因此要筛选具有 某一特性的酶时，只要到相应的环境中采样即可。 2. 富集培养 ①原理：采集到的样品中如果所需的菌很少，需要先经过富集培养，使所需的菌大 量繁殖，而不需要的菌则不生长或少生长，以利于筛选。 ②富集的方法：控制培养的温度、pH和营养成分等。 3. 菌种的分离 ①淀粉与碘液反应会形成蓝色化合物。 ②淀粉酶能使淀粉分解为葡萄糖，而葡萄糖与碘反应不会形成蓝色化合物，结果可 使淀粉酶产生菌周围形成透明圈，从而筛选出淀粉酶产生菌。 （二）淀粉酶产生菌的发酵及葡萄糖标准曲线绘制 1. 原理：根据淀粉酶水解淀粉生成还原性糖，还原糖与3，5 -二硝基水杨酸共热 后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540nm 进行测定。 2. 酶活定义：在一定pH5.5、37C条件下，每分钟内从底物溶液中分解释放 1卩mol葡萄糖所需要的酶量为一个酶活单位U/g。 酶活计算公式：酶活（U/g）=A X 5X K X N X 1000/（T X W） A:样品的OD值（平均值）K:标准曲线的斜率 N:稀释倍数5:0.2毫升反应液转换为1毫升体积T:反应时间（min）1000:转换因子1mmol=1000 ^mol W:葡萄糖的分子量（180.2g/mol） 3 绘制标准曲线 ①先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分 别测定它们的吸光度A。 ②以A 为横坐标，浓度c 为纵坐标，则得到一条拟合度较好的直线，称为标准曲 线。 ③然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找 出对应的被测溶液浓度或含量 三、器材
?（1）常规鉴定 常规鉴定内容有形态特征和理化特性。形态特征包括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应和血清学反应等。 ?（2）BIOLOG碳源自动分析鉴定 BIOLOG鉴定系统以微生物对不同碳源的利用情况为基础，检测微生物的特征指纹图谱，建立与微生物种类相对应的数据库。通过软件将待测微生物与数据库参比，得出鉴定结果。 该系统已获美国FDA认可，已逐步应用于食品和饮品企业、环保、海洋生物/水产品、制药、农业微生物、生物治理、化妆品、临床等领域的微生物鉴定试验中。 CICC拥有国内最全的BIOLOG数据库，涉及革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、厌氧菌、酵母、丝状真菌在内近2000种微生物。 ?（3）分子生物学鉴定 应用分子生物学方法从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系，是目前微生物分类学研究普遍采用的鉴定方法。CICC拥有微生物菌种分类鉴定的分子生物学实验室，配有PCR仪、高速冷冻离心机、电泳仪、HPLC、凝胶成像系统、紫外控温分析系统等先进仪器设备，以及DNAMAN、 BIOEDIT、CLUSTALX、TREEVIEW等序列分析软件。目前CICC可采用核酸序列分析法分析细菌16S rDNA/16S-23S rDNA区间序列、酵母18S rDNA/26S rDNA（D1/D2）序列及丝状真菌的18S rDNA/ ITS1-5.8S-ITS2序列，提供科学的鉴定结果。 ?（4）API细菌数值鉴定系统 API鉴定系统涵盖15个鉴定系列，约有1000种生化反应，目前已可鉴定超过600种的细菌。鉴定过程中，可根据细菌所属类群选择适当的生理生化鉴定系列，通过软件将待测细菌与数据库参比，得出鉴定结果。 CICC目前可应用API 50CH系列、API 20 E系列、API Staph系列对乳酸杆菌（Lactobacillus sp.）和相关细菌、芽孢杆菌（Bacillus sp.）、葡萄球菌属（Staphylococcus sp.）、微球菌属（Micrococcus sp.）和库克菌属（Locuria sp.）进行鉴定。 ?（5）功能性分析及功能基因
16S r D N A鉴定菌株的标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程 1.适用范围 本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。 本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。 2.方法和原理 16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。 细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。 在 16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。 16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。
由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。 3.设备和材料 3.1器材 移液器（1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler；凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000；基因分析仪： AB3500、AB3130 3.2试剂 DNA快速提取试剂：PrepMan Ultra；琼脂糖；PCR试剂：Taq酶，10×Taq Buffer(Mg2+)，dNTPs，ddH2O等； ExoSAP-IT；测序试剂：BigDye Terminator，5×Sequencing Buffer；BigDye XTerminator Purification Kit； 3.3耗材 移液器吸头：1000μL、200μL、10μL；离心管：1.5mL、200μL；Micro Amp TM Optical 96-Well Reaction Plate；Micro Amp TM Optical Adhesive Film；
现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌,请你鉴定其革兰氏染色反应.你 怎样运 传统的细菌革兰氏染色法操作繁琐，初学者不易掌握，寻找一种简便方法。方法：玻璃片上将细菌与碱液混合，用接种环或接种针往上挑，观察有无丝状物出现，我们把它叫作“细菌拉丝实验”。结果：用本法鉴别细菌革兰氏染色性质，G＾－菌有丝状物出现，即拉丝实验阳性，G＾＋菌无丝状物，拉丝实验阴性经过对照使用，本法具有快速，准确，简便，结果易判断，成本低廉等优点，值得推广应用。 由于细菌细胞壁的结构不同，革兰氏染色法可使有的细菌染上初染的的紫色，为革兰氏阳性细菌，有的细菌染上复染的的红色，为革兰氏阴性细菌。大肠杆菌是革兰氏阴性菌，染色后为红色，细菌形态为短小的杆状，单个存在。枯草杆菌是革兰氏阳性菌，染色后为紫色，细菌形态为杆状，比大肠杆菌大，可排成链状的，有的菌体里有椭圆芽孢（无色）或在视野中有散在的芽孢。 实验十肠杆菌科 肠杆菌科(Enterobacteriaceae)是一大群寄居于人和动物肠道中、生物学性状相似的革兰阴性杆菌。多数为肠道的正常菌群，但在机体免疫力低下或寄居部位发生改变时可引起感染。根据其生化反应、血清学试验、DNA同源性等可将肠杆菌科分为120多个菌种，其中与医学密切相关的有埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属等。 一、大肠埃希菌 大肠埃希菌(E. coli)俗称大肠杆菌，是寄居于人和动物肠道的正常菌群。当机体抵抗力下降、该菌侵入肠外组织或器官，可引起急性炎症或继发感染；有些血清型可引起腹泻。从水和食品中检出较多大肠杆菌时，可判断它们已被粪便污染。因此，大肠杆菌常被作为饮水、牛乳及食品的卫生学检测指标。 （一）形态与培养特性 【材料与方法】 1．大肠杆菌革兰染色标本片。 2．大肠杆菌普通琼脂平板、SS平板、中国蓝平板、伊红美蓝(EMB)平板培养物。 【结果】 1．大肠杆菌为革兰阴性、中等大小杆菌，两端钝圆或稍弯曲，呈分散排列。 2．菌落特征(表10-1)。 表10-1 大肠杆菌在普通琼脂平板及选择鉴别培养基上的菌落特征 培养基菌落特征 普通琼脂平板圆形，中等大小，灰白，整齐，光滑菌落 SS平板呈红色 中国蓝平板呈蓝色 伊红美蓝平板呈紫黑色，有金属光泽 （二）生化反应 【材料与方法】 1．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖发酵管，37℃培养24h，观察结果。 2．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于双糖铁培养基，37℃培养24h，观察结果。 3．靛基质产生、甲基红、VP、枸橼酸盐利用试验(IMViC试验)，见实验四。 【结果】
菌种鉴定常见问题解答 1.菌种鉴定的方法和步骤是什么？ 菌种鉴定一般就只要提取基因组DNA，然后PCR扩增16srDNA片段，上GeneBank或者Eztaxon对比即可。一般序列相似度在97%以上就可以认为是同种细菌（当然也有例外，DNA序列仅仅是一个参考指标）。 -----消息来源：百度问答 . 2. 微生物的菌种鉴定可以鉴定到“株”一级吗？ 如果你的菌株是自然界中分离得到，就只能鉴定到种，不能鉴定到株，因为多多少少和其他株系的细菌有区别，即便你做了一些特征的鉴定，发现和某一株细菌一模一样，你也没有理由说你的细菌就是那一株细菌，因为你不可能把所有的特征都做完，株和株之间的关系就相当于不同的人之间的关系，世界上不可能有完全相同的两个人。除非你知道你的细菌本来就是某一株细菌扩增出来的（而且要保证没有变异，否则就是一个新株），可是这样就没必要鉴定了。 -----消息来源：百度问答 3．为什么鉴定出来的菌种跟我想象的相差太大？ 答：我们菌种鉴定使用PCR直接扩增的方法，即以客户提供的菌株为模版直接进行PCR扩增，中间不经过传代培养，因此不会引入新的污染，如果出现结果不一致的情况，一般有以下原因导致： 1、您提供的样品未经过三次分离纯化，含有其他杂菌； 2、您提供样品的真实情况确认如此。 建议您提供三次纯化的菌株重新进行鉴定。 4．为什么有时会出现PCR扩增不出的现象； 答：扩增不出的原因主要有以下几种： 1、您提供的菌种从严格意义上讲不是细菌或者真菌，或者是信息有误； 2、您提供的菌种为革兰氏阳性菌，由于细胞壁较厚，采用常规方法不能有效地破壁； 3、培养基或菌体中表达产物含有抑制PCR产物的组份。 对于第二种或第三种情况需要提供基因组DNA。 5．PCR扩增直接测序为什么会出现套峰的现象； 答：1、测序结果个别碱基出现N，是由细菌rDNA多态性造成，对菌种鉴定没有无影响； 2、所有测序反应均出现大面积套峰，是由于您提供的样品模版不纯造成的。这种情况需要重新纯化菌种。 6．PCR产物克隆测序为什么会出现结果分离的现象？ 答：我们以菌种为模版直接进行PCR扩增，然后对PCR产物进行克隆测序，如果出现2种或以上的测序结果，说明您提供的模版不单一，即菌种不纯，含有其他杂菌，这种情况建议您将菌种重新进行三次以上纯化。 7．菌种鉴定可以鉴定到种吗？ 答：利用rRNA的保守区域进行鉴定只是菌种鉴定的一个分子生物学指标，通过鉴定结果可以了解未知菌株和NCBI公布序列的哪个种属比较接近。
自然界中产淀粉酶菌株分离 纯化及酶活测定 淀粉酶（Amylase ）又称糖化酶，是指能使淀粉和糖原水解成糊精、麦芽糖和 葡萄糖的酶的总称。淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等a-1,4-葡聚糖，水解a l, 4-糖苷键的酶。根据作用的方式可分为a淀粉酶（EC 3. 2. 1. 1.）与禺淀粉酶（EC 3. 2. 1.2.）。a-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物；3■淀粉酶与a-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断a1,4-葡聚糖链。主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘署、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。 淀粉酶是一种用途极广的生物催化剂，广泛应用于造纸、食品、医药工业。如饴糖、啤酒、黄酒、葡萄糖、味精、抗生素等行业；用于高质量的丝绸、人造棉、化学纤维退浆；制成不同品种的工业酶、医用酶、诊断酶等；在洗涤剂工业中，作为洗涤剂酶与碱性蛋白酶、脂肪酶一起添加于洗衣粉中制成多酶洗衣粉等具有极广泛的用途。随着社会需求的增大，工业生产对淀粉酶的需求量越来越大，其在各领域应用广泛，急需寻找更高酶活的产酶菌株满足生产需要。 生淀粉酶是指对不经过蒸煮糊化的生淀粉颗粒能够表现出强水解活性的酶类。 70年代由于两次石油危机，引起各国学者从节能和有效利用天然资源出发，重视对生淀粉酶的研究。研究大致分两个方面：一是探讨对生淀粉不经蒸煮，直接用于酒精发酵的可能性；另一则是从自然界中分离筛选能产生生淀粉酶的微生物，并进而研究生淀粉酶的酶学特性及其产生菌的徽生物学特性[1,2]。除动物自身的消化 道可分泌一些淀粉酶外，淀粉酶的另外两大来源是植物和微生物能产生生淀粉酶的微生物较多。Ueda [3, 4]，Mizokami [5]，Tamiguchi [6]，Kainuma [7]先后报道了Aspergillus awaraori，Rbizopus . sp.，Strepiococcus boris Bacillus circulans，Chalara paradoxa 等菌种均有产淀粉酶能力。 本实验拟从种植谷物的贫瘠土壤和平地肥沃土壤的5cm~25cm 土层取土壤样品 中分离土壤微生物，筛选能产生淀粉酶的菌种，并进行初步鉴定[8]。同时，拟进
菌种鉴定的几方面特征 1、个体形态：镜检细胞形状、大小、排列，革兰氏染色反应，运动性，鞭毛位置、数目，芽孢有无、形状和部位，荚膜，细胞内含物；放线菌和真菌的菌丝结构，孢子丝、孢子囊或孢子穗的形状和结构，孢子的形状、大小、颜色及表面特征等。 2、培养特征：①在固体培养基平板上的菌落和斜面上的菌苔性状（形状、光泽、透明度、颜色、质地等）。 ②在半固体培养基中穿刺接种培养的生长情况。③在液体培养基中混浊程度，液面有无菌膜、菌环，管底有无絮状沉淀，培养液颜色等。3、生理生化特征：生理生化特征与微生物的酶和调节蛋白的本质和活性直接相关，酶及蛋白质都是基因产物，所以对微生物生理生化特征的比较也是对微生物基因组的间接比较，加上测定生理生化特征比直接分析基因组要容易得多，因此生理生化特征对于微生物的系统分类仍然是有意义的。4、血清学试验与噬菌体分型。5、氨基酸顺序和蛋白质分析。 6、核酸的碱基组成【(G+C)%】 7、核酸的分子杂交。 营养缺陷型的应用 从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始菌株，称为野生型菌株。野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养（氨基酸、维生素、核酸等）的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长，称为营养缺陷型。营养缺陷型菌株的筛选，在生产实践和基础理论中都有着重要的意义。生产实践中，营养缺陷型可用于工业微生物育种，协助解除代谢反馈调控机制，从而达到大量积累终产物的目的；也可将营养缺陷型菌株作为生产菌种杂交、重组育种时的遗传标记。在基础理论中，营养缺陷型不仅被广泛应用于阐明微生物代谢途径上，而且在遗传学上具有特殊的地位。在遗传规律中的转化、转导、原生质体融合、质粒和转座因子等的研究中，营养缺陷型是最常用的标记菌种。代谢调控的类型 1、初级代谢的调节控制：虽然代谢调节方式很多，由于微生物细胞体内的所有生化反应都是在酶的催化下进行的，因此，对酶的调节控制是最主要、最有效的调控方式。它包括两个方面，一是调节酶的合成量（反馈阻遏），二是调节现成酶分子的催化活力（反馈抑制）。两者密切配合和协调，以达到最佳的调节效果。①酶合成的调节：酶合成的调节是一种通过调节酶的合成量进而调节代谢速度的调节机制，这是一种在基因水平上（在原核生物中主要在转录水平上）的代谢调节。凡能促进酶生物合成的调节，称为诱导，而能阻碍酶生物合成的调节，则称为阻遏。 ②酶活性的调节：酶活性调节是以酶分子的结构为基础的，在酶分子水平上的一种代谢调节。它是通过改变现成的酶分子活性来调节新陈代谢的速率，包括酶活性的激活和抑制两个方面。2、次级代谢的调节控制：①次级代谢产物的诱导调节②次级代谢产物碳源分解调节③次级代谢产物氮源分解调节④次级代谢反馈调节⑤磷酸盐调节⑥细胞膜透性的调节原生质体的制备方法 制备大量具有活性的原生质体是微生物原生质体融合育种的前提。为制备原生质体，必须有效地除去细胞壁。去壁的方法有三种：⑴机械法⑵非酶分离法⑶酶法。采用前两种方法制备的原生质体效果差，活性低。酶法分离原生质体的方法：首先选择原始亲株，经过遗传标记筛选，得到直接亲本，采用培养皿平板玻璃纸或摇瓶振荡法培养，取年轻的菌体转入到高渗溶液中，加入有关水解酶，在一定条件下（温度、pH值等）酶解细胞壁。酶解后释放的原生质体和残存菌丝片断的混合液经过滤，除去大部分菌丝碎片。滤液进一步低速离心10min，洗涤后弃去上清液，沉淀悬浮于同一种高渗溶液中，即可得到纯化的原生质体。 融合体的鉴定 融合体中除重组体外，还有异核体或部分结合子、杂合二倍体或杂合系，这些都会在平板上形成菌落，检出融合体的方法有多种，在育种工作中可根据实验目的和微生物不同加以选择，下面是在原生质体融合育种中经常采用的。⑴利用营养缺陷型标记选择融合体，其检出设计的原则是在分离的培养基上只有融合体生长而不能让双亲本原生质体形成菌落。融合的双亲带有不同营养缺陷型标记，原生质体融合处理后的混合物直接分离到基本培养基上就可检出融合体。⑵利用抗药性选择融合体，微生物的抗药性是菌种的重要特性，是由遗传物质决定的。不同种的微生物对某一种药物的抗性存在差异，利用这种特性也可用于融合体筛选。 ⑶利用荧光染色法选择融合体，荧光染色法是事先使双亲染色体而携带不同荧光色素标记，然后在显微操作器和荧光显微镜下，挑取同时带有双亲原生质体荧光标记的融合体，直接分离到再生培养基上再生，最后得到融合体。⑷钝化选择法，用灭活原生质体和具活性原生质体融合（营养缺陷型），由于灭活亲株原生质体和营养缺陷型亲株原生质体在基本培养基上都不能生长，只有融合体才能形成菌落。 菌种选育的方法和特点 1、诱变育种：微生物的诱变育种，是以人工诱变手段诱发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选，从多种多样的变异体中筛选出产量高、性状优良的突变株，并且找出发挥这个变株最佳培养基和培养条件，使其在最适的环境条件下合成有效产物。基因突变是微生物变异的主要源泉。人工诱变又是加速基因突变的重要手段。以人工诱发突变为基础的微生物诱变育种，具有速度快、收效大、方法简单等优点，它是菌种选育的一个重要途径。 2、杂交育种：微生物杂交的本质是基因重组，优点：第一，通过具有不同遗传性状菌株的杂交，使遗传物质进行交换和重新组合，改变亲株的遗传物质基础，扩大变异范围，使两亲株的优良性状集中于重组体内，获得新品种。第二，通过杂交后获得具有新遗传特性的重组体，不仅可克服因长期诱变造成的生活力下降，代谢缓慢等缺陷，也可以提高对诱变剂的敏感性，降低对诱变剂的“疲劳” 效应。第三，通过杂交可以总结遗传物质的转移和传递规律，丰富并促 进遗传学理论的发展。3、基因工程育种：与传统育种方法不同的是， 基因工程育种不但可以完全突破物种间的障碍，实现真正意义上的远缘 杂交。而且这种远缘既可跨越微生物之间的种属障碍，还可实现动物、 植物、微生物之间的杂交。广义的基因工程育种包括所有利用DNA重 组技术将外源基因导入到微生物细胞，使后者获得前者的某些优良性状 或者利用后者作为表达场所来生产目的产物。由于微生物是单细胞，且 结构简单，是基因工程理想的表达载体。所以许许多多来自于不同界的 物种（人体、动物、植物、微生物等）的基因都被成功地克隆到微生物 细胞中并获得表达。 诱变育种的方法和优缺点 诱变育种具有方法简单、投资少、收获大等优点，但它最大缺点是缺乏 定向性。在诱变育种过程中应注意出发菌株、诱变剂及诱变剂量的选择、 诱变处理方式方法的应用，以及结合有效的筛选方法等来弥补不足，以 提高诱变育种的效率。诱变育种的步骤和方法包括：出发菌株的选择， 单孢子（或单细胞）菌悬液的制备，诱变剂及诱变剂量的选择，诱变的 处理方法，以及纯化分离等。1.出发菌株要求：⑴对诱变因素敏感的菌 株；⑵选择具备一定生产能力，并且在生产过程中经过自然选育的菌株； ⑶采用具有有利性状的菌株，如生长速度快、营养要求低以及产孢子早 而多的菌株；⑷选择纯种作出发菌株；⑸选择出发菌株应考虑其稳定性； ⑹选择出发菌株的其他因素；2.出发菌株的纯化：确定诱变出发菌株之 后，就要进行纯化，通过菌种纯化分离，从单菌落中挑选所需要的优良 菌株，与具有其他性状的菌株分离开来，从中获得遗传性状基本一致的， 并且稳定的变种。纯种分离方法，常用划线分离法和稀释分离法。 3. 单孢子（或单细胞）悬液的制备：在诱变育种中，所处理的细胞必须 是单细胞、均匀的悬液状态。这是因为，一方面分散状态的细胞可以均 匀地接触诱变剂，另一方面又可避免长出不纯菌落。4.诱变剂及诱变剂 量：凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远远超过自发突变率的物理 因子或化学物质，称为诱变剂。它们包括物理诱变剂、化学诱变剂和生 物诱变剂三大类。诱变的最适剂量，应该使所希望得到的突变株在存活 群体中占有最大的比例，这样可以减少以后的筛选工作量。5.诱变的处 理方法：⑴单因子处理⑵复合因子处理①两个以上因子同时处理②不同 诱变剂交替处理③同一种诱变剂连续重复使用④紫外线光复活交替处 理。 反馈阻遏和反馈抑制的原理 反馈阻遏：主要是通过终产物与阻遏蛋白的亲和力的改变，使阻遏蛋 白与操纵基因结合，不能合成mRNA，从而达到对整个反应过程进行调 节的目的。反馈抑制：主要的作用方式在于末端产物对反应途径中调 节酶的抑制。受反馈抑制的调节酶一般都是变构酶，酶活力调控的实质 就是变构酶的变构调节。变构酶分子具有两个和低分子物质结合位点， 一个是与底物结合的催化中心（活性中心），另一个可与调节因子（又 称效应物）相结合的调节中心（变构中心）。当效应物与调节中心结合 后，可引起酶蛋白分子发生构象变化，从而引起酶的活性中心对底物的 亲和力和催化能力的改变，阻碍了酶和它的底物的结合，促进或抑制了 酶活力，使整个代谢途径的快、慢受到调节，称这种现象为变构效应。 抗反馈调节菌株的筛选 抗反馈调节突变株是一种解除合成代谢反馈调节机制的突变型菌株。其 特点是所需产物不断积累，不会因其浓度超量而终止生产，如果由于结 构基因突变而使变构酶成为不能和代谢终产物相结合的，便是失去了反 馈抑制的突变，称为“抗反馈突变型”，若是由于调节基因突变引起调节 蛋白不能和代谢终产物相结合而失去阻遏作用的，称为“抗阻遏突变 型”。操纵基因突变也能造成抗阻遏作用，产生类似于组成型突变的现 象。其方法是把结构类似物作为筛选的遗传标记。通常是把结构类似物 和培养基混合制成平板，诱变后菌体分离其上，经培养，那些被解除反 馈调节的突变株可以选择性地生长，并在细胞内合成相应的氨基酸。变 株的菌落在生长过程把氨基酸分泌到培养基中，促使菌落周围敏感菌的 生长，形成一个混淆的增殖圈，挑取增殖圈大而明显的菌落，进一步试 验复证。 建库前的菌种的检定（大肠杆菌表达的工程菌菌种） 1、划种LB琼脂平板，应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长， 2、涂片革兰氏染色，在光学显微镜下观察为典型的革兰氏阴性杆菌， 3、对抗生素的抗性，应与原始菌种相符，大多数为抗氨卡青霉素， 4、 电镜检查，应为典型大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生 物污染。5、生化反应，应符合大肠杆菌生物学性状，6目的产物表达 量，在摇床中培养应不低于原始菌种的表达量，7、表达产物的类型， 用免疫学或合适方法证明型别无误，8、质粒检查，质粒的酶切图谱应 与原始质粒相符。 微生物细胞的破碎方法 化学法：1、自溶法，细胞膜结构在一定的条件下，由于细胞自体的各 种水解酶如蛋白酶、酯酶等的酶解作用而发生溶解，2、表面活性剂处 理法，常用十二烷基硫酸钠等阴离子表面活性剂，3、脂溶性溶剂处理 法：用丙酮、氯仿、甲苯等溶解细胞的脂蛋白，4、用低渗溶液，如氨 水、稀盐及含有少量有机溶剂的水溶液处理，是细胞膜胀破。物理法： 1机械磨碎法，2、加压破碎法，在55Mpa的高压下，急速喷射撞击挤 压。3超声破碎法，4反复冻融法。生物学的方法主要是采用酶解法 生物产品浓缩和干燥的方法 浓缩：1、减压干燥浓缩法，是通过降低液面的压力使液体沸点降低， 减压的真空度越高，沸点降得越低，蒸发越快。此法适用于一些不耐热 的生物大分子及生物制品的浓缩。2、吸收法，是通过一种吸收剂直接 吸收除去溶液中溶剂分子，是溶液浓缩的方法。使用的吸收剂必须与溶 液不起化学反应，对生物大分子不起吸附租用，易与溶液分开，吸收剂 除去溶剂后能反复使用（常用的是聚乙二醇）3、超滤法，是使用一种 特制的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法。通过超滤 法，蛋白质和酶的稀释液一般可浓缩到10%~50%浓度，回收率高达90%。 应用超滤法关键是在于滤膜的选择。干燥：1，真空干燥，适用于不耐 高温、易氧化的物质的干燥和保存，其原理与减压浓缩相同，真空度越 高，沸点降得越低，蒸发越快。2、冷冻真空干燥，又称为升华干燥， 除利用真空干燥的原理外，同时增加了温度因素。在相同压力下，水蒸 汽压力随温度的下降而下降，故在低温低压下，冰很容易升华为气体。 基因工程产品一般需检测的指标 1、鉴别试验， 2、外观，冷冻干燥制品应为白色薄壳疏松体。加入标量 蒸馏水后应迅速溶解为澄明液体，不得含有肉眼可见的不溶物，3、化 学检定4、pH值5、水分，一般冷冻干燥生物制品应不高于3%，6、效 价测定7、无菌试验8、异常毒性试验9、蛋白质含量，一般用Lowry法 测定10、比活性11、纯度，根据要求用电泳法和高效液相色谱法等12、 分子量，一般用还原型SDS—PAGA法13、外源性DNA法残留量，一般 用固相斑点杂交法，以地高辛标记的核酸探针法测定14、IgG残留量15、 宿主蛋白残量，一般用酶联免疫法测定16、残余抗生素活性17、细菌内 毒素含量18、等电点19、紫外光谱扫描20、肽图21、N—末端氨基酸序 列。 菌种衰退的原因，防止措施和保存方法 原因：1、基因突变－－主要原因：有关基因发生负突变导致菌种衰退， 表型延迟造成菌种衰退，质粒脱落导致菌种衰退，2、连续传代－－加 速衰退，3、不适宜的培养和保藏条件－－加速衰退。防止措施：控制 传代次数，菌种经常纯化，创造良好的培养条件，利用不易衰退的细胞 移种传代，采用有效的菌种保藏方法，讲究菌种选育技术。保存方法： 斜面低温保藏法，石蜡油封藏法，砂土管保藏法，麸皮保藏法，甘油悬 液保藏法，冷冻真空干燥保藏法，液氮超低温保藏法，宿主保藏法