酵母单杂交手册
目录
1简介
2试剂盒包含的内容
3缩写
4 Y1H Gold 酵母菌株的相关信息
5附加材料&酵母培养基
A cDNA扩增、文库构建和筛选所需的附加材料
B 相应的培养基要求
6诱饵质粒及诱饵酵母菌株的构建
A方法：合成、克隆p目的基因-AbAi质粒
B方法：构建诱饵-受体酵母菌株
7利用AbA r的表达检测诱饵菌株
A方法：找到抑制诱饵菌株生长的最低AbA浓度
8 cDNA文库的构建
A方法：利用SMART技术合成cDNA第一链
B方法：利用Long Distance PCR (LD-PCR)扩增cDNA第一链
C方法：利用CHROMA SPIN+TE-400 Columns技术纯化合成的双链DNA
9单杂交的文库的构建和筛选
A方法：单杂交cDNA的文库的构建和筛选
10结果分析
11阳性克隆检验和猎物（prey）质粒分离
A方法：通过划板确认受体表型
B方法：酵母菌落PCR以消除Duplicate Clones（假阳性克隆？多拷贝？）C分离和纯化文库中可靠的具有受体活性的质粒
D方法：区分阳性克隆和假阳性克隆
E分析阳性克隆的序列
12问题排除指南
13参考文献
附录A：质粒信息
附录B：酵母生长培养基的配置及所需营养物
附录C：SMART技术原理
图1 利用Matchmaker Gold One-Hybrid System筛选蛋白-DNA的相互作用
图2 将相应的片段整合到Y1HGold菌株，构建诱饵受体菌株
图3 利用SMART技术和酵母的特点构建和筛选你的文库
图4 通过菌落PCR确认pBait-AbAi构建成功
图5 利用SMART技术合成cDNA第一链并因此合成相应的粘性末端能够整合到pGADT7-Rec 图6 利用SMART技术进行扩增
图7 利用CHROMA SPIN+TE-400技术并收集产物
图8 说明受体基因表达阳性克隆和假阳性克隆之间的活性差异
图9 通过共转化选择性培养基验证相互作用
图10 pAbAi载体和做对照的p53-AbAi载体图谱
图11 pGADT7-Rec载体图谱
图12 pGADT7载体图谱
表格
表1 Y1HGold酵母菌株基因型
表2 利用各种SD培养基验证Y1HGold酵母菌株的表型
表3 AbA r本底表达的预期结果
表4 RNA总量与最佳循环数直接的关系
表5 Matchmaker Gold One-Hybrid问题排除指南
表6 Set 1酵母培养基和Set 1 Plus酵母培养基的组分
表7 Matchmaker Gold Protocols所包含的每一个内容
A介绍
Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System为建立酵母单杂交cDNA文库的建立提供了一个简单高效的方法。Matchmaker Gold Systems具有AbA抗性因而具有很强的筛选能力，可极大地降低背景水平。这种单杂交方法是在酵母双杂交的方法上演变而来，可以识别和分析蛋白质与DNA之间的相互作用，而不仅仅是证明蛋白之间的相互作用。（图1）
图1. 利用Matchmaker Gold One-Hybrid System筛选蛋白-DNA的相互作用
将一至三个目的DNA重复序列克隆至pAbAi报告载体，然后整合到Y1HGold酵母基因组中以构建一个诱饵特异的报告菌株。一旦文库中的猎物蛋白质与诱饵序列相结合，就会激活AbA抗性(AbAr) 基因的表达。
酵母单杂交文库同时通过酵母细胞进行构建和筛选，以此得到活体内的重组质粒，使用这种方法无需通过大量繁琐步骤克隆、扩繁、获取大肠杆菌E.coli内构建的文库。Matchmaker Gold System方法中的文库构建用到了SMART cDNA合成技术，只需从任意组织部位提取总量为100ng 的RNA，即可使用该方法构建cDNA 文库。
B酵母单杂交的原理——蛋白-DNA互作的一种实验方法
诱饵（Bait）——DNA目的片段，或者一段诱饵序列，通过单拷贝或随即拷贝克隆到pAbAi 载体上，构建好的pBait-AbAi载体通过同源重组可高效整合到Y1HGold酵母菌株中，并产生诱饵特异性报告菌株（图2）
图 2. 通过同源重组将构建好的pBait-AbAi整合到Y1HGold菌株，构建诱饵受体菌株。ura3-52基因位于Y1HGold，常态下不活跃，造成不可逆的转座子中断现象，只有通过与野生型中的URA3 gene同源重组才可以修复。而pBait-AbAi载体就包含URA3 gene。当用BstBI 或BbsI酶切表达载体后，pBait-AbAi载体呈线性化，用来转化Y1HGold，转化产物可以在SD/-Ura培养基（缺尿嘧啶）的培养基中生长，这些克隆中也包含稳定的Bait-AbAi，可以用来筛选蛋白-DNA之间的相互作用。
C猎物（Prey）在Matchmaker酵母单杂交方法里，可能结合DNA的蛋白，或者说猎物蛋白，被融合到含有酵母GAL4转录激活结构域（GAL4 AD）表达载体中进行表达，通过共转化SMART PCR扩增的cDNA和线性化的pGADT7-Rec载体到酵母Y1HGold诱饵报告菌株中可以直接构建好酵母中的猎物文库（图3）
图3利用SMART技术和酵母的生物学特性，在酵母中同时构建和筛选文库。在酵母中同时构建和筛选cDNA文库。首先，利用SMART技术构建cDNA文库，这些cDNA文库的序列末端与线性化的猎物载体pGADT7-Rec 末端具有同源序列。将cDNA文库和pGADT7-Rec共转化到Y1HGold-Bait报告菌株中，在酵母中进行同源重组。将酵母细胞涂布于SD/-Leu/+AbA培养板上，以筛选表达报告基因的阳性的Y1H相互作用。
探寻蛋白-DNA的相互作用——Aureobasidin A (AbA)是一种环酯肽抗生素，在低浓度(0.1-0.5 礸/ml) 下即可对酵母产生毒性。包含AbA r gene（AUR1-C突变基因）的转化酵母菌株pBait-AbAi可以获得抗生素抗性。当猎物蛋白（Prey）结合到诱饵序列（Bait），GAL4 AD就会激活AbA r 的表达，从而能够在含有抗生素AbA的培养基上生长（图1）。
Matchmaker Gold One-hybrid技术可被用于：
鉴定新的蛋白-DNA的互作
验证已知或可疑的蛋白-DNA的互作
明确存在互作的蛋白结构域和同源的DNA序列
方法总述：（包含以下步骤）
第一步：将目的基因（bait）克隆到pAbAi载体上
第二步：将构建好的pBait-AbAi质粒转化到Y1HGold酵母菌株中（图2）
第三步：测试Y1HGold bait菌株的AbA r背景表达水平
第四步：通过共转化和体内同源重组构建和筛选cDNA文库（图3）
第五步：确认和解释筛选结果
ATTENTION: Successful use of any yeast one-hybrid system depends upon no/low recognition of your target sequence by endogenous yeast transcription factors, which can cause high background expression of the reporter gene. For this reason it is critical to test your Y1HGold [Bait-AbAi] strain for AbA r expression (AbA resistance) before screening a library (see Section 6).
注意！酵母单杂交系统是否可靠取决于内源酵母转录因子不识别/几乎不识别你的目的片段，如果能识别该目的片段将造成报告基因很高的背景表达。因此，在进行文库筛选前要严格测试酵母菌株Y1HGold [Bait-AbAi] AbA r的表达（可产生AbA抗性）
2试剂盒包含的内容
The Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System (Cat. No. 630491)包含的材料可以构建5个酵母单杂交文库，推荐使用Advantage? 2 PCR Kit (Cat. Nos. 639206 & 639207) 试剂盒扩增SMART cDNA来获得双链DNA（ds cDNA）
3 缩写
4 Y1H Gold 酵母菌株的相关信息
表1是Y1H Gold 酵母菌株的基因型，表2是在不同SD（营养缺陷型）培养基上的表型。
若想了解更多关于酵母生长和繁殖的信息，请查阅Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Guthrie & Fink, 1991)
5附加材料&酵母培养基
A cDNA扩增、文库构建、文库筛选所需材料
进行PCR时DNA聚合酶的稳定性。推荐使用the Matchmaker Gold kit扩增SMART单链cDNA，并以此为模板，用Advantage 2 PCR Kit(Cat Nos. 639206 & 639207)扩增ds DNA。利用Advantage 2聚合酶混合物扩增cDNA(as large as 20 kb)比常规PCR具有更高的保真性。Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System 不包含Advantage 2 PCR Kit。
限制性内切酶BstBI 或BbsI，可使pBait-AbAi质粒线性化，帮助其更好的转化并整合到Y1H-Gold中。
（酵母菌落PCR确认pBait-AbAi质粒已整合到Y1H-Gold基因组中，用rTaq即可）
（PCR仪）
其他实验室常规试剂、酶以及质粒构建、扩增、鉴定等所需试剂。详见individual protocols for requirements。
B酵母培养基及所需营养成分
（详见附录B）
（AbA，已买，具体介绍、使用说明等见附录B）
酵母培养基（附录B有每一个组分购买、配制等详细介绍说明）
YPDA是用于培养所有S. cerevisiae酵母菌株的一种常规的丰富培养基。附加的腺嘌呤（adenine）可阻止酵母因继代培养代数过多而变成粉红色。
SD培养基(synthetically defined medium)是用于S. cerevisiae酵母菌株培养和质粒转化鉴定的一种minimal media。SD base培养基包含了一个酵母细胞生长所需的所有最基本的东西，包括碳源和氮源。而各种重要的氨基酸分别加到SD base培养基中就形成了minimal media。Clontech’s Yeast Media Pouches已经包含了预先混合好的各组分。根据转化质粒的抗性标记基因选择不同的minimal medium以供含有转化质粒的酵母菌株生长。
SD/-Ura DO supplement（缺乏尿嘧啶的SD培养基内容物）用于鉴定bait-reporter是否构建整合到YIHGold菌株中。SD/-Ura DO supplement中包含了酵母生长所需要的所有营养物质，除开尿嘧啶（这是公司规模化生产的一种商品，DO就是dropped out的意思）。因为pAbAi质粒编码一个URA3基因，其产物就是尿嘧啶。因而整合了该质粒的酵母菌株可以在缺乏尿嘧啶的培养基中生长，而普通的酵母细胞中该基因处于抑制状态，不能自己合成尿嘧啶，则不能在这种缺陷型培养基上生长。
SD/-Ura/AbA*培养基。若prey proteins与bait sequence之间存在相互作用，就会产生Aureobasidin A 抗性，用于筛选的AbA的浓度要根据每个酵母菌株的不同采用滴定法进行确定。
6诱饵质粒及诱饵酵母菌株的构建
在开始实验前请仔细阅读该说明书，克隆目标基因详见方法A。获得Y1hgold target reporter bait strain详见方法B。
A．方法：构建pBait-AbAi 质粒
pBait-AbAi质粒必须包含至少一个目的DNA拷贝，插入到pAbAi 载体AbA r受体基因的上游，(具体说明见Target Sequence Notes)。许多研究表明高效的质粒包含三个目的基因的串联拷贝，但是在有些情况下单拷贝也能满足条件。有多种方法可以获得串联拷贝，其中利用寡核苷酸合成（引物合成）是最为方面可靠的办法，尤其是合成<20 bp的常规片段。
（设计引物时两端酶切位点应不同
mutant bait载体作为负对照，方法见Section 10
若有已知的与目的序列互作的蛋白，可将其整合到pGADT7 vector作为正对照）
1. 针对不同的目的DNA序列，设计两个反向平行的引物，该引物对必须包含pAbAi载体上的酶切位点，
以产生粘性末端。强烈建议当5’-end选择MCS中SmaI上游的多克隆位点做为酶切位点时（比如SacI），3’-end选择SalI或XhoI作为酶切位点。建议同时构建一个mutant bait载体，这个载体包含一段可以抑制bait结合文库蛋白的目的DNA序列（RNAi？）
2. 合成的引物在PCR程序过程中，退火之后，引物可以结合到pAbAi载体上。
引物在–20°C保存。
a.溶解引物至终浓度为100 μ M的母液
b.按照1：1比例混合上游引物和下游引物，至终浓度为50 μM（假设100% theoretical annealing)
c.将混合后的溶液在95°C处理30s，使所有二级结构解聚
d.72°C 加热2 min
e.37°C 加热2 min
f. 25°C 加热2 min
g.置于冰上
3. 线性化1 ug pAbAi载体。用限制性内切酶酶切pAbAi载体，使其带有粘性末端（详见Section 6 A.1）。跑琼脂糖凝胶电泳，分离线性化的载体，再切胶回收纯化该片段。
4. 连接线性化的pAbAi Vector和ds oligonucleotide
a.将（2g.冰上保存的）引物浓度稀释到0.5 μ M
注意：为了达到较高的连接效率，引物一定要进行稀释，若引物浓度太高会降低连接效率。
b.反应体系：（按照相应比例换成10uL体系）
注意：如想做对照，可用1uL ddH2O替代目的片段
Note: If desired, a control ligation can be assemble d using 1 μl of nuclease-free H2O instead of annealed oligonucleotide.
c.反应混合液置于室温3h，转化大肠杆菌E. coli，菌落PCR鉴定阳性菌落，挑阳性菌落，摇菌扩繁，提质粒，酶切鉴定载体是否构建成功。
B. 方法：获得Bait-Reporter Yeast Strains
将构建好的pBait-AbAi质粒转化到Y1HGold菌株中包含以下步骤（示意图见Figure 2）：
第一步：用限制性内切酶BstBI 或BbsI酶切pBait-AbAi，pMutant-AbAi（阴性对照，确定有相互作用后再构建），和p53-AbAi（阳性对照，一定与AD存在互作）质粒，使其线性化。
第二步：将线性化的质粒转入Y1HGold菌株，用SD/-Ura培养基进行筛选。
第三步：菌落PCR鉴定阳性菌落，消除假阳性。pMutant-AbAi和p53-AbAi如何鉴定？Matchmaker Insert Check PCR Mix 1 (Cat. No. 630496)？
第四步：摸索确定抑制诱饵菌株生长的最低AbA浓度。
强烈建议按照以下方法将线性化的p53-AbAi转入酵母做为阳性对照（正对照），构建pMutant-AbAi 作为阴性对照（负对照）。
所需材料：
Y1HGold yeast strain
p53-AbAi质粒以及根据方法A构建的pBait-AbAi质粒和pMutant-AbAi 质粒
限制性内切酶BstBI或BbsI
去DNA试剂盒DNA clean-up kit (e.g. NucleoSpin Extract II, Cat. No. 740609.50)
Yeastmaker Yeast Transformation System 2 (included)
Matchmaker Insert Check PCR Mix 1 (Cat. No. 630496)
SD base+ DO Supplement-Ura 固体培养基（SD/-Ura with Agar）
YPDA液体培养基（可采用YPD代替YPDA）
1. 用限制性内切酶BstBI或BbsI同时酶切2ug pBait-AbAi，pMutant-AbAi和p53-AbAi，将载体
上的URA3基因打断，载体线性化。酶切后，电泳分离片段，切下目的片段，用试剂盒回收纯化。
可用NucleoSpin Extract II (Cat. No. 740609.50)试剂盒，本实验室用普通胶回收试剂盒。
2. 用Yeastmaker Yeast T ransformation System 2（PT1172-1）里面提到的方法，将线性化的1ug
质粒转到Y1HGold中
3. 将转化后的菌液分别稀释10倍，100倍，1000倍，吸取100 uL稀释后菌液到
SD/-Ura固体培养基上。
4. 培养三天后，挑取5个单菌落，用Matchmaker Insert Check PCR Mix 1做菌
落PCR，确定阳性菌落（原理见图4）。用未转化的Y1HGold菌株做负对照。
图4.用菌落PCR验证pBait-AbAi整合到Y1HGold中。Matchmaker Insert Check PCR Mix 1中的引物位于Y1HGold基因组中的AbA r基因上，处于URA3基因的下游。如果质粒成功整合到Y1HGold 中，利用这对引物可以扩增出一段包含bait序列的约1.4kb+X的片段。联系图2更便于理解。
预期的PCR结果分析：
正对照：1.4kb
负对照：没有条带
包含目的片段的菌株：1.35 kb + Insert size（1.5kb）
5. 确认为阳性菌株的各挑一个单菌落，以及正对照p53-AbAi c ontrol上的一个菌落，挑菌在
SD/-Ura培养基上划线，30℃倒置培养平板3天，在4℃至少保存1个月，既构建好Y1HGold[Bait/AbAi]菌株和[p53/AbAi] control s train。
6. 挑菌在YPDA (3 ml)液体培养基中过夜培养，离心收集菌体，加1mL freezing medium (Appendix
B)重悬菌体。在液氮中速冻后，可在–70℃长期保存。
注意：完整的质粒是非常稳定的，即使在没有URA3选择压力的液体培养基上过夜培养，也不会导致质粒部分结构丢失。
7.利用AbA r的表达检测诱饵菌株
A. 方法：找到抑制诱饵菌株生长的最低AbA浓度
如果bait sequence整合到pAbAi载体中，在没有猎物蛋白（prey）的诱饵报告菌株（bait reporter stain）
中的本底表达水平是不稳定的。例如，抑制p53-AbAi control生长的的最低Aureobasidin A浓度是100 ng/ml。
注意：任何酵母单杂交实验成功的关键取决于酵母内源转录因子对你的目的片段不识别/几乎不识别。因此，
在筛选文库（或验证相互作用）前要用AbA r expression严格测试构建好的诱饵菌株。以下的实验方法可以帮你确定在文库筛选过程中抑制bait construct本底表达的AbA浓度。
所需材料：
利用第6部分B方法得到的Y1HGold[Bait/AbAi] strain，Y1H[Mutant/AbAi] strain和Y1HGold[p53/AbAi] control strain
SD/-Ura培养基
Aureobasidin A (AbA)
包含100–200 ng/ml AbA的SD/-Ura/AbA培养基
方法：
1. 从bait和control strains中挑选较大的菌落，用适量0.9% NaCl重悬菌液，调至OD600~0.002（即大
约每100uL包含2000个细胞）
2. 分别在SD/-Ura，SD/-Ura with AbA (100 ng/ml)，SD/-Ura with AbA (150 ng/ml)和SD/-Ura with AbA
(200 ng/ml)培养基中各点100uL，30℃倒置培养2-3d
3. 预期结果见表3
注意：如果200 ng/ml的AbA也不能抑制本底表达，可以尝试将AbA浓度加大到500-1000 ng/ml。但是如果在没有prey的情况下，1000 ng/ml也不能抑制AbA r基因的表达的话，你的bait DNA sequence极有可能被酵母内源转录因子识别，那么你的这段序列就不能用于酵母单杂交的筛选试验。
4. 筛选文库时，用抑制bait strain生长最低的AbA浓度，或者用比最低浓度高50–100 ng/ml的能完全
抑制生长的AbA浓度。
8 cDNA文库的构建
（本实验不需要，此部分未翻译）
包含表4 RNA总量与最佳循环数直接的关系
图5利用SMART技术合成cDNA第一链并因此合成相应的粘性末端能够整合到pGADT7-Rec
图6利用SMART技术得到高纯度的cDNA文库
图7利用CHROMA SPIN+TE-400技术并收集产物
9单杂交的文库的构建和筛选
（本实验不需要，此部分未翻译）
10 结果分析
在经过单杂交文库的筛选验证后，你可能获得了几个可能与你的序列有相互作用的蛋白，其中，需要你做进一步分析的这种阳性互作的蛋白可能极少，也可能很多。此时，建议您先按下列步骤进行检查：
A 阳性候选蛋白很少的情况
●Have you screened >1million independent clones? Refer to Section 9.A, step 6 to calculate
whether you have screened at least 1 million independent clones. Optimize the transformation procedure and repeat the screening procedure.
●Check that your growth media performs as expected with the positive and negative controls.
●Retest the minimal inhibitory concentration of AbA for your bait strain
●Try increasing the number of repeats of your target sequence. Generally we find that three
repeats work well.
B阳性候选蛋白很多的情况
●Have you determined the optimal AbA concentration for your bait as described in Section
7.A?
●Check that your media performs as expected with the positive and negative controls.
●If you used 100 ng/ml AbA, repeat the screen with 200 ng/mL.
●Pick only large healthy colonies after 3–5 days to analyze further in Section 10.
●Your bait may interact with a partner that is abundant in the library. Sort duplicates by yeast
colony PCR (Section 11.B). After the clones have been sorted into groups, a representative of each unique type can then be analyzed for false positive interactions (Section 11.D).
11阳性克隆检验和猎物（prey）质粒分离
请在开始实验前完整阅读本方法
表型确认的详细说明见方法A，酵母菌落PCR消除假阳性见方法B，能有效激活AUR1-C reporter的文库质粒的提取与分离见方法C，阳性互作和假阳性互作的区分见方法D。
下列推荐的方法可以帮助你确认真正的阳性互作，但是，请注意：your preferred order of events may be somewhat determined by the number of positives obtained from your assay. 比如，如果与你的bait sequence存在相互作用的蛋白在文库里是功能冗余的，你将会得到许多候选的阳性蛋白，需要你进行分类，它们中甚至很多可能是同一个蛋白，在这种情况下，在分离质粒前你可以通过进行菌落PCR实验(Section 11.B)消除因酵母繁殖造成的复制克隆。但是如果候选的阳性克隆很少，你就可以省略菌落PCR筛选步骤。
A.方法：再划板确认报告表型
所需材料：
●在SD/-Leu/AbA*培养基上筛选文库得到的单克隆菌落
（本实验将构建好的AD转到Y1HGold中，用SD/-Leu/AbA*培养基得到单克隆）
●SD/-Leu/AbA*培养基（见Appendix B）
方法：
1.挑取阳性克隆在SD/-Leu/AbA*培养基上再划板获得单克隆(Appendix B)
2.真正的阳性克隆在30℃倒置培养2-4天后会再长出健康的单菌落，这些单菌落要进行
扩大培养以进行随后的分析。
B．方法：酵母菌落PCR消除假阳性（Duplicate Clones）
1.用Matchmaker Insert Check PCR Mix 2 (Cat. No. 630497)扩增的你的文库插入片段（prey），这个试剂盒预先混合了酶，反应液（buffer）和引物，可以扩增出pGADT7载体上的cDNA 插入。接下来你可通过第2-4步，用限制性内切酶酶切的方法排除假阳性。强烈推荐使用此试剂盒，因为在使用过程中方便可靠。
2.用0.8%TBE的琼脂糖凝胶电泳分析菌落PCR产物，扩增出多条条带属正常现象，因为一个细胞中可能包含多个prey质粒。
注意：为了确认大小相近的条带是否包含相同的插入片段，可用AluI、HaeIII或其他常用的内切酶酶切PCR产物，再用2%的琼脂糖凝胶分析产物（用浓度大的胶可以更好的分离片段）。
3.如果大多数的克隆里都包含一个大小相同的片段（AD/library insert），expand your PCR analysis to another batch of 50 colonies.
4.在此阶段，为了尽快的确认克隆片段，在照胶时只显示一条带的菌落可以用离心柱纯化（是否要挑菌提质粒？还是直接送菌液？或者直接切胶回收，回收产物即可用T7扩出来？），用T7引物确定序列（送测序，用通用引物T7）。
C．方法：能有效激活的文库质粒的提取与分离
1.分离酵母文库中的质粒
转化后的酵母细胞体内可以同时存在多个不同的相关质粒（不用于转化后的E.coli细胞），这意味着在一个酵母细胞中，除开包含一个编码与bait序列相互作用的蛋白的prey质粒外，还可能包含其他没有相互作用的prey质粒。
●如果你没有首先排除掉那些没有相互作用的prey，就采用转化E.coli来提取质粒的话，
那么你有可能得到并不存在相互作用的prey质粒。
●为了增加提取到阳性质粒的可能性，建议在SD/-Leu/AbA*培养基上划板2-3次，每次都
挑取单菌落再划板，这样质粒就可以在这些克隆中分离出来（见第2步）。
2.从酵母细胞中分离出文库质粒
推荐使用Easy Yeast Plasmid Isolation Kit (Cat. No. 630467)来提取SD/-Leu/AbA*培养基上长出的酵母细胞中的质粒，以便于确认是否为阳性互作。
3.提取到的质粒转化E.coli，分离文库prey质粒
因为pGADT7-Rec包含一段Amp抗性基因，所以prey质粒可以转化到任何E.coli菌株中，比如DH5α，并用含有100μg/mL Amp的LB板进行筛选。
D．方法：区分阳性互作和假阳性互作
使用酵母单杂交筛选系统，有可能出现假阳性，因此，按照下列标准排除bait 序列和a prey 蛋白之间的假阳性互作就十分重要。
阳性互作（Genuine Positive）：激活AbA r报告基因要求同时存在Bait序列和Prey。
假阳性互作（False Positive）：prey和突变的bait序列一起激活AbA r报告基因。
图8. 说明报告基因表达模式在阳性互作和假阳性互作之间的差异
所需材料：
●Yeastmaker Yeast Transformation System 2 reagents
●Y1HGold[Bait/AbAi] y east
●Y1HGold[Mutant/AbAi] y east（暂时先不做，突变就要做结构域缺失）
●SD/-Leu培养基
●SD/-Leu/AbA*培养基
方法：
1.使用Yeastmaker Transformation System 2中的试剂以及小剂量转化步骤，分别将分离出
的prey质粒转化100ng到下列酵母菌株中。
●Y1HGold[Bait/AbAi]
●Y1HGold[Mutant/AbAi]
注意：建议在进行这些实验时同时加入正对照和负对照（Section 5）。
2.将转化后得到的酵母菌液分别稀释10倍、100倍后滴100uL到下列培养基中：
●SD/-Leu培养基
●SD/-Leu/AbA*培养基
3.在30℃恒温箱中倒置培养3-5天后，预期结果：
图9是使用共转方法并通过筛选培养基验证单杂交的互作。
图9. 通过共转化选择性培养基验证相互作用
酵母双杂交系统 1．原理 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS 的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。 2．试验流程 酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为: 2．1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。 2．2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。2．3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。 2．4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。 3．特点 优点 蛋白--蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。酵母双杂交系统的建立为研究这一问题提供了有利的手段和方法。 缺点
2.1.1酵母双杂交 2.1.1.1Gateway入门克隆 设计Gateway引物时，在上游引物的5'端加上B1序列：GGGG-ACA-AGT-TT G-TAC -AAA-AAA-GCA-GGC-TNN-，下游引物的5'端加上B2序列：GGGG-ACC-ACT-TT G-T AC-AAG-AAA-GCT-GGG-TN-。其中，5'-GGGG序列是保护碱基，防止引物的重要部分被降解，下划线加粗的部分是在整个的Gateway克隆中可以保存下来的序列，3'端的碱基N是为了保证经过入门载体构建目的载体时阅读框的正确性，一般建议为C。 通过PCR扩增获得带有att B位点的基因片段，扩增体系和条件见3.2.2.2，其中将退火温度改为65℃。获得扩增产物后对其进行回收纯化，测定纯化后DNA 的质量和浓度后进行下一步的BP反应，反应体系如下： att B-PCR产物（≥10 ng/μL）1-7μL pDONR221 (150 ng/μL)1μL TE buffer, pH 8.0 补足8μL 将上述混合物加入离心管中，加入2μL BP反应酶，加入之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离心后，25℃反应1h，加入1μL蛋白酶K后，混匀离心，37℃反应10min终止BP反应，将BP反应产物参照3.2.2.6进行转化，由于pDONR221载体为Kan抗性，所以选用含有50μg/mL Kan抗生素的LB平板进行阳性克隆筛选，参照3.2.2.7检测阳性克隆，然后根据3.2.2.8中的方法提取重组质粒，测定质量和浓度后送至测序公司进行测序。 进行BP反应时，需注意以下几项： (1)对于BP反应来说，最高效的是采用线性的att B-PCR产物和超螺旋的att P 入门载体； (2)为了提高BP反应的效率，可以将建议的25℃反应1h适当延长至4-6h，可 以将效率提高2-3倍，或者延长至过夜反应，可以将效率提高5-10倍，对 于长片段克隆来讲，适当的延长反应时间是非常必要的； (3)提高体系中PCR产物的量可以增加反应效率，但每10μL体系中PCR产物 最好不要超过250ng。 2.1.1.2诱饵载体构建 重组的入门载体测序正确后，通过LR反应来构建酵母双杂交的诱饵载体，LR反应体系如下： 入门载体(50-150 ng)1-7μL pDEST32 (150 ng/μL)1μL TE buffer, pH 8.0 补足8μL
酵母单杂交 —研究蛋白质与特定DNA序列之间的相互作用 酵母单杂交技术最早是从酵母双杂交技术发展而来的，酵母双杂交技术通过对报告基因的表型进行检测以实现对蛋白质间相互作用的研究，而酵母单杂交技术则通过对报告基因的表型检测，分析DNA与蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控。 ●顺式作用元件 存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列，本身不编码任何蛋白质，仅仅提供一个作用位点，与反式作用因子相互作用参与基因表达调控。 ●反式作用因子 是指能直接或间接地识别或结合在顺式作用元件核心序列上参与调控靶基因转录效率的蛋白质。 酵母单杂交(Yeast one-hybrid)是根据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理，克隆与靶元件特异结合的转录因子基因(cDNA)的有效方法。 其理论基础是：许多真核生物的转录激活子由物理和功能上独立的DNA结合区(DNA-binding domain BD)和转录激活区(Activationdomain AD)组成。BD可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游；AD可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。两个结构域各据功能，互不影响。 (单独的BD虽然能和启动子结合，但是不能激活转录。) 这两个结构域各具功能，互不影响,单独存在时没有转录激活的功能，只有两者通过共价或非共价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完整的激活特定基因表达的激活因子的功能。 用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子。研究表明GAL4 的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)；而转录激活结构域可与RNA 聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA 聚合酶的活性。在这一过程中，DNA 结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。 据此，我们可将GAL4 的DNA结合结构域置换为其他蛋白，只要他能与我们想要了解的目的基因相互作用，就照样可以通过其转录激活结构域激活RNA聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录。
目录 （一）介绍 4 （二）试剂盒物品清单 7 （三）额外附加物品列表9 （四）酵母菌株11 （五）酵母载体14 （六）方法简述：单杂交文库的构建和筛选16 方法简述：双杂交文库的构建和筛选17 （七）构建用于酵母单杂交的报告质粒载体18 （八）构建用于酵母双杂交的DNA-BD融合载体19 （九）构建生成cDNA文库21 （十）构建和筛选酵母单杂交和双杂交文库（简述）27 （十一）酵母单杂交文库的构建和筛选28 （十二）酵母双杂交文库的构建和筛选30 方法A:通过酵母配对（Yeast Mating）来筛选目的蛋白30 方法B:通过共转化的方法筛选目的蛋白35 （十三）分析阳性相互作用结果38 （十四）问题解决指南44 （十五）参考文献47 （十六）相关产品50 附录A: 双链 cDNA合成的典型结果51 附录B: 酵母感受态的制备—LiAc 法52 附录C：单杂交对照载体信息53 附录D：双杂对照载体信息54 表格列表 Table I． BD Matchmaker酵母菌株的基因型11 Table II． BD Matchmaker酵母菌株的表型11 Table III．单杂交系统的载体14 Table IV．双杂交系统的载体15 Table V．各BD-Matchmaker DNA-BD 载体的比较19 Table VI． RNA起始浓度和PCR扩增循环数之间的关系24 Table VII．单杂交共转化的对照实验的设置29 Table VIII．单杂共转化对照实验：期望的结果29 Table IX．双杂交转化的对照实验的设置33 Table X．双杂交配对筛选的对照实验的设置 Table XI．双杂交共转化的对照实验的设置 Table XII．双杂交共转化的对照实验：期望的结果 Table XIII．用于PCR筛选菌落的Assembling Master Mixs
1 pBait-AbAi载体的构建（酵母报道子的构建） 注：酵母报道子（pBait-AbAi）包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝，且插入到pAbAi载体AbAi r报告基因的上游。大量研究表明最有效的构建应包含目的DNA三个以上的首尾连接的拷贝。首尾连接的拷贝产生方式很多，但对于长度小于20 bp的调控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。 （1）设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核苷酸序列，且两端加上与pAbAi载体酶切产物一致的粘性末端（建议合成一个目的序列的突变序列作为对照，以排除可能的假阳性）。 （2）用TE buffer溶解寡核苷酸至终浓度100 μmol/L。 （3）将正向链和反向链按照1:1的比例混合（退火后的双链寡核苷酸最大浓度为50 μmol/L）。 （4）95 ?C保温30 s，去除二级结构。 （5）72 ?C保温2 min，37 ?C保温2 min，25 ?C保温2min。 注：缓慢退火，有助于双链寡核苷酸的形成。 （6）冰上放置。退火后的产物可贮存在-20 ?C冰箱备用。 （7）酶切1 μL pAbAi载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。 注：回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。 （8）将退火后的寡核苷酸稀释100倍至终浓度为0.5 μmol/L。 （9）在连接反应管中加入如下成分： pAbAi载体（50 ng/μL） 1.0 μL annealed oligonucleotide （0.5 μmol/L） 1.0 μL 10×T4 DNA ligase buffer 1.5 μL BSA（10 mg/mL）0.5 μL Nuclease-free H2O 10.5 μL T4 DNA ligase （400 U/μL）0.5 μL 总体积15 μL 注：如果有必要，可用1 μL nuclease-free H2O代替寡核苷酸作为阴性对照。 （10）将反应体系室温放置连接3 h，转化E coli，采用常规方法检测阳性克隆。
各种SD培养基： 1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（？ “四缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ; 葡萄糖20g (即2%) 2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g. (即2%) 3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 4)SD/-leu (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%) 5)SD/-trp (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%) 注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。我们这用的是含硫酸铵的。（买来就加进去了的）。如果不含硫酸铵，那么要在终浓度0.17%的YNB中再加入0.5%的硫酸铵，即最终在1000 ml溶液中加入总量为6.7g的YNB与硫酸铵。 实际配制的方法是： 1.配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃ 以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。（李博士经验这一步不高压，过滤即可使用）2.酵母氮源6.7g，加DO supplement 在920ml水中溶解，调PH至5.8（李博士的经验大 约加10M NaOH 200ul即可），之后补水至950 ml。 3.高压完后待温度降至55℃以下，加入50 ml40%葡萄糖。
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中） 概念： 1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。 2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。优点：比次序转化更容易操作。 pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？ pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) ？ 各种SD培养基： 1) SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（？“四缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 2) SD/-leu/-trp/-his (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g. (即2%) 3) SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 4) SD/-leu (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）
酵母单杂交技术 1．酵母单杂交的基本原理 酵母单杂交技术是1993年由酵母双杂交技术发展而来的，其基本原理为：真核生物基因的转录起始需转录因子参与，转录因子通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多个其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成，即DNA 结合结构域(DNA—bindingdomain，BD)和转录激活结构域(activationdomain，AD)。用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白是一种典型的转录因子，GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)，而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。据此，我们可将GAL4的DNA结合结构域置换为文库蛋白编码基因，只要其表达的蛋白能与目的基因相互作用，同样可通过转录激活结构域激活RNA聚合酶，启动下游报告基因的转录。 酵母单杂交原理示意图 2．酵母单杂交技术的特点 酵母单杂交体系自1993年由Wang和Reed创立以来，在生物学研究领域中已经显示出巨大的威力。应用酵母单杂交体系已经验证了许多已知的DNA与蛋白质之间的相互作用，同时发现了新的DNA与蛋白质的相互作用，并由此找到了多种新的转录因子。近来，已有应用酵母单杂交体系进行疾病诊断的研究报道。随着酵母单杂交体系的不断发展和完善，它在科研、医疗等方面的应用将会越来越广泛。采用酵母单杂交体系能在一个简单实验过程中，识别与DNA特异结合的蛋白质，同时可直接从基因文库中找到编码蛋白的DNA序列，而无需分离纯化蛋白，实验简单易行。由于酵母单杂交体系检测到的与DNA结合的蛋白质是处于自然构象，克服了体外研究时蛋白质通常处于非自然构象的缺点，因而具有很高的灵敏性。目前，多种酵母单杂交体系的试剂盒和相应的cDNA文库已经商品化，为酵母单杂交体系的使用提供了有利的条件。 但酵母单杂交也存在以下缺点：有时由于插入的靶元件与酵母内源转录激活因子可能发生相互作用，或插入的靶元件不需要转录激活因子就可以激活报告基因的转录，因此往往产生假阳性结果。如果酵母表达的AD融合蛋白对细胞有毒性，或融合蛋白在宿主细胞内不能稳定地表达，或融合蛋白发生错误折叠，或者不能定位于酵母细胞核内，以及融合的Gal4AD封闭了蛋白质上与DNA相互作用的位点，则都可能干扰AD融合蛋白结合于靶元件的能力，从而产生假阴性结果。 3．酵母单杂交的基本操作过程
酵母单杂交 酵母单杂交技术最早是1993年由Li等从酵母双杂交技术发展而来，通过对报告基因的表型检测，分析DNA与蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控。由于酵母单杂交方法检测特定转录因子与顺式作用元件专一性相互作用的敏感性和可靠性，现已被广泛用于克隆细胞中含量微弱的、用生化手段难以纯化的特定转录因子。酵母单杂交(Yeast one-hybrid)是根据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理，克隆与靶元件特异结合的转录因子基因(cDNA)的有效方法。其理论基础是：许多真核生物的转录激活子由物理和功能上独立的DNA结合区(DNA-binding domain BD)和转录激活区(Activation domain AD) 组成，因此可构建各种基因与AD的融合表达载体，在酵母中表达为融合蛋白时，根据报道基因的表达情况，便能筛选出与靶元件有特异结合区域的蛋白。理论上，在单杂交检测中，任何靶元件都可被用于筛选一种与之有特异结合区域的蛋白。(百度百科) 酵母单杂交法 酵母单杂交体系(yeast one-hybrid system)常用于研究DNA-蛋白质间的相互作用。 酵母单杂交体系可识别稳定结合于DNA上的蛋白质，可在酵母细胞内研究真核DNA-蛋白质间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。也可用于分析鉴定细胞中转录调控因子与顺式作用元件相互作用。 酵母单杂交原理：将已知的顺式作用元件构建到最基本启动子(minimal promoter，Pmin)上游，把报告基因连接到Pmin下游。将待测转录因子的cDNA与酵母转录激活结构域(activation domain，AD)融合表达载体导入细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件结合，而激活Pmin启动子使报告基因表达。 酵母单杂交体系主要用于分离编码结合于特定顺式调控元件或其他DNA位点的功能蛋白编码基因，验证反式转录调控因子的DNA结合结构域，准确定位参与特定蛋白质结合的核苷酸序列。
Two-hybrid assay of yeast transformation Qi's protocol (This method can be used for both laboratory and industrial yeast) Yeast strain we used for two-hybrid is S. cerevisiae HF7c (MATa ura3-52 his3-200 ade2-101 lys2-801 trp1-901 leu2-3,112 gal4-542 gal80-538 LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3 URA3::GAL4 17mers(x3)-CyC1TATA-LacZ), which contains the two reporter genes LacZ and HIS3, was used in two-hybrid analysis. Yeast can be co-transformation with plasmids carrying the different GAL4 DNA binding domain-target protein fusions (TRP1marker) and plasmid carrying the GAL4 activation domain (LEU2marker) to perform the protein-protein interaction study or two-hybrid screening. The transformation method is modified from Schiestl and Gietz (1989) GAL4 DNA binding domain vector (pGBT8 or pGBT9, difference only in polylinker, relatively low expression, TRP1 marker) GAL4 activation domain vector (pGAD424, low expression; pGADGH, high expression, LEU2 marker ) Transformation protocol for unique plasmid or for two known plasmids 1. From the stock (-70aC) the yeast were inoculated on YPAD plate for 2 days at 28-32aC 2. Inoculate 2-3 independent yeast colonies to 10 ml YPAD medium for the preinoculation, shaking at 28-32aC for 10 to 12 hours, check OD600. 3. Make an inoculation of the volume necessary for the transformation. (Usually 10 ml of OD600 0.3 cells or 5 ml of OD600 0.8 is used for each sample transformation. You can use the formula: OD -------- 2n ------------- x Vinoc. = Vpreinoc. ODpre OD is OD600 of cells you will use for transformation, 0.3-0.8 of OD600 is good for LiOAc transformation. ODpre is OD600 of the preinoculation. n is the generation time of yeast, different yeast strain has different generation time. The generation time for HF7C is 1.5 hours in rich medium and 2 hours in minimal medium. Vinoc. The volume you need for the transformation. Vpreinoc. is the volume you need take from preinoculation. Shaking at 28-32aC and an overnight inoculation is recommended
模块七蛋白质之间的相互作用 1.实验目的 本实验以重组质粒和酵母细胞为材料, 学习检测蛋白质相互作用的基本原理和 技术方法。主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术 ; 让学生了解和掌握酵母双 杂交系统的应用 ; 掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。 2.实验原理 1989 年Fields 和Song 等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认 识(即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与,提出并建立了酵母双杂交系 统。该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平 台 ,近几年得到了广泛的运用和发展。 相比于其它蛋白质筛选系统,酵母双杂交系统具有以下优点:(1 检测在真核活细 胞内进行 ,在一定程度上代表细胞内的真实情况。(2 作用信号是在融合基因表达后, 在细胞内重建转录因子的作用而给出的 ,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。(3 检测结果是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互 作用。(4 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA 文库 ,能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。(5 通过mRNA 产生多种稳定的酶使信号放大。同时,酵母表型、X-Gal 及 HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交系统也具有一定的局限性。首先 , 经典的双杂交系统分析蛋白间的 相互作用定位于细胞核内,因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白 的研究。酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性”。在酵母双杂交系统建立的 初期阶段 ,由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系,这种报告基因的表 达往往不能十分严谨地被控制,因此容易产生假阳性。由于某些蛋白本身具有激活 转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用, 使DNA 结合结构域融合蛋白在 无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白
. 酵母双杂交系统原理(Yeast Two-hybrid System) 生物谷谷友：jnulynn提供
a genetic assay for detecting protein-protein interactions X Y Suppose we have two proteins... One way of answering this question is to use the yeast two hybrid method. To understand the method we must first consider how gene expression is regulated in yeast...... and the question, do these two protein bind each other?
Regulation of gene expression in yeast g e n e U A S (u p s t r e a m a c t i v a t i o n s e q u e n c e ) t r a n s c r i p t i o n a c t i v a t o r D N A b i n d i n g d o m a i n a c t i v a t i o n d o m a i n t r a n s c r i p t i o n m a c h i n e r y and now back to the question... a genetic assay for detecting protein-protein interactions
4月4日划线配培养基 TE/LIAC PEG/LIAC 配置培养基（YPD YPDA）取酵母细胞划线 30°生长3天。 需要用品：三角瓶灭菌封口膜酵母提取物蛋白胨 注：以下所有涉及菌的操作均需在超净台中完成。 4月6号星期三 （1）选择2-3mm的单克隆（枪头吸取）放入3-5ml的YPDA液体培养基，30°摇菌200rpm，8h 7号下午开始，过夜培养，次日若菌液浓度达到标准，可先置于4度冰箱保存。 需要用品：200ul灭菌枪头、50ml三角瓶、YPDA液体培养基、摇床。 4月7号星期四 （2）吸取2.5-10ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基，摇菌16-20h直到OD值0.15-0.3。 下午4点开始 8号 8点结束 Tips：由于第一次活化的菌夜浓度不一，此处建议设置梯度，分别取2.5、5、10 ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基（转化5个以下质粒的话，25ml菌量就够后续使用）。 4月8号星期五 （3）将菌液转移至灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。 （4）弃掉上清，加入50ml新鲜的YPDA液体重悬菌体（由于离心转速较低，沉淀易悬起来，故倒掉上清液时要小心操作）。 （5）30°震荡培养，直到OD值达到0.4-0.5 （3-5h）。8号 8点开始下午一点结束进行以下操作之前，配置好TE/LiAc溶液，并准备好冰浴。 （6）将上述菌液转移至一个灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。（7）弃掉上清，用30ml无菌水重悬菌体（小心操作）。 （8）再次用天平配平后，室温下700g离心5分钟，弃去上清，加入1.5ml 1.1xTE/LIAC重悬菌体。（9）将上述溶液转移到灭菌的1.5ml EP管中，高速离心15s。 （10）弃去上清，加入600ul 1.1x TE/LIAC，感受态细胞制备完成，置于冰上待用。 需要物品：50ml 灭菌离心管、50ml 三角瓶、1.5ml EP管、5ml灭菌枪头、1ml灭菌枪头、灭菌ddH2O、YPDA液体培养基、1.1x TE/LIAC。 1.1x TE/LIAC 10ML 10xTE 1.1ml 10xliac 1.1ml Dh2O 8.8ml
模块七蛋白质之间的相互作用 1. 实验目的 本实验以重组质粒和酵母细胞为材料，学习检测蛋白质相互作用的基本原理和技术方法。主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术；让学生了解和掌握酵母双杂交系统的应用；掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。 2. 实验原理 1989年Fields和Song等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认识（即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与），提出并建立了酵母双杂交系统。该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，近几年得到了广泛的运用和发展。 相比于其它蛋白质筛选系统，酵母双杂交系统具有以下优点：（1）检测在真核活细胞内进行，在一定程度上代表细胞内的真实情况。（2）作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。（3）检测结果是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互作用。（4）酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。（5）通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型、X-Gal 及HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交系统也具有一定的局限性。首先，经典的双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白的研究。酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性”。在酵母双杂交系统建立的初期阶段，由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系，这种报告基因的表达往往不能十分严谨地被控制，因此容易产生假阳性。由于某些蛋白本身具有激活转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域融合蛋白在无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生“假阳性”结果。产生“假阴性”结果的原因可能有许多蛋白质间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、磷酸化和二硫键形成，还有些蛋白的正确折叠和功能有赖于某些非酵母蛋白的辅助等。 现在的酵母双杂交系统大都采用多种报告基因，如AH109酵母株含有三类报告基因—ADE2、HIS3、MEL1/lacZ，这三类报告基因受控于三种完全不同、异源性的GAL4-反应元件和三类启动子元件-GAL1、GAL2以及MEL1（如图6-1-1）。通过这种方法就消除了两类最主要的假阳性，一类是融合蛋白可以直接与GAL4结合位点结合或者是在结合位点附近结合所带来的假阳性；另一类是融合蛋白和某种转录因子结合后再结合到特定的TA TA盒上所带来的假阳性。ADE2一种报告基因就已经能够提供较强的营养选择压力，这时选择性地使用HIS3报告基因，一来可以降低假阳性率；二来可以控制筛选的严格性（如果需要筛选与诱饵蛋白具有较强结合的蛋白，就可以同时使用ADE2、HIS3两种报告基因；如果只需要筛选与诱饵蛋白具有中等强度或较弱结合的蛋白，就可以使用ADE2或HIS3两者中的一种）。MEL1和lacZ分别编码α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶，可以作用于相应的底物
酵母单杂交技术（Yeast One-hybrid method） 一、原理 酵母单杂交方法是根据DNA结合蛋白（即转录因子）与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理来克隆编码目的转录因子的基因（cDNA）。该方法也是在细胞内（in vivo）分析鉴定转录因子与顺式作用元件结合的有效方法。将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子（minimal promoter，Pmin)上游，Pmin启动子下游连接报道基因。进行c DNA 融合表达文库筛选时，编码目的转录因子的c DNA 融合表达载体被转化进入酵母细胞后，其编码产物（转录因子）与顺式作用元件结合，就可以激活Pmin启动子，并促使报道基因表达。根据报道基因的表达，筛选出与已知顺式元件结合的转录因子。 二、实验步骤 ①构建报道子载体：将已知的特定顺式作用元件按同一方向随机串联到一个最小启动子（minimal promoter，Pmin）上游，其下游连有报道基因； ②将构建好的报道子载体转化酵母细胞筛选合适的3-AT浓度； ③提取总RNA，合成c DNA双链； ④将报道子、c DNA和融合表达载体共转化到酵母中，在相应的缺陷性SD培养基上进行筛选阳性克隆； ⑤对阳性克隆进行鉴定，去除假阳性克隆； ⑥对所获得的阳性克隆进行测序，为进一步分析打下基础。如可进一步分析DNA确切的结合位点。 三、图片分析 1、选择YM4271[ pHISi3NF4] 克隆株重复进行3-AT 梯度试验，在没有3-AT的SD/-His平板上生长状态很好，在15mM 3-AT存在下被明显抑制，而在30mM 3-AT存在下完全不能生长。故选择15mM为筛库实验的3-AT工作浓度。 2、经9天培养，在SD/-Leu/-His/ +15mM[3-AT]选择培养基上共长出351个大小不同的阳性候选克隆。取100个菌落划线于30mM 3-AT和60mM[3-AT]平板，仅有1个克隆被淘汰。证实15mM[3-AT]的选择是正确的。挑取阳性候选克隆菌落提取酵母质粒并转化E .coli Top 10F'后，酶切鉴定，共得到31个初筛阳性克隆。 四、严谨性分析 1、为了克服His3基因的渗漏表达对筛库实验结果的影响，我们选择克隆株重复进行3-AT 梯度试验。菌株在没有3-AT的SD/-His平板上生长状态很好，在15mM 3-AT下被明显抑制，
酵母双杂交系统原理 酵母双杂交系统(Yeast Two-hybrid System)由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA 结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。 双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。 酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。主要是由于：①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交筛选原理 双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明, 转录激活因子在结构上是组件式的(modular), 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, 简称为DB，？BD)和转录激活结构域(activation domain, 简称为AD), 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的DB虽然能和启动子结合, 但是不能激活转录。而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的Gal4蛋白的DB与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。 Fields等人的工作标志双杂交系统的正式建立。他们以与调控SUC2基因有关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。由DB和AD形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵”(bait)和“猎物”或靶蛋白(prey or target protein)。如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转
酵母单杂交(yeast one hybrid)技术 (2013-03-23 05:24:00) 转载▼ 分类：分子生物学专业 标签： 酵母单杂交 gal4蛋白 酵母双杂交技术 报告基因 文化 酵母单杂交(yeast one hybrid)技术，是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法，通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析，来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因，或对DNA结合位点进行分析。 运用此技术，能筛选到与DNA结合的蛋白质，并可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核苷酸序列，而无需复杂的蛋白质分离纯化操作，故在蛋白研究中，具有一定的优势；而且，酵母属真核细胞，通过酵母系统得到的结果，比其他体外技术获得的结果，更能体现真核细胞内基因表达调控的真实情况。 1 酵母单杂交技术的原理 酵母单杂交技术，最早是1993年由Li et al从酵母双杂交技术发展而来，酵母双杂交技术通过对报告基因的表型进行检测以实现对蛋白质间相互作用的研究，而酵母单杂交技术则通过对报告基因的表型检测，分析DNA、蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控。 目前认为真核生物的转录起始，需要转录因子的参与。这些转录因子通常由一个DNA 特异性结合功能域和一个或多个与其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成，即DNA结合结构域(DNA-binding domain, BD)和转录激活结构域(activation domain, AD)。 用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子。 研究表明GAL4的DNA结合结构域，靠近羧基端,含有几个锌指结构,可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS);而转录激活结构域，可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。 在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。据此，我们可将GAL4的DNA结合结构域置换为其他蛋白，只要它能与我们想要了解的目的基因相互作用，就照样可以通过其转录激活结构域激活RNA聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录。 正是基于这一理论，酵母单杂交系统由2部分组成： (1)将文库蛋白片段，与GAL4转录激活域融合表达的cDNA文库质粒； (2)含有目的基因和下游报告基因的报告质粒。
蛋白的酵母双杂交实验 ——以钓饵蛋白筛选cDNA 文库研究蛋白相互作用 第一部分 系统简介 1. 实验原理 蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用 对真核基因转录调控影响的实验。很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA 上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。这种DNA 个相互独立的结构域即DNA 结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。目前酵母双杂交实验采用的系统有LexA 系统和Gal4 LexA DNA 结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA 构成，转录活化结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 在Gal4系统中，BD 和AD 分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa 与768-881aa)构成。cDNA 文库或DNA 与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。一般情况下，单独的BD 可以与GAL4上游活化序列（）结合但不能引起转录，单独的AD 则不能与GAL UAS 结合，只有当BD 与AD BD 与AD 才能与GAL UAS 结合并且引起报道基因的转录。在BD 与AD 要导入的酵母菌AH109通过基因工程的方法在GAL4 UASs 和启动子的下游构建了3个报道基因——ADE2，HIS3，MEL1（或LacZ ），否存在相互作用。GAL4系统的原理如图所示： 图一：酵母双杂交系统工作原理 Kan r Amp r pGBKT7-bait pACT2-cDNA