2 基因概念的演变与发展
任何一门科学体系的建立都是以概念为基础的，科学的发展史实质上就是概念的提出、证明、修正、再证明的不断发展的历史。如果说物理学是以“原子论”为基础，那么遗传学则是以“基因论”为基础。T. H. Morgan（摩尔根1926）的“基因论”是对早期关于“基因”的“种质”概念的修正和发展，J.Watson 和F.Crick（1953）提出的‖DNA分子双螺旋结构模型‖赋予了基因的分子结构和功能的科学理论基础，Benzer S.(1962) 提出的顺反子概念将Morgan“三位一体”的基因概念发展为“一位一体”的基因概念，断裂基因、重复基因、重叠基因、跳跃基因等概念使人们对基因的本质获得了新的认识与发展。显然人类对基因概念的认识，对生命现象的解析，经历了一个从个体水平到细胞水平，再到分子水平的过程，在近一个多世纪的漫长历史中，人类实践了按‖还原论‖的观点认识自然现象，揭示生命规律的过程。将猫狗之分，人畜之别归因于DNA分子中的核苷酸组成和排列上，然而基因概念的彻底分子化，对解释生物个体间的生物学差异，生命现象的整体性和复杂性有时显得十分的牵强附会，其说不一。二十一世纪人类大规模地开展生物的基因组学，功能基因组学的研究，在‖还原论‖认识基因的基础上，开始用‖整体论‖的观点审视基因间的互作关系，认识基因表达与性状表现之间的联系。生物学的过程是一个远比物理、化学过程更加高级，更为复杂的包括物理学、化学过程在内的生命过程，人类对基因概念的认识还将会不断地发展和深化。
2.1 早期的“基因”概念
“种瓜得瓜，种豆得豆”是人类对遗传现象最通俗，最简略的描述。但最早关于控制生物遗传的物质基础及其解释是公元前5世纪Hippocrates提出的“融合遗传理论”（Blending inheritance）。这一理论认为；父本精液与母本胚胎中的体液融合后，传递给后代并控制子代个体的性状表现（图2－1）。双亲体液中集中了来自身体各部分的控制生物遗传的元素。公元前4世纪Aristotle认为残疾人的后代不一定是残疾者。否定了体液为后代身体各部分发育提供控制生物遗传元素的假说。
1809年https://www.doczj.com/doc/f84634313.html,marck在对物种驯化，适应现象系统研究的基础上提出器官“用进废退”的进化论观点，并据此提出“获得性遗传理论”(Inheritance of acquired characteristics)。这一理论否定遗传物质的存在，认为物种的形成是对环境的适应过程，环境对形态的改变一旦发生就可以获得并遗传给后代，使生物体逐渐转变为新种。
Darwin (图2-2)1866年提出“泛生论”（Hypothesis of the Pangenesis ）假说。在这一理论中，Darwin 认为生物体一切性状的表现受控于体内各部位的各种泛生粒（panger ）。例如根的泛生粒决定根的发生与形态，叶的泛生粒决定叶的发生与形态，茎的泛生粒决定茎的发生与形态等，当生物体形成生殖细胞时，根、叶、茎的泛生粒分别流向生殖细胞并传递给后代，控制后代植株形态的发生与形成。显然“泛生论”假说成为获得性遗传的理论支撑。 然而这一理论没有得到任何实验证据的支持。
1883年法国动物学家W. Roux 在并不知道G . Mendel 提出遗传因子假说的情况下，
通过对细胞有丝分裂和减数分裂过程的观察，提出遗传单元直线排列的染色体是遗传物质。同年生物学家 A. Weismann 进行了一个简单而又科学的切割老鼠尾巴的实验，Weismann 在每代小鼠出生后便将其尾巴切掉，以阻止控制尾巴发生的“泛生粒”向生殖细胞传递，这一实验连续进行了22代，但第23代小鼠出生后仍有尾巴产生。Weismann 是第一个通过切出尾巴实验的证据否定了“泛生论”假说的科学家，并于1885年提出了著名的遗传物质的“种质论”（Theory of germplasm ）。Weismann 认为多细胞生物的细胞可分为“体质‖（somatoplasm ）和‖种质‖（germplasm ）。生物体的性状表现是由各组织、器官的体质细胞控制的, 而体质细胞由种质细胞产生。种质虽不直接控制性状的表达，但可衍繁自身，世代相继，种质是连续的。体质受到环境条件的影响而发生改变可能会导致性状的变化， 但不会改变体质的基本特征，也不会遗传给后代。“种质论”较为合理地解释了Weismann 实验中第23代小鼠仍然具有尾巴的现象。同时 A. Weismann 还假定遗传物质在生殖细胞中数量减半，受精后的细胞中遗传物质的数目得
图2-2 C. Darwin 提出遗传的泛生论
图2－1 融合遗传的理论假说
以恢复。分别来自父、母双亲的遗传物质在子代个体中各占一半。显然Weismann 在创立科学遗传理论方面未能成功的原因不仅在于他缺乏严密的科学实验，同时受W. Roux 研究的影响，但却错误地认为每一条染色体中均具有该生物的全部“种质”。
2.2 经典的基因概念
奥地利神父G . J. Mendel （孟德尔）1865年根据7个豌豆性状的实验提出了遗传因子假说 (Hypothesis of the inherited factor)。 这一假说认为: 每个性状由定位在染色体上的遗传因子控制，并提出了遗传因子的分离与自由组合的两大遗传规律。事实证明这种假说奠定了现代颗粒遗传的重要基础。 然而也许由于神父在科学界的平凡和论文发表杂志的低挡，G . J. Mendel(图2-3)将自己的论文分寄给当时国际著名的生物学家，却始终得不到任何回音。这一伟大的科学发现由于时代的原因而被埋没了近35年，Mendel 临终前说；“等着瞧吧，我的时代总有一天会来临”。直到1900年由荷兰阿姆斯特丹大学的Hugo de Vires (1900.3.26), 德国土宾根大学的Carl Correns (1900.4.21)和奥地利维也纳农业大学的Erich von Tshermak Seysenegg (1900.6.2)分别发表论文, 重新发现Mendel 的遗传因子假设和两大遗传规律。1909年丹麦遗传学家约翰逊创造了基因“gene ”单词来表述Mendel 的“遗传因子”。
遗传学家Thomas Hunt Morgan （摩尔根） (图2-4)通过对果蝇的研究提出了基因的连锁遗传规律，并在著名的“基因论”一书中科学地定义了经典的基因概念；即基因是孤立地排列在染色体上的实体（不再是代表某种性状的抽象符号A, a, B, b …）, 是具有特定功能，能独立发生突变和遗传交换的、“三位一体“的、最小的遗传单位。这一基因概念成为经典遗传学理论的重要支柱。科学从来不是一成不变的信条。随着研究的不断深入和研究手段的发 图2-4 摩尔根（Thomas Hunt Morgan ）
图2-3 伟大的遗传学家孟德尔（G. J. Mendel ）
展，经典基因概念中的某些定义也随之得到更为科学的修正和发展。
2.2.1 经典基因概念的重要修正
如果说经典的基因概念认为基因是彼此孤立地，呈线性排列在染色体上的遗传实体，那么Morgan 的弟子Sturtevant 对果蝇棒眼遗传研究的结果是对经典基因概念进行的第一次修正。
小眼数
780
38545
65
野生型
重复剂量效应位置效应
X —染色体
棒眼
16A
图2-5 基因的位置效应 Sturtevant 发现控制果蝇复眼中小眼数目的基因位于X 染色体的16A 区，当两条X 染色体上各具有一个16A 区时，果蝇复眼中小眼数目为780个，占满整个复眼，表现为椭圆形大红眼。当一条染色体中的16A 区发生重复，共有3个16A 区时，小眼的数目减少为385个。当两条染色体的16A 区均各发生一次重复，共有4个16A 区时，小眼的数目进一步减少为68个，表现了负剂量效应。当一条染色体的16A 区发生两次重复，而且紧密连锁，同样具有4份16A 区的剂量效应，但小眼的数目却只有45个，似一根小棒位于复眼的中部，这一棒眼的遗传效应显然表明，基因效应的表达不仅有计量效应，也有明显的位置效应。即基因不是一个孤立地排列在染色体上的遗传实体（图2-5）。果蝇的红眼基因W 对白眼基因w 为显性，杂合体W/w 表现红眼。但当红眼基因W 位于异染色质区时，杂合体W/w 却表现白眼。DNA 结构上具有完全相同的基因，由于处于不同的染色体状态下却具有不同的表达方式，进而表现出不同的表现型。这一典型的表观遗传学现象（Epigenetics ）进一步证明，基因不是孤立地排列在染色体上的遗传实体，基因的表达显然受到染色体状态的影响。
2.2.2 拟等位基因(pseudo allele)概念的提出
等位基因（allele ）是指野生型基因（A ）发生突变后形成的突变基因（a ），它与野生型基因位于相同染色体的同一基因座位上，当野生型（A ）基因向不同方向发生突变形成不同状态的等位基因（a1,a2,a3….），又总称为复等位基因（Multiple alleles ）。
根据经典的“三位一体”的基因概念，基因是交换的最小单位，即基因的交换只能发生在基因与基因之间。显然理论上认为突变体a1a1与突变体a2a2的杂交后代中是不会出现野生型个体的。然而在突变体白眼果蝇w-w-与突变体杏仁色果蝇w a w a (amygdaloid) 的杂交后代中却出现了1／1000高概率的红眼野生型个体。在不同糯玉米品系（wxwx）间杂种F1的花粉中发现了较高频率的非糯花粉粒（Wx），而且这种频率往往又是恒定的。这些不能用经典的基因概念给予解释的遗传现象也导致了新的拟等位基因(pseudo allele)概念的产生。将紧密连锁，控制同一性状的非等位基因定义为拟等位基因。只有当这两个非等位基因均为野生型状态时，性状才表现为野生型。显然这一新概念的提出较好地解释了上述红眼果蝇和非糯玉米花粉出现的原因是拟等位基因间交换的结果。
众所周知，从二十世纪四十年代以来，由于遗传学的研究对象从高等生物果蝇，玉米等向低等的微生物拓展，尤其是以大肠杆菌和噬菌体等为遗传学研究的试材，它们以遗传结构简单，个体小，群体大，繁殖快等优点，以概率论为基础的极低概率事件被大量发现。微生物中突变体与突变体间的接合，转化，后代出现野生型的事件不断报道，人们难以置信这些野生型个体的产生都是拟等位基因之间交换的结果。S. Benzer提出“顺反子假说‖(cistron)，从理论上修正了拟等位基因的概念，再次发展了经典的基因概念。
2.2.3 顺反子理论（cistron）
在前人关于基因本质研究成就的基础上，S. Benzer以E. coli T4 噬菌体rII区突变体为试材，通过遗传重组实验和功能互补实验提出了著名的顺反子理论（cistron）。
野生型E. coli T4 噬菌体的RII区含有控制侵染寄主E. coli B和K12菌株，并产生边缘模糊的、白色小噬菌斑的基因, 当rII区发生突变，T4-rII突变体不仅不能侵染K12菌株，而且侵染B菌株后，产生边缘清晰的、圆形大噬菌斑（图2-6）。Benzer将诱变获得的数百个T4-rII突变体，按重组实验设计，两两组合并同时侵染E. coli B菌株，当E. coli B培养皿上出现野生型和突变型两种噬菌斑后，采用影印法将噬菌斑转印到含有E. coli K12菌株的培养皿中。以统计重组实验中由于两条T4-rII染色体交换而形成的野生型噬菌斑的机率，并绘制T4噬菌体rII区内突变位点的遗传连锁图（图2-7）
E.coli B 培养皿影印到E.coli K12培养皿
图2－6 E. coli T4 噬菌体rII 区突变位点的遗传重组实验
图2－7 E. coli T4 噬菌体rII 区突变位点的遗传连锁图
? 如果按照基因“三位一体”的经典概念，基因是一个交换的最小单位，交换只能发
生在基因之间，那么在rII 区能够根据交换机率的大小而定位的数百个突变位点，是否意味着在RII 区内有数百个基因控制对寄主E. coli B 和K12菌株的侵染能力？S.Benzer 根据1941年 Beadle 和Tatum 提出的“一个基因一个酶”的重要理论，认为在rII 区为杂合二倍体的菌株内，野生型基因对突变型等位基因可以发生功能的补偿, 产生功能互补效应，从而使表型正常。当将带有不同突变位点的两个噬菌体同时感染一个细菌，构成双突变杂合二倍体，组成互补测验体系，便可测定各突变位点所在基因的等位性。凡具有功能互补效应的测验菌株，则表明两个噬菌体中的突变位点是位于不同的等位基因中。凡不具有功能互补效应的测验菌株，则表明两个噬菌体中的突变位点是位于相同的等位基因中。如图2 -8所示， rII47与rII106两个噬菌体同时侵染E. coli K12菌株，没有噬菌斑产生，而将rII51与rII106两个噬菌体同时侵染E. coli K12菌株，却产生了噬菌斑。rII47, rII51和rII106均不能单独感染K12菌株，不能产生噬菌斑。而且rII47与rII106的连锁图距较rII51与rII106大，显然在K12菌株中形成的噬菌斑只能是等位基因功能互补的结果（图2－9） ? S.Benzer 通过对rII 区所有突变体的互补测验证明RII 区仅含有A ，B 两个重要的
结构基因(图2-10)。并确定了A ，B 基因在染色体上的区域大小。同时提出了著名的顺反子理论(theory of cistron ）。这一理论对经典的基因概念进行了重要的修正！顺反子理论认为，基因（也即顺反子）是染色体上的一个区段，在一个顺反子内有若干个交换单位（否RII 区
RII 47 104 101 103 105 106 51102
则就不可定位出rII 区个突变位点的排列与连锁图距），最小的交换单位被称为交换子（recon ）。
E.coli K12培养皿
图2-8 rII 区的互补测验实验
图
2-9 互补测验体系中的功能互补原理
图2-10 互补测验确定的T4噬菌体RII 区的顺反子
? 在一个顺反子中有若干个突变单位（否则在RII 区域内就不会有rII47, rII104, rII51等数百个
突变体），最小的突变单位被称为突变子（muton ）。在一个顺反子的结构区域内，如果发生突变就会导致功能的丧失，所以顺反子即基因只是一个具有特定功能的、完整的、不可分割的最小的遗传单位。
? S.Banzer 关于顺反子理论的提出不仅将基因的“三位一体”的经典概念修正为基因的“一
位一体”概念，而且动摇或否定了“拟等位基因”的概念，认为拟等位基因实际上是基因内不同位点的突变体，是复等位基因的不同成员。同时将“在同一基因座位(locus)中，同一突
变位点（site）向不同方向发生突变所形成的等位基因”称为全同等位基因( homoallele )。将“在同一基因座位中，不同突变位点发生突变所形成的等位基因”称为非全同等位基因( heteroallele )。早期在果蝇及玉米中发现的，突变体与突变体杂交后代出现野生型个体的现象实际上是非全同等位基因间交换的结果。全同等位基因间在对称交换的前提下，是不会出现野生型基因的。
?Jacob, Monod 1961年关于乳糖操纵子（Lactose operon）的理论进一步揭示了“一个基因功能的表现是在调控基因控制下若干基因相互作用的整体行为”。
2.2.4 DNA是主要的遗传物质
从1928年Frederick Griffith到1944年Oswald Avery 科学家在长达16年围绕肺炎双球菌遗传转化的研究，证实了DNA是引起RII型转化为SIII型的主要遗传物质。Avery的体外遗传转化实验是十分严谨的，但终因时代的局限, 被誉为分子生物学界孟德尔的Avery的成就长久得不到学术界与Nobel基金委员的认可与肯定。然而事隔8年后, Avery的科学发现在1952年被Hershey－Chase等人关于T2噬菌体震渗实验所证实。Hershey在T. F. Anderson (1949年) 和Herriott（1951年）对噬菌体研究的基础上，分别用32P和35S标记T2噬菌体的DNA和蛋白质外壳，将被标记的T2噬菌体感染E.coli寄主细胞，采用振荡，离心和同位素检测技术，发现35S存在于离心管的上清液中，而32P存在于底层菌体沉淀中。实验揭示了T2噬菌体侵染寄主时，将蛋白质外壳留在寄主细胞外，而将自己的DNA注入寄主细胞内，并以其为模板合成DNA分子，衍繁后代。实验直接证实了DNA是主要的遗传物质。
这一结果不仅得到科学界的广泛认可，而且Hershey也因此获得1969年Nobel医学生理奖。
二十世纪四十年代W. T. Astbury用X光衍射研究DNA结构，1950年Chargaff发现DNA 组成的A＝T，C＝G，A＋G／T＋C＝1的当量规律，1952年M. H. Wilkins完成高质量的DNA纤维X射线衍射照片，1957年Watson和Crickt提出著名的DNA双螺旋结构的模型，从而奠定了基因的分子生物学基础，开创了分子生物学的新纪元。
作为主要遗传物质的DNA（少数RNA病毒的遗传物质为RNA分子）以两种方式携带着生物的遗传信息。其一是以中心法则为基础的结构基因遗传信息，这种DNA信息是通过转录RNA，翻译蛋白质而表达的，以三联体密码子的方式编码，储存在非模板链（有义链）的一级结构上，并具有简并性(degeneracy)。另一类是调控基因选择性表达的遗传信息，它是以具有特定三维结构的调节蛋白（反式作用因子）与特定核苷酸序列的DNA区段（顺式作用因子）相结合，从而启动某结构基因特异性表达的方式而体现的。这种调控密码类似于
图2-11 Stanley B. Prusiner 钥匙与锁的空间密码，由于一种反式作用因子可与多种顺式作用因子作用，或一种顺式作用因子可接受多种反式作用因子（真核生物基因表达调控的特异性往往通过多对顺、反因子的作用而实现），因而也同样具有遗传的简并性。
1956年A. Gierer 和G . Schraman 将从烟草花叶病毒（TMV ）中分离出的RNA 接种烟草，可以产生典型的TMV 侵染病斑，当用RNA 酶消化TMV 提取液，就失去了这种侵染能力，
从提取液中分离的蛋白质不具备这种侵染能力。从而证明RNA 也是RNA 病毒的遗
传物质，这一结论也被H. Fraenkel-Conrat 和B. Singre 的研究证实。
引起羊痒疫 (scrapie)，人类kuru 病和牛海绵状脑炎(疯牛病)
的传染性病原蛋白颗粒（Prion . proteinaccous infections particle)，
使科学界曾一度出现关于遗传物质争论的风波. 仅具蛋白质的朊
病毒（Prion ）的复制是如何进行的？蛋白质是否也可能是遗传物
质？美国加州大学Stanley B. Prusiner (图2-11)出色的工作证明，
Prion 朊病毒的繁殖是将自身（PrP CS ，27-30kd ）的分子结构信息
通过与正常膜蛋白（PrP C ，33-35kd ）的结合， 在分子伴侣的辅助下，传递给PrP C 并其转化为PrP CS 的过程。Stanley B. Prusiner 不仅因此获得1997年的Nobel 奖，而且也结束了关于蛋白质是否也为遗传物质的争论。
DNA 作为主要遗传物质的优点在于其储存遗传信息的量大，在1kb DNA 序列中，就可能编码有41000 种遗传信息；以A / T, C / G 互补配对形成的双螺旋，结构稳定，利于复制，便于转录，可以突变以求不断进化，方便修复以求遗传稳定；核糖的2’ – OH 脱氧，使其在水中的稳定性高于RNA ，DNA 中有T 无U ，消除了C 突变为U 带来进化中的负担和潜在危险。
2.3基因的分子结构
2.3.1 核酸的分子结构
1957年Watson 和Crick 关于DNA 双螺旋结构的模型，不仅为回答基因如何进行复制，如何实现表达，如何发生突变的分子生物学机理，而且系统地阐明了基因的分子结构。 DNA （Deoxynucleotide Acid ）作为主要的遗传物质，从结构上讲，它是两条多聚脱氧核苷酸链以极性相反，反向平行的方式，由氢键连接而成的双螺旋结构。每条多聚脱氧核苷酸链的基本组成单位或单体是脱氧核苷酸（Deoxynucleotide dNt ）, 每个脱氧核苷酸由一
个磷酸和一个脱氧核苷（Deoxynucleoside, dNs ）组成，而每个脱氧核苷又由一个脱氧核糖和一种碱基组成，在DNA 分子中，碱基有两种嘌呤（腺嘌呤A ，鸟嘌呤G ）和两种嘧啶（胸腺嘧啶T ， 胞嘧啶C ）(图2-12)。
嘌呤
核酸(NA) 多聚核苷酸链(poly Nt)
(Nt) 一磷酸(M p)脱氧核糖( 核糖)
碱基(pu) 嘧啶(py)
腺嘌呤Aderine (A) 胸腺嘧啶Thymine (T)
鸟嘌呤Guanine (G) 尿嘧啶Uracil (U)
胞嘧啶Cytosine (C)
图2－12 核酸的分子组成
核苷酸RNA 分子与DNA 分子在结构上的差异主要表现在，（1）核苷中的核糖为3’位非脱氧的OH 基，（2）碱基中没有胸腺嘧啶T （除tRNA 分子的T ΨC 环外），只有尿嘧啶U （图2
－13），（3）RNA 分子多为单链分子, (4) RNA 分子的化学稳定性较差，易发生降解，（5）在以DNA 为主要遗传物质的生物中，DNA 分子链长，数目少，而RNA 分子链短，数目多。
图2－13 组成核酸分子的主要碱基
2.3.2 核苷的分子构象 ( conformation of nucleoside )
由一磷酸分子和碱基组成的核苷是通过核糖的C1与嘌呤N9位，或与嘧啶N1位之间的糖苷键连接而成的。由于碱基可以糖苷键为轴而旋转，使糖环与碱基处于不同的空间中，从而形成核苷的不同构象，直接影响DNA 分子结构的多型性和稳定性。如图2－14 所示，
将碱基以糖苷键为轴旋转形成的角定义为χ角，嘌呤核苷中的χ角为C4-N9――C1’-O4’之间的平面角，嘧啶核苷中的χ角为C2-N1――C1’-O4’之间的平面角。当χ= 0 °±90°时，被定义为顺式构象（syn conformation），当χ= 180 °±90°时，被定义为反式构象（anti conformation）（图2－15,16）。
在常见的B型DNA中，碱基对间均是以反式构象形成氢键，但在Z型DNA中，因除鸟嘌呤核苷以顺式构象外，其他碱基核苷均是反式构象，因而使DNA的磷酸骨架呈之字型走向。
图2－14 核苷的χ角
顺式构象
图2－15 嘧啶和嘌呤核苷的反式与顺式构象
A.嘧啶和嘌呤核苷的反式与顺式构象
B.嘧啶和嘌呤核苷的反式与顺式构象
2.3.3 DNA 双螺旋结构模型(DNA Double Helix Model)
Chargaff发现DNA组成的当量规律证明，尽管不同生物的DNA分子中碱基数量差异较大，组成不等，但A＝T，C＝G，即A＋G／T＋C＝1。这一规律（Chargaff法则）
为DNA分子中A/T配对，G/C配对，形成双螺旋结构提供了重要的理论依据。1952年M. H. Wilkins和Franklin完成的高质量的DNA纤维X－衍射照片表明，DNA分子中原子排列沿纵轴存在0.34nm和3.4nm的周期性，这一结论证明DNA分子具有螺旋构象。1952年Alexander Todd证明多聚核苷酸链是以3’, 5’ 磷酸二酯键（phosphodiester bonds）将核苷酸连接而成的。1957年Watson和Crickt在前人所取得的重要成就的基础上，凭借专业互补的
图2－16 核苷的反式与顺式分子结构图
优势和科学分析提出了著名的DNA双螺旋结构的模型，揭示了DNA分子是由两条反向平行的多聚核苷酸链组成的，磷酸骨架主链位于螺旋的外缘，A/T，G/C以氢键方式连接形成的碱基对堆积在螺旋内部，向右盘旋的B型双螺旋棒状实体（图2－17）。其主要的结构特征是：
图2－17 B型DNA双螺旋分子是碱基堆积的棒状实体
1，脱氧核苷酸之间是通过3’, 5’磷酸二酯键将脱氧核糖5’位和3’位连接，形成螺旋体的磷酸骨架（图2－18）。每条多聚脱氧核苷酸链具有5’ 磷酸末端和3’羟基末端
的极性方向。两条多聚脱氧核苷酸链以极性相反，反向平行的方式，按A/T，G/C 配对的原则，以氢键连接向右盘旋形成B型双螺旋体(图2-19)。B型DNA螺旋的直径2.0nm (20?)，由于核糖与磷酸的亲水性，决定了螺旋体的磷酸骨架处于螺旋的外侧，核糖平面与螺旋轴平行，碱基对处于螺旋的内侧，碱基对平面与螺旋轴基本垂直（在受到碱基对间的挤压作用下，碱基的平面角度会发生相应的调整与改变）。
图2－18 核苷酸间的磷酸二酯键
2，多聚核苷酸链间形成氢键的前提是具有为共价键束缚的氢原子和受体原子，并能满足碱基之间按氢键互补配对的方式，形成直径2.0nm的螺旋体(图2-20)。在DNA分子中嘌呤环与嘧啶环上的氨基等均具有能提供氢键的为共价键束缚的氢原子和酮基等受体原子，从图2－21 可见，A/T, G/C 碱基对（base pair, bp）间以N—H--N和N —H--O的供体－氢原子--受体方式形成氢键互补配对，满足了多聚核苷酸链间形成氢键的基本前提，A/T之间以二氢键配对, G/C之间以三氢键配对，这种配对关系也称为Watson－bond。碱基对之间依螺旋体的旋转有规律地堆积在螺旋的内侧。
3，双螺旋中任一条核苷酸链绕纵轴旋转360°（一周）所升降的螺距为3.4nm, 其中包
含有10个碱基对，每对碱基对之间相拒0.34nm, 相对于螺旋纵轴上升或下降了
36°。
4， 由于从螺旋轴心到两条磷酸骨架主链所划分的两个扇形不等，一个大于180°，一个
小于180°，从而沿螺旋轴方向观察，双螺旋的表面形成两条凹槽，一条宽而大，被
称之为大沟，一条小而窄，被称之为小沟。由于螺旋轴穿过碱基对中央, 大、小沟的
深度相似。 碱基顶部的极性基团裸露在DNA 大沟内，存在较多能与蛋白质因子形
成特异结合的氢键的供体与受体，加之大沟的空间大，能提供蛋白质因子沿大沟与
DNA 形成专一性结合的机率与多样性远高于小沟，因而大沟往往是基因表达调控的
重要位点（图2－19）。
图2－19 B 型DNA 的结构及磷酸骨架
图2－20 B 型DNA 的分子结构图
图2－21 DNA分子A/T与G/C碱基对间形成的氢键
2.3.4 影响双螺旋结构稳定性的因素
作为遗传物质的DNA分子, 以碱基堆积的双螺旋结构形式存在于细胞内, 既保证了基因表达的灵活性, 又具有保证遗传稳定性的结构基础。从结构生物学角度分析，促进细胞内DNA双螺旋结构稳定的因素有：
1，氢键（Hydrogen bond）。氢键从本质上讲是一种静电力，是作用力仅有4~6 kc / mol 的次级弱键，因此加热便可使DNA双链解链。由于DNA分子是成千上万对碱基对堆积的实体，许多弱氢键按一定的方向，呈线性地连续排列和堆积形成的集合能是十分大的，成为促使DNA趋于稳定的主要因素。
2，磷酸酯键(phosphodiester bond) 。80~90 kc / mol强作用力的磷酸二酯键是连接核苷酸形成DNA双螺旋骨架的重要作用力。也是稳定DNA螺旋体的主要因素。
3，在0.2 mol/L 钠盐的细胞内生理条件下，围绕DNA分子的Na＋离子，可有效地屏蔽带较强负电荷的两条核苷酸链上磷酸基团间的静电斥力，成为促进DNA趋于稳定的因素之一。
4，碱基堆积力。DNA螺旋体是内部由重叠排列的碱基对堆积的一个棒状实体。在同一条核苷酸链中, 相邻碱基间的疏水作用力和范德华作用力（Van der Waal force），统称为碱基堆积力，也称为非特异性结合力。水分子是一个由氢键结构组成的网络状态，每个氧原子由4个氢原子包围，其中两个是自身的氢原子，另两个是与其他水分子形成氢键所共有的。不溶于水的疏水物质有减少与水分子接触，依靠疏水作用力而聚集的能力。在细胞环境中，位于DNA螺旋体内部的碱基具有疏水性极强的芳香环，难以与水分子形成氢键，相邻碱基依靠疏水作用力（即熵，Entropy）相互连接，但DNA 分子中的亲水基团核糖与磷酸使水分子中的氢键网络破坏，进而形成新的氢键网络，这也意味着熵值的降低，DNA螺旋中碱基有序的堆积使以氢键连接方式围绕的水分子降低到最小限度，即将熵值赋予的疏水作用力维持在最大值，在水溶液中这种作用力对维持DNA稳定性的贡献可能大于氢键的贡献。
DNA双螺旋中相邻碱基间的垂直螺距为 3.4?, 而嘌呤环与嘧啶环之间的范德华作用力的半径为 1.7?, 其作用力大小为1千卡／mole, 在大量嘌呤与嘧啶碱基堆积的DNA分子中，累积的范德华作用力也成为维持DNA稳定不可低估的因素。
5，碱基对之间的挤压、抵御可以使DNA分子的内能增加, 碱基间有序排列的状态破坏，
氢键作用力被减弱。一切减弱氢键作用力的因素都会导致DNA双螺旋结构的不稳定。
2.3.5 DNA分子的变性与复性( DNA denaturation and renaturation )
，DNA的两条核苷酸链是由碱基对之间氢键连接的，当天然DNA的溶液被加热或受到极端pH溶剂、尿素, 酰胺等某些有机试剂处理后，碱基对之间的氢键会发生断裂、或氢键的形成关系会发生改变、或碱基间的堆积力会受到破坏，两条核苷酸链便逐渐彼此分离，形成无规则的线团，这一过程称为变性（DNA denaturation），也称为熔解(melting)。已发生变性的DNA溶液在逐渐降温的条件下，两条核苷酸链的配对碱基间又重新形成氢键，恢复到天然DNA的双螺旋结构，这一过程称为复性（DNA renaturation），也称为重退火(reannealing）（图2－22）。
2.3.5. 1 DNA分子的变性
研究DNA发生变性的规律往往采用加温变性法，极端酸碱变性法，变性剂处理法（凡能与核苷酸形成氢键，或减弱碱基堆积作用的有机试剂均称为变性剂，如尿素、甲酰胺等）等。其中以采用加温变性法最为方便，最为广泛。当然各种方法均有其利弊，采用热变性
图2－22 DNA分子的变性与复性
法时，高温也可能引起磷酸二酯键的断裂，形成长短不一的DNA分子，进而影响变性动态的研究。在制备单链DNA时往往采用pH11,3的强碱变性法，可以使DNA中的氢键全部解除，完全变性为单链DNA，但必须维持这种强碱环境，或使变性DNA处于Na盐浓度低于0,01mol/L的溶液中，消除对单链DNA磷酸基团间静电斥力的屏障，防止单链DNA
图2－23 不同核酸分子的紫外吸收特征值 1.双链DNA 2.变性DNA
3.核苷酸的紫外吸收
分子的靠近和配对。
由于DNA 分子的变性过程是碱基对间的氢键逐渐断裂的一个动态过程，测定变性发生过程的方法有紫外分光光度法（光吸收法）、园二色性法、层析法、旋光色散法等，但每一种方法都是基于跟踪度量DNA 分子在不同变性处理时段内由双链变为单链状态的某一理化特征。
碱基中的嘌呤环与嘧啶环对260nm 的紫外光具有强烈的特征吸收值。在DNA 双螺旋分子中，碱基的嘌呤环与嘧啶环被有序地排列并
堆积，相邻碱基间的电子相互作用导致对紫外光
的吸收值明显降低。碱基的排列越是有序，这种
吸收值就越低。研究证明浓度均为50μg/ml 的
双链DNA 、单链DNA 和游离脱氧核苷酸的溶液，
其A 260值分别为1.00、1,37和1,60。当在进行
DNA 热变性研究时，这种随温度升高单链状态的
DNA 分子不断增加而表现出A 260值递增的效应被
定义为碱基的增色效应（hyperchromycity ），或DNA 的减色效应。
溶液的粘度取决于分子流动过程中的内摩擦和阻力，因此高分子溶液的粘度大于普通溶液，线状分子溶液的粘度大于不规则线团分子溶液，更大于球形分子溶液。具有螺旋结构的双链DNA 分子由于有大量氢键的支撑， 钢性较强，结构较为舒展。而一旦发生变性的单链DNA ，由于失去了氢键支架，其构型也由双螺旋状态转向为折叠和线团状态，使变性的单链DNA 表现出粘度降低的特征。不同状态的DNA 分子其沉降系数也不同，发生了变性的单链DNA 的离心沉降速度会明显加快。
在多种变性研究的方法中，紫外分光光度吸收法
较粘度测定法、离心法等更为简单、方便、准确。
图2－24示意了天然DNA 分子热变性的动态过程。
缓慢均匀加热天然DNA 溶液，并记录不同温度下，
DNA 溶液的A 260值并绘制DNA 熔解的动态曲线。当温
度上升至70℃左右时，A 260值基本保持不变，此时
DNA 在总体结构上仍处于双链状态，当温度继续升高到80℃左右时，A 260值在6℃－8℃狭窄的范围内急剧上升,约40％的DNA 分子出现较多
的单链部分，经过这一增色效应的跳跃之后，随着温度的继续上升，A 260值的增加又处于平坦缓慢的状态，再继续增加到40％左右后，A 260值达到1.37，表明双链DNA 已完成了全部的变性过程。通过对不同DNA 分子变性S 曲线的分析，将增色效应达到最大值一半的温度定义为该DNA 分子的变性温度或T m 值（melting temperature ）。
由于DNA 分子中G/C 碱基对有三氢键，在热变性过程中其稳定性较具有二氢键的A/T 碱基对更高，特别是在A/T 碱基对集中分布的DNA 分子中，当温度逐步升高时，变性会首先在A/T 集中区域发生，整个DNA 分子会形成若干个泡状结构。随着温度的继续升高，泡状结构也会不断扩大，单链DNA 部分也增加，表现出增色效应的跳跃现象（Jump of Hyperchromicity ）。经过短暂的A 260值的跳跃阶段后，才逐渐进入完全变性的过程（图2－25）。可见富含AT 碱基，或A/T 分布较为集中的DNA 分子，在热变性过程中较富含GC 碱基，或A/T 碱基对分布均匀的DNA 分子热稳定性差，具有较低的T m 值，通过对不同生物DNA 分子热变性动态过程的比较研究，不仅可以了解各种DNA 分子的核酸组成与分布，也成为分子生物学研究的重要技术手段。
图2－25 DNA 分子变性的跳跃现象
不同DNA 分子T m 值的大小是反映DNA 热变性过程的重要常数。大千世界，物种繁多，维系这种生物的多态性是不同结构与组成的DNA 分子。多数物种或富含A/T, 或富含G/C,少有A/T 与G/C 含量相等的物种，微生物中DNA 的碱基组成差异尤为明显，其（G ＋C ）的含量变化在20％－80％之间。
影响DNA 分子热变性T m 值的主要因素有：
（1）DNA 分子的碱基组成。在 A, T, C, G 随机分布的情况下，（G ＋C ）含量愈高的DNA 分子，T m 值也愈大，（G ＋C ）含量愈低的DNA 分子，T m 值也愈小。1962年Marmur 和Daiy 在进行大量热变性研究的基础上提出了计算T m 值的Marmur －Doty 公式，（G ＋C ）％含量为30-70%之间的DNA 分子，在1倍SSC 缓冲液的反应条件下( 0.15 mol/L 氯化钠 + 0.015 mol/L 柠檬酸钠 )，T m 值为：T m = 69.3 + 0.41 × (G+C)%，即G ＋C 的含量每上升1％，T m 值则增加0.4℃。或已知某一DNA 分子的T m 值，根据公式可以推断其 （G ＋C ）％＝(T m - 69.3)×2.44（图2
富AT 区富AT 区
－26）。
图2－26 不同物种间(G+C)%含量与T m值的线性关系及比较
（2）DNA分子的碱基排列。在（G＋C）%含量相同的DNA分子间， A/T碱基对集中分布，可形成变性的跳跃核心，其变性速度较快，T m值较小。除变性跳跃核心的影响外，在碱基组成相同, 但排列不同, 沿纵轴排列的碱基对之间堆积力的差异，碱基的-NH2, -N=, =O,卤素基团与邻近碱基的芳香环互作方式不同,互作强度的差异等均直接影响DNA分子的稳定性相关, 表现出T m 值的不同(图2-27)。碱基对间的堆积力与垂直方向碱基环的重叠面成正比，例如5’嘌呤→3’嘌呤＞ 5’嘌呤→3’嘧啶＞ 5’嘧啶→3’嘧啶。
从图2－28 可见不同碱基排列的DNA分子之间，其碱基的堆积力与T m值间存在明显的正相关关系。特别是TATA排列的序列，在基因组内往往是基因转录的启动子序列，DNA复制的原点序列等，其T m值仅有37.73℃, 意味着这些位点的双链状态在活体细胞的正常温度下，就可自然地开链，形成单链状态，这种被称为“DNA呼吸”的现象与基因表达等功能是相适应的。
（3）DNA片段的大小大片段DNA分子间比较，片段长短对T m值的影响较小，短于100个碱基对的DNA分子间比较，片段较短的T m较小。
（4）变性剂的影响在含有尿素，酰胺等变性剂的溶液中，变性剂物质会与DNA分子中的碱基形成新的氢键，改变原有的A／T，G／C的配对关系，从而导致T m值的降低，甚至可降至40℃。这也是分子生物学研究中采用的尿素变性凝胶的基本原理。
（5）盐浓度变性液中的Na＋盐浓度愈高，对核苷酸上磷酸基团静电荷的屏蔽作用就愈大，双螺旋DNA分子的稳定性就愈高，T m值也就愈大。相反，Na＋盐浓度愈低，DNA分子中的两条核苷酸链间的斥力就愈高，T m值也就愈低（图2－29）。
不同构向DNA 分子中的碱基堆积的程度
碱基的堆积程度
＞
Py Pu Pu Py
图2-27 不同构相DNA 分子中的碱基堆积程度
图2－28 各种碱基排列的DNA 分子间堆积力与Tm 值的线性关系
（6）pH 值 当DNA 溶液的pH 值在5－9范围内，热变性测定的T m 值变化不大。但当pH 值小于5时，DNA 分子易发生脱嘌呤，特别是当反应缓冲液pH 值为2－3的强酸性时，碱基会发生广泛质子化，当反应缓冲液pH 值为12的强碱性时，碱基中的酮基会转变为烯醇基，从而使DNA 分子中的氢键减弱，引起T m 值降低。
2.3.5. 2 DNA 分子的复性
将发生完全变性的DNA 溶液缓慢降温，冷却到低于T m 值25℃条件下并维持较长的一段时 间，此时DNA 溶液的A 260也会迅速降低。如果再次对这一溶液加热，可发现其熔解曲线图（或T m 值）与天然DNA 的几乎完全相同，表明缓慢降温可使变性的单链DNA 分子完全恢复到天然的双链结构状态，发生了准确的复性过程。
136.12