培养基及培养条件对青钱柳愈伤组织生长和黄酮含量的影响
上官新晨,郭春兰,杨武英,蒋艳,沈勇根
(江西农业大学植物资源开发与利用研究室,江西南昌330045)
摘要:在固体培养条件下,研究了不同外植体来源、培养基、植物激素、接种量、培养时间对青钱柳愈伤组织生长和黄酮含量的影响.结果表明:①不同外植体来源的愈伤组织增长量茎段大于叶片,而黄酮含量叶片大于茎段;②8种基本培养基中,改良MS培养基上的愈伤组织增长量及黄酮含量均显著高于其它培养基;③促进青钱柳愈伤组织增长量和黄酮含量积累的最佳激素组合为: 1.0 mg·L-1KT+0.5 mg·L-12, 4-D +0.3 mg·L-1NAA;④愈伤组织增长量最大时的接种量为0.65 g;⑤愈伤组织培养至12 d增长量最大,培养16 d,黄酮含量达最高值.
关键词:青钱柳;愈伤组织;黄酮含量中图分类号:Q943.1文献标识码:A文章编号:1671-5470(2006)06-0588-05
Effects of basicm edia and culture conditions on callus growth and flavonoid content of Cyclocarya paliurusSHANGGUAN Xin-chen, GUO Chun-lan, YANGWu-ying, JIANG Yan, SHEN Yong-gen(PlantResources Exploitation andUtilization Laboratory, JiangxiAgriculturalUniversity, Nanchang, Jiangxi 330045, China)
Abstract:Under the solid culture conditions, the effects of source of explants, medium, phytohormone, inoculating quantity and culture days on growth of calli and contentof flavonoid inCyclocarya paliuruswere studied. The results showed as follows. The cal-lus growth quantity from different explant source in stem was higher than that in lea,f but the flavonoid content in leafwas higher than that in stem. Of eight sorts of basic mediums, the callus growth quantity and flavonoid content in the improvedMS medium were significantly higher than those in the othermediums. The optimal hormone combination promoting the callus growth and fla-vonoid content accumulation was 1. 0 mg·L-1KT+0. 5 mg·L-12, 4-D+0. 3 mg·L-1NAA. When the callus growth quantitywas the highest, the inoculation quantitywas 0. 65 g. The callus growth quantitywas the higheston the 12th day, and the flavonoidcontent reached the peah value on the 16th day.Key words:Cyclocarya paliurus; callus; flavonoid content
青钱柳[Cyclocarya paliurus(Bata.l ) Iljinskaja]为胡桃科(Juglandaceae)青钱柳属落叶乔木[1],是我国特有的珍稀单种属植物,国家重点保护濒危植物之一,又名摇钱树、麻柳、青钱李等,广泛分布于我国广东、广西、福建、台湾、浙江、江苏、安徽、江西、湖南、陕西、四川、云南、贵州等省区的海拔420-2500 m的山区、溪谷或石灰岩山地[2].长期以来,江西民间取其叶制茶作饮料,据《中国中药资源志要》[3]记载,其树叶、树皮、树根可入药.青钱柳又是我国特有的保健食品资源.其水提物具有生津止渴、清热解毒、降低血糖和血压、降血脂、治疗顽癣、抗氧化、抗衰老和增强机体的免疫力等多种功效[4-6].然而,由植物次生代谢途径生
成的有效药用成分的含量很低,虽然可通过提取获得产品,但受含量低、原料、季节等条件的限制,提取量非常有限,而且青钱柳本身繁殖系数低,可利用资源匮乏[7].因此,青钱柳保健品至今难以满足市场需求,研究利用青钱柳细胞培养技术生产黄酮和生物碱等次生代谢产物对大规模商业化生产青钱柳重要活性成分具有重大的现实意义.目前,仅见对青钱柳愈伤组织的诱导进行了初步研究[8],但青钱柳组织培养中次生代谢物的研究未见报道.本研究通过培养基和培养条件的优化组合,筛选青钱柳愈伤组织高增长量和黄酮高含量培养基,为大规模组织培养生产青钱柳药用有效成分提供一定的理论依据.
1材料与方法
1.1培养基及培养条件的选择
分别将3年生青钱柳母树幼叶和幼茎诱导出的愈伤组织接种至改良MS培养基上,附加0.5 mg·L-12,4-D、1.0 mg·L-1KT和0.3 mg·L-1NAA培养3代后,进行来源于不同部位外植体愈伤组织的生长和黄酮含量的试验.选用MS、B5、N6、H、White、WPM、DKW、改良MS 等8种基本培养基,附加0.3 mg·L-12, 4-D+0.5 mg·L-1BA+10 g·L-1Vc,分别对来源于茎段和叶片的愈伤组织生长量和黄酮类化合物积累进行试验.对2, 4-D(0.0、0.2、0.5、1.0 mg·L-1),NAA(0.0、0.3、0.5、1.0 mg·L-1)和KT(0.0、0.3、0.5、1.0 mg·L-1)3种植物激素进行L16(43)正交试验,利用DPS软件对试验结果进行分析,优选出有利于愈伤组织生长和黄酮类化合物形成的激素组合.取茎继代培养第3代愈伤组织,在改良MS+1.0 mg·L-1KT+0.5mg·L-12, 4-D+0.3mg·L-1NAA培养基上进行不同接种量对青钱柳愈伤组织增长量影响和继代培养次数对愈伤组织增长量和总黄酮产量积累影响的试验.培养室温度(25±1)℃,光照强度1500-2000 lx,光照时间12 h·d-1.
1.2总黄酮标准曲线的制作
精密称取120℃干燥至恒重的芦丁标准品10 mg,用体积分数为80%乙醇溶解,定容至25 mL,摇匀.分别吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mL于10 mL的试管中,加入0.3 mL 50 g·L-1NaNO2,放置6min,加入0.3 mL 100 g·L-1Al(NO3)3,放置6 min,再加入4 mL 40 g·L-1NaOH,加水至刻度10 mL,摇匀后静置15 min.用754PC型分光光度计在波长509 nm处测得光密度值.经最小二乘法作线性回归得到决定系数(R2=0.9997)的回归方程:Y=9.3929+0.0027X.
1.3青钱柳愈伤组织生长量和总黄酮含量的测定方法
1.3.1愈伤组织增长量(鲜重)的测定每个处理接种30瓶,每瓶接种愈伤组织块2-3块,接种量0.65g左右.观察继代后的愈伤组织颜色、质地及生长势,愈伤组织生长15 d后收获,取出每瓶愈伤组织块进行称量,计为每瓶愈伤组织的鲜重.本试验采用固体培养基易于收集细胞与准确称重,便于计算愈伤组织增长量和增长率.愈伤组织增长量/(g·瓶-1) =收获量-接种量;愈伤组织增长率/% =愈伤组织增长量×100/接种量.
1.3.2总黄酮含量的测定把培育好的愈伤组织于50-60℃烘箱中干燥,干燥后碾成粉末,取粉末
2.0g,用70%乙醇水溶液按料液比为1∶10,在60℃提取3 h,定容为250 mL后离心得上清液.准确吸取上清液0.3 mL于10 mL试管中,按标准曲线的制备方法操作,在波长为509 nm处测得样品的光密度值,根据回归方程计算出样品中的总黄酮含量.试验均重复3次,结果取其平均值.
2结果与分析
2.1不同来源的愈伤组织继代生长和黄酮含量的比较
分别以3年生青钱柳母树幼叶和幼茎诱导出的愈伤组织在继代培养基上培养3代后,测定来源于不同部位外植体愈伤组织的增长量和黄酮含量,试验结果见表1.
表1不同来源的愈伤组织增长量及黄酮含量的比较1)
Table 1Comparison of callus growth quantities and flavonoid content among different sources
来源愈伤组织
增长量(鲜重) /(g·瓶-1)增长率/%生长情况w(黄酮) /%
叶片9.87±0.32Bb 1518 ++++ 3.61±0.03Aa
茎段11.93±0.24Aa 1835 ++++ 2.03±0.03Bb
1)数字后附不同大、小写字母者分别表示差异达0.01、0.05显著水平; ++++.生
长好.
由表1可知,不同来源愈伤组织的保
持能力差异较大.茎段和叶片2种外植体
来源的愈伤组织增长量和黄酮含量差异均
极显著,茎段来源愈伤组织增长量大于叶
片来源愈伤组织增长量, 2种外植体来源
的愈伤组织增长倍数分别为18.35、15.18.
叶片来源的愈伤组织黄酮含量高于茎段来
源的愈伤组织黄酮, 2种外植体来源的愈
伤组织黄酮含量分别为3.61%、2.03%.
由于总黄酮产量由愈伤组织增长量及总黄酮含量共同决定,为得到较高的黄酮生物产量,应选择叶片
来源的愈伤组织生产黄酮.
2.2不同基本培养基对愈伤组织生长和黄酮含量的影响
由表2、3可知,在改良MS培养基上形成的愈伤组织为浅绿色,增殖最快,茎、叶来源的愈伤组织生长
倍数分别为12.00和11.00,生长旺盛,而且愈伤组织比较容易形成松散的细胞,展示出较好的保持潜力;
在MS培养基上形成的愈伤组织为黄绿色,增殖较快,但极易褐变,寿命较短;在B5、DKW和WPM培养基
上形成的愈伤组织增殖相对较慢,但愈伤组织的质地较坚硬,呈淡绿色,也有较好的保持潜力;N6、H和
White培养基上形成的愈伤组织增殖极慢,呈水渍状,尤以White培养基最为严重.从外植体来看,幼茎形
成的愈伤组织增殖较快,愈伤组织呈颗粒状,较易分散;幼叶形成的愈伤组织质地较疏松,增殖相对较慢,
但寿命较长.
表2不同基本培养基对茎愈伤组织生长和黄酮含量的影响1)
Table 2Effects ofdifferentmedia on shoot callus growth and flavonoid content
基本培养基茎愈伤组织
增长量(鲜重) /(g·瓶-1)增长倍数生长情况2)w(黄酮) /%
MS 7.06±0.19ABb 10.86 +++ 3.24±0.05Bb
B53.49±0.22Dd 5.37 ++ 2.08±0.06Dd
N62.93±0.29Dd 4.51 + 1.68±0.06Ee
H 2.91±0.33Dd 4.48 + 1.24±0.05Gg
White 1.52±0.11Ee 2.34 + 1.03±0.08Hh
DKW 6.17±0.16CC 9.49 +++ 1.46±0.06Ff
WPM 6.43±0.19BCc 9.89 +++ 2.29±0.05Cc
改良MS 7.80±0.21Aa 12.00 ++++ 3.57±0.04Aa
1)数字后附不同大、小写字母者分别表示差异达0.01、0.05显著水平;2)+.生长差; ++.生长一般; +++.生长较好; ++++.生长好.
表3不同基本培养基对叶愈伤组织生长和黄酮含量的影响1)
Table 3Effects ofdifferentmedia on leaf callus growth and flavonoid content
基本培养基叶愈伤组织
增长量(鲜重) /(g·瓶-1)增长倍数生长情况2)w(黄酮) /%
MS 6.27±0.25Bb 9.65 +++ 3.49±0.07Bb
B54.64±0.16Cd 7.14 +++ 2.24±0.04Dd
N62.65±0.08Ef 4.08 ++ 1.72±0.04Ee
H 3.78±0.12De 5.82 ++ 1.64±0.03Ee
White 1.19±0.15Fg 1.83 + 1.28±0.05Ff
DKW 4.85±0.15Ccd 7.46 +++ 1.75±0.03Ee
WPM 5.13±0.17Cc 7.89 +++ 2.62±0.04Cc
改良MS 7.15±0.16Aa 11.00 ++++ 3.85±0.04Aa
1)数字后附不同大、小写字母者分别表示差异达0.01、0.05显著水平;2)+.生长差; ++.生长一般; +++.生长较好; ++++.生长好.
从表2、3可见,改良MS不仅适合愈伤组织的生长,还有利于总黄酮的形成.茎、叶愈伤组织增长倍数
分别为12.00和11.00,茎、叶黄酮的含量分别为3.57%和3.85%; B5培养基有利于总黄酮的积累但不利
于愈伤组织的生长.
表4L16(43)正交试验结果及极差分析
Table 4Orthogonal experiment results and their analysis of range
试验号因素
A(KT) B(2, 4-D) C(NAA)增长量/gw(黄酮) /%
1 1 1 1 2.56 0.37
2 1 2 2 9.1
3 0.97
3 1 3 3 8.71 0.67
4 1 4 4 7.78 0.71
5 2 1 2 7.38 0.77
6 2 2 1 6.91 1.13
7 2 3 4 5.46 2.11
8 2 4 3 4.69 1.54
9 3 1 3 12.80 1.67
10 3 2 4 13.41 2.67
11 3 3 1 10.99 2.46
12 3 4 2 7.92 2.98
13 4 1 4 10.84 3.93
14 4 2 3 13.26 4.43
15 4 3 2 16.24 4.65
16 4 4 1 11.08 3.16
均值K17.045 8.3950 7.8850
K26.110 10.6775 10.1675
K311.280 10.3500 9.8650增长量结果分析
K412.855 7.8675 9.3725
极差R′6.071 2.5290 2.0543
均值X10.6822 1.6868 1.7798
X21.3875 2.2985 2.3427
X32.4410 2.4713 2.0784黄酮含量结果分析
X44.0437 2.0977 2.3535
极差R′3.0254 0.7061 0.5164
表5增长量的方差分析
Table 5Variance analysis of callus growth quantities
变异来源平方和自由度均方F值显著水平
A 127.27010 3 42.42337 7.54515 0.01847
B 23.47625 3 7.82542 1.39178 0.33329
C 12.30895 3 4.10298 0.72973 0.57076
误差33.73560 6 5.62260
总和196.79090 15
表6黄酮含量的方差分析
Table 6Variance analysis of flavonoid content
变异来源平方和自由度均方F值显著水平
A 25.62457 3 8.54152 44.27154 0.00017
B 1.36842 3 0.45614 2.36422 0.17018
C 0.88088 3 0.29363 1.52189 0.30221
误差1.15761 6 0.19293
总和29.03147 15
图1不同接种量对青钱柳愈伤组织生长的
影响
Fig. 1Effects of inoculating quantity on the callus
growth
由图1可知,接种量在0.5-0.65 g之间,青钱柳愈伤组
织的增长量(鲜重)随接种量的增加而增加,当接种量超过0.
65 g后,愈伤组织的增长量开始下降,因此在150 mL玻璃瓶
中青钱柳愈伤组织接种量控制在0.65 g左右比较合适.接种
量过大或过小都不利于愈伤组织的生长,当接种量为0.65 g
时,其鲜重增加量最大.接种量过大,鲜重增加反而减少,且培
养后期愈伤组织更易老化.
2.5培养时间对愈伤组织生长和黄酮含量的影响
取茎继代第3次愈伤组织接种于改良MS+1.0 mg·L-1
KT+0.5 mg·L-12, 4-D+0.3 mg·L-1NAA培养基上,每天
进行12 h光照培养,每隔4 d取样1次,测定愈伤组织鲜重,
进行继代培养次数对愈伤组织生长和总黄酮产量影响的试验
(表7).
从表7可见,愈伤组织培养到第12天时,增长倍数最大
·591·第6期上官新晨等:培养基及培养条件对青钱柳愈伤组织生长和黄酮含量的影响2.3植物激素对愈伤组织生长和黄酮含量的影响
针对改良MS基本培养基的3种激素(2,4-D、KT和NAA)对茎段愈伤组织生长和黄酮含量的影响,采用
L16(43)进行正交试验,对3种激素的水平进行优化.正交试验结果及极差分析和方差分析见表4-6.
由表4可见,促进青钱柳愈伤组织生长和黄酮含量积累的最佳激素组合都是A4B3C2,即1.0 mg·L-1
KT+0.5 mg·L-12, 4-D+0.3 mg·L-1NAA的愈伤组织增长倍数最大,达到24.98,愈伤组织质地
较松
脆、粒大色浅黄;黄酮化合物积累最多,达4.65%.由表5可知, KT浓度对愈伤组织生长量的影响达显著
水平, 2, 4-D和NAA浓度影响不显著.由表6可见, KT浓度对黄酮含量积累是差异极显著的影响因素,
2, 4-D和NAA浓度的影响不显著.
KT浓度对青钱柳愈伤组织生长及黄酮积累有着极其重要的影响.这是由于KT在适宜的浓度范围
内,具有促进细胞分裂和伸长,促进细胞分化及物质的合成与运输,影响细胞中各种酶的活性等作用.
2.4继代培养的接种量对愈伤组织生长的影响
取茎继代第3次愈伤组织接种于改良MS+1.0 mg·L-1KT+0.5 mg·L-12, 4-D+0.3 mg·L-1NAA 培养基上,进行不同接种量对愈伤组织生长影响的试验.
为8.17倍,且愈伤组织质地松脆.所以最合适的继代时间为第12天,这也是愈伤组织培养的最佳转接时
间.从培养时间对黄酮含量的影响来看,培养至16 d愈伤组织中黄酮含量最高.
表7培养时间对愈伤组织生长和黄酮含量的影响1)
3讨论
培养基的组成直接影响细胞的生长及次生代谢物的产生,其中氮源的影响较为明显,很多文献都有报
道[9-12].不同培养基的无机元素浓度差异很大,对植物细胞生长和次生代谢产物的形成必然会有较大的
影响,培养基中硝态氮和铵态氮之间的比例也会影响愈伤组织细胞生长和次生代谢产物的合成.本试验的
改良MS培养基不仅有利于愈伤组织生长,也有利于总黄酮的形成.所以对培养基优化的研究有待进一步
深入,应采用统计分析方法对培养基中各种成分(N、C、P、Ca、Mg等)进行多因素水平的筛选.
不同类型的愈伤组织在细胞组成上有明显的不同,同一植株不同器官形成愈伤组织的能力也不同.本
试验中,叶片来源的愈伤组织黄酮含量高于茎段来源的愈伤组织.选用适当的基本培养基附加适当的植物
生长调节剂对愈伤组织培养非常重要,在L16(43)正交试验中得出, KT浓度对愈伤组织生长量和黄酮含
量的积累是影响显著的因素.促进青钱柳愈伤组织生长量和黄酮含量积累的最佳激素组合都是1.0 mg·
L-1KT+ 0.5 mg·L-12, 4-D + 0.3 mg·L-1NAA.
参考文献:
[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M]. 21卷.北京:科学出版社, 1979.
[2]应俊生,张玉龙.中国种子植物特有属[M].北京:科学出版社, 1994: 389-391.
[3]中国药材公司.中国中药资源志要[M].北京:科学出版社, 1994.
[4]冷任轩.青钱柳的基础理论研究和临床观察[J].江西中医药, 1994, 25(2): 64.
[5]上官新晨,陈锦屏,吴少福,等.青钱柳提取物对家兔实验性糖尿病模型降血糖作用的研究[J].西北农林科技大学学
报, 2003, 31(6): 117-120.
[6]王文君,蒋艳,吴少福,等.青钱柳醇提取物对糖尿病小鼠降血糖作用的研究[J].畜牧兽医学报, 2003, 6(4): 562-566.
[7]郭春兰,杨武英,胡冬南,等.青钱柳嫩枝扦插育苗的研究[J].江西农业大学学报, 2006, 28(2): 254-257.
[8]胡冬南,蒋艳,吴少福,等.青钱柳组织培养的初步研究[J].江西农业大学学报, 2005, 2(1): 39-41.
[9]袁弟顺,林丽明,孙威江,等.不同品种茶树愈伤组织的培养与茶氨酸的积累[J].福建农林大学学报:自然科学版,
2004, 33(2): 178-181
[10]李琰,王冬梅,姜在民,等.培养基及培养条件对杜仲愈伤组织生长及次生代谢产物含量的影响[J].西北植物学报,
2004, 24(10): 1912-1916.
[11]张美萍,王义,孙春玉,等.不同基本培养基及其元素组成对西洋参愈伤组织悬浮培养物生长和皂苷含量的影响[J].
植物资源与环境学报, 2003, 12(2): 14-16.
[12]习徒琳莉,李振山.培养基成分对东北红豆杉细胞生长和紫杉醇产量的影响[J].遗传, 2001, 23(4): 325-328.
(责任编辑:陈幼玉)
无菌培养基灌装试验 验证方案 编号：VMP-XZGY-YZFA-001 ****药业有限公司
目录 1 概述 (1) 2 验证目的 (1) 3 验证范围及要求 (1) 4 验证小组成员及职责 (2) 4.1 验证小组成员 (2) 4.2 相关职责 (2) 5 验证前提条件 (2) 5.1 厂房和空调系统验证情况检查 (2) 5.2 设备和公用系统确认情况检查 (2) 5.3人员和物料情况检查 (3) 5.4检验仪器确认情况检查 (3) 5.5环境监测结果检查 (3) 6 验证标准 (3) 7 培养基适用性检查 (4) 7.1无菌性检查 (4) 7.2灵敏度检查 (4) 8 验证内容 (4) 8.1 取样及检测 (4) 8.2 验证程序 (7) 9 验证偏差和变更 (8) 10 再确认周期 (8) 11 确认结果评定及结论 (8)
共9页第1页 名称：无菌培养基灌装试验 验证方案 编号VMP-XZGY-YZFA-001版本号00 替代版本号—— 制定人审核人批准人 制定日期审核日期批准日期 制定部门生产部印数1份执行日期 颁发部门质量部存档部门质量部 分发部门生产部、质量部 变更记载： 版本号批准日期执行日期 变更历史及原因： 1、概述： 无菌培养基灌装试验是指由掌握了无菌操作的人员在一个有控制的环境中将培养基按工艺配制，并经除菌过滤后灌装于灭菌的容器中，并在适当条件下培养，确认没有菌生长，以证明无菌生产工艺的可靠性的过程。本试验是在与无菌灌装生产过程有关的其他验证合格后，且操作人员熟练掌握了岗位操作规程后进行的。培养基灌装作为无菌灌装的模拟实验，可以直观、方便、准确地反映出无菌灌装过程的污染情况及问题。 2 、验证目的 通过无菌培养基灌装试验证明灌装用的安瓿瓶、过滤器、灌注器等的染菌率是否达到规定的合格标准，确认小容量注射剂车间的洁净环境及进行无菌灌装过程中所采用的各种防止微生物污染的方法和规程的可行性，从而为保证所生产产品的无菌性提供依据。 3、验证范围及要求 本验证方案适用于新建或生产工艺进行过重大更改后的非最终灭菌小容量注射液的无菌灌装过程的验证。必须经连续三批合格的培养基灌装试验后方可证明被验证工艺的可靠性。不同批次的模拟灌装应在同一条生产线不同的工作日内进行。如实际生产中有不同的班次，则应对实际生产操作的每个班次进行培养基灌装试验，每班次连续进行3次合格试验。
燕麦总黄酮含量的测定 一、仪器 紫外-可见分光光度计、分析天平、低速离心机、超声波提取器、恒温水浴锅、粉碎机、pH计、10mL容量瓶15个、10mL具塞试管、100mL烧瓶、10mL离心管10个、试管架2个 二、药品 芦丁标准品40mg、无水乙醇1000mL、亚硝酸钠500g、硝酸铝500g、NaOH 500g 三、实验步骤 （一）、样品处理及总黄酮的提取 1. 将样品籽粒分别称取 2.5 g置于小信封里，80℃烘干24 h。 2. 研成粉末，称取500±2 mg样品于10 mL离心管中，使样品位于试管底部（重复3次）。 3. 每管加4 mL 60％乙醇，放水浴锅60℃浸提2 h。6000 r/min离心10 min，离心后取上清液于10 mL容量瓶中。 4. 再向离心管中加4 mL的60％乙醇，放水浴锅60℃浸提1 h。6000 r/min离心10 min，离心后取上清液于相应的10 mL容量瓶中。60％乙醇定容至10 mL，待测。 （二）、标准曲线绘制 1. 精确量取浓度200 μg/mL芦丁标准溶液0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、 2.0 mL 分别置于10 mL容量瓶中。 2. 向容量瓶中分别加60％乙醇5、4.8、4.6、4.2、 3.8、3.4、3.0 mL。 3. 然后加5％亚硝酸钠0.3 mL，摇匀，静置6 min。 4. 再加10％硝酸铝0.3 mL，摇匀，静置6 min。 5. 加4％氢氧化钠4.0 mL，用60%的乙醇定容至刻度，摇匀，静置12 min。 6. 于510 nm波长下测定吸光度，并以芦丁标准浓度值为纵坐标，以吸光度为横坐标，绘制标准曲线。 （三）、样品提取液总黄酮含量的测定 准确吸取总黄酮提取液2.0 mL于10 mL容量瓶中，按二的方法测定吸光度，
粉蕉愈伤组织的诱导1 朱军，黄惠琴，方哲，鲍时翔 中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口 (571101) E-mail：bsxhhq@https://www.doczj.com/doc/f44608671.html, 摘要：香蕉是一种重要的热带水果。本文就影响粉蕉愈伤组织诱导的因素（外植体来源、生长调节剂种类、浓度等）进行了研究。其诱导的最佳条件是：以未成熟雄花花序或球茎为外植体，MS＋2,4-D 4 mg/L＋IAA 1 mg/L＋NAA 1 mg/L，28℃下暗培养。以球茎所诱导的愈伤组织诱导率可达89.1%。 关键词：香蕉，愈伤组织，诱导 中图分类号：S668 1. 引言 近年来，利用植物生产人类疫苗和其他药用蛋白越来越受到人们的重视。作为世界上重要的热带水果和粮食作物的香蕉（Musa spp.），因其果实营养丰富、生产周期短、可鲜食等特点而成为理想的植物生物反应器，因此香蕉转基因技术研究尤其显得重要。由于利用愈伤组织作为转化受体并诱导胚状体而再生的转基因香蕉可降低嵌合体发生[1]，且胚性愈伤组织可大量增殖、保存时间长，因此愈伤组织作为香蕉转基因受体受到越来越多研究者的重视。但香蕉是一种愈伤诱导率极低的作物，且品种间差异极大[1～5]。这极大的限制了香蕉转基因技术的研究。本文就粉蕉愈伤组织诱导进行了探讨，希望为我国香蕉转基因技术的研究提供参考。 2. 材料与方法 2.1 材料 选取香蕉品种粉蕉(Musa spp., ABB)为试验材料。 2.2 方法 2.2.1 外植体表面消毒 剥去未成熟雄花花序的苞叶，直至4 cm左右；在70%(体积分数)的酒精中浸泡1 min；再用1 g/L升汞(HgCl)浸泡10 min；取出，用无菌水彻底冲洗汞。假茎、球茎、幼叶取自试管苗，故无须消毒。 2.2.2 不同外植体的处理 选取粉蕉未成熟雄花花序、假茎、球茎、幼叶为外植体。分别将香蕉未成熟雄花花序剥去苞叶直至1.5 cm左右，沿轴线纵切成4块，再横切成厚约1 mm的薄片；假茎切成厚约1 mm左右的薄片；球茎切成小块；幼叶切成10 mm×10 mm方块接入愈伤组织诱导培养基中培养。 1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金资助课题(No.20050565004) 的资助。
毕业论文文献综述 生物工程 青钱柳研究进展 摘要：青钱柳系胡桃科青钱柳属，为中国特有的单种属乔木植物，是国家重点保护的濒危植物之一，研究发现其树叶具有许多生物活性。本文对青钱柳的生物学特性、资源分布、树种培育、有效成分、生物活性及产品开发等方面的研究进展进行了较为全面的介绍与分析。关键词：青钱柳；生物学特性；繁殖；有效成分；生物活性；价值；研究进展。 1. 生物学特性与资源分布 1.1 生物学特性 青钱柳(Cylocaya palirus)又名铜钱树、摇钱树，为胡桃科青钱柳属植物，该属仅有青钱柳一种，是集用材、绿化、茶饮保健、药用治疗于一身的珍稀树种。其树形象柳树，果实如古铜钱，约10个果实串生在一起，层层叠叠，颜色碧绿，故名“青钱柳”。叶为单数羽状复叶，小叶7～9 片，革质。花期3～4月，单性，雌雄同株，雄柔荑花序2～4条成1束集生在短总梗上，雌柔荑花序单独顶生。果序轴长25～30厘米，果实有革质水平圆盘状翅，顶端有4枚宿存花被片及花柱。10月果实由青转黄时采摘，去翅混砂贮藏。冬播或春播，种子外壳坚硬，播种前需用温水浸种2～3天，每斤种子2800粒左右，每亩播种约20斤【1】。 我国从1970年开始对青钱柳进行药用开发研究，结果表明，青钱柳具有明显的降血糖、降血压、减肥、抗肿瘤、抗衰老、抗过敏、清热解暑、提高人体免疫力、促进新陈代谢等多种功效，尤其对治疗糖尿病有显著疗效【2】。青钱柳叶含有丰富的矿质营养素，在水中可溶解10% 以上的元素有钾、镁、锌、锰、硒、镍、铜和锂，能有效地降低血糖和尿糖，可治疗糖尿病。 1.2 生长环境 青钱柳树大喜光，幼苗稍耐阴，喜生于温暖、湿润、肥沃、排水良好的酸性红壤或黄红壤。适生于湿度较大的环境,在土壤干旱瘠薄的地方生长不良。青钱柳根系发达，每年有大量的凋谢物，分解速率高，是良好的肥料树种，与常绿针叶树种混合造林后，可改善土壤结构，提高土壤肥力，并能充分发挥涵养水源的功能。青钱柳常与银鹊树、大叶楠、青冈、紫楠、浙江柿、香槐、柳杉等混生，组成常绿与落叶阔叶混交林群落【3】。
植物组培培养基的成分 培养基是人工配制的，满足不同材料生长，繁殖或积累代谢产物的营养物质。在离体培养条件下，不同种类植物对营养的要求不同，甚至同一种植物不同部位的组织以及不同培养阶段对营养要求也不相同。筛选合适的培养基是植物组织培养极其重要的内容，是决定成败的关键因素之一。 大多数植物组织培养基的主要成分是无机营养物质（大量营养元素和微量营养元素）、碳源、有机添加物、植物生长调节剂和凝胶剂。一些组织可以生长在简单的培养基上，这些培养基只含无机盐和可利用的碳源（蔗糖），但大多数组织必须在培养基中添加维生素、氨基酸和生长物质，而且经常还将一些复合的营养物质加入到培养基中，这种由“化学定义”的化合物组成的培养基称为“合成”培养基。 人们已设计了许多培养基用于特殊组织和器官的培养。 怀特培养基是最早的植物组织培养基之一，最初作为根培养的培养基。为了诱导培养组织器官发生和再生植株，广泛使用含有大量无机盐成分的MS（Murashige和Skoog，1962）和LS(Linsmaier 和Skoog，1965)培养基。原本为细胞悬液或愈伤组织培养而设计的B5培养基，经过改良后，被证实有利于原生质体培养。同时，B5培养基也被用于诱导原生质体再生植株。尽管Nitshch(1969)为花药培养设计的培养基仍然使用频繁，但另一个称为N6的培养基，专门用于禾谷类花药培养和其他组织培养。类似的，N6培养基越来越多地
用于大豆、红三叶草和其他豆科植物的培养。该培养基营养成分促进胚性细胞和原生质体再生细胞快速生长。使用这些培养基成功的原因很可能是营养元素的比例和浓度基本上满足不同培养体系中细胞或组织生长和分化的最适需要。 植物组织培养基中无机和有机成分的浓度用质量浓度（mg/L 或ppm，但现在习惯用mg/L）或物质的量浓度(mol/L)表示。按照国际植物生理学协会的推荐，应该用mol/L表示大量营养元素和有机营养成分浓度，用μmol/L表示微量营养元素、激素、维生素和有机成分浓度。用物质的量浓度的优点是，每一种化合物每一摩尔的分子数是常数，所以按照特定培养基配方配制培养基时，无论无机盐化合物的水分子数为多少，原物质的量浓度都可以使用。但是，用质量浓度来表示浓度的话，就不能不考虑无机盐化合物的水分子数目了。 1、水分 水分是植物体的主要组成部分，也是一切代谢过程的介质和溶媒，在植物生命活动过程中不可缺少。配制培养基母液时要用蒸馏水或纯水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止储藏过程中发霉变质。研究培养基配方时尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。而在大规模工厂化生产时，为了降低生产成本，常用自来水代替蒸馏水。如自来水中含有大量的钙、镁、氯和其他离子，最好将自来水煮沸，经过冷却沉淀后再使用。
培养基促生长实验操作 Prepared on 22 November 2020
1目的 制订培养基灵敏度实验操作，是为了规范、统一培养基灵敏度检测，确保微生物检测准确、安全进行。 2 范围 适用于所有配制好并灭菌的培养基。 3 编写依据 4 术语 无 5 职责 QC卫检组人员负责培养基的配制、灭菌、灵敏度实验。 6 内容 使用的设备、器具 生物安全柜、无菌培养皿、无菌刻度吸管或无菌注射器、无菌玻璃涂布器、酒精灯 等 使用的菌株 EP检测用ATCC的菌株: 金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 6538 大肠埃希菌Escherichia coli ATCC 8739 铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 枯草芽孢杆菌 Bacilllus subtilis ATCC 6633 沙门氏菌Salmonella enterica subsp ATCC 14028 白色念珠菌Candida albicans ATCC 10231 黑曲霉Aspergillus niger ATCC 16404
培养基灵敏度检测所用的菌株传代次数不得超过5代, 并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验用菌株的生物学特性。 检测频率 每批配制、灭菌后的培养基均应做灵敏度测试。 操作方法 6.4.1 对照标准培养基 用已经过实验证明合格的培养基或购买的有质量证书的成品平皿培养基作为对照标准培养基. 6.4.2 实验培养基 将琼脂类的实验培养基加热融化后，冷却至45℃左右，以无菌的方式在无菌培养皿中注入15～20ml，备用。液体类的培养基直接使用。 6.4.3 菌悬液的制备 6.4.3.1 细菌菌悬液的制备 方法一：取细菌的斜面培养物1耳匙接种在酪蛋白大豆消化肉汤培养基中30～35℃培养18～24h，取上述培养物用无菌水按10倍系列稀释，分别制成10-7～10-8的菌悬液备用。 6.4.3.2 霉菌菌悬液的制备 取白色念珠菌的斜面培养物1耳匙接种在沙氏琼脂斜面上于20～25℃培养24～ 48h，加入无菌水4ml制成原液，取上述原液按10倍系列稀释，分别制成10-6～10-7的菌悬液备用。 取黑曲霉的斜面培养物加入无菌水4ml制成孢子悬液，取上述孢子悬液按10倍系列稀释，分别制成10-6～10-7的菌悬液备用。
总黄酮含量的测定 一、仪器 紫外-可见分光光度计、分析天平、低速离心机、超声波提取器、恒温水浴锅、粉碎机、pH计、10mL容量瓶15个、10mL具塞试管、100mL烧瓶、10mL离心管10个、试管架2个 二、药品 芦丁标准品40mg、无水乙醇1000mL、亚硝酸钠500g、硝酸铝500g、NaOH 500g 三、实验步骤 （一）、标准曲线绘制 1. 芦丁标准品40mg置于称量瓶中80℃烘干至恒重，取烘干后的20mg芦丁标准品用水定容至100mL,得200μg/mL芦丁标准贮备液，精确量取上述浓度芦丁标准贮备溶液0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、 2.0 mL分别置于10 mL具塞试管中。 2. 向具塞试管中分别加60％乙醇5、4.8、4.6、4.2、 3.8、3.4、3.0 mL。 3. 然后加5％亚硝酸钠0.3 mL，摇匀，静置6 min。 4. 再加10％硝酸铝0.3 mL，摇匀，静置6 min。 5. 加4％氢氧化钠4.0 mL，用60%的乙醇定容至刻度，摇匀，静置12 min。 6. 于510 nm波长下测定吸光度，并以芦丁标准浓度值为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。研究表明芦丁标准品含量在0～0.5mg 范围内与吸光度具有良好的线性关系。 （二）、样品处理及总黄酮的提取（以60%乙醇提取为例） 1. 将样品在80℃烘干24 h，粉碎后过80目筛置于干燥器中备用。 2. 称取500±2 mg样品于25 mL具塞三角瓶中，使样品位于三角瓶底部（重复3次）。 3. 每瓶加4 mL 60％乙醇，放超声波提取器提取2 h。提取液转至10 mL具塞离心管中。 4. 再向具塞三角瓶中加4 mL的60％乙醇，放超声波提取器提取1 h，提取液转至相应10 mL具塞离心管中，6000 r/min离心10 min，离心后取上清液于相应
实验二愈伤组织诱导及观察 一.实验目的 通过愈伤组织诱导的操作，使同学们了解进行植物组织培养时的一些关键操作技术和方法，如外植体的选择、培养基母液配制、使用液配制、分装灭菌、外植体表面消毒、接种、培养、愈伤组织诱导原理和方法以及接种后污染率，愈伤组织诱导率的统计与观察。使同学们能够亲身体会、了解激素对外植体的作用，还使同学们了解无菌培养的无菌操作，清楚植物体的带菌部位等。 二.实验内容 （一）、实验原理 植物组织培养是指在无菌条件下，对离体植物组织（器官或细胞）分离并在培养基中培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组，因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出全能性，从已经分化定型的细胞，脱分化，成为恢复分裂能力的细胞，并能重新生长发育成完整的植株。愈伤组织就是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的一团细胞。在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。 愈伤组织的形成 从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。 起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素(如机械损伤、改变光照
一、概念 1 愈伤组织； 2 脱分化； 3 再分化； 4 外植体； 5 初代培养； 6 继代培养 二、填空 1.根据外植体材料的不同，将植物组织培养分为（）（）、（）、（）、（）。 2.植物组织培养发展可分为三个阶段（）、（）、（）。 三、问答题 1．什么是细胞全能性学说？如何理解? 2．什么是植物组织培养? 3．植物组织培养常用的激素哪些类型？各类激素又有哪些常用种类？ 4．如何利用植物激素调控愈伤组织形态的发生？形态发生有哪些途径？ 5．植物组织培养的主要类型有哪些？ 一、名词解释 周期细胞 G0期细胞 终端化细胞 胚状体 器官发生 体细胞胚胎发生 二、问答题 1. 优良愈伤组织的特点？ 2. 禾本科的愈伤组织的类型？ 3. 体细胞胚胎发生与器官发生的区别？ 4. 体细胞胚与合子胚的比较？ 5. 如何诱导产生高质量的体细胞胚？ 6. 器官发生的基本方式有哪些？ 一、名词解释 胚培养 培养基 胚乳培养 植物离体授粉 胚珠培养 子房培养 胚乳看护培养 二、问答题 1. 简述离体胚培养的三种发育方式？ 2. 幼胚培养的关键技术？ 3. 植物离体授粉程序？ 4. 简述胚的5个发育阶段？ 5. 为何幼胚比成熟胚培养要求的培养基成分复杂？ 一、名词解释： 1 单倍体 2 P-花粉 3 看护培养法 4 白化苗现象 5 花药培养 6 花粉培养 二、填空： 1 单倍体细胞培养主要包括三个方面（）、（）、（）。 2 花粉培养的方法（）、（）、（）、（）、（）。 3 花粉培养的实质是（），花药培养的实质是（）。 三、问答题： 1 离体培养条件下的小孢子发育途径 2 花药培养前给予一定的低温处理的意义 3 影响花药培养的因素 一、名词解释 1.植物快繁 2. 丛生芽 3. 原球茎 4.驯化 5.玻璃化现象 6. 褐化现象 7. 黄化现象 8.无性系9.无性系变异 二、问答题 1.简述植物快繁器官形成的5种方式及其特点？ 2.简述植物快繁的程序？ 3.试管苗移栽的步骤？ 一、名词解释 1.茎尖 2.原原种 3.原种 4.微体嫁接法 5.珠心组织培养脱毒法 二、问答题 1.简述植物脱毒方法的种类？ 2.简述植物茎尖脱毒方法的原理？ 3.如何进行脱毒效果的检测？ 组织培养的历史 虽然组织培养技术的蓬勃发展近50年。但它的整个历史可以追溯到上世纪初。组织培养的发展过程大致可以分为三个阶段： 萌芽阶段（从20世纪初至20世纪30年代中）
培养基模拟灌装实验方案考试卷 一、填空题（5分/题，共50分） 1. 本次培养基模拟灌装实验为新改建的洁净厂房内实施，为培养基模拟试验的首次验证，因此通过连续三批模拟灌装实验及结果有限性的评价，确认结果的重现性。 2. 对无菌灌装区的设备台面及可能接触到的表面进行无菌程度的检查，其合格标准为：灌装机设备台面微生物数量＜3个，设备输送带＜5个。 3. 培养基模拟灌装过程中对操作人员的无菌服、五指手套、口罩等部位微生物数量进行检测, 其合格标准为：五指手套微生物数量＜3个，一个操作人员双臂、前胸微生物总数＜5个，口罩微生物数量＜3个。 4. 粉针剂无菌分装间应控制合适的温度及相对湿度，其合格标准为：房间温度：20-22 ℃，相对湿度：45-50%。 5. 模拟分装过程：采用先灌装乳糖、再注入液体培养基的方式，其阳性对照样品为枯草芽孢杆菌和白色念珠菌。 6. 微生物培养条件：将全部样品在适宜的温度下培养14天，先在较低的温度（23-28℃）培养7天，然后在较高的温度下(30-35℃)培养7天，在第三天和第七天之间至少观察培养基样品的微生物的生长情况，通过最后一天的观察，确认有无微生物生长。 7. 对于培养基/乳糖样品的培养结果，若发现污染应明确记录瓶号、瓶数，同时应检查胶塞、铝盖的密封情况；若有破损应记录并检查其破损原因。对于被污染的样品进行鉴别试验，至少包括菌落数、细胞形态学记革兰染色特性等。 8. 试验结果与评价：评价无菌模拟灌装实验结果的主要指标就是污染水平，不管实验的数量有多少，其结果污染瓶均要为零，如果连续三批实验结果均出现1瓶，应进行再次实验，培养结果如出现2瓶以上，应停止生产，进行污染调查。 9. 对于已投入使用的粉针剂生产线，每年至少进行2次培养基模拟灌装实验，其生产线的每一位员工至少每年参加一次成功的培养基模拟灌装实验。 10. 当生产设备、设施、操作人员的结构、操作方法发生变动时，必须进行培养基模拟灌装实验，已确认其变动没有对该生产线的无菌保证产生影响。 二、问答题（50分） 1.简述培养基模拟灌装实验方案验证内容（15分）。 答：①培养基制备及无菌性检查，②培养基促生长实验，③无菌原料的制备、无菌性及抑菌性检验，④模拟灌装最差条件选择，⑤模拟分装过程，⑥灌装产品的培养，⑦根据培养，⑧结果确定本次模拟灌装实验的有效性，⑨模拟灌装过程记录。
蜂胶产品中总黄酮含量到底多少正常 中国蜂产品协会时间：2010-04-26新闻来源：北京天恩生物工程高新技术研究所吕泽田 经常有消费者和企业询问,蜂胶产品中的总黄酮含量到底多少才正常有的蜂胶产品的总黄酮含量高达8%、9%,甚至10%以上是不是事实是不是总黄酮的含量越多越好对这些疑问和质疑,笔者根据在制定蜂胶国家标准过程中获得的有关数据和所收集到的相关资料,谈谈看法。 蜂胶产品中总黄酮含量的多少取决于蜂胶原料总黄酮的含量。一般来说，蜂胶原料总黄酮含量比较高，或蜂胶含量比较高的产品,其总黄酮的含量也相应比较高。由于不同产地，不同树种,不同季节的蜂胶原料中总黄酮含量是不平均的;又因蜂胶原料的差异性,又造成蜂胶提取物中总黄酮含量也是不平均的.所以产品中蜂胶含量的多少与总黄酮的多少不是成正比的;而且蜂胶中总黄酮的含量是有一定范围的,超出这个范围显然是不正常的。 先说蜂胶原料(毛胶).中国农业科学院蜜蜂研究所（1987－1989）对不同地区，不同季节采集的120个蜂胶样品的分析结果，蜂胶原料中总黄酮含量为～％, 含量高低相差2倍多。 中国农业科学院蜜蜂研究所骆尚骅研究员等对30份蜂胶样品进行检测，总黄酮含量为6～％, 含量高低相差倍多,其中总黄酮含量小于20％的占样品总数％。 北京天恩生物工程高新技术研究所先后对直接从蜂箱木制采胶栅框刮取的蜂胶原料15样份进行检测，总黄酮平均值为％。 2007年制定蜂胶国标时,采用保健食品中总黄酮的测定方法测得97份样品，总黄酮含量5～％,含量高低相差将近倍。其中,总黄酮含量小于15％的有39个样份，占总样份的％；总黄酮含量8～15％的有个48个样份，占总样份的％；总黄酮含量小于8％的有个10个样份，占总样份的％。 从以上检测结果可以看出蜂胶原料中总黄酮含量的明显差异性。 再说蜂胶乙醇提取物.蜂胶原料不能直接生产产品.那么作为产品原料的蜂胶乙醇提取物中的总黄酮含量又如何呢 北京天恩生物工程高新技术研究所检测不同产地，不同树种的蜂胶乙醇提取物13样份，其总黄酮含量为～％。其中含量13～14％的样品3个，占总样数的％；14～17％的样品9个，占总样数的％；17％以上的样品1个，占总样数的％。 江西汪氏蜜蜂园检测4个蜂胶乙醇提取物样品，总黄酮含量范围为～％，其中，含量～％的样品3个含量％的样品仅1个。 浙江大学动物科学学院和杭州天厨蜜源保健品有限公司测定不同厂家的27
小麦愈伤组织诱导与其再生培养体系的建立 前言：小麦属于禾本科植物，麦粒在植物学上称为颖果，在种子学上则称为种子，通常称为小麦。麦粒皮色有红白之分，红皮的叫红麦，白皮的叫白麦。由于品种和受环境影响不同，红皮小麦又有深红色和红褐色；白皮小麦又有白色、乳白色或黄白色之分。 一：目的及意义 我国小麦目前的状况有以下几点：1 我国是农业大国，小麦面积4亿亩、产量9000万吨左右，分别占世界总量的 12%和18%，均居世界第一位。2 我国春小麦主要分布在东北、西北及华北北部。据中国粮油信息中心的数据显示，预计中国 03/04市场年度（7月至次年6月）春小麦播种面积仅为190万公顷，较上年度减少5％，这是多年来中国春小麦种植面积首次低于200万公顷；预计03/04年度春小麦产量为580万吨，较02/03年度下降7.48%。我国的小麦种植面积不断的减小，总产量也在不断减少。由于我国目前存在的状况，农业大国，主产小麦，但小麦的产量的质量都不是很好，种植面积又在减少，本研究主要是提高小麦的产量和质量。 二：综述国内外对小麦的研究状况 2.1 小麦愈伤组织诱导及原生质体的分离与纯化张小红，闵东红，邵景侠（西北农林科技大学，陕西杨凌712100） 试验方法：以普通小麦的幼穗和幼胚为外植体进行了愈伤组织诱导，及由幼胚愈伤组织进行了原生质体分离和纯化试验，研究了幼穗和幼胚外植体及低温预处理等因素对愈伤组织诱导的影响，在原生质体分离中研究了酶浓度和配比、酶解时间及蔗糖浓度等因素对幼胚愈伤组织原生质体游离和纯化的影响。结果表明：小麦幼穗离体培养时，以1.0~1.5 cm长度的幼穗有利于愈伤组织的诱导；小麦幼穗和幼胚外植体采后低温储藏时不易超过3 天，时间太长会影响愈伤组织诱导；2.0%纤维素酶＋0.5%果胶酶+0.6 M甘露醇分离原生质体较好，最佳酶解时间为 4~6 h，原生质体产量和活力较高。 2.2 小麦愈伤组织诱导及其植株再生研究进展王廷璞，陈荃，崔爱明，刘瑞媛，马伟超 （天水师范学院生命科学与化学学院，甘肃天水741001） 试验方法：小麦组织培养体系的建立与完善是应用植物基因工程改良小麦品质的重要基础和保证，综述了近年来小麦愈伤组织诱导及植株再生的研究情况。研究资料表明：小麦组织培养中，不同来源和不同生理状态的小麦外植体（幼胚、幼穗、花药、成熟胚、叶、根等），在愈伤组织诱导和获得再生植株的能力方面均显示了优点和不足。不足之处是在生产过程中，不断受到生物、非生物等因素的胁迫，严重影响其产量及品质。 2.3小麦愈伤组织诱导及其再生能力影响因素的研究贾海燕, 王洪刚 ( 山东 农业大学农学院, 山东泰安 271018) 试验方法：以农艺性状较好的24 份小麦品种( 系) 为材料, 筛选出了愈伤组织诱导率高且植株再生能力强的基因型材料山农995604 和F281- 10, 在此基础上对影响愈伤组织的分化能力以及较长时间保持分化能力的因素进行了研究。结果表明, 在愈伤组织的继代过程中, 保持较高浓度的2, 4- D, 或对愈伤组织进行交替继代培养有利于较长时间保持其再生能力。最佳取材时间在开花后15d 左右,
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目的 Purpose 为保障微生物检验的准确性及相关工作特制定本规定。 范围 Scope 本程序适用于微生物限度测定培养基的适用性检查及相关工作。 职责 Responsibility ！ 分析员：严格按照本操作规程执行。及时完成各类相关记录。在主管的指导下进行任何可能的OOS及偏差调查。 主管：监督本操作规程的执行。对检验员进行必要的培训。指导任何可能的OOS和偏差调查。 内容procedure 1检验员应根据培养基配制程序或培养基各自的说明书配制培养基。 2试验用菌种及培养基 2.1菌种: 2.1.1培养基灵敏度测试所用的菌株传代次数不得超过5代，从国家药检所或菌种保藏中心购买。 2.1.2枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[ATCC 6633] 2.1.3~ 2.1.4大肠埃希菌(Escherichia coli) [ATCC 8739] 2.1.5金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [ATCC 6538] 2.1.6白色念珠菌(Candida albicans) [ATCC 10231] 2.1.7黑曲霉(Aspergillus niger)[ATCC 16404] 2.1.8伤寒沙门菌(Salmonella) [ATCC 14028] 2.1.9铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) [ATCC 9027] 2.2培养基 2.2.1按照培养基说明书进行配制灭菌。 2.2.2| 2.2.3大豆酪蛋白消化肉汤 Soybean-Casein Digest Broth 2.2.4大豆酪蛋白消化琼脂 Soybean-Casein Digest Agar 2.2.5沙氏葡萄糖琼脂 Sabouraud Dextrose Agar
总黄酮含量测定 一样品溶液的制备 70%乙醇溶液，料液比1﹕8 ，80度下回流2h。取10g样品放入圆底烧 瓶中加入80ml 70%乙醇溶液回流2h,抽滤定容至100ml备用。使用时先离心再用70%乙醇稀释10倍做样品溶液。 二芦丁标准品的配置 精密称取芦丁2mg，加无水乙醇定容至10ml。制得浓度为0.2mg/ml芦 丁标准品溶液。 三显色方法的确定 1 扫描原液分别取芦丁溶液和样品溶液各1ml，加无水乙醇定容至25ml，空白对照，全波扫描。 2硝酸铝显色法分别取芦丁对照品溶液和样品溶液各5ml，加5%亚硝酸 钠溶液（1.25g亚硝酸溶于无水乙醇中定容到25ml容量瓶中) 1ml, 摇匀，放置6min，加10%硝酸铝溶液(4,4014g硝酸铝.九水溶于无水乙醇中定容到25ml 容量瓶中) 1ml，摇匀，放置6min，加4%氢氧化钠试液(2g氢氧化钠溶于无水乙醇中定容到50ml容量瓶中）10ml, 再加无水乙醇定容至25ml，摇匀，放置15min，空白对照，全波扫描bb 。 3氯化铝显色法分别取芦丁对照溶液和样品溶液各5ml ,加1%的氯化 铝溶液（1g氯化铝溶于无水乙醇中定容到100ml容量瓶中)10ml，摇匀放置10min，空白对照，全波扫描。 4 氢氧化钾显色法分别取芦丁对照品溶液和样品溶液各5ml，加3ml10% 氢氧化钾溶液（2.5g氢氧化钾溶于无水乙醇中定容到25ml容量瓶中）， 充分摇匀显色5min后，用无水乙醇定容至25ml, 摇匀，空白对照，全波 扫描。 四显色条件的确定 五标准曲线的绘制 分别取1ml,2ml,3ml,4ml,5ml,6ml芦丁对照品溶液，按所选的显色方法测定吸光度，绘制标准曲线。 六精密度实验 按标准曲线绘制方法，分别准确量取1.0ml芦丁标准液5份，按所选显色剂和所确定的最优显色条件在所选波长下测定吸光度。
班级：植物092 姓名：徐炜佳学号：0901080223 愈伤组织的诱导和培养 一、实验目的及意义 植物愈伤组织的诱导和培养在植物科学的基础研究和应用研究中都有重要的意义。通过本次实验，可以初步掌握植物外植体材料消毒、接种的无菌操作技术，愈伤组织的诱导方法和愈伤组织继代培养的方法。 二、实验原理 植物组织与细胞培养是应用无菌操作的方法培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择适当的消毒剂对植物外植体进行表面消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得植物组织培养，成功的基本前提和重要保证。由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织（callus）。植物生长调节剂如2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）等是诱导外植体形成遇上组织的重要因素。 三、实验仪器与药品 超净工作台，酒精灯，镊子，剪刀，解剖刀，75%乙醇，酒精消毒棉 材料：烟草无菌苗，甘薯无菌苗 四、实验步骤 1.按下表分别配制培养基
将配置的四种培养基分别分装入20个培养瓶，高温灭菌后水平放置凝固 2.接种前，将实验所需器具放入超净工作台，打开紫外灯灭菌20~30min，关闭紫外灯，开启通风开关。洗手后用酒精喷洒消毒手、手臂、实验材料及培养基外部等进入超净工作台的部分。进入超净工作台，用酒精棉擦拭台面（手勿伸出工作台），台面完全风干后点燃酒精灯。 3.接种开始时，将镊子及手术刀在酒精中浸泡，并在酒精灯外焰上烧炽片刻，充分冷却。取幼嫩的烟草（甘薯）叶片，用手术刀切割成小片，再用镊子将其接种至相应的培养基上，每瓶接种3~5片，封口后取出超净工作台，标注姓名、日期、培养基和接种材料。 4.将上述培养材料常温暗培养，每隔7天观察一次，并记录培养情况 五、实验结果
植物组织培养MS培养基配方 （一）母液配制与保存 配制培养基时，如果每次配制都要按着杨成分表依次称量，既费时，又增加了多次称量误差。为了提高配制培养基的工作效率，一般将常用的基本培养基配制成10～200倍，甚至1000倍的浓缩贮备液，即母液。母液贮存于冰箱中，使用时，将它们按一定的比例进行稀释混合，可多次使用，并在配制较多数量的培养基时，降低工作强度，也提高试验的精度。 基本培养基的母液有四种：大量元素（浓缩20倍），微量元素（浓缩100倍），铁盐（浓缩200倍），除蔗糖之外的有机物质（浓缩100倍） 1大量元素 配制大量元素母液时要分别称量，分别溶解，在定容时按表1中的序号依次加入容量瓶中，以防出现沉淀。倒入磨口试剂瓶中，贴好标签和做好记录后，可常温保存或放入冰箱内保存。 表1大量元素母液（配1L20倍的母液） 序号成分配方浓度/（mg.L-1）称取量/mg 配1mL培养基吸取 量/mL 1 硝酸铵NH4NO3 1650 33000 50 2 硝酸钾KNO 3 1900 38000 3 磷酸二氢钾KH2PO 4 170 3400 4 七水合硫酸镁MgSO4.7H2O 370 7400 5 氯化钙无水CaCl2 440 6644 2微量元素母液 在配制微量元素母液时，也应分别称量和分别溶解，定溶时不分先后次序，可随意加入溶量瓶中定容（表2），一般不会出现沉淀现象。倒入磨口试剂瓶中，贴好标签和做好记录后，可常温保存或放入冰箱内保有存。 表2微量元素母液(配制1L100倍母液) 成分配方浓度/(mg.L-1) 称取量/mg 配制1L培养基吸取 量/mL 碘化钾KI 0．83 83 10 硫酸锰MnSO4.H2O 22．3 2230 硼酸H3BO3 6．2 620 硫酸锌ZnSO4.7H2O 8．6 860 钼酸钠Na2MoO4.2H2O 0．25 25 硫酸铜CuSO4.5H2O 0．025 2．5 氯化钴CoCl2.6H2O 0．025 2．5 3铁盐母液 由于铁盐无机化合物不易被植物吸收利用，只有基螯合物才能被植物吸收利用，因此需要单独配成螯合物母液表3）。 配制方法：称取5.56g硫酸亚铁和7.46g乙二胺乙酸二钠，分别用450ml的去离子水溶解，分别适当加热不停搅拌，分别溶解后将硫酸亚铁溶液缓缓加入到乙二胺四乙酸二钠溶液中，将两种溶液混合在一起，最后用去离子水定溶于1000mL，倒入棕色贮液瓶中，贴好标签和做好记录后放入冰箱内保存。
制订培养基灵敏度实验操作，是为了规范、统一培养基灵敏度检测，确保微生物检测准确、安全 进行。 范围 适用于所有配制好并灭菌的培养基。 编写依据 EP6.5 术语 职责 QC 卫检组人员负责培养基的配制、灭菌、灵敏度实验。 内容 生物安全柜、无菌培养皿、无菌刻度吸管或无菌注射器、无菌玻璃涂布器、酒精灯等 EP 检测用ATCC 勺菌株: 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus ATCC 6538 培养基灵敏度检测所用勺菌株传代次数不得超过 5 代 , 并采用适宜勺菌种保藏技术，以保证试验用 菌株勺生物学特性。 6.3 检测频率 每批配制、灭菌后勺培养基均应做灵敏度测试。 6.4 操作方法 6.4.1 对照标准培养基 大肠埃希菌 Escherichia coli ATCC 8739 铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 枯草芽孢杆菌 Bacilllus subtilis ATCC 6633 沙门氏菌 Salmonella enterica subsp ATCC 14028 白色念珠菌 Candida albicans ATCC 10231 黑曲霉 Aspergillus niger ATCC 16404 6.1 使用的设备、器具 6.2 使用的菌株
15? 用已经过实验证明合格的培养基或购买的有质量证书的成品平皿培养基作为对照标准培养基 6.4.2 实验培养基 20ml ，备用。液体类的培养基直接使用。 6.4.3 菌悬液的制备 6.4.3.1 细菌菌悬液的制备 24h ，取上述培养物用无菌水按 10倍系列稀释，分别制成 10-7?10-8的菌悬液备用。 6.4.3.2 霉菌菌悬液的制备 取白色念珠菌的斜面培养物 1耳匙接种在沙氏琼脂斜面上于 20?25 C 培养24?48h ，加入无菌水 4ml 制成原液，取上述原液按 10倍系列稀释，分别制成 10-6?10-7的菌悬液备用。 取黑曲霉的斜面培养物加入无菌水 4ml 制成孢子悬液，取上述孢子悬液按 10倍系列稀释，分别制 成 10-6 ?10-7 的菌悬液备用。 每株菌用 2管（或瓶）实验培养基，接种 0.1 ? 0.5ml 的菌悬液（约 10?100CFU 试验菌），同时用 2 个对照标准的培养基或用已知合格的酪蛋白大豆消化琼脂平皿做对照，接种相同量的菌悬液试验，在 规定温度下培养 ,对比或计 数，在规定时间内能生长菌落为合格。 6.4.5 培养基的生长促进和抑制特性试验 6.4.5.1 液体培养基的生长促进特性试验 将琼脂类的实验培养基加热融化后，冷却至 45 C 左右，以无菌的方式在无菌培养皿中注入 方法一：取细菌的斜面培养物 1 耳匙接种在酪蛋白大豆消化肉汤培养基中 30?35 C 培养 18? 方法二：直接用杭州微球生物技术有限公司的产品 -培养基灵敏度指示剂，该产品已经帮我们精确 控制了细菌数量，只要直接拿稀释液稀释下就可以直接取到 10?100CFU 试验菌。使用方便，数量精 确。推荐用此方法操作。 6.4.4 培养基的生长促进实验 6.4.4.1 琼脂类培养基的生长促进实验 每株菌用 2 个实验培养基平皿，用表面涂布法在每个平皿表面接种 0.1 ? 0.5ml 的菌悬液（约 10? 100CFU 试验菌），同时用 2 个对照标准的培养基平皿做对照，接种相同量的菌悬液试验，在规定温度 下培养 ,取出平皿点计菌落数。实验培养基上的微生物数量应为对照培养基上微生物生长数量的 70%-150%范围内。（注：每种培养基生长促进实验的具体菌株见附录 1） 6.4.4.2 液体类培养基的生长促进实验
1 各批次药材含量测定 使用已经确定的总黄酮含量检测方法分别进行5个批次原料含量的测定 总黄酮含量测定：分别精密称取药材粗粉0.5g，置100ml锥形瓶中，加70%乙醇50ml，称定重量，超声60分钟，放冷，称定，加入70%乙醇补足减失重量，摇匀，过滤，弃去粗滤液，精密量取续滤液10.0ml上聚酰胺树脂，待充分吸附后，用乙醇进行洗脱，至流出液基本无色，以洗脱液定容至25ml量瓶中，备用。精密量取供试品溶液5ml，置10ml比色管中，加 5％亚硝酸钠溶液0.4ml，使混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液0.4ml，摇匀，放置6 分钟，加2mol/L氢氧化钠溶液3ml，再加30%乙醇至刻度，摇匀，放置15分钟，照分光光度法（《中国药典》2010版一部附录Ⅴ B），在504nm 的波长处测定吸收度。 表1 不同批次药材总黄酮含量测定结果 批号含量（%） 1 2 3 X±S 20140516 0.16350.16480.17010.1661±0.0035 20140516紫外扫描色谱图 2 药材总黄酮转移率研究 2.1 单个药材转移率研究
2.1.1 单个药材的转移率测定 同一批次的各药材，分别按照产品生产工艺提取得单个药材的总黄酮浓缩液样品，进行总黄酮含量检测，与“1”项下同批药材的总黄酮含量相比得出单个药材的转移率（如下式），分别进行5批次药材测定。 黄芪、桑叶、黄精、山茱萸：分别取黄芪、桑叶、黄精、山茱萸各100g，加水煎煮两次（回流），第一次加水12倍量，煎煮2.0h，过滤；第二次加水10倍量，煎煮1.0h，过滤，合并滤液浓缩至100ml，备用。 黄芪不同浓缩程度的考查：取黄芪100g，加水煎煮两次（回流），第一次加水20倍量，煎煮2.5h，过滤；第二次加水20倍量，煎煮2.0h，过滤，合并滤液，重复试验三次，分别浓缩至50ml、100ml、200ml，备用。 精密量取上述溶液5ml，加乙醇15ml，摇匀，过滤，弃去粗滤液，精密量取续滤液10.0ml上聚酰胺树脂，待充分吸附后，用乙醇进行洗脱，至流出液基本无色，以洗脱液定容至25ml量瓶中，备用。精密量取供试品溶液5ml，置10ml 比色管中，加5％亚硝酸钠溶液0.4ml，使混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液0.4ml，摇匀，放置6 分钟，加2mol/L氢氧化钠溶液3ml，再加70%乙醇至刻度，摇匀，放置15分钟，照分光光度法（《中国药典》2010版一部附录ⅤB），在504nm 的波长处测定吸收度。 表2 不同批次药材提取液总黄酮含量测定结果 批号含量（%） 1 2 3 X±S 20140516 0.16350.16480.17010.1661±0.0035
专题2细胞工程 植物细胞工程的实际应用 寄语：世事洞明皆学问，人情练达即文章。 【学习目标】1、理解微型繁殖技术的应用。 2、了解单倍体育种过程和优点。 【课题重点】植物细胞工程应用的实例。 【课题难点】列举植物细胞工程的实际应用。 【学习过程】 一、植物繁殖的新途径 1.微型繁殖 （1）微型繁殖技术：用于优良品种的技术。 （2）特点：①保持优良品种的。 ②高效快速地实现种苗。 （3）实例：20世纪60年代，荷兰的科学家就成功地实现了利用 来培育兰花。 2.作物脱毒 （1）材料：植物的（如）。分生区附近的病毒极少，甚至。（2）脱毒苗：切取（例如茎尖）进行组织培养获得的。 （3）优点：使农作物。 3.人工种子 （1）概念：一植物组织培养得到的、、顶芽和等为材料，经过人工包装得到的种子。 （2）特点：①后代无。 ②不受、和限制。 (3)人工种子的制备，如图人工种子主要由三部分组成，一是胚状体 (分生组织)，它相当于天然种子的胚，是有生命的物质结构；二是 供胚状体维持生命力和保证其在适宜的环境条件下生长发育的人工胚乳； 三是具有保护作用的“人工种皮”。 二、作为新品种的培育 1.单倍体育种 染色体加倍 （1）方法：离体培养植株纯合子植株。 （2）优点：①后代是纯合子，能。②明显缩短了。 2.突变体的利用
（1）产生原因：在植物的组织培养过程中，易受和 （如、等）的影响而。 （2）利用：筛选出对人们有用的，进而培育成。 三、细胞产物的工厂化生产 1.细胞产物种类：、脂肪、糖类、、香料、生物碱等。 2.技术：植物技术。 3.实例：我国利用植物组织培养技术实现了大量生产；另外，三七、紫草和银杏的也都已经实现了工厂化生产。 课堂小结 1.微型繁殖技术 微型繁殖是快速繁殖优良品种的植物组织培养技术，实际上是无性生殖的一种。在繁殖的过程中，细胞进行有丝分裂，因此亲、子代细胞内DNA相同，具有相同的基因，因此能保证亲、子代遗传特性不变。利用这种技术能高效快速实现种苗的大量繁殖。 优点：选材少、培养周期短，繁殖率高，便于自动化管理。 组织培养（微型繁殖）主要是一种无性繁殖。如果培养的是体细胞，得到的植株同亲代基因型完全相同，所得个体能保持母体的一切性状；但如果培养的是生殖细胞，如花药，得到的植株是单倍体，应为有性生殖中的单性生殖。 2.作物脱毒、人工种子与单倍体育种 作物脱毒主要是强调微型繁殖的取材一定是无毒的（如茎尖、根尖），才能繁殖出无毒的幼苗。 人工种子采用的也是微型繁殖的技术，但是只需培育得到胚状体、不定芽、顶芽和腋芽，包上人工种皮就可以形成人工种子。人工种子与微型繁殖得到的幼苗一样能保持亲本的优良性状，另外还可不受气候、季节和地域的限制。胚状体的获取途径：①由已脱分化的外植体直接产生②由愈伤组织产生③由悬浮细胞培养产生。 单倍体育种的优点是后代无性状分离，后代都是纯合子，能够稳定遗传，明显缩短育种年限。应用染色体变异的原理。 【习题巩固A级】 1．植物的微型繁殖技术，是指() A．植物体细胞杂交技术B．嫁接C．营养繁殖D．植物组织培养 2．下列育种措施，可以增加植物突变体出现的是() A．采用嫁接方法培育苹果新品种 B．将鱼的抗冻蛋白基因导入烟草受精卵中，培育抗冻烟草