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第16卷第6期 分析科学学报2000年12月V o l.16 N o.6 JOU RNAL O F ANAL YT I CAL SC IEN CE D ec. 2000文章编号:100626144(2000)0620516208
三维荧光光谱技术分析应用进展
刘志宏 蔡汝秀
(武汉大学化学系,武汉,430072)
摘 要:本文对三维荧光技术的发展及其分析应用作了回顾、评述与展望,引用文献75篇。
关键词:三维荧光光谱;分析应用;综述
中图分类号:O657.39 文献标识码:A
荧光分析方法已成为例行分析的重要手段。然而,随着分析对象的不断发展、分析任务的日益复杂,传统的荧光分析法已很难满足要求。因为传统的荧光发射(激发)光谱只是在某一个激发(发射)波长下扫描,而事实上,荧光是激发波长和发射波长两者的函数,所以这种传统的荧光发射(或激发)光谱并不能完整地描述物质的荧光特征。一个化合物荧光信息完整的描述需要三维光谱才能实现[1]。这是进行光谱识别、表征的必要条件。另外,对一个含多种组分的荧光光谱(发射 激发)重叠的对象,传统的峰值定量法很难解决组分之间的干扰问题,需要从对象更完全的信息中寻找选择性的区域,或结合其它的优化手段才可能准确地实现多个组分的同时分析。三维荧光法是近20多年发展起来的一门新的荧光分析技术,这种技术能够获得激发波长与发射波长或其它变量同时变化时的荧光强度信息,将荧光强度表示为激发波长2发射波长或波长2时间、波长2相角等两个变量的函数。三维荧光光谱分别被称作三维荧光光谱(T h ree2D i m en si onal F luo rescence Sp ectrum)、激发2发射矩阵(Em issi on2Excitati on M atrix)、总发光光谱(To tal L um inescence Sp ectrum)、等高线谱(Con tou r Sp ectrum)等[2]。图1所示是典型的等角三维投影图及其等高线谱图。
通常,三维荧光的三个维度是指荧光激发、发射波长和荧光强度,它表现的是荧光强度随激发和发射波长同时变化的信息。一般获取三维荧光数据的方法,是在不同激发波长位置上连续扫描发射光谱,并可利用各种绘图软件将其以等角三维荧光投影图(Ex2Em2 If)或等高线光谱(Ex2Em)等形式图象化表现。此外,电视荧光仪(V ideo F luo rom eter)[3,4]和CCD照相技术[5,6]等也是获取三维荧光的方法。
除此之外,一些其它的荧光技术及联用技术也能获得三维数据。三维同步荧光[1]的三个维度分别是波长差、发射波长和荧光强度,它可以通过在不同的激发2发射波长差下记录发射光谱获得。相分辨荧光是另一种获得三维荧光的技术[7],其相分辨荧光强度(PR F I)作为检测相角和发射波长的函数,可在不同的调制频率Ξ下作发射扫描而获得。相分辨三维荧光[8]则综合了相分辨荧光与三维荧光的优点。时间分辨2三维荧光[9]则是研
收稿日期:2000207207 通讯联系人:蔡汝秀
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F ig .1 Typ ica l iso m etr ic three -d i m en siona l projection (a )and its con tour plot (b )
究时间相关的荧光过程的有力工具,在不同的时间对发光谱进行快速扫描,可获得这种类型的三维数据,其荧光强度是时间和波长的函数。激光激发的运用加快了这项技术的发展和应用[10]。将荧光作为色谱的检测器,则可获得荧光强度与色谱保留时间和发射波长同
时相关的三维光谱信息,包括快速扫描荧光仪[11,12]、CCD 荧光仪
[13,14]和二极管阵列荧光仪[15,16]都有与色谱联用的报道。
1 光谱指纹技术
生物大分子如蛋白质、DNA 的荧光光谱对微环境和构像变化很敏感。这样就可能透过荧光光谱指纹的细微变化来揭示生物大分子环境的变化,帮助理解其结构及生理功
能。[17]Chen 等[18]研究了hem o rrhagin 在不同的介质(SD S 、CTAB 、Gu 2HC l )中的三维荧光光谱,它能直接揭示蛋白质的构像变化以及色氨酸残基的微环境变化情况,借助等高线谱可清晰地看到发射波长迁移与色氨酸残基微环境变化之间的关系。鄢远等[19]运用三维荧光偏振光谱研究了牛血清蛋白(B SA )和鸡蛋白蛋白(EA )在不同条件下的构象变化,表明三维荧光是研究溶液状态下蛋白质分子构象的一种直观、有效的方法。王菊等[20]将三维全内反射荧光光谱用于细胞色素C 在银电极表面吸附过程的研究,解释了细胞色素C 吸附在不同电极表面上的不同构象,以及其电化学行为。
鄢远等[21,22]研究了溴化乙锭、芘在不同环境介质中的三维荧光指纹特征,并且将溴化乙锭作为一种荧光探针研究DNA 的构象以及两者之间的相互作用机理[23]。三维荧光光谱的谱图特征以及丰富的信息含量,为有机小分子作为介质荧光探针的研究,以及它们与生物大分子蛋白质相互作用机理的研究提供了有力的手段。胶束和反相胶束可作为生物体内有序介质的一种模拟[24],作者[25,26]研究了氟喹诺酮药物分子在水溶液和胶束及反相胶束中的三维荧光光谱性质及其分析应用,对于揭示药物在生物体内的分布、停留有一定参考价值。
石油中多环芳烃(PA H )成分及含量的表征,对于溢油的污染监控、石油勘探等都具
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有现实意义。在这一领域,三维荧光光谱法发挥了分析快速、信息丰富、适于现场操作等优点。赵云英等[27]论述了三维荧光光谱在鉴别海面溢油源中的研究进展。引用国内外众多海洋环境保护单位大量的研究成果,表明利用荧光光谱的三维特征进行油源的鉴别是有特色的。侯镜德等[28]采用三维全扫描荧光法,以三维空间荧光图和等高线图描述样品中的芳烃含量,并以总荧光强度、特征荧光强度等参数描述芳烃含量随井深的变化情况,用于油田单井的评价。吴清洲等[29]在此基础上发展了一种反射式三维全扫描荧光技术,不仅保持了原来三维荧光法的优点,同时可对固体样品直接扫描。
此外,三维荧光光谱还被用来研究烟草的“吃味”。雍克岚等[30]研究了不同品种烟草石油醚冷萃取物的三维荧光光谱,包括烟草所共有的荧光性质和各自的荧光特征,寻找它们与烟草“吃味”之间的关系,从总体特征方面对烟草的品质评价给予描述和表征。
对于一些需要原位、快速和非破坏性分析的样品,
光纤传感与三维荧光结合是一种很
有用的技术。Zung[31]等论述了光纤传感2三维荧光的优点。N oda等[32-34]利用光纤传感2三维荧光技术系列研究了中日古代印染布料所用染料的来源及成分等特征。
也有作者采用所谓的三维同步荧光谱[1]作为指纹技术,其实质是多个波长差(?Κ)同步谱合成的三维图?Κ2Em2If。何家俊等[35]研究了三维同步荧光谱随生物喜树碱4种结构变化的规律,用三维同步荧光谱能明显地表现出4种结构的荧光光谱的异同之处,其变化过程也一目了然。
值得指出的是,作为光谱指纹技术进行荧光物质的判定和识别,或研究荧光探针及其作用机理,等高线光谱比总体积光谱更有意义和价值。荧光强度以等高线的方式表现在一个平面上,能很直观地提供任何激发2发射波长所对应的荧光强度信息,而且容易体现与普通的激发光谱、发射光谱以及同步荧光谱的关系。尤为重要的是,等高线谱克服了等角三维投影图中许多小荧光峰被大峰遮蔽的问题,能够清晰地揭示谱图微细结构,因而可表达更为丰富的荧光信息。
2 复杂体系多组分同时分析
对复杂的多组分体系,避免费时而繁琐的分离手段直接对各组分进行选择性定量是一个很现实的课题。传统的荧光分析利用荧光物质的荧光强度峰值进行定量,在处理多组分体系或者组分荧光光谱重叠的体系时,其选择性、灵敏度将受到挑战。三维荧光技术为这一难题的解决提供了一种可能的途径。
2.1 激发2发射矩阵三维荧光
激发2发射矩阵是最为普遍的一种三维荧光。它包含了荧光物质完整的稳态荧光信息。应用这种三维荧光矩阵数据,不经分离直接测定混合物中的各种组分,已成为一种十分重要的分析手段[36,37]。这种数据的解析往往需要借助一些数学、统计学的算法,通常在计算机上完成,也即与化学计量学结合,将在后文详述。
2.2 其它类型三维荧光
其它类型三维荧光是指由X2Em2If构成的数据阵列,它可同时利用光谱和另外一个方向的信息。这里的X可以是时间分辨中的衰减时间、相分辨中的检测相角以及色谱分离中的保留时间等等。李建军等人[10]曾利用时间分辨2三维荧光技术,对稀土混合物同时815
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测定,获得满意的结果。三维同步荧光不仅可用作光谱指纹进行定性分析,也可对结构相近的多种组分同时选择性测定[35]。Yan等[38]的工作证实了三维同步荧光同时测定多组分的良好选择性,特别是对斯托克斯位移较小的荧光物质,此法具有独特的优势。M cGow n 和同伴将相分辨2三维荧光[39]用于混合物体系分析,证实此技术具有出色的直接抑制散射光的能力,因而特别适合于一些含有高散射样品(如含蛋白质的生化样品、胶束体系以及环境微生物样品)的分析。从高效液相色谱与快速扫描荧光联用[12,40]中获得的三维谱图数据也成功地用于水样中多环芳烃混合物的测定。
2.3 三维2变角同步荧光
三维2变角同步荧光是值得注意的一项高选择性分析手段。对一个荧光光谱严重重叠的多组分混合物样品,最佳的同步荧光扫描轨迹需要同时经过各组分的最大荧光强度值,尽量少的光谱重叠,以及尽可能地避开拉曼散射的干扰[41,42]。而传统的同步荧光(?Κ恒定)往往并不能满足这样的要求。对此,一个重大的改进就是三维2变角同步荧光技术[43]的应用。
所谓可变角同步荧光(V ariab le2A ngle Synch ronou s F luo ri m etry),就是在同步扫描过程中,激发和发射波长之间的差值不断地变化。它与三维荧光结合,利用三维荧光光谱,特别是等高线谱,配以合适的软件,并通过微机控制来确定最优的扫描轨迹[44]。Pu lgarin 等[45]开发的一个名为F to tal的软件专门用以从三维荧光等高线谱中获取最优的变角同步荧光扫描路径。将满足最佳条件的等值线上的点进行函数拟合。他们将三维2变角同步荧光法成功地用于化学结构非常相似、荧光光谱严重重叠的吡哆醛等三组分[41],血清中的的水杨酰氨等三组分[42]以及药物多组分[46]的同时测定。Garcia等[47-49]开发的一种商业化的数字仪器,装置并非十分复杂,但大大缩短了获取全部数据所需的时间,用于药物等多组分的同时测定,获得很令人满意的选择性和灵敏度。同时,三维变角同步荧光法也与导数光谱技术相结合,构成三维2导数变角同步荧光,进一步增加了对重叠荧光谱的解析能力,提高分析的选择性[50-52]。
2.4 三维荧光光谱总体积积分法
三维荧光法在提高定量分析灵敏度方面的一个重要特征,就是三维荧光光谱总体积积分法的应用。三维荧光光谱总体积积分进行定量使检测灵敏度成百倍的提高。许金钩等详细论述了三维荧光光谱总体积积分进行定量分析的优点以及M on te Carlo积分的原理,指出总体积积分值与待测物浓度之间呈指数相关而并非线性相关即F=K cΑ,系数K 因积分而增大,同时随机误差被抑制,大大增加了信噪比,这也正是灵敏度提高的原因[53,54]。鄢远等[55]用三维荧光光谱总体积积分法同时测定萘、芘、艹
北,灵敏度较单点法分别提高30倍左右。而三维导数荧光光谱总体积积分法[56]用于同一体系的测定,灵敏度较三维荧光光谱总体积积分法略低,但选择性有明显的提高。M on te Carlo积分法还被用在三维同步荧光光谱中[38],其两个积分变量分别为发射波长(Em)和波长差(?Κ),用总体积积分值对萘等三组分同时测定,灵敏度较单点法提高近百倍。
3 化学计量学与三维荧光技术结合
与化学计量学方法结合,是三维荧光技术又一重要发展方向。对于复杂的多组分体系
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(灰色或黑色体系)的解析,只有利用二阶甚至三阶数据才能获得具物理意义的唯一解,也即准确的定量信息[57]。因而,作为一种重要的二阶数据,与化学计量学方法的结合已成为三维荧光提高对复杂多组分体系的解析能力的主要手段。
各种形式的多变量校正方法在多组分混合物,尤其是结构、性质相近的多组分同时定量分析中广泛应用。常用的多变量校正方法如基于迭代算法的并行因子分析法(PA RA FA C)[5,58]和基于因子分解的主成分回归(PCR)[59,60],以及对光谱非线性有较强克服能力的(非线性)偏最小二乘回归(PL SR)[60,61]等,均有文献报道与三维荧光结合用于多组分同时测定。B eltran等[62]考察了PA RA FA C和PL SR处理多环芳烃的混合物实际样品的能力,发现PA RA FA C用于实际样品分析存在一些缺点,计算过程比较冗长,更重要的是,非线性的瑞利散射对其有较严重的干扰,而PL SR比PA RA FA C效果要好。作者将PL S法用于苯酚、对甲基酚和邻苯二酚这三种内源荧光光谱严重重叠的混合物同时测定[63],对实际样品分析获得了满意的结果。但是一些非线性严重的混合物体系(如存在荧光熄灭现象),将给利用三维荧光进行多元校正的工作带来困难,PL S并不是总能很好地解决这个问题。人工神经网络因其所具有的很强的非线性映照能力使其在非线性多元校正中起到重要作用,刘平[64]等将人工神经网络用于三维荧光光谱,成功地预测了罗丹明三组分混合体系的浓度。秩消失因子分析法(RA FA)是由Ho等人专门针对三维荧光光谱的定量分析而提出的[65],其基本原理就是利用纯组分的三维荧光谱是双线性矩阵,其秩为1来进行特征值分解。L o rber[66]将其发展为第一种非迭代的用于从三维荧光数据中估计组分浓度并获得单组分光谱的方法,T.Roch[67]将RA FA用于15种多环芳烃的三维荧光数据解析,结果表明这种方法有很强的克服实际样品中腐质酸干扰以及消除杂散光干扰的能力。Ferreira等[68]将多个样品的三维荧光光谱(二阶数据)合为一个三阶的数据张量,采用三线性分解法(TLD)处理,同时获得了各组分的纯物质光谱(定性)以及各样品中每种组分的含量(定量)。这种高阶数据解析的方法还有投影旋转因子分析法,它是由B u rdick等[69]专门针对相分辨三维荧光所产生的三阶数据而提出的。
除了这些校正算法,模式识别[70]技术(其中最经典的是人工神经网络[71,72]),专家系统[73]等智能化的化学计量学手段也被应用于三维荧光光谱的数据处理中。
4 结语及展望
三维荧光在分析化学的诸多应用领域受到了普遍重视,这说明三维荧光在分析化学里的应用有很大的发展潜力。从目前的研究应用进展情况来看,三维荧光技术的发展主要将体现在以下一些方面:
(1)新型三维荧光仪器及相应软件的研究和商品化,快速而高灵敏地获取完整的荧光信息将成为三维荧光技术向更广、更精的分析应用领域拓展和深入的关键。
(2)与其它分析技术联用。曾有文献[74]将电视荧光仪作为高效液相色谱的检测器,进行流出液的实时检测,获取时间2激发2发射2荧光强度四维的信息,同时利用色谱与三维荧光光谱的优势,对色谱分离十分困难的苯并[a]芘和苯并[e]芘进行了选择性定量。最近有报道将三维CCD荧光仪[75]与色谱联用,但是类似联用方法用于复杂混合物分析的工作还不是很多见。可以预见,类似这种色谱2三维荧光光谱的联用,提高的绝不仅仅是数据的025
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一个维度,更重要的是分析的信息量以及由此带来的解决复杂分析问题的能力。
(3)化学计量学已经在复杂体系分析中显示了其优越性并得到越来越多的应用。多维数据的分辩和校正都离不开这些数学和统计学的手段。而化学计量学本身到今天也只有二十多年的发展历史,因此随着它自身不断的成熟和进步,计量学手段将会与三维荧光光谱更多地结合。
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Progresses and Appl ica tion s of Three-D i m en siona l
Fluorescen t Spectroscopy
L I U Zh i2hong,CA I R u2x iu3
(D ep a rt m en t of C he m istry,W uhan U n iversity,W uhan,430072)
Abstract:A dvance in th ree2di m en si onal fluo rescen t sp ectro scop y and app licati on s of th is analytical techno logy are review ed in the p resen t w o rk.T he researches in the field of fingerp rin t,the enhancem en t of sen sitivity and selectivity,and the com b inati on w ith chem om etrics are discu ssed,resp ectively.75literatu res are cited.
Keywords:T h ree2di m esi onal fluo rescen t sp ectro scop y;R eview;A nalytical app licati on
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1 荧光定义 某些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态回到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式放射出去即发光，称之为荧光。可产生荧光的分子或原子在接受能量后引起发光，供能一旦停止，荧光现象随之消失。 2 荧光分类 由化学反应引起的荧光称为化学荧光，由光激发引起的荧光称为光致荧光，课题主要研究光致荧光。按产生荧光的基本微粒不同，荧光可分为原子荧光、X 射线荧光和分子荧光，课题主要研究分子荧光。 3 光致荧光机理 某一波长的光照射在分子上，分子对此光有吸收作用，光能量被分子所吸收，分子具有的能量使分子的能级由最低的基态能级上升至较高的各个激发态的不同振动能级，称为跃迁。分子在各个激发态处于不稳定的状态，并随时在激发态的不同振动能级下降至基态，在下降过程中，分子产生发光现象，此过程为释放能量的过程，即为光致荧光的机理。光致荧光的过程按照时间顺序可分为以下几部分。 分子受激发过程 在波长为10~400nm的紫外区或390~780nm的可见光区，光具有较高的能量，当某一特征波长的光照射分子时，是的分子会吸收此特征波长的光能量，能量由光传递到分子上，此过程为分子受激发过程。分子中的电子会出现跃迁过程，在稳定的基态向不稳定的激发态跃迁。跃迁所需要的能量为跃迁前后两个能级的能量差，即为吸收光的能量。分子跃迁至不稳定的激发态中即为电子激发态分子。 在电子激发态中，存在多重态。多重态表示为2S+1。S为0或1，它表示电子在自转过程中，具有的角动量的代数和。S=0表示所有电子自旋的角动量代数和为0，即所有电子都是自旋配对的，那么2S+1=1，电子所处的激发态为单重态， 用S i 表示，由此可推出，S 即为基态的单重态，S 1 为第一跃迁能级激发态的单重 态，S 2 为第二跃迁能级激发态的单重态。S=1表示电子的自旋方向不能配对，说明电子在跃迁过程中自旋方向有变化，存在不配对的电子为2个，2S+1=3，电子 在激发态中位于第三振动能级，称为三重态，用T i 来表示，T 1 即为第一激发态中 的三重态，T 2 即为第二激发态中的三重态，以此类推。
1 原子荧光光谱法的基本原理 1.1 原子荧光光谱法原理 原子荧光光谱法（AFS)是原子光谱法中的一个重要分支，是介于原子发射(AES）和原子吸收（AAＳ)之间的光谱分析技术，它的基本原理就是：固态、液态样品在消化液中经过高温加热，发生氧化还原、分解等反应后样品转化为清亮液态,将含分析元素的酸性溶液在预还原剂的作用下，转化成特定价态，还原剂 KBH 4 反应产生氢化物和氢气，在载气（氩气)的推动下氢化物和氢气被引入原子化器(石英炉）中并原子化。特定的基态原子(一般为蒸气状态)吸收合适的特定频率的辐射,其中部分受激发态原子在去激发过程中以光辐射的形式发射出特征波长的荧光,检测器测定原子发出的荧光而实现对元素测定的痕量分析方法。1.2 原子荧光的类型 原子荧光是一种辐射的去活化(ｄｅcactｉｖatioｎ)过程。当有原子吸收由一合适的激发光源发射出的特征波长辐射后被激发，接着辐射区活化而发射出荧光。基本上，荧光线的波长和激发线的波长相同,也有可能比激发线的波长长，但比激发线波长短的情况也有，但不多。原子荧光有5中基本类型:①共振荧光。即激发波长与产生的荧光波长相同时，这种荧光称为共振荧光,是原子荧光分析中最常用的一种荧光;②直跃线荧光。即激发波长大于产生的荧光波长相同时，这种荧光称为直跃线荧光；③阶跃线荧光。即激发波长小于产生的荧光波长相同 时,这种荧光称为阶跃线荧光;④热助阶跃线荧光.既原子吸收能量由基态E 激发 至E 2能级时,由于受到热能的进一步激发,电子可能跃迁至于E 2 相近的较高能级 E 3，当其由E 3 跃迁到较低能级E 1 时所发射的荧光，称为热助阶跃线荧光;⑤热助 反Stokes荧光。即电子从基态E 0邻近的Ｅ ２ 能级激发至E ３ 能级时，其荧光辐射 过程可能是由Ｅ ３回到Ｅ 所发出的荧光成为热助反Sｔokes荧光。 1．3 汞的检测方法 汞及其化合物属于剧毒物质,是国际国内进出口商品中一项重要理化指标。汞在体内达到一定量时，将对人的神经系统、肾、肝脏产生严重的损害。汞测定方法有冷原子吸收光谱法、二硫腙比色法、原子荧光光谱分析法、电热原子吸收
三维荧光光谱分析法 荧光强度与激发波长Kex、发射波长Kem、衰变时间( t)、荧光寿命(S)、吸光系数(E)、偏振度(P ) 及待测组分浓度(c) 等因素有关。若主要研究荧光强度与Kex 和Kem 的关系, 就构成了Kex2K em2F 三维荧光光谱(EEM ) , EEM 光谱技术简化了复杂组分繁琐的分离过程, 提高了荧光分析的灵敏度、选择性和实用性, 还可进行指纹分析和技术鉴定。许金钩小组应用EEM 技术和方法,获得了生物大分子、有机小分子荧光探针、以及荧光探针分子与生物大分子相互作用的大量信息, 并运用Mon te2Carlo 数学模型对EEM 进行总体积分,建立了EEM 总体积分方法, 用于样品中有机物质和药物分子的定量分析, 获得满意的结果。除了使用EEM 技术和方法外, 还可以根据实际需要, 选择荧光衰变时间( t)、偏振度(P )、荧光寿命(S) 等参数,构成Kex2K em2x (待定参数) 三维荧光光谱, 从不同的角度出发来提高荧光分析的灵敏度、选择性。这种分析技术不仅被用来进行物质的定性和定量分析,而且被用于测定生物大分子的形状、大小、构象, 以及固态物质、生物大分子与有机分子和金属离子相互作用等的研究, 在临床医学、环境检测、法医鉴定、生命科学以及有序介质中生物大分子荧光探针光谱特性的研究等方面, 发挥着极为重要的作用。但由于多维荧光光谱技术中需要处理大量的实验数据,因此在研制仪器的同时, 还要开发许多有实用价值的数学处理方法和多维光谱软件120 世纪70 年代发展起来的同步导数荧光技术在混合物的连续测定中发挥着重要作用, 这一方法的特点是同时扫描激发波长和发射波长, 并对得出的图谱进行微分处理, 使容易重叠的波峰彼此完全分开, 便于得出可靠的测量结果。有人对人血尿中temopo rt in2po lyethylene glyno l 共轭物分别用HPLC、C I 和荧光光谱分析法进行测定, 发现荧光光谱分析法是其中最简便、迅速、灵敏的分析方法, 新一代荧光指示剂如酪氨
基于三维荧光光谱技术的水质有机物检测方法研究硕士学位
中图分类号：X83论文编号：HBLH2014-204 U D C：密级：公开 硕士学位论文 基于三维荧光光谱技术的水质有机物检测方法研究作者姓名：周燕 学科名称：控制理论与控制工程研究方向：检测与控制技术及智能装置 学习单位：河北联合大学学习时间: 2.5年提交日期: 2013年12月9日 申请学位类别：工学硕士 导师姓名：陈至坤教授单位：河北联合大学电气工程学院 论文评阅人：赵春祥研究员单
位：唐山亿立科技开发有限公司 王福斌高工单位：河北联合大学电气工程学院 论文答辩日期：2014年3月3日答辩委员会主席：赵春祥研究员 关键词：微量石油类有机物；三 维荧光光谱技术；平行 因子分析法；成分检测 唐山河北联合大学 2014年3月
Study of Detection Method of Water Quality Organic Based on Three-Dimensional Fluorescence Spectra Technology Dissertation Submitted to Hebei United University in partial fulfillment of the requirement for the degree of Master of Science in Engineering by Zhou Yan (Control Theory and Control Engineering) Supervisor: Professor Chen Zhikun March, 2014
第十七章荧光光谱分析 当紫外线照射到某些物质的时候，这些物质会发射出各种颜色和不同强度的可见光，而当紫外线停止照射时，所发射的光线也随之很快地消失，这种光线被称为荧光。 西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes于1575年第一次记录了荧光现象。17世纪，Boyle和Newton等著名科学家再次观察到荧光现象。17世纪和18世纪，又陆续发现了其它一些发荧光的材料和溶液，但是在荧光现象的解释方面却没有什么进展。1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍长，才判明这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念。同时，他由发荧光的矿物“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。1867年，Coppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝-桑色素配合物的荧光进行铝的测定。1880年，Liebeman提出了最早的关于荧光与化学结构关系的经验法则。到19世纪末，人们已经知道了600种以上的荧光化合物。20世纪以来，荧光现象被研究得更多了。例如，1905年Wood发现了共振荧光；1914年Frank和Hertz利用电子冲击发光进行定量研究；1922年Frank和Cario发现了增感应光；1924年Wawillow进行了荧光产率的绝对测定；1926年Gaviola进行了荧光寿命的直接测定等。 荧光分析方法的发展离不开仪器应用的发展。19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由Jette和West研制出第一台光电荧光计。早期的光电荧光计的灵敏度是有限的，1939年Zworykin和Rajchman发明光电倍增管以后，在增加灵敏度和容许使用分辨率更高的单色器等方面，是一个非常重要的阶段。1943年Dutton和Bailey提出了一种荧光光谱的手工校正步骤，1948年由Studer推出了第一台自动光谱校正装置，到1952年才出现商品化的校正光谱仪器。 荧光光谱分析法除了可以用作组分的定性检测和定量测定的手段之外，还被广泛地作为一种表征技术应用于表征所研究体系的物理、化学性质及其变化情况。例如，在生命科学领域的研究中，人们经常可以利用荧光检测的手段，通过检测某种荧光特定参数（如荧光的波长、强度、偏振和寿命）的变化情况来表征生物大分子在性质和构象上的变化。 很多化合物由于本身具有大的共轭体系和刚性的平面结构，因而具有能发射荧光的内在本质，我们称这些化合物为荧光化合物。在某些所要研究的体系中，由于体系自身含有这种荧光团而具有内源荧光，人们就可以利用其内源荧光，通过检测某种荧光特性参数的变化，对该体系的某些性质加以研究。但是，如果所要研究的体系本身不含有荧光团而不具有内源荧光，或者其内源性质很弱，这时候就必须在体系中外加一种荧光化合物即所谓荧光探针，再通过测量荧光探针的荧光特性的变化来对该体系加以研究。例如，如果我们要检测体系的极性，便可以将对极性敏感的荧光探针加入到体系中，然后通过对荧光探针的荧光特性的检测，求得体系的极性，或通过探针的荧光特性的变化来表征体系的极性的变化情况。 荧光分析法之所以发展如此迅速，应用日益广泛，其原因之一是荧光分析法具
X荧光光谱分析仪工作原理 用X射线照射试样时，试样可以被激发出各种波长的荧光X射线，需要把混合的X射线按波长（或能量）分开，分别测量不同波长（或能量）的X射线的强度，以进行定性和定量分析，为此使用的仪器叫X射线荧光光谱仪。由于X光具有一定波长，同时又有一定能量，因此，X射线荧光光谱仪有两种基本类型：波长色散型和能量色散型。下图是这两类仪器的原理图。 用X射线照射试样时，试样可以被激发出各种波长的荧光X射线，需要把混合的X射线按波长（或能量）分开，分别测量不同波长（或能量）的X射线的强度，以进行定性和定量分析，为此使用的仪器叫X射线荧光光谱仪。由于X光具有一定波长，同时又有一定能量，因此，X射线荧光光谱仪有两种基本类型：波长色散型和能量色散型。下图是这两类仪器的原理图。 现将两种类型X射线光谱仪的主要部件及工作原理叙述如下： 1.X射线管
两种类型的X射线荧光光谱仪都需要用X射线管作为激发光源。上图是X射线管的结构示意图。灯丝和靶极密封在抽成真空的金属罩内，灯丝和靶极之间加高压（一般为40KV）,灯丝发射的电子经高压电场加速撞击在靶极上，产生X射线。X射线管产生的一次X射线，作为激发X射线荧光的辐射源。只有当一次X射线的波长稍短于受激元素吸收限lmin时，才能有效的激发出X射线荧光。笥?SPAN lang=EN-US>lmin的一次X射线其能量不足以使受激元素激发。 X射线管的靶材和管工作电压决定了能有效激发受激元素的那部分一次X射线的强度。管工作电压升高，短波长一次X射线比例增加，故产生的荧光X射线的强度也增强。但并不是说管工作电压越高越好，因为入射X射线的荧光激发效率与其波长有关，越靠近被测元素吸收限波长，激发效率越高。 X射线管产生的X射线透过铍窗入射到样品上，激发出样品元素的特征X射线，正常工作时，X射线管所消耗功率的0.2%左右转变为X射线辐射，其余均变为热能使X射线管升温，因此必须不断的通冷却水冷却靶电极。 2.分光系统
X射线荧光光谱分析 X射线是一种电磁辐射，其波长介于紫外线和γ射线之间。它的波长没有一个严格的界限，一般来说是指波长为0.001-50nm的电磁辐射。对分析化学家来说，最感兴趣的波段是0.01-24nm，0.01nm左右是超铀元素的K系谱线，24nm则是最轻元素Li的K系谱线。1923年赫维西(Hevesy, G. Von)提出了应用X射线荧光光谱进行定量分析，但由于受到当时探测技术水平的限制，该法并未得到实际应用，直到20世纪40年代后期，随着X射线管、分光技术和半导体探测器技术的改进，X荧光分析才开始进入蓬勃发展的时期，成为一种极为重要的分析手段。 1.1 X射线荧光光谱分析的基本原理 当能量高于原子内层电子结合能的高能X射线与原子发生碰撞时，驱逐一个内层电子而出现一个空穴，使整个原子体系处于不稳定的激发态，激发态原子寿命约为10-12-10-14s，然后自发地由能量高的状态跃迁到能量低的状态。这个过程称为驰豫过程。驰豫过程既可以是非辐射跃迁，也可以是辐射跃迁。当较外层的电子跃迁到空穴时，所释放的能量随即在原子内部被吸收而逐出较外层的另一个次级光电子，此称为俄歇效应，亦称次级光电效应或无辐射效应，所逐出的次级光电子称为俄歇电子。它的能量是特征的，与入射辐射的能量无关。当较外层的电子跃入内层空穴所释放的能量不在原子内被吸收，而是以辐射形式放出，便产生X射线荧光，其能量等于两能级之间的能量差。因此，X射线荧光的能量或波长是特征性的，与元素有一一对应的关系。图1-1给出了X射线荧光和俄歇电子产生过程示意图。
K层电子被逐出后,其空穴可以被外层中任一电子所填充，从而可产生一系列的谱线，称为K系谱线：由L层跃迁到K层辐射的X射线叫Kα射线,由M层跃迁到K层辐射的X射线叫Kβ射线……。同样,L层电子被逐出可以产生L系辐射(见图1-2)。
荧光光谱分析技术概述....................................................................................................................... 1荧光光谱分析原理.1 ................................................................................................................................... 4荧光分析法.2 ........................................................................................................................ 4定性分析法.2.1 4 ......................................................................................................................... 2.2定量分析法 荧光光谱分析原理1光谱法是辐射能与物质组成和结构的相光学分析法 分为光谱法和非光谱法，不涉及能级跃非光谱法不包含物质内能的变化，互作用，以光谱的出来为基础，迁，而是辐射方向和物理性质的改变。 光学分析方法分类 1表分析法特征具体方法 射线荧光光谱、分子荧X光谱法原子发射光谱、原子荧光光谱、光的发射光光谱、分子磷光光谱、化学发光、电子能谱、俄歇电子能谱射线原子吸收光谱、紫外-可见分光光度法、红外光谱、X光的吸收吸收光谱、核磁共振光谱、电子自旋共振光谱、光声光谱拉曼光谱光的散射 比浊法、散射浊度法光的散射非光谱法 折射法、干涉法光的折射 X射线衍射、电子衍射光的衍射 旋光色散法、偏振法、圆二向色法光的转动 , 光波愈短荧光发光机理可按量子理论通俗解释: 光具有波动、粒子二重性, 当某些物质受到紫外线或较短波长其光子能量愈强; 反之波长愈长其能量则弱。当, , 吸收了全部或部分光能量, 使其分子的能级升高而处于亚稳定状态光照射其中一部分化为热量, , 这些分子就会立即释放多余的能量恢复到稳定的基态时因为有部分能, 向基态跃迁时是以“光”形式释放而消失。但对某些物质而言, 光波愈, 量被消耗所以重新发出的光能量总比吸收的能量要小。由于能量愈小, , 所以物质所激发的荧光总比照射它的光波要长。磷光的能量较荧光还要小长, 这就是两者的区别。寿命可达数小时之久所以它的波长比荧光要长, , 如果物质的分子吸收了紫外和可见区电磁辐射后，它的电子能跃迁至激发本身又回复到基态如果吸收辐然后以热能的形式将这一部分能量释放出来，态，再发射的波射能后处于电子激发态的分子以发射辐射的方式释放这一部分能量， 长可以同分子所吸收的波长相同，也可以不同，这一现象称为光致发光。最常见的两种光致发光现象是荧光和磷光。这两种光致发光的机理不同，荧光发光过程 -3s-10s的时间间隔。而磷光则往往能延续10因在激发光停止后10s内停止发光，此，可通过测定发光寿命的长短来区分荧光和磷光。 一些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式放射(即发光)称之为荧光。可产生荧光的分子
实验荧光光谱分析 一、实验目的与要求： 1. 了解荧光分光光度计的构造和各组成部分的作用； 2. 掌握荧光分光光度计的工作原理； 3. 掌握激发光谱、发射光谱及余辉衰减曲线的测试方法。 二、基本概念 1. 发射光谱 是指发光的能量按波长或频率的分布。通常实验测量的是发光的相对能量。发射光谱中，横坐标为波长（或频率），纵坐标为发光相对强度。 发射光谱常分为带谱和线谱，有时也会出现既有带谱、又有线谱的情况。 2. 激发光谱 是指发光的某一谱线或谱带的强度随激发光波长（或频率）变化的曲线。横坐标为激发光波长，纵坐标为发光相对强度。 激发光谱反映不同波长的光激发材料产生发光的效果。即表示发光的某一谱线或谱带可以被什么波长的光激发、激发的本领是高还是低；也表示用不同波长的光激发材料时，使材料发出某一波长光的效率。 3. 余辉衰减曲线 是指激发停止后发光强度随时间变化的曲线。横坐标为时间，纵坐标为发光强度（或相对发光强度）。 三、测试仪器 激发光谱、发射光谱及余辉衰减曲线的测试采用日本岛津RF-5301PC型荧光分光光度计。 从150W氙灯光源发出的紫外和可见光经过激发单色器分光后，再经分束器照到样品表面，样品受到该激发光照射后发出的荧光经发射单色器分光，再经荧光端光电倍增管倍增后由探测器接收。另有一个光电倍增管位于监测端，用以倍增激发单色器分出的经分束后的激发光。 光源发出的紫外-可见光或者红外光经过激发单色器分光后，照到荧光池中的被测样品上，样品受到该激发光照射后发出的荧光经发射单色器分光，由光电倍增管转换成相应电信号，再经放大器放大反馈进入A/D转换单元，将模拟电信号转换成相应数字信号，并通过显示器或打印机显示和记录被测样品谱图。 四、样品制备 液体试样
紫外可见吸收光谱一紫外吸收光谱分析 基于物质对200-800nm光谱区辐射的吸收特性而建立起来的分析测定方法称为紫外-可见吸收光谱法或紫外-可见分光光度法。它属于分子吸收光谱，是由于分子内电子跃迁而产生的光谱。 二紫外光谱的产生 物质分子的能量具有量子化的特征（即物质分子的能量具有不连续的特征）。一个分子有一系列能级，其中包括许多电子能级，分子振动能级以及分子转动能级。分子吸收特定的波长的光而产生吸收光谱 分子的紫外吸收光谱是由于分子中价电子的跃迁而产生的，从化学键的性质上考虑，与电子光谱有关的主要是三种电子：（1）形成单键的σ电子；（2）形成双键的π电子；（3）分子中非键电子即n电子。 化合物不同，所含的价电子类型不同，所产生的电子跃迁类型不同，根据分子轨道理论，分子中这三种电子能级的高低次序大致是： （σ）＜（π）＜（n）＜（π*）＜（σ* ）σ,π是成键轨道，n 是非键轨道，σ* ,π* 是反键轨道 由于电子能级间跃迁的同时总伴随有振动和转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。 二紫外光谱的表示方法
紫外光谱图是由横坐标、纵坐标和吸收曲线组成的。 横坐标表示吸收光的波长，用nm（纳米）为单位。 纵坐标表示吸收光的吸收强度，可以用A(吸光度)、T(透射比或透光率或透过率)、1-T(吸收率)、?(吸收系数) 中的任何一个来表示。 吸收曲线表示化合物的紫外吸收情况。曲线最大吸收峰的横坐标为该吸收峰的位置，纵坐标为它的吸收强度。 四、紫外光谱中常用的几个术语 1.发色基团和助色基团 发色基团：是能导致化合物在紫外及可见光区产生吸收的基团，不论是否显示颜色都称为发色基团。一般不饱和的基团都是发色基团（C=C、C=O、N=N 、三键、苯环等）
第四章原子吸收光谱法与原子荧光光谱法 4-1 . Mg原子的核外层电子31S0→31P1跃迁时吸收共振线的波长为285.21nm,计算在2500K 时其激发态和基态原子数之比. 解: Mg原子的电子跃迁由31S0→31P1 ,则 g i／g0=3 跃迁时共振吸收波长λ=285.21nm ΔEi=h×c／λ =（6.63×10-34）×（3×108）÷（285.31×10-9） =6.97×10-19J 激发态和基态原子数之比： Ni／N0＝（g i／g0）×e-ΔEi／kT 其中: g i／g0=3 ΔEi／kT=-6.97×10-19÷〔1.38×10-23×2500〕 代入上式得： Ni／N0＝5.0×10-9 4-2 .子吸收分光光度计单色器的倒线色散率为1.6nm／mm，欲测定Si251.61nm的吸收值，为了消除多重线Si251.43nm和Si251.92nm的干扰，应采取什么措施？ 答： 因为: S1 =W1/D = (251.61-251.43)/1.6 = 0.11mm S2 =W2/D =（251.92-251.61）/1.6 =0.19mm S1＜S2 所以应采用0.11mm的狭缝. 4-3 .原子吸收光谱产生原理，并比较与原子发射光谱有何不同。 答： 原子吸收光谱的产生：处于基态原子核外层电子，如果外界所提供特定能量（E）的光辐射恰好等于核外层电子基态与某一激发态（i）之间的能量差（ΔEi）时，核外层电子将吸收特征能量的光辐射有基态跃迁到相应激发态，从而产生原子吸收光谱。 原子吸收光谱与原子发射光谱的不同在于： 原子吸收光谱是处于基态原子核外层电子吸收特定的能量，而原子发射光谱是基态原子通过电、热或光致激光等激光光源作用获得能量；原子吸收光谱是电子从基态跃迁至激发态时所吸收的谱线，而原子发射光谱是电子从基态激发到激发态，再由激发态向基态跃迁所发射的谱线。
理解分子荧光分析的基本原理 理解激发光谱发射光谱同步光谱三维荧光光谱的含义 掌握分子荧光发射光谱的特性 了解荧光光谱仪器的组成及各部分作用 掌握影响荧光强度的内部结构因素和外部环境因素 了解光谱分析法的应用范围 第一章分子荧光光谱分析 1概述 分子荧光光谱分析也叫荧光分光光度法，是当前普遍使用并有发展前途的一种光谱分析技术。物质的分子吸收了紫外和可见光后它的电子跃迁到激发态，然后以热能的形式将这一部分能量释放出来，本身回复到基态。。如果吸收辐射能后处于电子激发态的分子以发射辐射的方式释放这一部分能量，再发射的波长可以同分子所吸收的波长相同也可以不同，这个现象叫光致发光，最常见的光致发光现象是荧光和磷光。 当用一种波长的光照射某种物质时，这个物质会在极短的时间内发射出比照射波长更长的光，这种光称为荧光。对于荧光来说，当激发光停止照射后，发光过程几乎立即（10-9-10-6 S）停止; 当用一种波长的光照射某种物质时，这如果种物质在较长的时间内发射出比照射波长更长的光，这种光称为磷光。对于磷光来说，当激发光停止照射后，发光过程将持续一段时间（10-1-10 S）; 磷光和荧光的发光机理是不同的。 由于物质分子结构不同，所吸收的光的波长和发射的荧光波长也有所不同，利用这个特性可以定性鉴别物质。同一种分子结构的物质用同一波长的激发光照射可以发射相同波长的荧光，若该物质的浓度不同，则浓度大时，所发射的荧光强度也强，利用这个性质可以进行定量测定。用荧光进行定性和定量的方法叫荧光分析法。 2荧光分析的原理 2.1分子荧光发生过程 2.1.1荧光与磷光
2.1.1.1 分子的电子能级与激发过程 分子除了电子不断运动外，分子本身还有振动和转动。量子力学表明，这些运动的能量是量子化的，所以分子有电子能级，分子振动能级，及分子转动能级。每个电子能级中有包含一系列的振动能级和转动能级。. . 图1 分子电子能级，振动能级和转动能级示意图 室温下大多数分子处于基态的最低振动能级。处于基态的分子吸收能量（电能，热能，光能，化学能）后被激发为激发态。激发态不稳定将很快衰变为基态，若返回到基态伴随着光子的辐射，这种现象称为发光。现在从分子结构上讨论荧光发光产生的机理。 每个分子具有一系列严格分立的能级，称为电子能级。而每个电子能级中又包含者一系列振动能级和转动能级。我们用S0 S1 Sn表示电子的基态，第一电子激发的单线态和第N电子激发的单线态。T1表示第一电子激发的三线态。 电子激发的单线态和相应的三线态的区别在于电子自旋方向不同，另外三线态的能级稍微低一些。 电子能态的的多重性用M= 2S+1表示, S为电子自旋量子数的代数和，其数值为0或1。大多数分子含有偶数个电子。基态时这些电子成对地填充在能量
三维荧光数据主成分分析 在文献上看到有对三维荧光数据矩阵进行主成分分析，然后用主成分得分进行投影的内容，不知道对于一个三维荧光光谱（数据为一个两维的数据矩阵）是怎么得到主成分得分的。 以前一般做的都是针对一维数据的主成分分析，一个样本的数据就是一个行向量，把N个样本放在一起组成一个二维矩阵然后进行主成分分析。 对于二维的不知道是什么情况，是怎么得到单个三维荧光光谱的主成分得分的 三维荧光光谱数据矩阵行向量代表某个激发波长下的荧光发射光谱，列向量代表某个发射波长下的荧光激发光谱，样品中的复杂组分在多种激发，发射光谱条件下会有不同特性，对这个数据矩阵进行主成分分析等化学计量算法，就可分析其中的复杂组分了。 以前你做的是多个样品组成的数据矩阵，而三维荧光光谱数据是单个样品在多种激发，发射条件下的荧光强度数据矩阵，方法应该类似。 所谓三维荧光光谱，其实只是一个三维形式的展示，其数据仍为一个二维的数据矩阵。一些常规的化学计量学程序（如The Unscrambler 等）都有固定的PCA功能，将你的数据转成两维的数据矩阵后，直接输入，再依指示操作，就可得到主成分。 我认为和网友以前所做的是一样的，你所说的把N个样本放在一起组成一个二维矩阵，其实已经是一个三维展示（包括样本变量，波数或波长，强度三个变量）。 用Singular Value Decomposition，再加上基于模型的数据拟合可以实现。这是比较成熟的方法。 三维荧光光谱（即激发发射矩阵荧光光谱）技术，应用于一个样品所获得数据，虽可以三维显示，但本质为矩阵响应数。 对于这样的矩阵数据，应用一般的矩阵分析方法，如主成分分析或奇异值分解方法就可得到主成分数，但须注意其物理意义，并注意估计时，最好利用“零组分区”第一主成分的结果来做比较。 当三维荧光光谱（即激发发射矩阵荧光光谱）技术应用于多样本或多试验条件时，所得的响应值为三维及更高维数据阵。 而三维数阵的主成分数或成分数估计，国内外已有许多篇论文涉及这一内容，请上网搜索吴海龙简介资料。
荧光光谱分析 一、实验目的 1、了解荧光光谱的基本原理； 2、熟悉荧光光谱仪的基本原理和操作规程； 3、了解荧光光谱的基本分析方法。 二、荧光光谱原理 分子吸收辐射后,使其价电子处于不稳定的激发态，随后以光的形式辐射出能量、这称为“光致发光”。在二次发光的发射过程中，最常见的两种光致发光是分子荧光(fluorescence)和分子磷光(phosphorescence)。由测量分子荧光和磷光强度而建立起来的定量分析法称为分子荧光分析法和分子磷光分析法。在化学反应过程中，分子吸收反应释放出的化学能产生激发态物质，这种激发态物质发出的光辐射称为化学发光(chemiluminescence)。根据化学发光强度或发光总量来确定物质组分含量的分析方法称为化学发光分析法。化学发光分析、分子荧光分析和磷光分析统称为分子发光分析法。 2.1、荧光及磷光的产生原理 含有孤对电子n和π轨道的分子，吸收光能后产生π→π*和n→π*电子跃迁。在通常情况下，基态分子的电子自旋是配对的，净自旋S＝0，光谱项的多重性2S+1＝l，这种状态称为单重态。电子激发态的多重性也是2S+1。若有一个电子激发至高能轨道时，当S=0, 此时分子所处的状态就称为激发单重态；若—个电子激发至高能轨道，但S＝1时，即2S+l ＝3，这种状态的分子就处于激发三重态。假若分子中含有奇数电子，则S＝1/2时，分子处于二重态。 在图11-1电子激发能级图中，处于激发态的分子可以有多种辐射形式去激发而回到基态。首先由于与同类分子或其它分子碰撞，损失一部分能量，产生无辐射跃迁。然后，若能态的多重性不变(激发单重态向基态单重态跃迁)所产生的辐射称为荧光。而能态的多重性改变(激发三重态向基态单重态跃迁)时产生的辐射称为磷光。由图11-1可知，吸收光谱的能级高于荧光光谱能级，荧光光谱能级又高于磷光光谱能级。所以，荧光波长较磷光短；荧光的寿命约为10-9～10-6s, 而磷光的寿命约为10-3～10s; 一般荧光在常温下即可以发射，但磷光必须在极低的温度下（液氮，-196o C）才可以发射。
三维荧光光谱分析法 三维荧光光谱分析法【内容摘要】 荧光强度与激发波长kex、发射波长kem、衰变时间(t)、荧光寿命(s)、吸光系数(e)、偏振度(p)及待测组分浓度(c)等因素有关。 荧光强度与激发波长Kex、发射波长Kem、衰变时间( t)、荧光寿命(S)、吸光系数(E)、偏振度(P ) 及待测组分浓度(c) 等因素有关。若主要研究荧光强度与Kex 和Kem 的关系, 就构成了Kex2K em2F 三维荧光光谱(EEM ) , EEM 光谱技术简化了复杂组分繁琐的分离过程, 提高了荧光分析的灵敏度、选择性和实用性, 还可进行指纹分析和技术鉴定。许金钩小组应用EEM 技术和方法,获得了生物大分子、有机小分子荧光探针、以及荧光探针分子与生物大分子相互作用的大量信息, 并运用Mon te2Carlo 数学模型对EEM 进行总体积分,建立了EEM 总体积分方法, 用于样品中有机物质和药物分子的定量分析, 获得满意的结果。除了使用EEM 技术和方法外, 还可以根据实际需要, 选择荧光衰变时间( t)、偏振度(P )、荧光寿命(S) 等参数,构成Kex2K em2x (待定参数) 三维荧光光谱, 从不同的角度出发来提高荧光分析的灵敏度、选择性。这种分析技术不仅被用来进行物质的定性和定量分
析,而且被用于测定生物大分子的形状、大小、构象, 以及固态物质、生物大分子与有机分子和金属离子相互作用等的研究, 在临床医学、环境检测、法医鉴定、生命科学以及有序介质中生物大分子荧光探针光谱特性的研究等方面, 发挥着极为重要的作用。但由于多维荧光光谱技术中需要处理大量的实验数据,因此在研制仪器的同时, 还要开发许多有实用价值的数学处理方法和多维光谱软件120 世纪70 年代发展起来的同步导数荧光技术在混合物的连续测定中发挥着重要作用, 这一方法的特点是同时扫描激发波长和发射波长, 并对得出的图谱进行微分处理, 使容易重叠的波峰彼此完全分开, 便于得出可靠的测量结果。有人对人血尿中temopo rt in2po lyethylene glyno l 共轭物分别用HPLC、C I 和荧光光谱分析法进行测定, 发现荧光光谱分析法是其中最简便、迅速、灵敏的分析方法, 新一代荧光指示剂如酪氨酸磷酸化胰岛素荧光指示剂的出现等,预示药物荧光分析法有着远大的发展前景。今后,药物荧光分析法研究的热点问题很可能是: 继续发扬传统药物荧光分析法的优点, 探索并提出常规药物荧光分析新方法; 将荧光分析仪器与计算机技术紧密结合, 研制出自动化程度和灵敏度高, 获得信息和处理信息速度快的荧光分析仪器; 发现和合成选择性优良的药物荧光试剂; 将荧光光谱分析法与其他各种现代化的分析仪器和方法联合使用, 以更准确、更灵敏、更专一和更低检测限地获得药物及药物与生物大分子相互作用的有关信息。
荧光分析法的特点及在环境分析中的应用 摘要：论文综述了荧光分析法的特点及在环境分析中的应用。重点分析了荧光分析法的原理、特点，以及常用的荧光分析法的讨论。分析了荧光分析法在环境监测中的应用，测定范围和发展情况。 关键词：荧光分析；环境分析；应用 1.引言 环境中分析、监测的对象往往是微量、超微量的物质，有很多还具有时间性和空间性，因此对分析技术要求越来越高。荧光分析法和分光光度法以其灵敏度高、检测限低、准确性好等优点在近年来得到了迅速发展。荧光分子探针的设计合成以及荧光分析法在环境分析化学中的应用是方兴未艾的研究方向[1]。 分子荧光分析具有检测限低，灵敏度高，选择性好，取样量少，方法简捷快速等特点，是一种重要的光谱化学分析手段，其中荧光分子探针检测技术在环境分析化学中占有重要的地位[2]。因此，在对环境的分析中，荧光分析法应用非常广泛，从天然水、饮用水到废水、污水；从土壤、大气到动植物；从人的头发、骨骼、血液到内脏等各个器官，涉及到的样品和应用范围几乎无所不有[3]。 2.荧光分析法的原理和特点 2.1.荧光分析法 2.1.1荧光及荧光分析 荧光是荧光化合物在受到紫外光、电和化学等能量激发后，电子从基态跃迁到激发态，然后通过辐射衰变释放出光子而回复到基态，即产生荧光。这些物质会在极短的时间内(8-10秒)发射出各种颜色和不同强度的可见光，而当紫外光停止照射时，所发射的光线也随之很快地消失。 荧光分析是指利用某些物质在紫外光照射下产生荧光的特性及其强度进行物质的定性和定量的分析的方法。1852年G.G.斯托克斯(G.G.Strokes)发现荧光，真正的荧光光谱测量则始于本世纪60年代。 2.1.2荧光激发光谱和发射光谱 荧光是一种光致发光现象，由于分子对光的选择性吸收，不同波长的入射光便具有不同的激发效率。如果固定荧光的发射波长不断改变激发光的波长，并记
紫外可见吸收光谱 一紫外吸收光谱分析 基于物质对200-800nm光谱区辐射的吸收特性而建立起来的分析测定方法称为紫外-可见吸收光谱法或紫外-可见分光光度法。它属于分子吸收光谱，是由于分子内电子跃迁而产生的光谱。 二紫外光谱的产生 物质分子的能量具有量子化的特征（即物质分子的能量具有不连续的特征）。一个分子有一系列能级，其中包括许多电子能级，分子振动能级以及分子转动能级。分子吸收特定的波长的光而产生吸收光谱 分子的紫外吸收光谱是由于分子中价电子的跃迁而产生的，从化学键的性质上考虑，与电子光谱有关的主要是三种电子：（1）形成单键的σ电子；（2）形成双键的π电子；（3）分子中非键电子即n 电子。 化合物不同，所含的价电子类型不同，所产生的电子跃迁类型不同，根据分子轨道理论，分子中这三种电子能级的高低次序大致是：（σ）＜（π）＜（n）＜（π*）＜（σ* ）σ,π是成键轨道，n 是非键轨道，σ* ,π* 是反键轨道 由于电子能级间跃迁的同时总伴随有振动和转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。 二紫外光谱的表示方法
紫外光谱图是由横坐标、纵坐标和吸收曲线组成的。 横坐标表示吸收光的波长，用nm（纳米）为单位。 纵坐标表示吸收光的吸收强度，可以用A(吸光度)、T(透射比或透光率或透过率)、1-T(吸收率)、 (吸收系数) 中的任何一个来表示。 吸收曲线表示化合物的紫外吸收情况。曲线最大吸收峰的横坐标为该吸收峰的位置，纵坐标为它的吸收强度。
四、紫外光谱中常用的几个术语 1.发色基团和助色基团 发色基团：是能导致化合物在紫外及可见光区产生吸收的基团，不论是否显示颜色都称为发色基团。一般不饱和的基团都是发色基团（C=C、C=O、N=N 、三键、苯环等） 助色基团：指那些本身不会使化合物分子产生颜色或者在紫外及可见光区不产生吸收的一些基团，但这些基团与发色基团相连时却能使发色基团的吸收带波长移向长波，同时使吸收强度增加。助色基团通常是由含有孤对电子的元素所组成（-NH2, -NR2, -OH , -OR , -Cl等），这些基团借助P-π共轭使发色基团增加共轭程度，从而使电子跃迁的能量下降。 2．红移、蓝移、增色效应和减色效应 由于有机化合物分子中引入了助色基团或其他发色基团而产生
一、三维荧光光谱的基本定义 三维荧光光谱（EEM）是将荧光强度以等高线方式投影在以激发光波长和发射光波长为纵横坐标的平面上获得的谱图，图像直观，所含信息丰富。 三维荧光光谱（EEMs）能同时获得激发和发射波长信息，且因有机物种类和含量不同而各异，具有与水样（溶液）一一对应的特点，就像人的指纹具有唯一性一样，所以被称为水的“荧光指纹”。 三维荧光光谱仪可快速检测液体中的有机化合物（DOM），每个样品仅需数十秒或者几分钟，即可及时识别液体中的有机物成分。 二、原理 由于三维荧光光谱具有与物质组成成分一一对应的光谱特性，根据此特性三维荧光光谱可广泛应用于水质检测、食品检测等领域。 能表征水中（特别是废水）有机物含量和性质的水质指标一直是水质研究领域的重要内容之一。传统表征水质有机污染的指标如化学需氧量（COD）和生化需氧量（BOD）的测量需耗时数小时甚至数天，不能及时反映水质变化，而且只能反映有机物总量，不能展现有机物成分，例如无法区分易降解、可降解和不易降解的有机物或者降解速率快和慢的有机物。这些不足使得污水处理设施的设计和运行长期只能依赖经验。三维荧光光谱为这些问题解决提供了近乎完美的方案。 三、应用领域 水质分析应用一：河水/湖水水质 溶解性有机质是（DOM）主要是由含氧、氮和硫的氨基酸、脂肪族、芳香族等功能团组成的异质碳氢化合物，遍存在于湖泊、河流等自然水体中，对污染物的溶解、吸附解吸、毒性以及迁移转化特性影响非常大，影响着水生环境中生化性质，被用来表征水质特征。三维荧光光谱研究的荧光溶解性有机物（FDOM）或者有色溶解有机（CDOM）是DOM的重要组成部分，其重要组成部分及其三维荧光发光峰位如表1所示 表1 DOM各类物质对应的特征峰
1荧光定义 某些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态回到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式放射出去即发光，称之为荧光。可产生荧光的分子或原子在接受能量后引起发光，供能一旦停止，荧光现象随之消失。 2荧光分类 由化学反应引起的荧光称为化学荧光，由光激发引起的荧光称为光致荧光，课题主要研究光致荧光。按产生荧光的基本微粒不同，荧光可分为原子荧光、X 射线荧光和分子荧光，课题主要研究分子荧光。 3光致荧光机理 某一波长的光照射在分子上，分子对此光有吸收作用，光能量被分子所吸收，分子具有的能量使分子的能级由最低的基态能级上升至较高的各个激发态的不同振动能级，称为跃迁。分子在各个激发态处于不稳定的状态，并随时在激发态的不同振动能级下降至基态，在下降过程中，分子产生发光现象，此过程为释放能量的过程，即为光致荧光的机理。光致荧光的过程按照时间顺序可分为以下几部分。 3.1 分子受激发过程 在波长为10~400nm的紫外区或390~780nm的可见光区，光具有较高的能量，当某一特征波长的光照射分子时，是的分子会吸收此特征波长的光能量，能量由光传递到分子上，此过程为分子受激发过程。分子中的电子会出现跃迁过程，在稳定的基态向不稳定的激发态跃迁。跃迁所需要的能量为跃迁前后两个能级的能量差，即为吸收光的能量。分子跃迁至不稳定的激发态中即为电子激发态分子。 在电子激发态中，存在多重态。多重态表示为2S+1 o S为0或1,它表示电子在自转过程中，具有的角动量的代数和。S=0 表示所有电子自旋的角动量代数和为0,即所有电子都是自旋配对的，那么2S+仁1,电子所处的激发态为单重态，用S i 表示，由此可推出，S0 即为基态的单重态，S1 为第一跃迁能级激发态的单重态，S2为第二跃迁能级激发态的单重态。S=1表示电子的自旋方向不能配对，说明电子在跃迁过程中自旋方向有变化，存在不配对的电子为2个，2S+仁3,电子在激发态中位于第三振动能级，称为三重态，用T i 来表示，T1 即为第一激发 态中的三重态，T2即为第二激发态中的三重态，以此类推。 分子跃迁至各个激发态中，状态不稳定，随时会释放出能量，释放能量的类型有两种：一种是辐射跃迁，另一种是非辐射跃迁，释放能量会回到稳定的基态。
原子荧光法复习题 一、填空： 1.原子荧光分析中，荧光类型有、、、热助线荧光和敏化原子荧光等。 答案：共振荧光、直跃线荧光、阶跃线荧光 2.原子荧光光谱仪中，目前有和两类仪器。 答案：色散系统、非色散系统 3.七十年代末，由于、及各种高效原子化器的使用，AFS技术得到了较大发展。 答案：高强度空心阴极灯、激光器 4.荧光猝灭的程度与及有关。 答案：被测元素、猝灭剂的种类 5.在原子荧光分析中，原子浓度较高时容易发生，它可使荧光信号变化和荧光谱线，从而峰值强度。 答案：自吸、变宽、减少 6.在原子荧光分析中，无论是连续光源或者线光源，光源强度越高，其测量线性工作范围。答案：越宽 7.原子荧光光谱仪的检测部分主要包括、以及放大系统和输出装置。 答案：分光系统、光电转换装置 8.在原子荧光分析中，石英原子化器炉温过高会使降低、增高，但较高的炉温又有利于消除干扰，所以应根据实际情况确定原子化温度。 答案：灵敏度、噪声、气相 9.在原子荧光分析中，测定灵敏度随观测高度增加而，观测高度太低时，会增加，观测高度太高时，会使和下降。 答案：降低、噪声、灵敏度、精度 10.原子荧光光谱仪中，以供电的空心阴极灯，可以使增强几十至几百倍。 答案：脉冲、谱线 11.在原子荧光分析的实际工作中，会出现空白大于样品强度的情况，这是因为空白溶液中不存在的原因。 答案：荧光、干扰 12.在原子荧光分析中，样品分析时，标准溶液的应和样品完全一致，同时必须做。 答案：介质、空白 13.在原子荧光分析中，当光电倍增管的负高压增加时，和水平同时增加，当灵敏度可以满足要求时，应尽量采用的负高压。 答案：信号、噪声、较低 14. 原子荧光光谱仪一般由四部分组成：、、和。 答案：光源（激发光源）、原子化器、光学系统（单色仪）、检测器 15.石英原子化器的外屏蔽气是用以防止周围的进入，产生，以保证较高及稳定的。