急性白血病细胞凋亡抑制基因Livin表
达及临床意义
（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）
【摘要】目的观察Livin 基因在急性白血病(AL)病人白血病细胞中的表达及其临床意义。方法采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT PCR)方法检测41例不同时期AL病人白血病细胞Livin mRNA的表达水平，以10例健康人作为正常对照。结果AL病人白血病细胞Livin mRNA 阳性表达率为53.7%。其中急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性非淋巴细胞白血病(ANLL)病人Livin mRNA 阳性表达率分别为53.8%、53.6%，二者比较差异无显著性，但均高于正常对照组(10.0%)(P=0.035、0.017)。初治和复发AL病人白血病细胞Livin mRNA 阳性表达率分别为52.4%、85.7%，明显高于对照组(P=0.025、0.004)。缓解组病人Livin mRNA阳性表达率为15.4%，明显低于初治组和复发组(P=0.004、0.030)，而与对照组相比差异无统计学意义。白细胞计数≥50×109/L的初治白血病病人Livin mRNA 的阳性表达率(77.8%，7/9)明显高于白细胞计数50×109/L的初治病人(25.0%，3/12)(P=0.022)，其表达水平也明显高于后者(T=6.50，
P0.05)。结论Livin mRNA过度表达参与了AL的发病，可作为AL 的诊断、复发及预后判断的指标之一。Livin mRNA表达在AL细胞的增殖分化和(或) 抗凋亡过程中发挥了重要作用，可能是导致AL细胞对化疗药物不敏感的原因之一，可作为治疗的一个潜在靶点。
【关键词】Livin 基因;白血病;逆转录聚合酶链反应
[ABSTRACT] Objective To explore the correlation between the expression of Livin gene in acute leukemic (AL) cells and its clinical significance. Methods The levels of leukemic cell Livin mRNA in 41 AL patients and 10 healthy controls were measured by semi quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT PCR) technique. Results The positive expression rate of leukemic cell Livin mRNA in the patients was 53.7%, and that of Livin mRNA in ALL cells and ANLL cells were 53.8% and 53.6%, respectively, the difference between them was not significant, but higher than that in normal controls (10.0%) (P=0.035,0.017). The expression of Livin mRNA in initially treated AL patients and the recurrent was 52.4% and 85.7%, respectively, which was significantly higher than that in normal controls (P=0.025,0.004). The expression of Livin mRNA in patients at remission was 15.4%, which was lower than that in initially treated and recurrent patients (P=0.004,0.030), but there was no statistical significance as compared with normal controls. Besides, the initially treated AL
patients with a leukocyte count of at least 50×109 /L had a significantly higher Livin mRNA expression rate (77.8%,7/9) than that with a leukocyte count of less than 50×109 /L (25.0%,3/12) (P=0.022). In addition, the level of Livin mRNA in the former was significantly higher than that of the latter (T=6.50,P0.05). Conclusion Overexpression of Livin mRNA involves in the pathogenesis of acute leukemia, which can be used as one of the parameters in the diagnosis, prediction of recurrence and prognosis of the disease. The expression of Livin mRNA plays an important effect on the proliferation and differentiation of AL cells, which may be one of the reasons leading to insensitive to chemotherapy of AL cells and be used as a potential target for the treatment of the disease.
[KEY WORDS] Livin gene; leukemia; reverse transcriptase polymerase chain reaction
凋亡抑制是肿瘤细胞的一个普遍特性。近年发现的凋亡蛋白抑制因子(IAP)是一类重要的抗细胞凋亡因子，与肿瘤的发生发展关系密切。目前，人类IAPs家族中已发现有NIAP、XIAP、clAP1、clAP2、survivin、apollon、ILP2和Livin共8个成员，其抗凋亡功能远强于Bc12家族，在肿瘤的发病机制中起着重要作用。其中clAP1、clAP2、survivin等多个IAP家族成员在白血病细胞中高表达，且与预后相关[13]。Livin是IAPs家族中的一个新成员，有2种异构体(Livin
α和Livin β)，特异性表达于人的胚胎组织及大多数人类实体瘤组织，在分化成熟的正常组织中无表达或低表达[46]，在肿瘤组织中表达明显增高，与肿瘤的发生密切相关，可能成为肿瘤基因诊断和治疗的新靶点[7]。本研究旨在观察Livin 基因在各类急性白血病(AL)病人中表达水平的变化，并探讨其临床应用价值。
1 对象与方法
1.1 研究对象
AL病人41例，男16例，女25例;年龄19～80 岁，中位年龄52 岁。其中急性非淋巴细胞白血病(ANLL) 28例(M2者10例，M3者4例，M4者6例，M5者8例)，急性淋巴细胞白血病(ALL) 13例(L1型5例,L2型8例)。初治病人21例，复发7例，缓解13例。缓解病人中2例系由初诊病人转化而来。所有初诊ALL 病人采用VDP(长春新碱、柔红霉素、泼尼松) 或VDCP(长春新碱、柔红霉素、环磷酰胺、泼尼松) 化疗方案诱导治疗;ANLL病人采用HA (高三尖杉酯碱、阿糖胞苷) 或DA (柔红霉素、阿糖胞苷) 化疗方案治疗，M3 病人采用全反式维甲酸(atRA) 或atRA与三氧化二砷(As2O3)合用，或以atRA 为主，联合应用小剂量DA 或HA 方案诱导分化治疗。以上所有病人的诊断及治疗均参照张之南等[8]主编的《血液病诊断及疗效标准》。选择10例健康人作为正常对照，男4例，女6例;年龄21～57 岁，中位年龄41.5 岁。
1.2 标本处理
无菌操作取EDTA抗凝的骨髓液2 mL，Ficol液(相对密度
1.077) 分离单个核细胞，细胞比例大于80%，锥虫蓝拒染率大于99%，取约6 ×106个细胞，用PBS液洗涤2次，加Trizol 液1 mL，混匀后-20 ℃保存，待提取RNA。
1.3 细胞总RNA提取
按Invitrogen 公司试剂盒说明书的步骤操作。紫外线分光光度计测定RNA 纯度(A260/A2801.6)，同时进行RNA 定量测定。在15 g/L琼脂糖凝胶上电泳可见3条清晰亮带，说明所提取RNA完整。
1.4 cDNA合成
取RNA 5 μg，OLigo (dT) primer(0.5 g/L)1 μL，用DEPC 处理水补至12 μL，于70 ℃下放置5 min。冰上骤冷后，加5×缓冲液4 μL，RNA 酶抑制剂20 U，10 mmoL/L dNTPs 2 μL，37 ℃5 min后加入RevertAid M MuLV逆转录酶200 U，反应体系20 μL，42 ℃反应1 h，70 ℃下放置10 min终止反应。
1.5 PCR 扩增
1.5.1 引物设计实验中所用引物根据GenBank 提供的Livin mRNA 序列(Livin αNM_139317.1;Livin βNM_022161.2)，由上海生工公司设计合成。Livin α正义链：5′TGTCAGTTCCTGCTCCGGT CAA3′，反义链：5′CGCACGGCACAAAGACGAT G3′，其目的基因的长度为298 bp。Livin β正义链：5′TGGGAAGAACCGGAAGAC3′，反义链：5′CACGGCACAAAGACGATG3′，其目的基因的长度为263 bp。β
actin正义链：5′CTGGGACGA CATGGAGAAAA3′，反义链：5′AAGGAAGGC TGGAAGAGTGC3′，目的基因长度为500 bp。
1.5.2 PCR反应PCR反应体系包括：20 μmol/L的Livin 正、反义链引物各0.5 μL，10 mmol/L的dNTPs 1.6 μL，10 ×缓冲液2 μL，Taq DNA 聚合酶1 U，RT 产物1 μL，其余以DEPC水补足至20 μL。预实验确定产物与循环之间呈线性关系。PCR 条件：95 ℃预变性5 min，1个循环;然后94 ℃变性30 s，59 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环;最后72 ℃延伸10 min。同时行βactin 测定作为内参照。
1.6 PCR 产物分析
取PCR 产物10 μL 与Loading Buffer 2 μL混合，在15 g/L 琼脂糖凝胶中电泳，80 V、25 min。阳性结果可见500、298和263 bp 处各有一条亮带，分别为βactin、Livin α和Livin β。紫外线透射仪观察并照相，照片经Metamorph Imaging Sight软件进行分析并读取吸光度值，取Livin/βactin 吸光度比值进行半定量，代表mRNA表达水平。各标本重复2 次，取平均值。
1.7 统计学处理
用SPSS 11.5 和PPMS 1.5[9]统计软件进行统计学处理。实验数据以率和中位数(四分位数间距)表示，组间比较采用χ2检验、Fisher’s精确概率检验或秩和检验。
2 结果
2.1 AL细胞中Livin mRNA的表达
41例AL病人白血病细胞Livin mRNA 阳性表达率为53.7%(22/41)。其中ALL 病人的阳性表达率为53.8%(7/13)，ANLL 病人阳性表达率为53.6%(15/28)，二者均高于对照组的10% (1/10)，差异有统计学意义(P=0.035、0.017)。但ALL与ANLL 比较无统计学差异。ALL、ANLL病人及对照组Livin/βactin的半定量结果分别为0.171 (0.102)、0.087(0.117)、0.010(0.007)，ALL与ANLL 病人Livin mRNA 表达水平均高于对照组(H=20.22，d=14.25、14.61，P0.05)。图1为部分病人的电泳结果。
M：Marker;①、②同一初治病人Livin α、β;③、④同一缓解病人Livin α、β;⑤、⑥同一复发病人Livin α、β;⑦、⑧正常对照。
图1 不同阶段白血病病人Livin mRNA的表达
2.2 AL病人不同时期Livin mRNA的表达
初治组和复发组病人Livin阳性表达率分别为52.4%(11/21)、85.7%(6/7)，均高于对照组(P=0.025、0.004)。缓解组病人Livin阳性表达率为15.4%(2/13)，明显低于初治组和复发组病人(P=0.004、0.030)，缓解组与对照组相比差异无统计学意义。
2.3 Livin mRNA 表达与外周血白细胞计数关系
将初治白血病病人按白细胞计数分为两组，白细胞计数≥50×109/L的白血病病人Livin mRNA阳性表达率(77.8%，7/9)，明显高于白细胞计数50×109/L的病人(25.0%，3/12)(P=0.022);两组Livin/βactin 半定量结果分别为0.086(0.389)、0.038(0.298)，前者表达水平也明显高于后者(T=6.50，P0.05)。
3 讨论
IAPs家族已发现8个成员，是独立于Bcl2的抗凋亡蛋白。IAPs的抗凋亡作用主要通过抑制凋亡蛋白酶的活性而实现。
Livin是LIN等[6]根据IAPs同源序列，采用含有BIR 序列的EST克隆，在人胚肾cDNA文库中发现的一个IAPs 家族的新成员。2001年ASHHAB等[5]明确了Livin存在2个不同的异构体Livin α和Livin β，分别由298和280个氨基酸组成。基因定位于染色体20q13.3。Livin主要存在于细胞质中[56]。Livin抑制细胞凋亡作用主要通过其BIR区与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspases)结合，抑制Caspases3/7和Caspases9的活性，达到阻断凋亡受体及以线粒体为基础的凋亡途径而起作用[6]。有研究报道Livin 还可能通过分解Smac，阻止其对XIAP的拮抗作用，从而间接抑制Caspase来调控凋亡[10]。由于Livin α和Livin β两种亚型结构上的差异，体外研究发现它们表现出不同的抗凋亡活性，虽然两者都能阻断TNFα与抗CD95抗体所诱导的细胞凋亡，但在阻断依托泊甙等降解DNA 的抗癌药物所诱导的细胞凋亡中，Livin β比Livin α有更强的阻断能力[1113]。
Livin在胎儿发育过程中的多种组织高表达，在正常成人的大多数终末组织中(除胎盘)低表达或不表达[45]，而在如黑色素瘤、乳癌、宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌、胃癌、结肠癌等多种恶性肿瘤组织中高表达[1112]。
ABE 等[13]的研究显示，Livin 在骨髓增生异常综合征
(MDS) 及初治急性髓系白血病(AML) 中表达均明显高于正常对照组，提示Livin在初治白血病中可抑制凋亡。本文结果表明，大部分AL 病人表达Livin mRNA，而且Livin mRNA表达阳性率和表达水平在AL病人中均明显高于正常对照组，认为Livin的异常高表达与AL 的发病有密切关系，与有关文献报道一致[13]。本研究还对不同类型AL进行分析，结果显示ALL 和ANLL中Livin mRNA的表达均高于正常对照组，各个亚型之间并无明显差异，推测Livin mRNA的过表达有可能是各类AL的共同发病机制。本文结果还显示，初治及复发白血病病人Livin mRNA表达率高于对照组，而缓解组与对照组无差别，说明Livin 表达在AL细胞的增殖分化和(或) 抗凋亡过程中发挥了重要作用。本研究还显示，Livin的表达水平在外周血白细胞数≥50×109/L的病人中高表达，而外周血白细胞数升高是AL预后不良的重要因素。因此，Livin可以作为判断预后的重要指标之一。Livin的高表达是造成白血病细胞耐药的又一重要因素，具体作用机制有待于进一步研究。
有研究结果显示，Livin过表达是白血病细胞耐药的根本原因[14]。本文结果也显示，Livin mRNA 在初治AL病人表达率明显高于正常对照组，治疗缓解后其表达率明显下降，复发后表达率又再次升高，其原因可能与Livin高表达后造成白血病细胞对化疗药物的敏感性下降有关。目前已有研究结果显示，采用RNA干扰技术对Livin 基因表达进行干预后，细胞对诱导凋亡的药物和射线的敏感性增加[11]。由此可见，Livin基因有可能成为白血病治疗的一个潜在靶点。
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十个问题及答案 问题1：基因检测有什么用途？ 回答： 1. 辅助临床诊断：很多疾病表现出来的症状类似，临床上很难进行鉴别诊断，容易混淆。若是通过基因检测，在基因层面找到致病原因，可以辅助临床医生鉴别诊断甚至纠正临床上的诊断。 举例：某基因检测机构通过对一个临床疑似“先天性白障-小角膜综合症”的家系进行了基因检测，最后在基因层面发现他们家系患的其实是“玻璃体视网膜脉络膜病”而非“先天性白障-小角膜综合症”，帮其纠正了临床诊断。 又如：糖尿病中有一型特殊类型的糖尿病为“单基因糖尿病”（由单个基因突变引起，为孟德尔遗传病）由于其基因存在缺陷，使得患者在代谢特征、临床表现和治疗方案等方面，都与1型或者2型糖尿病患者有着明显的区别。但是，由于认识上的不足，单基因糖尿病常常被误认为1型或2型糖尿病。英国一项流行病学的调查显示，有80%的青春晚期糖尿病(MODY)患者未被正确诊断。在欧美国家的单基因糖尿病的研究中，发现有10%的1型糖尿病和2-5%的2型糖尿病其实是单基因糖尿病。所以，通过对正常人群体，特别是有糖尿病家族史的人群，进行单基因糖尿病致病基因的筛查，可以尽早发现基因缺陷，从而把单基因糖尿病患者从1型或者2型糖尿病患者中区分出来。 2.携带者筛查：最常见的是唐氏综合征的筛查。传统的唐氏综合征筛查是利用血清学筛查进行的，检出率为65%-75%，容易漏检。而无创产前基因检测则可以准确地筛查出唐氏综合征患儿，还包括对18三体综合征和13三体综合征的筛查。此外，针对具有某些单基因遗传病（尤其是隐性遗传病）家族史的高危人群进行相关致病基因的筛查，可以及时发现该家族中致病基因的携带情况，进而分析后代患病的风险，为家属成员提供有效的遗传信息，防止缺陷基因向下一代遗传。 3指导治疗：现在医生开药的遵循的是经过广泛测试后提供的剂量信息。但所有的药物在测试过程中都是以群体作为样本的，因此药物剂量在对于大多数人是合适的。但是由于每个人的基因不同，会导致正常剂量下的药物对一些人产生致命的作用。导致原本挽救健康的药可能反而对健康造成伤害。这样的现象就称为药物不良反应（adverse drug reactions, ADR）。如药物warfarin是一种抗凝剂，是防止血液凝固的一种药物，病人服用这种药物可以大大减轻血栓形成的危险。但是抗凝剂服用过多，血液便不容易凝固，会造成出血，甚至有生命危险。在我们身体中有一种酶叫CYP2C9，它可以代谢这种抗凝剂，把它分解成小分子物质，使之失去抗凝血作用。正常情况下warfarin发挥作用后被代谢，完成它的药物治疗作用，也并不对人身体造成危害。但是，如果一个人CYP2C9发生突变，代谢功能降低，是弱代谢型(poor metabolizer)，就意味着warfarin代谢过慢，在身体中不断积累，最终可能造成出血倾向。基因检测的作用就在于此：它可以先判定某人的CYP2C9是否发生了突变，并判定他属于哪种代谢类型，然后再根据代谢类型决定药物剂量。如果是强代谢型，那就适当提高
第6章《细胞的生命历程》单元测试题 一、单选题(每小题只有一个正确答案) 1.下列发生了细胞分化且能体现体细胞全能性的生物学过程是() A．玉米种子萌发长成新植株 B．小鼠骨髓造血干细胞形成各种血细胞 C．小麦花粉经离体培养发育成单倍体植株 D．胡萝卜韧皮部细胞经组织培养发育成完整植株 2.下图是某二倍体动物的几个细胞分裂示意图，据图判断错误的是() A．若按分裂的先后顺序排列，应为②→②→②→② B．图②到②构成了一个完整的细胞周期 C．正常情况下，图②所示细胞两极染色体形态和数目相同 D．图②所示时期是观察染色体形态和数目的最佳时期 3.在测量琼脂块变色深度的方法中，正确的测量方法是(虚线表示测量位 置)() A．B．C．D． 4.甲图是洋葱根尖生长点连续分裂的细胞在各个时期细胞核内DNA含量 的测定结果，乙图是一组目镜标有5×和16×字样、物镜标有10×和40×字 样的镜头，丙图是某同学在乙图中选用的一组能放大160倍的镜头组合所 观察到的图像。欲将丙图视野中处于甲图e时期的细胞移至视野中央进行 640倍高倍镜观察，正确的镜头组合及操作程序应是() A． (1)×(4)；左上方 B． (1)×(3)；右下方 C． (2)×(3)；右下方
D． (2)×(3)；左上方 5.观察风信子根尖细胞的永久装片时，可在视野中找到图中的几种形态的细胞，其细胞内a、b、c的数量关系符合直方图所示的是(a是染色体数，b是染色单体数，c是DNA分子数) () A． ②② B． ②② C． ②② D． ②② 6.下列关于人体造血干细胞及其分化的叙述，正确的是() A．造血干细胞分化形成红细胞、B细胞、T细胞等的过程中，其全能性得到表现 B． B细胞属于高度分化的体细胞，不能再继续分化 C． T细胞和B细胞分化、发育的场所不同 D．在不发生突变的情况下，T细胞和B细胞中的RNA部分相同，部分不相同 7.在造血干细胞分化为B细胞的过程中，细胞内发生相应变化的是() A．蛋白质种类 B．基因种类 C．细胞器种类 D．转运RNA种类 8.关于高等动、植物细胞有丝分裂的叙述，正确的是() A．核分裂时，染色体的活动不同 B．细胞质的分裂方式相同 C．纺锤体的形成和消失方式相同
细胞凋亡和细胞增殖都是生命的基本现象，是维持体内细胞数量动态平衡的基本措施。在胚胎发育阶段通过细胞凋亡清除多余的和已完成使命的细胞，保证了胚胎的正常发育；在成年阶段通过细胞凋亡清除衰老和病变的细胞，保证了机体的健康。和细胞增殖一样细胞凋亡也是受基因调控的精确过程，在这一节我们就细胞凋亡的分子机理作简要的介绍。 细胞凋亡的途径主要有两条，一条是通过胞外信号激活细胞内的凋亡酶caspase、一条是通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase。这些活化的可将细胞内的重要蛋白降解，引起细胞凋亡。 一、凋亡相关的基因和蛋白 细胞凋亡的调控涉及许多基因，包括一些与细胞增殖有关的原癌基因和抑癌基因。其中研究较多的有ICE、Apaf-1、Bcl-2、Fas/APO-1、c-myc、p53、ATM等。 1．Caspase家族 Caspase属于半胱氨酸蛋白酶，相当于线虫中的ced-3，这些蛋白酶是引起细胞凋亡的关键酶，一旦被信号途径激活，能将细胞内的蛋白质降解，使细胞不可逆的走向死亡。它们均有以下特点：①酶活性依赖于半胱氨酸残基的亲核性；②总是在天冬氨酸之后切断底物，所以命名为caspase（cysteine aspartate-specific protease），方便起见本文称之为凋亡酶； ③都是由两大、两小亚基组成的异四聚体，大、小亚基由同一基因编码，前体被切割后产生两个活性亚基。 最早发现人类中与线虫ced-3同源的基因[1]是ICE，即：白介素-1 β转换酶（Interleukin-1 β-converting enzyme）基因，因该酶能将白介素前体切割为活性分子，故名。通过cDNA杂交和查找基因组数据库，在人类细胞中已发现11个ICE同源物[2]，分为2个亚族（subgroup）：ICE亚族和CED-3家族（图15-6），前者参与炎症反应，后者参与细胞凋亡，又分为两类：一类为执行者（executioner或effector），如caspase-3、6、7，
摘要】目的比较耐顺铂的人肺腺癌细胞(A549DDP)凋亡相关基因的表达与亲代A549细胞的差异，探讨细胞凋亡与细胞耐药的发生机制。方法应用Oligo GE Array细胞凋亡基因芯片，检测A549和A549DDP细胞相关凋亡基因表达水平。结果A549DDP细胞表达BAD、BAG3、BFAR、CARD8、CASP6、GADD45、TNFRSF14、CD70、TRADD、TRAF1、TRAF3基因较亲代A549细胞显著增高(P<0.05),二者比值上调2倍以上。结论肺腺癌A549DDP细胞过表达上述凋亡相关基因，可能是导致细胞凋亡受抑、细胞耐药的主要原因。 【关键词】肺癌;凋亡基因;细胞凋亡;耐药 细胞耐药是导致化疗失败的主要原因。研究发现耐药的发生与细胞凋亡基因的异常表达密切相关。采用Oligo GE Array细胞凋亡基因芯片方法检测细胞凋亡相关基因，具有敏感性高、速度快和重复性好等优点。目前尚未见以Oligo GE Array细胞凋亡基因芯片方法检测A549细胞凋亡相关基因的报道。本文采用Oligo GE Array细胞凋亡基因芯片检测人肺腺癌亲代细胞与耐顺铂细胞(A549和A549DDP)凋亡相关基因,并对检测结果的临床意义进行初步分析，进一步探讨肿瘤细胞凋亡与耐药的发生机制。 1 对象与方法 1.1 对象人肺腺癌亲代A549细胞和耐顺铂的A549DDP细胞(华西医科大学新桥医院呼吸病研究所提供)。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养人肺腺癌A549与A549DDP细胞,以含有10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5% CO2条件下培养,每2～3 d传代1次,初始密度为2×105/ml(2 ml/6孔板)。取对数生长期细胞进行实验。 1.2.2 凋亡基因检测按着Oligo GEArray基因芯片实验操作步骤进行(Oligo GEArray细胞凋亡基因芯片由上海康成生物科技有限公司提供)。 1.2.3 RNA 抽提Trizol一步法进行细胞总RNA的抽提。 1.2.4 RNA质量检测经变性琼脂糖凝胶电泳及紫外吸收测定法对RNA质量进行检测。 1.2.5 cRNA标记与合成首先合成cDNA，再合成cRNA，并对合成的cRNA进行标记和扩增，进而cRNA 纯化。 1.2.6 芯片杂交、化学发光检测、图象采集和数据分析。 1.3 统计学分析采用χ2检验。 2 结果 对芯片中114个与凋亡相关的基因检测时发现耐顺铂的A549DDP细胞表达凋亡相关基
专题17 细胞的分化、衰老、凋亡和癌变 一、基础知识必备 1、细胞分化 （1）概念:在个体发育中,由一个或一种细胞增殖产生的后代,在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程。 （2）时间:发生在整个生命进程中,胚胎时期达到最大程度。 （3）结果:形成不同的组织和器官。 （4）特点:稳定性、持久性和普遍性和不可逆性。 （5）实质:基因的选择性表达。 （6）意义:是生物个体发育的基础；使多细胞生物体中的细胞趋向专门化,有利于各种生理功能的高效表达。 2、细胞的全能性 （1）概念 已分化的细胞,仍然具有发育成完整个体的潜能 （2）原因 细胞中含有发育成生物体所需要的全套遗传信息。 （3）条件 离体、一定的营养物质(无机盐、维生素、氨基酸等)、激素和适宜的外界条件(适宜的温度、pH 等)。 3、衰老细胞的特征 4、细胞的凋亡 （1）概念:由基因所决定的细胞自动结束生命的过程。 （2）原因:受到严格的由遗传机制决定的程序性调控。 （3）类型{ 个体发育中细胞的编程性死亡成熟个体中细胞的自然更新被病原体感染的细胞的清除
（4）意义{ 保证多细胞生物体完成正常发育维持内部环境的稳定抵御外界各种因素的干扰 5、细胞的癌变 （1）概念:由于致癌因子的作用,细胞中的遗传物质发生变化,变成了不受机体控制的、连续进行分裂的恶性增殖细胞。 （2）主要特征 （3）致癌因子:物理致癌因子、化学致癌因子、病毒致癌因子。 （4）原癌基因主要负责调节细胞周期,控制细胞生长和分裂的进程;抑癌基因主要阻止细胞不正常的增殖。 二、通关秘籍 1、细胞分化使细胞类型增多,数目不变;细胞分裂使细胞数目增多,但细胞类型不变;细胞分裂是细胞分化的基础。细胞分化的本质是基因的选择性表达,多细胞生物不同类型的细胞中mRNA 和蛋白质种类不同,但体细胞DNA 都相同,所以细胞分化过程中细胞内的遗传物质不改变。 2、细胞衰老贯穿于整个个体发育过程中,多细胞生物体内的细胞总是不断地更新,总有一部分细胞处于衰老或走向死亡的状态。 3、细胞凋亡是正常的生理现象,对生物体生命活动具有积极意义。 4、细胞坏死与细胞凋亡不同,细胞坏死是细胞的非正常死亡。 5、不是只有癌细胞中才存在原癌基因,正常细胞中也存在原癌基因。 6、原癌基因和抑癌基因不是简单的拮抗关系,二者共同对细胞的生长和分化起着调节作用。 对点训练 1、细胞生长，其表面积增大，导致细胞的物质交换效率升高 （ ） 【解析】随着细胞生长，细胞体积增大时，细胞表面积/体积减小，相对表面积减少，导致物质运输速率下降，错误。
细胞凋亡与疾病 一、单项选择题 ．细胞增殖周期的顺序依次是（） A G1→M→G2→S B G1→S→G2→M C M→G1→G2→S D S→G1→M→G2 3.关于p53基因下列哪项说法不正确（） A．p53有“分子警察”的美誉 B．p53蛋白负责检查DNA是否损伤 C．p53蛋白可启动DNA修复机制 D．p53基因突变后可促进细胞凋亡 [答案] D 8.关于细胞凋亡下列说法哪项不正确（） A．细胞凋亡是由内外因素触发预存的的死亡程序的过程B．其生化特点是有新的蛋白质合成 C．其形态学变化是细胞结构的全面溶解 D．凋亡过程受基因调控 [答案] C 9.清除体内受损、突变、衰老细胞的主要方式是（） A．细胞坏死 B．免疫调理 C．肝脏处理 D．细胞凋亡 [答案] D
10.凋亡细胞的清除是指已经凋亡的细胞（） A．经肾脏排出体外 B．经肝脏灭活 C．被邻近的吞噬细胞吞噬 D．经水合酶水解 [答案] C 12.细胞凋亡的主要执行者是（） A．核酸内切酶 B．溶酶体酶 C．巨噬细胞 D．蛋白激酶C [答案] A 13.凋亡细胞特征性的形态学改变是（） A．溶酶体破裂 B．染色质边集 C．形成凋亡小体 D．细胞肿胀 [答案] C 15.凋亡蛋白酶的主要作用是（） A．执行染色质DNA的切割任务 B．灭活细胞凋亡的抑制物 C．抑制细胞生长因子 D．激活内源性核酸内切酶 [答案] B 16.含锌药物可用于治疗某些凋亡过度的疾病，其理由是（） A．Zn2+可防止线粒体Δψm下降
B．Zn2+阻止细胞内钙超载 C．Zn2+可抑制核酸内切酶的活性 D．Zn2+可促进细胞的增殖 [答案] C 17. 人免疫缺陷病毒（HIV）感染引起的AIDS关键的发病机制是（） A．CD4+淋巴细胞选择性增生，相关免疫反应功能增强 B．CD4+淋巴细胞选择性破坏，相关免疫缺陷 C．Fas基因表达下调，T淋巴细胞死亡增加 D．Fas基因表达下调，B淋巴细胞增殖过度 [答案] B 18.目前研究表明，AD造成神经原丧失的主要机制是（） A．细胞坏死 B．乙酰胆碱合成减少 C．神经递质分布异常 D．细胞凋亡 [答案] D 19.细胞凋亡不足与过度并存的疾病是（） A．心力衰竭 B．动脉粥样硬化 C．胰岛素依赖性糖尿病 D．肝癌 [答案] B 20.与细胞凋亡过度有关的疾病是（） A．帕金森氏病 B．结肠癌 C．肺癌
如有侵权请联系网站删除 精品资料荧光PCR仪检测平台：叶酸能力代谢基因检测 一、叶酸能力代谢基因检测的临床意义： 1、提前预防脑卒中，降低脑卒中发生率和死亡率 大量研究数据显示：亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因型变异是导致我国人群脑卒中高发最主要的遗传危险因素。 MTHFR基因的多个位点在人群中具有多态性，其中与功能和疾病最为相关的是C677T位点多态性。在MTHFR基因第677个核苷酸位置，其碱基可发生胞嘧啶（C）向胸腺嘧啶（T）的突变，MTHFR酶的活性逐级降低（CC型活性为100%，CT型活性为70%，TT型活性为35%），引起同型半胱氨酸在人体内不同程度的蓄积，破坏全身血管，从而形成”H型高血压”，导致卒中风险比一般人高出11-28倍。因此提前检测与脑中风最相关的基因MTHFR677C/T基因对预防脑卒中，提前进行干预治疗，从而降低脑卒中的发病率，有着非常重要的意义。 2、提前预防新生儿出生缺陷，提高我国人口素质 神经管畸形，唇腭裂等是常见的新生儿缺陷。出生缺陷不仅影响儿童的生命健康和生活质量，而且给患者家庭带来巨大的精神痛苦和经济负担。而大量的研究表明MTHFR677C/T基因突变会导致孕妇体内同型半胱氨酸升高，从而导致孕妇早产、低出生体重儿、新生儿神经管畸形、唇腭裂等。因此提前检测与孕妇早产，新生儿出生缺陷相关基因，提前进行干预治疗，从而降低新生儿出生缺陷以及孕妇早产，对提高我国人口素质，降低国家和家庭负担方面有着重要的意义。二、检测试剂盒介绍及优势 采用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）、对MTHFR 基因C677T 位点多态性进行定性检测：首先从EDTA 抗凝的全血中提取基因组DNA，在PCR反应体系中加入荧光探针，利用荧光利用探针可与DNA模板特异性结合的特点，通过报告荧光的不同来分辨出样本的亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）的基因型，最后通过电脑软件自动计算给出结果，区分该基因位点的野生型（CC）、杂合型（CT）和纯合突变型（TT）。 基因多态性检测试剂盒优势： 1.灵敏度高：可以对低至1ng的DNA模板准确的进行基因多态性检测；
基因检测相关知识 81、什么是基因检测？ 答：这里所说的基因检测，全称为“疾病易感基因检测”。是通过提取受检测者细胞里的基因，通过基因分析的技术手段寻找其中与某些疾病相关的基因，并根据这些基因的情况，借助基因组学知识，对受检测者患某种疾病的风险进行预测，从而指导人们有针对性地预防疾病的发生。 82、什么是基因诊断？ 答：基因诊断就是通过基因检测，分析受检者所携带的基因型来判断引起某些疾病的基因层面的原因。 83、检测疾病易感基因的原理是什么？ 答：基因是两条精密配对的多核苷酸链组成。我们把一段含有已知错误碱基（或称易感基因位点）的多核苷酸链放在基因芯片上，然后把受检测者的众多基因的两条链在化学试剂中裂解开，染上颜色，也放到基因芯片上。如果受检测者的某个基因中也含有这种错误碱基，它就会与我们预先放置在基因芯片上的片段结合起来，并把颜色留在基因芯片上。我们通过精密仪器扫描到这种颜色，我们就能判断受检测者体内是否含有与我们预先放置在基因芯片上的有错误碱基序列一致的位点，从而确定其是否有某种易感基因。 84、基因检测的作用？ 答：(1)有病早预防----健康生活就来到 通过我们的产品基因芯片健康检测卡对被检者身体细胞中的DNA进行基因芯片检测，数亿元的专业设备及生物学专家专为被检者检测身体所含的与肿瘤，糖尿病等多种疾病相关的易感基因，从而使被检者能及时了解自己的基因信息，改善自己的生活环境及生活习惯，及早预防肿瘤及相关疾病的发生，改善生活质量，提高生活品质，享受健康人生。 (2)保健----“量身定制”，有针对性地调补 通过基因芯片检测的结果，我们推出了一系列专门针对弥补易感基因缺陷的产品，从而使会员身体能够获得一个最佳体质，能够对环境有一个更好的适应。 (3)健康----从定期咨询服务开始 通过为广大会员建立基因健康信息卡，定期组织权威专家对广大会员进行咨询服务，专家会引导到知名权威医院进行治疗，享受更优质的针对性治疗待遇。 85、目前可用来进行基因检测的工具平台有哪些？ 答：常用的工具平台有DNA测序、Illumina激光共聚焦光纤微珠超高通量基因分析平台、生物信息分析平台、微矩阵基因芯片分析平台、短片段重复（STR）序列分析平台、贝克曼SNP基因分型高通量流式检测平台。 86、基因检测主要的两种方法是什么？ 答：测序法和基因芯片法 87、什么是生物芯片？ 答：应用微电子加工工艺，在玻璃、塑料、硅片等材料上加工出用于生物样品分离、反应或分析的微细结构。 88、什么是基因芯片技术？ 答：将基因片段有序地固定在玻璃载体上，通过被检测者细胞的DNA抽提，通过合成引物后扩增，用荧光标记的DNA片段上与之杂交、洗脱、结果扫描、软件提取并分析数据的一种快速、高效的分子生物学分析手段。 89、基因多态性芯片检测原理是什么？
第一节细胞凋亡的生物学意义及其相关基因 对于一个多细胞生物来说，要维持完整性和保持平衡性，凋亡是一个非常重要的生物学过程。多细胞生物的诞生、生长、发育、存活以及死亡，无一不伴随着细胞凋亡过程。 关于细胞增殖能力和寿命是有限的观点。细胞，至少是培养的二倍体细胞，有一定的寿命；它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限，这就是 Hayflick 界限。癌细胞或培养的细胞系是不正常细胞，其染色体数目或形态已经不同于原先的细胞细胞的增殖能力与供体年龄有关。物种寿命与培养细胞寿命之间存在着一定的关系。 一、细胞衰老 二倍体细胞的衰老是由细胞本身决定的。决定细胞衰老的因素在细胞内部，而不是外部的环境；是细胞核而不是细胞质决定了细胞衰老。在机体内，细胞的衰老和死亡是常见的现象，甚至在个体发育的早期也会发生;衰老动物体内，细胞分裂速度显著减慢，其原因主要是G1期明显延长;衰老个体内的环境因素影响了细胞的增殖和衰老; 二、衰老细胞结构的变化 细胞核的变化： 体外培养的二倍体细胞，细胞核随着细胞分裂次数的增加不断增大；细胞核的核膜内折（invagination）、染色质固缩化。 2. 内质网的变化： 衰老动物内质网成分弥散性地分散于核周胞质中，粗面内质网的总量似乎是减少了。 3.线粒体的变化： 通常细胞中线粒体的数量随龄减少，而其体积则随龄增大；致密体的生成：脂褐质，老年色素等。 4.膜系统的变化： 衰老的细胞，其膜流动性降低、韧性减小。衰老细胞间间隙连接减少；细胞膜
内（P面）颗粒的分布也发生变化（减少）三、细胞衰老的分子机理氧化性损伤学说：代谢过程中产生的活性氧基团或分子（ROS---O2-， OH-， H2O2），引发的氧化性损伤的积累，最终导致衰老。 端粒与衰老：发现端粒长度确实与衰老有着密切的关系，提出细胞衰老的“有丝分裂钟”学说（Harley,1990）。 rDNA与衰老: 酵母染色体外rDNA 环的积累，导致细胞衰老。 沉默信息调节蛋白复合物与衰老：复合物存在于异染色质区，其作用在于阻断所在位点DNA转录。. 细胞衰老的分子机理：基因和WRN基因与衰老：SGS1基因和WRN基因同源,编码解旋酶;酵母sgs1突变体寿命明显短于野生型（平均代:代）; wrn突变引发早老症. 2.发育程序与衰老: 线粒体DNA与衰老: Sen-DNA(80年代);mtDNA突变积累与细胞衰老有关 (一)细胞死亡的方式死亡是生命的普遍现象，但细胞死亡并非与机体死亡同步。正常的组织中，经常发生“正常”的细胞死亡，它是维持组织机能和形态所必需的。 细胞死亡的方式通常有3种： ①细胞坏死（necrosis） ②细胞凋亡（apoptosis） ③细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD） 影响因素:化学因素（如强酸、强碱、有毒物质）、物理因素（如热、辐射）、生物因素（如病原体）、坏死细胞的形态改变。 病理过程 酶性消化：参与此过程的酶，如来源于死亡细胞本身的溶酶体，则称为细胞自溶（autolysis）；若来源于浸润坏死组织内白细胞溶酶体，则为异溶（heterolysis）蛋白变性 坏死细胞的形态改变
LH()的临床意义 1、LH阈值：COS中获得足够E2合成及正常卵泡发育的最低LH有效剂量即为LH阈值剂量。当LH超过某一剂量引起募集障碍和卵泡闭锁即为LH上限剂量。 2、LH窗：正常卵泡发育LH在阈值和上限值之间称LH窗（1-10IU/L）。正常LH5IU/L左右；定义LH阈值非常困难：多篇文献研究结果显示：每日补充重组LH75IU或75-150IU/D 可以获得良好的卵泡发育；一些学者提议测循环血中LH水平作为阈值：。IVF治疗周期中在卵泡晚期添加LH2-3天，会更好的促进卵泡生长 卵泡晚期添加LH：（若添加过早会降低继续妊娠率） 作用机制：r-LH诱导TC生成ECG,促使GC、卵丘细胞、卵细胞共同产生EGF，EGF可激活卵细胞内的生长分化因子9而促进卵子细胞浆和核同步成熟并同时防止卵丘细胞凋亡，较长时间保持卵丘细胞的生理功能，能够促进卵子细胞浆与核同步成熟直至排卵，从而提高卵子质量，改善IVF结局 优点：通过（提高卵子质量；诱导E2合成；促进Em发育）而改善IVF结局，降低流产率。适应症： 低促性腺性性功能减退症（HH）即内源性LH过低（使得卵子成熟时间延长，受精率下降，早期流产率升高）； 降调周期LH过度抑制（LH小于L,E2过低）； 年龄过大（雄激素分泌功能降低、有功能的LH受体降低；GnRHa降调致LH受体下降；免疫反应未改变，但LH生物活性降低；随年龄增加卵巢旁分泌降低（LH活性升高受旁分泌影响）。年龄大于等于35岁，LH水平正常不足以维持生长，对LH敏感性降低，产生A升高，有功能LH受体降低，24小时T水平下降）； 对FSH反应不良者（包括低反应、垂体过分抑制内源性LH活性过低使得卵巢反应降低，单纯FSH不足以有效促进卵泡和卵子正常发育）。 3、LH生理作用： 传统观点：诱导卵泡膜细胞合成雄激素（作为E合成底物）；诱发排卵；支持黄体。 目前观点：卵泡发育晚期颗粒细胞接受一定量LH，协助FSH促进GC增殖、卵巢类固醇合成
表1 常见的细胞凋亡诱导剂和抑制剂 诱导剂与抑制剂靶细胞诱导剂 激素地塞米松T细胞 细胞因子IL—2 胸腺细胞 TGF—β肝细胞、上皮细胞、慢性B淋巴瘤细胞 IL—10 髓样白血病细胞 IFN—Υ前B细胞、T细胞抗体抗IgM抗体B细胞 抗IgD抗体B细胞 抗HLA—II抗体静止B细胞 超抗原SPE CD4+T细胞 胞内信号分子调节 剂 放线菌酮T细胞 PKC激活剂胸腺细胞 其他DNA拓扑异构酶抑制 剂 白血病细胞放射线淋巴样细胞 抑制剂 细胞因子IL—2 T H1细胞 IL—4 T H2细胞 IL—10 B、T细胞 IFN—ΥT细胞 IL—4 B细胞 黏附分子LFA—1、ICAM—1 B细胞 VLA—4、VCAM—1 B细胞 胞内信号分子调节 剂 PKC激活剂T、B细胞 细胞凋亡（apoptosis）是一种由基因控制的细胞自主死亡方式。1972年，英国教授Kerr首先提出凋亡的概念。近十余年来，细胞凋亡现象引起了广泛重视，有关的研究工作取得重要进展，并成为医学生物学各学科共同关注的极为活跃的研究领域。 细胞凋亡与组织器官的发育、肌体正常生理活动的维持、某些疾病的发生以及细胞恶变等过程均有密切的关系。
1．形态学变化： 细胞凋亡的形态变化大致可分为三个阶段： 1）胞体缩小，与周围细胞失去联系，细胞器变致密，核体积缩小，核仁消失，染色质浓集于核膜内表面下，形成新月形致密小斑块。 2）染色体断裂，核膜与细胞膜均内陷，包裹胞内成分（胞浆、细胞器、碎裂的染色质及核膜）形成“泡”样结构，此为“凋亡小体”。最后，整个细胞均裂解成这种“小体”。 3）凋亡小体被邻近的巨噬细胞、上皮细胞等识别、吞噬、消化。 上述三个阶段维持时间很短，通常在几分钟、十几分钟内即可完成。 2．细胞凋亡的生化改变： 1）胞内Ca2+浓度增高 所有细胞凋亡过程中均出现胞内Ca2+浓度增高，这可能是Ca2+内流所致。 2）内源性核酸内切酶激活 细胞发生凋亡时，由于内源性核酸内切酶被激活，DNA被从核小体连接处水解，形成180—200bp 或其整倍数的片段。 3）生物大分子的合成 凋亡过程的发生一般依赖于新的RNA和蛋白质的合成，如在激素、射线作用下，或由于去除生长因子等所引起的细胞凋亡中，情况均为如此。 常用的检测方法： 1．形态学方法 借助普通光学显微镜、荧光显微镜或透射电镜可对组织切片、切片涂片或细胞悬液进行形态学观察，凋亡细胞在组织中散在分布，表现为核致密浓染、核碎裂等。该方法简便、经济，可定性、定位。但在组织成分及细胞死亡类型复杂的情况下，难以判断结果，也无法定量。 2．电泳法 对凋亡细胞的基因组DNA进行琼脂凝胶电泳，由于存在180—200bp或其整倍数的片段，故电泳结果可见“梯状”（ladder）DNA条带。该法简便，可定性及定量，但无法显示组织细胞形态结构，也不能反映凋亡细胞与周围组织的关系。
基因检测运营可行性方 案 文件编码（008-TTIG-UTITD-GKBTT-PUUTI-WYTUI-8256）
基因检测可行性运营方案 一．项目介绍 基因是DNA分子上的一个功能片断，是的基本单位，是决定一切生物物种最基本的因子；基因决定人的生老病死，是健康、靓丽、长寿之因，是生命的操纵者和者。因此，哪里有生命，哪里就有基因，一切生命的存在与衰亡的形式都是由基因决定的，包括您的长相、身高、体重、肤色、性格等均与基因密不可分。 检测是通过血液、其他体液、或细胞对DNA进行检测的技术。 基因（Gene,Mendelian factor）是指携带有遗传信息的DNA或序列（即基因是具有遗传效应的DNA或RNA片段），也称为遗传因子，是控制性状的基本遗传单位。基因通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物个体的性状表现。 1. 基因与健康 现代医学研究证明，除外伤外，几乎所有的疾病都和基因有关系。像血液分不同血型一样，人体中正常基因也分为不同的基因型，即基因型。不同的基因型对环境因素的敏感性不同，敏感基因型在环境因素的作用下可引起疾病。另外，单独由异常基因直接引起疾病，被称为为。 可以说，引发疾病的根本原因有三种： （1）基因的后天突变； （2）正常基因与环境之间的相互作用； （3）遗传的基因缺陷。 绝大部分疾病，都可以在基因中发现病因。 基因通过其对蛋白质合成的指导，决定我们吸收食物，从身体中排除毒物和应对感染的效率。 第一类与遗传有关的疾病有四千多种，通过基因由父亲或母亲遗传获得。 第二类疾病是常见病，例如心脏病、、多种癌症等，是多种基因和多种环境因素相互作用的结果。 基因是人类遗传信息的化学载体，决定我们与前辈的相似和不相似之处。在基因“工作”正常的时候，我们的身体能够发育正常，功能正常。如果一个基因不正常，甚至基因中一个非常小的片断不正常，则可以引起发育异常、疾病，甚至死亡。
细胞凋亡和细胞坏死的区别 高考频度：★★★☆☆难易程度：★★☆☆☆ 脑缺氧、心缺血、急性胰腺炎、动脉粥样硬化等疾病都是由细胞坏死引起的。近日，厦门大 学生命科学学院韩家淮教授课题组的一项研究表明，存在于人体内的一种名为RIP3的蛋白 激酶，能够将细胞凋亡转换成细胞坏死，通过调控这种酶的合成，就可以调控细胞的死亡方式。下列有关叙述错误的是 A.从以上分析可知细胞坏死过程中存在基因的选择性表达 B.—些细胞的坏死对人体也有益处，比如被病原体感染的细胞在免疫系统的作用下死亡 C.抑制RIP3的活性，能在一定程度上对急性胰腺炎起治疗、防御的作用 D.在人体的癌细胞中，也可能存在控制RIP3合成的基因 【参考答案】B 【试藍翼祈】由细运碍亡特銮弟鈿迸环芒寸虽该追越白基医逵淫土爰注'A正聽：由越丹熄思繆不出譎縫琢死痔身徳有莖，B 樂唳；抑割该薛的洁席.则毅別条锻坏死，C正碍：艳籍踰胞前全寵惟，号令鑰無占的基因鑫是一縊的尸D正菇’ ■ ”推荐 -------------- ” 1有关细胞凋亡和细胞坏死的叙述正确的是 A.细胞凋亡的速率会因其功能不同而不同 B.被病毒侵染的细胞的清除属于细胞坏死 C.细胞凋亡和细胞坏死都有利于个体的生长发育 D.细胞凋亡和细胞坏死都受环境影响较大，机体难以控制 2.下列关于细胞凋亡和细胞坏死的叙述中，错误的是 A.细胞凋亡是一种自然的生理过程 B.细胞坏死是一种病理性变化
C.被病原体感染的细胞的清除是通过细胞坏死完成的 D.蝌蚪尾的消失，是由基因决定的细胞自动结束生命的过程 3?下列关于细胞凋亡和细胞坏死的叙述中，错误的一项是 A.细胞凋亡是主动的，细胞坏死是被动的 B.细胞凋亡是生理性的，细胞坏死是病理性的 C.细胞凋亡是基因调控的，细胞坏死是外界因素引起的 D.细胞凋亡是急性的，细胞坏死是慢性的 4?细胞凋亡也称为细胞编程性死亡，其大致过程如图所示。下列有关叙述错误的是 A.细胞皱缩、染色质固缩表明细胞处于衰老状态 B.图示过程只发生在胚胎发育过程中 C.吞噬细胞吞噬凋亡小体与细胞膜的流动性密切相关 D.细胞凋亡是由遗传物质控制的，与细胞坏死有明显区别 5?香烟中含有大量的有害物质，如尼古丁等会造成吸烟者肺部细胞的死亡。这种细胞的死亡过程属于 A.生理性死亡 B.正常衰亡 C.细胞坏死 D.细胞凋亡 1.【答案】A 【解析】功能不同的细胞凋亡速率不同，如神经细胞可能一生都不凋亡，口腔上皮细胞 则在短时间内发生凋亡，A正确；被病毒侵染的细胞的清除属于细胞凋亡，B错误；细胞凋亡是指由基因控制的细胞自动结束生命的过程，有利于个体的生长发育；细胞坏死是 1E常细 胞 细胞皱缩细胞励SL吞噬细胞 核染色质分解战多个包袅、呑噬 凋亡小体凋亡小体
细胞凋亡与疾病 一、基本要求 （一）掌握细胞凋亡的概念、生物学意义 （二）掌握细胞凋亡的发生机制 （三）熟悉细胞凋亡的过程及细胞凋亡与坏死的差别 （四）熟悉细胞凋亡的主要变化 （五）熟悉细胞凋亡的调控 （六）了解细胞凋亡与常见疾病或病理过程的关系 （七）了解细胞凋亡在疾病防治中的意义 二、知识点纲要 一、基本概念 （一）细胞凋亡的定义：由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞自杀过程称为细胞凋亡(apoptosis)，也称为程序性细胞死亡(programmed cell death， PCD)。 （二）细胞凋亡的基本过程 1．凋亡信号转导 2．凋亡基因激活 3．细胞凋亡的执行 4．凋亡细胞的清除 （三）凋亡时细胞的主要变化 1．细胞凋亡的形态学改变：胞膜空泡化，细胞固缩，染色质边集，凋亡小体。 2．细胞凋亡的生化改变：DNA“梯”状条带，内源性核酸内切酶激活，caspases（凋亡蛋白酶）激活。 （四）细胞凋亡的调控 1．细胞凋亡相关因素 细胞凋亡相关因素分诱导性因素和抑制性因素两大类 (1) 诱导性因素:激素和生长因子失衡,理化因素,免疫性因素,微生物等 (2) 抑制性因素: 某些激素（ACTH、睾丸酮）或细胞因子(IL-2，神经生长因子等) 的去除,某些二价金属阳离子如:Zn2+，药物如: 苯巴比妥、半胱氨酸蛋白酶抑制剂，病毒如：EB病毒，牛痘病毒CrmA等及中性氨基酸具有抑制细胞凋亡的作用。 2. 细胞凋亡信号的转导 (1)特点:凋亡信号转导系统是连接凋亡诱导因素与核DNA片段化断裂及细胞结构蛋白降解的中间环节。这个系统的特点是:①多样性;②偶联性;③同一性;④)多途性。 （2）研究较多的信号转导系统有：①胞内Ca2+信号系统；②cAMP/ PKA信号系统；③) Fas蛋白/Fas配体信号系统；④神经酰胺信号系统；⑤二酰甘油/蛋白激酶C信号系统；⑥酪氨酸蛋白激酶信号系统。 （五）凋亡相关基因 细胞凋亡相关基因多达数十种，根据功能的不同可将其分为三类:抑制凋亡基因（EIB、I AP、Bcl-2），促进凋亡基因（Fas、Bax、ICE、P53），双向调控基因（c-myc、Bcl-x）。 1． Bcl-2 是抑制凋亡的基因。 2.Fas Fas基因的表达可促进细胞凋亡。 3．p53 野生型P53基因具有诱导细胞凋亡的功能，当该基因发生突变后反而可抑制细胞凋亡。 4. c-myc，Bcl-x c-myc是一种癌基因，它能诱导细胞增殖，也能诱导细胞凋亡，具有
摘要目前国内外许多学者都逐渐认识到细胞内蛋白酶与细胞凋亡密切相关，认为这些蛋白酶可能在细胞凋亡的启动方面起着关键性作用。本文就这些蛋白酶的种类，底物及其抑制剂的作用作一综述。关键词：细胞凋亡；白介素1转换酶；蛋白酶 1 概述细胞凋亡是区别于细胞坏死的一种细胞死亡形式，它是在一定的生理和病理条件下，一种并不引起机体炎症反应的细胞程序性死亡（programmed cell Death, PCD）的过程。细胞凋亡这一概念最早由Kerr等提出的[1]，认为该种细胞死亡像秋天的树叶凋谢一样，故称谓“Apoptosis”，希腊文即凋亡之意。细胞凋亡在形态学和生化改变方面具有特征性。形态学改变包括细胞皱缩，染色质浓缩，核裂解成碎片，最终细胞膜及内质网膜将完整细胞器及碎片包裹成多个分散的凋亡小体。生化改变以往认为内源性核酸内切酶活性增加染色质核小体间DNA断裂是引起凋亡的一个启动因子，但有些具有细胞凋亡特征性改变的却没有染色质核小体间DNA断裂，有的甚至缺乏细胞核[1]，看来仅仅以此酶活性增加作为凋亡的启动因子，不能得到满意的解释。目前许多学者都着重于对细胞内蛋白酶的研究，认为这些蛋白酶可能在细胞凋亡的启动方面起着关键性作用。研究依据为：（1）在细胞凋亡早期已发现特异的、可复制的细胞内蛋白的降解[2]。（2）某些蛋白酶抑制剂可抑制细胞凋亡的发生[3]。（3）部分病毒蛋白质作用类似蛋白酶抑制剂，可以抑制细胞凋亡[4]。（4）基因删除实验证明某些蛋白酶在细胞凋亡中起着主要作用[5]。 2 白介素1转换酶家族（ICE家族）在蛋白酶的研究中，研究得最早且最多的为白介素1转换酶（Interleukin 1 converting enzyme, ICE）是巯基蛋白酶的一种。ICE的作用是将无活性的31KD的前白介素1（在天冬氨酸羧基端降解为有活性的17.5KD的细胞因子。ICE由Black等和Kostura等[6]在1989年发现，此酶有高度的底物特异性。ICE高度表达导致细胞死亡，而ICE抑制剂如痘苗病毒CrmA可抑制由各种不同刺激因子诱导的细胞凋亡[7]。在线虫C.elegans的遗传学研究中发现1090个细胞中131个细胞出现了预定的细胞凋亡，调控该程序性死亡的基因已被确认。基因删除实验证明有2个基因ced-3和ced-4是引起细胞凋亡所必需的。尽管由ced-3编码的多肽其功能还不十分清楚，但这一分子显示与人类ICE有广泛的相同部分，ced-3蛋白与ICE有29%氨基酸残基同源性。ced-3蛋白最长的保护顺序QACRG含有ICE活性所必需的半胱氨酸。14C碘乙酰胺标记和晶体学研究[8]均发现ICE活性位于半胱氨酸残基，此基团在催化作用中起着关键作用。活性型ICE是一个四聚体，由两个20KD和两个10KD亚基因组成。它是由无活性型的45KD酶原在天冬氨酸-X连接处降解成20KD和10KD亚基。晶体学研究提示2个亚基均是酶活性所必需的[8]。由于ced-3蛋白和ICE间29%同源性促使对包括人类的哺乳类细胞凋亡过程中ICE作用的研究，已发现鼠成纤维细胞中ICE过度表达引起细胞凋亡。若涉及ICE催化活性半胱氨酸和甘氨酸基团突变，则导致催化活性和诱导转染细胞凋亡的功能的丧失。由ATP诱导的鼠腹膜巨噬细胞凋亡及亚胺环已酮及肿瘤坏死因子诱导的Hela细胞凋亡过程中均发现有成熟的白介素1释放[9]，提示ICE在细胞凋亡中被激活。目前对于与ICE活性有关的特异性底物还不十分清楚。随着研究的不断深入，ICE家族成员不断扩大，统称为ICE同类物（ICE homologues）。包括：1）Nedd-2，最初从鼠大脑细胞发育早期一组基因中发现的，后在人胎儿大脑细胞cDNA库中分离得到相同的基因，命名为Ich-1（即ICE和ced-3同类物-1），其编码蛋白顺序与ICE和ced-3相同[10]，Ich-1有两种不同的mRNA即长Ich-1和短Ich-1。长Ich-1过度表达诱导细胞凋亡。而短Ich-1过度表达抑制细胞凋亡。Ich和ICE相比不易被CrmA抑制[10]。2）CPP32与ced-3同源性为35%，与ICE同源性为30%，其在真核细胞内的表达能诱导细胞凋亡。CPP32又称为YAMA和apopain。CPP32的底物特异性不同于ICE。前者在P1-P4位点偏向性为四肽DEVD＞YVAD，而后者偏向于YVAD。前者易被DEVD-醛所抑制，后者易被YVAD-醛抑制。CPP32能降解多二磷酸腺苷核糖多聚酶（PARP），ICE及长Ich-1并不降解PARP。3）TX（亦称为ICErelⅡ或Ich-2），与ICE有50%同源性，与ced-3有30%等同性[12]。该酶亦为巯基蛋白酶，能催化降解30KD的ICE前体变为有活性的ICE[12]。TX
细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段：接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化（Caspase）→进入连续反应过程细胞凋亡的启动是细胞在感受到相应的信号刺激后胞内一系列控制开关的开启或关闭，不同的外界因素启动凋亡的方式不同，所引起的信号转导也不相同，客观上说对细胞凋亡过程中信号传递系统的认识还是不全面的，比较清楚的通路主要有：1）细胞凋亡的膜受体通路：各种外界因素是细胞凋亡的启动剂，它们可以通过不同的信号传递系统传递凋亡信号，引起细胞凋亡，我们以Fas -FasL为例：Fas是一种跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，它与FasL结合可以启动凋亡信号的转导引起细胞凋亡。它的活化包括一系列步骤：首先配体诱导受体三聚体化，然后在细胞膜上形成凋亡诱导复合物，这个复合物中包括带有死亡结构域的Fas相关蛋白FADD。Fas又称CD95，是由325个氨基酸组成的受体分子，Fas一旦和配体FasL结合，可通过Fas分子启动致死性信号转导，最终引起细胞一系列特征性变化，使细胞死亡。Fas作为一种普遍表达的受体分子，可出现于多种细胞表面，但FasL的表达却有其特点，通常只出现于活化的T细胞和NK细胞，因而已被活化的杀伤性免疫细胞，往往能够最有效地以凋亡途径置靶细胞于死地。Fas分子胞内段带有特殊的死亡结构域（DD,death domain）。三聚化的Fas和FasL结合后，使三个Fas分子的死亡结构域相聚成簇，吸引了胞浆中另一种带有相同死亡结构域的蛋白FADD。FADD是死亡信号转录中的一个连接蛋白，它由两部分组成：C端（DD结构域）和N端（DED）部分。DD结构域负责和Fas分子胞内段上的DD结构域结合，该蛋白再以DED连接另一个带有DED的后续成分，由此引起N段DED随即与无活性的半胱氨酸蛋白酶8（caspase8）酶原发生同嗜性交联，聚合多个caspase8的分子，caspase8分子遂由单链酶原转成有活性的双链蛋白，进而引起随后的级联反应，即Caspases，后者作为酶原而被激活，引起下面的级联反应。细胞发生凋亡。因而TNF诱导的细胞凋亡途径与此类似2）细胞色素C释放和Caspases激活的生物化学途径线粒体是细胞生命活动控制中心，它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且是细胞凋亡调控中心。实验表明了细胞色素C从线粒体释放是细胞凋亡的关键步骤。释放到细胞浆的细胞色素C在dATP存在的条件下能与凋亡相关因子1（Apaf-1）结合，使其形成多聚体，并促使caspase-9与其结合形成凋亡小体，caspase-9被激活，被激活的caspase-9能激活其它的caspase如caspase-3等，从而诱导细胞凋亡。此外，线粒体还释放凋亡诱导因子，如AIF，参与激活caspase。可见，细胞凋亡小体的相关组份存在于正常细胞的不同部位。促凋亡因子能诱导细胞色素C 释放和凋亡小体的形成。很显然，细胞色素C从线粒体释放的调节是细胞凋亡分子机理研究的关键问题。多数凋亡刺激因子通过线粒体激活细胞凋亡途经。有人认为受体介导的凋亡途经也有细胞色素C从线粒体的释放。如对Fas应答的细胞中，一类细胞（type1）中含有足够的胱解酶8 （caspase8）可被死亡受体活化从而导致细胞凋亡。在这类细胞中高表达Bcl-2并不能抑制Fas诱导的细胞凋亡。在另一类细胞（type2）如肝细胞中，Fas受体介导的胱解酶8活化不能达到很高的水平。因此这类细胞中的凋亡信号需要借助凋亡的线粒体途经来放大，而Bid -- 一种仅含有BH3结构域的Bcl-2家族蛋白是将凋亡信号从胱解酶8向线粒体传递的信使。尽管凋亡过程的详细机制尚不完全清楚，但是已经确定Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡过程中是起着必不可少的作用，细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程，到目前为止，至少已有14种Caspase被发现，Caspase分子间的同源性很高，结构相似，都是半胱氨酸家族蛋白酶，根据功能可把Caspase基本分为二类：一类参与细胞的加工，如Pro-IL-1β和Pro-IL-1δ，形成有活性的IL-1β和IL-1δ；第二类参与细胞凋亡，包括caspase2,3,6,7,8,9.10。Caspase家族一般具有以下特征：1)C端同源区存在半胱氨酸激活位点，此激活位点结构域为QACR/QG。2)通常以酶原的形式存在，相对分子质量29000-49000(29-49KD），在受到激活后其内部保守的天冬氨酸残基经水解形成大（P20）小（P10）两个亚单位，并进而形成两两组成的有活性的四聚体，其中，每个P20/P10异二聚体可来源于同一前体分子也可来源于两个不同的前体分子。3)末端具有一个小的或大的原结构域。参与诱导凋亡的Caspase分成两大类：启动酶（inititaor）和效应酶（effector）它们分别在死亡信号转导的上游和下游发挥作用。