细胞凋亡的途径有哪几种？
细胞凋亡本质上是一种程序性细胞死亡，是机体在生理或病理条件下，启动自身内部机制，经过多途径的信号传递，结束其自身生命的过程。细胞凋亡的途径主要有两种：一条是死亡受体介导的凋亡通路，另一条是线粒体/细胞色素C介导的凋亡通路
1．死亡受体介导的凋亡通路
“死亡受体通路”是由胞外肿瘤坏死因子(TNF)超家族的死亡配体如TNFa、FasL／
CD95L、TWEAK和TRAIL引发的。这些配体和相关的细胞表面死亡受体(分别是TNFR、Fas／CD95、DR3、DR4／DRS)结合，使受体三聚化并激活，三聚化的死亡受体通过死亡域(deathdomain)募集衔接蛋白如TRADD和(或)FADD。衔接蛋白通过死亡效应域(deatheffecterdomain，DED)与pro-caspase-8形成复合物，称为死亡诱导信号复合物(death-inducingsignalingcomplex，DISC)。Pro-caspase-8具有弱的催化活性，在DISC 中局部浓度升高，可发生自我剪接并活化。活化的caspase-8释放到胞质中启动caspase
的级联反应，激活下游的效应caspase，导致细胞凋亡。激活的caspase-8能使胞质中的Bid 断裂成tBid，tBid转移到线粒体上，诱导细胞色素C从线粒体释放进人胞质，从而把死亡受体通路和线粒体通路联系起来，有效地扩大了凋亡信号。
2．线粒体／细胞色素C介导的凋亡通路
死亡受体非依赖的凋亡刺激如紫外线和丁辐射、化疗药物、病毒、细菌、细胞因子移除、神经营养蛋白和生长因子缺乏，或从细胞外基质脱离等能引起线粒体细胞色素C释放，作为凋亡诱导因子，细胞色素C能与Apaf-1、pro-caspase-9、ATP／dATP形成凋亡(apoptosome)，凋亡体引起的变构能大大加强caspase-9的活性，活化的caspase-9可激活caspase-3、caspase-6和caspase-7等成员，进而引发caspases级联反应，导致细胞凋亡。此时，一个核心的问题是细胞色素C究竟通过哪一种途径释放到细胞质中?由于大部分凋亡细胞中很少发生线粒体肿胀和线粒体外膜破裂的现象，所以目前普遍认为细胞色素C是通过线粒体PT孔(permeabilitytransitionpore)或Bel-2家族成员形成的线粒体跨膜通道释放到细胞质中的。线粒体PT孔主要由位于内膜的腺苷转位因子(adenine nucleotide transloeator，ANT)和位于外膜的电压依赖性阴离子通道(voltage dependent anion channel，VDAC)等蛋白质所组成。PT孔开放会引起线粒体跨膜电位下降和细胞色素C释放。Bcl-2家族蛋白对于PT孔的开放和关闭起关键的调节作用，促凋亡蛋白Bax等可以通过与ANT或VDAC的结合介导PT孔的开放，而抗凋亡类蛋白如Bcl-2、Bcl-XI。等则可通过与Bax竞争性地与ANT结合，或者直接阻止Bax与ANT、VDAC的结合来发挥其抗凋亡效应。Bcl-2家族的结构和能形成离子通道的一些毒素(如大肠埃希菌毒素)非常相似，插入膜结构中形成较大的通道，允许细胞色素C等蛋白质通过，这可能是细胞色素C释放的另一个途径。
细胞凋亡和细胞增殖与分化同样具有重要的意义，机体内的细胞随着生命过程的进行会不断的衰老、磨损、畸变、过剩，这些无用、衰老的细胞不仅是机体的负担，还可能变为有害细胞，对机体造成威胁，通过凋亡可以将它们清除。因而细胞凋亡是调节生物体正常发育和生命活动的一种不可缺少的机制，该调节一旦失败，可能导致机体疾病、畸形甚至死亡。因此，对“程序性细胞死亡”机理的研究将可能在人类战胜疾病中发挥出重大的作用。
细胞凋亡实验步骤及注意事项 一、实验目的 1、掌屋凋亡细胞的形态特征 2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞与坏死 细胞的方法 二、实验原理 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡与坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界,在生物个体与生存中起着非常重要的作用。它就是细胞在一 定生理条件下一系列顺序发生事件的组合,就是细胞遵循一定规律自己结束生命 的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学与生物化学特征。 在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触,细胞变园,细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网与细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体,凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外,不会影响其它细胞,因而不引起炎症反应。 在生物化学上,多数细胞凋亡的过程中,内源性核酸内切酶活化,活性增加。核DNA 随机地在核小体的连接部位被酶切断,降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳,可显示以180-200bp为基数的DNA ladder(梯状带纹)的特征。 相比之下,坏死就是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期 即丧失质膜完整性,各种细胞器膨胀,进而质膜崩解释放出其中的内容物,引起炎症反应,坏死过程中细胞核DNA虽也降解,但由于存在各种长度不等的DNA片断,不能形成梯状带纹,而呈弥散状。 一些温与的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡,通常这些因素在诱导凋亡的同时,也可产生细胞坏死,这取决于损伤的剧烈程度与细胞本身对刺激的敏感 程度。 三尖杉酯碱(HT)就是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病,急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0、02~5μg/ml范围内作用2小时,即可诱导HL-60细胞凋亡,并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡,同时也有少数细胞发生坏死。用 Hoechst33342与碘化丙啶(propidium iodide,PI)对细胞进行双重染色,可以区别凋亡、坏死及正常细胞。 细胞膜就是一选择性的生物膜,一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时,质膜不完整,PI就进入细胞内部,它可嵌入到DNA或RNA中,使坏死细胞着
细胞凋亡试验常用的方法（MTT法、荧光法、DNA琼脂糖凝胶电泳法与流式细胞仪检测法） （一）药物对肿瘤细胞的抑制效应的MTT法： 用培养基将肿瘤细胞调整至2 X108个/L，在96孔板中每孔加入100ul细胞悬液于37℃、5% CO2下培养过夜。 次日每孔加入不同浓度的药物100mg/L作为试验组，设加完全培养基不加药物的阴性对照，并用功能明确的药物为阳性对照和0.5%的乙醇溶剂对照，每组均设4-6个复孔（平行孔）、37℃、5% CO2继续培养。 培养至12h、24h、48h、实验终止前4-6h加入10ulMTT（5g/L），培养4-6h后，阴性对照孔中已形成明显的蓝紫色颗粒结晶时加100ul/孔SDS-HCl终止反应，于37℃存放过夜。 用酶标仪在A570波长下测吸光度值，按下式计算抑制率 抑制率（%）=（1-试验组平均吸光度值/阴性对照组平均吸光度值）x 100%。 （二）荧光法： 选用上述最佳浓度作用于肿瘤细胞，培养细胞48h后，收货细胞用PBS洗2-3次后用0.4%多聚甲醛室温下固定30min。 弃去固定液，并用PBS洗2次后，用1%Triton X-100作用4min加入适量的0.5mg/L DAPI 荧光染色60min，用PBS冲洗3次，取10ul滴片，干燥后于荧光显微镜下检测断裂的颗粒和片状荧光。 （三）DNA琼脂糖凝胶电泳法： 1、DNA提取： 用大方瓶培养肿瘤细胞，每瓶10ml，细胞浓度为3 x 108个/ml，每隔药物浓度、作用时间均设2瓶，共分3个时间段，4个药物浓度。共培养26瓶细胞。 分别于细胞中加入不同浓度的药物，于37℃、5% CO2中分别培养12h、24h、48h，收货细胞，用PBS洗2-3次。 于-20℃将细胞冷却处理10min后将细胞收集至离心管中，加1ml细胞裂解液，再加蛋白酶K，轻轻振摇使悬液混匀，成黏糊状，50℃过夜。 冷却后加入等体积的饱和酚溶液，混合后10000r/min离心10min，吸出上层水相，移至另一离心管中，再加入等体积饱和酚溶液重复抽提一次，直到无蛋白为止。 吸上清加入氯仿/异戊醇（24：1）按上述方法再抽提一次。 吸取水相层加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠溶液，混匀。 再加入2.5倍体积冷无水乙醇，混合置-20℃处理30min后，10000r/min离心10min，沉淀部分为提供的DNA，弃去无水乙醇后用70%乙醇漂洗2次，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干乙醇。 加入200ulTE缓冲液融解DNA，再加入25ul的RNA酶，置37℃作用30min，置4℃冰箱保存。 2、琼脂糖凝胶电泳： TBE缓冲液配制1.8%琼脂糖凝胶。在微波炉内煮沸至琼脂糖融解，待冷却至60℃时，加入溴化乙锭，使其终浓度为0.5mg/ml，混匀后灌胶。 待凝胶固定后放入含TBE电泳液的电泳槽内，使TBE电泳液盖过凝胶。 取10-15ul提取的各组DNA样品液与上样缓冲液按4：1比例混匀后点样。 60V电泳1h，用紫外透射仪观察梯形条带。
万方数据
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线粒体与细胞凋亡 作者：周艺群， 谷志远， ZHOU Yi-qun， GU Zhi-yuan 作者单位：浙江大学医学院附属口腔医院口腔颌面外科,浙江,杭州,310006 刊名： 解剖科学进展 英文刊名：PROGRESS OF ANATOMICAL SCIENCES 年，卷(期)：2006,12(1) 被引用次数：14次 参考文献(17条) 1.樊廷俊;夏兰;韩贻仁线粒体与细胞凋亡[期刊论文]-生物化学与生物物理学报 2001(01) 2.赵云罡;徐建兴线粒体,活性氧和细胞凋亡[期刊论文]-生物化学与生物物理进展 2001(02) 3.蔡循;陈国强;陈竺线粒体跨膜电位与细胞凋亡[期刊论文]-生物化学与生物物理进展 2001(01) 4.Hortelano S;Dallaporte B;Zamzami N Nitric oxide induces apoptosis via triggering mitochondrial permeability transition[外文期刊] 1997(2-3) 5.Marchetti P;Hirsch T;Zamzami N Mitochondrial permeability transition triggers lymphocyte apoptosis 1996(11) 6.Marchetti P;Castodo M;Susin SA Mitochondrial permeability transition is a central coordinating event of apoptosis[外文期刊] 1996(03) 7.Susin SA;Zamzami N;Castedo M Bcl-2 inhibits the mitochondrial release of an apoptogenic protease [外文期刊] 1996(04) 8.Chou JJ;Li H;Salvesen GS Solution structure of BID,an intracellular amplifier of apoptotic signaling[外文期刊] 1999 9.Ji HB;Zhai QW;Liu XY Transcription regulation of bcl-2gene 2000(02) 10.Tsujimoto Y;Shimizu S Bcl-2 family:Life or death switch 2000(01) 11.Zamzami N;Susin SA;Marchetti P Mitochondrial control of nuclear apoptosis 1996(04) 12.Ruth MK;Ella BW;Douglas RG The release of cytochrome c from apoptosis[外文期刊] 1997(5303) 13.Narita M;Shimizu S;ItoT Bax interacts with the permeability transition pore to induce permeability transition and cytochrome c release in isolated mitochondrial 1998(25) 14.Cosulich SC;Savory PJ;Clarke PR Bcl-2 regulates amplification of caspase activation by cytochrome C[外文期刊] 1999(03) 15.Bossy-Wetzel E;Green DR Caspases induce cytochrome C release from mitochondria by activating cytosolic factors[外文期刊] 1999(25) 16.Sutton VR;Davis JE;Cancilla M Initiation of apoptosis by granzyme B requires direct cleavage of bid,but not direct granzyme B-mediated caspase activation[外文期刊] 2000(10) 17.Stoka V;Turk B;Schendel SL Lysosomal protease pathways to apoptosis.Cleavage of bid,not pro-caspases,is the most likely route[外文期刊] 2001(05) 本文读者也读过(10条) 1.杨胜细胞凋亡机制简述[期刊论文]-科技信息（学术版）2007(26) 2.冯俊奇.李秀兰.白人骁.FENG Jun-qi.LI Xiu-lan.BAI Ren-xiao细胞凋亡机制研究进展[期刊论文]-国际生物医学工程杂志2006,29(1)
细胞凋亡检测技术与方法 点击次数：140 作者：佚名发表于：2008-07-22 08:18转载请注明来自丁香园 细胞凋亡（Apoptosis），又称细胞程序性死亡（PCD：Programmed Cell Death），是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。它是一个主动的，高度有序的，基因控制的，一系列酶参与的过程。细胞凋亡概念提出至今还不到3 0年的时间，但由于它在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键角色，对个体的正常发育及细胞凋亡紊乱在病理学研究中的重要作用，引起了人们对其机制和组分的广泛而深入地研究，成为目前生命科学界最为热门话题之一，也是生命科学界乃至社会各界争相投入的研究领域。从近年的SCI排名中我们可以看到，信号传导方面的文章远远超过位于第二位的人类基因组方面的，而信号传导中一个重要的前沿领域就是细胞凋亡的研究。随着这方面研究的持续升温，涌现出了大量新的技术和方法对细胞凋亡进行检测，其中不少已经有商品化的产品出现，大大加速了研究的进程。具体来说，针对凋亡的不同阶段有以下一些方法： 一、早期检测： 1、PS（磷脂酰丝氨酸）在细胞外膜上的检测： PS从细胞膜内侧转移到外侧在细胞受到凋亡诱导后不久发生，可能作为免疫系统的识别标志。AnnexinV，一个钙依赖性的磷脂结合蛋白，能专一性的结合暴露在膜外侧的PS，再通过简单的显色或发光系统进行检测。由于这是一种凋亡早期的活细胞检测（悬浮细胞和贴壁细胞都适用），可与DNA染料或别的晚期检测方法相结合来标记凋亡的发展阶段。 美国著名生物试剂公司CLONTECH和INTERGEN公司分别开发了多种标记的Annexin V 产品，简便快速，10分钟就可完成检测。其中带荧光标记的Annexin V-EGFP（Enhance d Green Fluorescent Protein）及Annexin V-FITC，灵敏度高，可作为FACS（流式细胞分选）方法筛选凋亡细胞的基础。由于融合蛋白Annexin V-EGFP，EGFP与PS 的结合比例为1：1，还可进行定量检测。除此之外，还提供生物素偶联的Annexin V，可通过常用的酶联显色反应来检测。另外，MACS公司将磁珠包被Annexin V，可采用磁分选方法筛选凋亡细胞。 2、细胞内氧化还原状态改变的检测： 这反应了细胞凋亡研究中相对较新的趋势，研究什么样的氧化还原环境引起下游事件的发生。CLONTECH公司的ApoAlertTM Glutathione Detection Kit通过荧光染料monoc
高中生物细胞凋亡的知识点(一) ［背景知识互动］ 1.人的自然寿命是多少岁？人的寿命的长短与什么有关？ 2.人体每天都有哪些细胞死亡？举例说明。 答案: 1.人的自然寿命是120岁。人的寿命与细胞衰老有直接关系。 2.人体每天死亡的细胞有小肠上皮细胞、皮肤细胞、血红细胞等。知识链接 人体的衰老与细胞的衰老有关。 人体内每天都有大量的细胞死亡。 ［典型例题探究］ 【例1】什么是细胞凋亡？ 解析：高等真核生物的大多数细胞，在丧失生理功能或严重受损时，激活固有的细胞自杀程序而自灭。这一过程称为细胞程序化死亡。细胞凋亡这个词指细胞程序化死亡所表现的生理变化和形态变化，其中包括细胞收缩、膜泡化、染色质浓缩和降解成小片段。 答案：细胞凋亡是指生物体生长发育过程中，由基因控制的，按照一定的程序发生的'细胞死亡，因而细胞凋亡又称为程序性死亡。规律发现 细胞凋亡中的细胞经常降解成为膜包裹的凋亡体，被巨噬细胞或邻近的细胞吞噬或消化，但不产生炎症反应。 【例2】细胞凋亡的大致过程可分为三个阶段，它们是：________、________、 ________。 解析：.细胞凋亡的过程的三个阶段为： 凋亡的起始：细胞皱缩，细胞连接消失，内质网膨胀，染色体固缩并沿着核膜分布，但细胞膜依然完整。 凋亡小体的形成：核膜破裂，染色体断裂为大小不等的片段，与一些细胞器聚集后被内折的细胞膜包围，在细胞表面形成了许多泡状和芽状的突起，这些突起叫做凋亡小体。 细胞的解体：凋亡小体逐渐与细胞分离，脱落至细胞间质，最终被周围的细胞吞噬并消化。 答案：凋亡的起始凋亡小体的形成细胞的解体注意对细胞凋亡过程的掌握。 1
流式检测细胞凋亡 Annexin V检测细胞凋亡 Annexin V (2) 实验原理 (2) 实验用品 (2) 操作步骤 (3) Annexin V Blocking (5) 凋亡细胞的断裂片段分析 (7) DNA 实验原理 (7) 实验用品 (8) 操作步骤 (9) BrdU Flow Kits检测细胞增殖 BrdU Flow (12) 实验原理 (12) BrdU Flow Kits试剂盒 (12) 结果分析 (17) 流式仪器设置指南 (18) 线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22) 实验原理 (22) 实验用品 (22) 样本制备 (23) 结果分析 (24) 注意事项 (24) Active Caspase-3检测细胞凋亡 Active (26) 实验原理 (26) 实验步骤 (27) 结果分析 (28)
A n n e x i n V检测细胞凋亡 实验原理 Annexin V是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由质膜内侧翻向外侧。Annexin V与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA碎片检测比较，使用Annexin V可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-)与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。 实验用品 1. 一次性12×75mm Falcon试管。 2. PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8°C保存。 3. 微量加样器和加样头。
第一节细胞凋亡的生物学意义及其相关基因 对于一个多细胞生物来说，要维持完整性和保持平衡性，凋亡是一个非常重要的生物学过程。多细胞生物的诞生、生长、发育、存活以及死亡，无一不伴随着细胞凋亡过程。 关于细胞增殖能力和寿命是有限的观点。细胞，至少是培养的二倍体细胞，有一定的寿命；它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限，这就是 Hayflick 界限。癌细胞或培养的细胞系是不正常细胞，其染色体数目或形态已经不同于原先的细胞细胞的增殖能力与供体年龄有关。物种寿命与培养细胞寿命之间存在着一定的关系。 一、细胞衰老 二倍体细胞的衰老是由细胞本身决定的。决定细胞衰老的因素在细胞内部，而不是外部的环境；是细胞核而不是细胞质决定了细胞衰老。在机体内，细胞的衰老和死亡是常见的现象，甚至在个体发育的早期也会发生;衰老动物体内，细胞分裂速度显著减慢，其原因主要是G1期明显延长;衰老个体内的环境因素影响了细胞的增殖和衰老; 二、衰老细胞结构的变化 细胞核的变化： 体外培养的二倍体细胞，细胞核随着细胞分裂次数的增加不断增大；细胞核的核膜内折（invagination）、染色质固缩化。 2. 内质网的变化： 衰老动物内质网成分弥散性地分散于核周胞质中，粗面内质网的总量似乎是减少了。 3.线粒体的变化： 通常细胞中线粒体的数量随龄减少，而其体积则随龄增大；致密体的生成：脂褐质，老年色素等。 4.膜系统的变化： 衰老的细胞，其膜流动性降低、韧性减小。衰老细胞间间隙连接减少；细胞膜
内（P面）颗粒的分布也发生变化（减少）三、细胞衰老的分子机理氧化性损伤学说：代谢过程中产生的活性氧基团或分子（ROS---O2-， OH-， H2O2），引发的氧化性损伤的积累，最终导致衰老。 端粒与衰老：发现端粒长度确实与衰老有着密切的关系，提出细胞衰老的“有丝分裂钟”学说（Harley,1990）。 rDNA与衰老: 酵母染色体外rDNA 环的积累，导致细胞衰老。 沉默信息调节蛋白复合物与衰老：复合物存在于异染色质区，其作用在于阻断所在位点DNA转录。. 细胞衰老的分子机理：基因和WRN基因与衰老：SGS1基因和WRN基因同源,编码解旋酶;酵母sgs1突变体寿命明显短于野生型（平均代:代）; wrn突变引发早老症. 2.发育程序与衰老: 线粒体DNA与衰老: Sen-DNA(80年代);mtDNA突变积累与细胞衰老有关 (一)细胞死亡的方式死亡是生命的普遍现象，但细胞死亡并非与机体死亡同步。正常的组织中，经常发生“正常”的细胞死亡，它是维持组织机能和形态所必需的。 细胞死亡的方式通常有3种： ①细胞坏死（necrosis） ②细胞凋亡（apoptosis） ③细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD） 影响因素:化学因素（如强酸、强碱、有毒物质）、物理因素（如热、辐射）、生物因素（如病原体）、坏死细胞的形态改变。 病理过程 酶性消化：参与此过程的酶，如来源于死亡细胞本身的溶酶体，则称为细胞自溶（autolysis）；若来源于浸润坏死组织内白细胞溶酶体，则为异溶（heterolysis）蛋白变性 坏死细胞的形态改变
细胞凋亡检测，细胞凋亡实验步骤，检测方法 一、定性和定量研究 只定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜） 进行定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA 定量琼脂糖凝胶电泳。 二、区分凋亡和坏死 可将二者区分开的方法：琼脂糖凝胶电泳，形态学观察（透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的方法），Hoechst33342/PI双染色法流式细胞仪检测，AnnexinV/PI双染色法流式细胞仪检测等。 不能将二者区分开的方法：原位末端标记法、PI单染色法流式细胞仪检测等。 三、样品来源不同选择 组织：主要用形态学方法(HE染色，透射电镜、石蜡包埋组织切片进行原位末端标记，ELISA或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳)。 四、细胞凋亡检测 1、早期检测: 1) PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测 2)细胞内氧化还原状态改变的检测 3)细胞色素C的定位检测 4) 线粒体膜电位变化的检测 2、晚期检测： 细胞凋亡晚期中，核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在 180-200 bp 的DNA片段。 对于晚期检测通常有以下方法： 1) TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记) 2) LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测) 3) T elemerase Detection (端粒酶检测) 3、生化检测： 1）典型的生化特征：DNA 片段化 2）检测方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记（TUNEL）等 3）TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记） 4）通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP （多为dUTP）间接或直接接到DNA 片段的3’-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。 4、LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测) 当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。通过LM-PCR,连上特异性接头，专一性地扩增梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段。此外，LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，
细胞凋亡检测方法 一、细胞凋亡的形态学检测 1 光学显微镜和倒置显微镜 （1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，全面皱缩，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体，凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 （2）染色细胞： 姬姆萨（Giemsa）染色、瑞氏染色等：正常细胞核色泽均一；凋亡细胞染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态；坏死细胞染色浅或没染上颜色。 苏木素-伊红（HE）染色：细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色（凋亡细胞），正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色，坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有：Hoechst 33342，Hoechst 33258，DAPI。三种染料与DNA 的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，能进入正常细胞膜而对细胞没有太大细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。 DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。 PI和Hoechst33342双标：PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。但PI不能通过正常细胞膜，Hoechst则为膜通透性荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调
亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。 凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。 3 透射电子显微镜观察 凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜内侧，但在细胞凋亡早期，PS可从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面，暴露在细胞外环境中。磷脂酰丝氨酸的转位发生在凋亡早期阶段，先于细胞核的改变、DNA断裂、细胞膜起泡。体内的吞噬细胞可通过识别
A n n e x i n V检测细胞凋亡 实验原理 Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-) 与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。 实验用品 1. 一次性12?75mm Falcon试管。 2. PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8?C保存。 3. 微量加样器和加样头。
4. Annexin V Binding Buffer缓冲液（Cat. No. 66121E）：浓度为 10?，使用时，用稀释为1?浓度的应用液。 5. Annexin V试剂与核酸染料： Annexin V 核酸染料 Annexin V-Biotin（Cat. No. 65872X）Streptavidin-FITC（Cat. No. 13024D） PI（Cat. No. 66211E）或7-AAD（Cat. No. 34321X） Annexin V-FITC（Cat. No. 65874X）PI（Cat. No. 66211E）Annexin V-PE（Cat. No. 65875X）7-AAD（Cat. No. 34321X） 6. FACS流式细胞仪：上样检测。 7. CELLQuest软件：获取和分析试验数据。 8. Annexin V检测对照管： Annexin V A-阴性对照B-补偿1 C-补偿2 Biotin SAv-FITC Annexin V-Biotin 和SAv-FITC PI 和SAv-FITC PE 未染色细胞Annexin V-PE 7-AAD FITC 未染色细胞Annexin V-FITC PI 操作步骤 1.取Falcon 试管，按标本顺序编好阴性对照管和标本管号。 2.使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1?Binding Buffer缓冲液制成1?106 细胞/ml的悬液。 3.Falcon试管中加入100 μl细胞悬液。 4.按以下体积加入Annexin V与核酸染料： 1阴性对照-- 2单阳1 AV-FITC - 4样本AV-FITC PI 5.轻轻混匀，室温（20?C ~25?C）避光处放置15分钟。
细胞凋亡及相关因素的研究进展 论文摘要：细胞凋亡(Apoptosis)是一种生理性死亡Physiogicalcell death，PCD)，是细胞对内外信息刺激的 应答反应，[1]它与细胞的生长、分化一样．属于最基本的 细胞学事件或过程．它决定着生物体的基本特征和转归．是胚胎发生和个体发育中清除细胞以维持细胞数目正常的调 节机制。 [2]当组织细胞发生异常调亡时，即可引起疾病的发生。一般来讲．凋亡过多会引起退行性变或早衰，调亡过少．易诱发肿瘤。[3] 因此，细胞凋亡近年来引起生命科学研究领域的广泛关注。本文仅就细胞调亡的概念及相关因素作一简要的概述。 【Summary】 Apoptosis is a kind of Physiogicalcell death and a reaction of cells to around informations stimulate .[1] It is same as cells’ growth and differentiation which belong to the basic cell subject’s incident or process.it decide living things’essential character- Istics ,and used to clear away cells to keep it rgular number’s regulation mechanism in the procees of embryo occur and individual growth.[2]there will couse ill- Ness when the organization cells come into being particularly apoptosis .Generally speaking ,more cell
细胞凋亡与疾病 细胞凋亡指机体细胞在发育过程中或在某些因素作用下，通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡。细胞凋亡对胚胎发育及形态发生组织内正常细胞群的稳定、机体的防御和免疫反应、疾病或中毒时引起的细胞损伤、老化、肿瘤的发生进展起着重要作用[1]。自1972年Kerr提出细胞凋亡这一概念后，从20世纪80年代末期开始成为肿瘤病因学、病理学研究热点，近几年的研究在凋亡信号转导途径、细胞凋亡的生化反应机制及细胞凋亡的调控基因，细胞凋亡与疾病的关系等方面都取得了显著的进展[2]。文章就细胞凋亡与疾病的关系进行综述。 1、概述 早在1972年，Kerr等已发现从细胞形态、超微结构和生化变化等方面来分析，细胞有两种死亡形式：一种是早被熟知的细胞坏死(Necrosis)，另一种是细胞凋亡(Apoptosis)[3]。 1.1概念 凋亡(apoptosis)一般是指机体细胞在发育过程中或在某些因素作用下，通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡(programmed cell death)。一般表现为单个细胞的死亡，且不伴有炎症反应。细胞凋亡又称程序性细胞死亡(PCD)，指的是细胞将自身裂解为许多膜小泡的一种精
确调节的细胞死亡过程，是有机体为保持自身组织稳定、调控自身细胞的增殖和死亡之间的平衡、由基因控制的细胞主动性死亡，一种正常的生理过程[4]。细胞凋亡参与调节机体细胞生长与更新间的平衡稳定，在机体发育过程中和成年机体新陈代谢中都起着重要作用。但近年来的研究表明，细胞凋亡还与多种疾病(如发育畸形、神经退化症、自身免疫性疾病、肿瘤、艾滋病等)的发生发展有关，从而使细胞凋亡研究成为生命科学研究的热点之一[5]。 2、细胞凋亡的形态学和生化特征 2.1 形态学特征 细胞凋亡时伴随着细胞膜表面、细胞质和核的一系列形态学改变，首先出现细胞体缩小、胞核固缩、胞浆密度增高，继而胞膜内陷将细胞自行分割为多个有膜包绕的凋亡小体(apoptotis bodies)。凋亡小体几乎立即被邻近的吞噬细胞所吞噬。吞噬细胞内的凋亡小体能停留数小时，可借助组织切片染色用光学显微镜观察[6]。在凋亡发生的全过程中，细胞膜一直保持完整。胞内容物不释放出来，所以不引起周围的炎症反应。同一组织中，不同细胞发生凋亡的过程并不同步[7]。 2.2生化特征 细胞凋亡时，早期Ca2+内流引起胞质中Ca2+浓度持续升高，激活了Ca2+依赖性核酸内切酶，于180碱基对处将DNA 切断，胞质内蛋白质发生交联，产生单个核小体和穴聚核小
细胞凋亡的几种检测方法 1、形态学观察方法 （1）HE（苏木精—伊红染色法）染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。 （2）丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （3）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。 （4）透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 2、DNA凝胶电泳 细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发
生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带 3、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定 凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。 检测步骤 1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体； 2、在微定量板上吸附组蛋白体’ 3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘ 4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’ 4、加酶的底物，测光吸收制。 用途 该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，
流式检测细胞凋亡 Annexin V 检测细胞凋亡 (2) 实验原理 (2) 实验用品 (2) 操作步骤 (3) Annexin V Blocking (5) 凋亡细胞的DNA 断裂片段分析 (7) 实验原理 (7) 实验用品 (8) 操作步骤 (9) BrdU Flow Kits 检测细胞增殖 (12) 实验原理 (12) BrdU Flow Kits 试剂盒 (12) 结果分析 (17) 流式仪器设置指南 (18) 线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22) 实验原理 (22) 实验用品 (22) 样本制备 (23) 结果分析 (24) 注意事项 (24) Active Caspase-3 检测细胞凋亡 (26) 实验原理 (26) 实验步骤 (27) 结果分析 (28)
Annexin V 检测细胞凋亡 实验原理 Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-) 与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。 实验用品 1. 一次性12×75mm Falcon试管。 2. PBS缓冲液：含0.1%NaN ，过滤后2-8°C保存。 3 3. 微量加样器和加样头。
流式双染测凋亡原理、步骤和结果判断 一、原理： 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35～36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC）标记，以标记了荧光素（FITC）的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够穿透细胞膜而使细胞核红染，所以PI主要检测坏死或中晚期调亡细胞（二者的膜都发生了破裂）。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将早期凋亡细胞和中晚期以及坏死细胞区分开来。 二、步骤： 1、无菌条件下获取新鲜的肝组织，置于事先消毒好的200目不锈钢细胞筛网上，下接50ml小烧杯。用眼科剪把组织剪成小块，眼科镊去除小血管及结缔组织，用玻璃棒轻轻研磨组织，使细胞脱落。待研磨充分后，用5％预冷的RPMI-1640液冲洗，收集小烧杯中单细胞悬液，随后以500-1000r/min离心5min ,弃上清。重悬、离心洗涤2次 ,以获得较纯化的肝细胞。将肝细胞悬液取样在光镜下用血细胞计数板计数，调节细胞数目至1×106 ∕ml。 2、取1ml单细胞悬液，用预冷的PBS洗涤两次，然后加入1×结合缓冲液1ml重悬细胞。 3、取100ul加入到5ml的培养管中，加入5ulFITC标记的Annexin-V和5ul PI，
细胞凋亡和细胞坏死的区别 高考频度：★★★☆☆难易程度：★★☆☆☆ 典例在线 脑缺氧、心缺血、急性胰腺炎、动脉粥样硬化等疾病都是由细胞坏死引起的。近日，厦门大学生命科学学院韩家淮教授课题组的一项研究表明，存在于人体内的一种名为RIP3的蛋白激酶，能够将细胞凋亡转换成细胞坏死，通过调控这种酶的合成，就可以调控细胞的死亡方式。下列有关叙述错误的是 A．从以上分析可知细胞坏死过程中存在基因的选择性表达 B．一些细胞的坏死对人体也有益处，比如被病原体感染的细胞在免疫系统的作用下死亡 C．抑制RIP3的活性，能在一定程度上对急性胰腺炎起治疗、防御的作用 D．在人体的癌细胞中，也可能存在控制RIP3合成的基因 【参考答案】B 基因都是一样的，D正确。 学霸推荐 1．下列有关细胞凋亡、坏死与癌变的说法，正确的是 A．细胞坏死常引起炎症；细胞癌变，代谢增强 B．细胞凋亡受基因控制；细胞癌变不受基因控制 C．细胞坏死，膜的通透性降低；细胞癌变，膜的黏着性增强 D．细胞癌变，细胞周期延长；细胞凋亡，细胞周期变短 2．下列关于细胞凋亡和细胞坏死的叙述中，错误的是 A．细胞凋亡是主动的，细胞坏死是被动的 B．细胞凋亡是生理性的，细胞坏死是病理性的 C．细胞凋亡是由基因调控的，细胞坏死是由外界因素引起的 D．细胞凋亡是急性的，细胞坏死是慢性的 3．下列实例不属于细胞凋亡的是 A．清除被病原体感染的细胞 B．骨折时造成的细胞死亡
C．成熟生物体中细胞的自然更新 D．人体内红细胞的正常死亡 4．细胞凋亡也称为细胞编程性死亡，其大致过程如图所示。下列有关叙述错误的是 A．细胞皱缩、染色质固缩表明细胞处于衰老状态 B．图示过程只发生在胚胎发育过程中 C．吞噬细胞吞噬凋亡小体与细胞膜的流动性密切相关 D．细胞凋亡是由遗传物质控制的，与细胞坏死有明显区别 5．香烟中含有大量的有害物质，如尼古丁等会造成吸烟者肺部细胞的死亡。这种细胞的死亡过程属于A．生理性死亡B．正常衰亡 C．细胞坏死D．细胞凋亡 答案 1．【答案】A 【解析】细胞坏死常引起炎症反应，以清除坏死细胞；细胞癌变时，具有无限增殖能力，代谢增强，A 正确；细胞癌变是原癌基因和抑癌基因突变的结果，导致细胞受突变后的基因的控制，B错误；细胞癌变后，细胞表面的糖蛋白减少，细胞的黏着性降低，C错误；细胞癌变后，分裂增殖失控，细胞周期变短，D错误。 2．【答案】D 3．【答案】B
线粒体与细胞凋亡 苑金香(潍坊学院生物系山东潍坊261043) 摘要 细胞凋亡是一种由基因控制的自主性死亡过程。近年来研究发现,线粒体在细胞凋亡过程中起重要作用,它可以通过改变膜通透性、释放凋亡活性物质等介导细胞凋亡。 关键词 线粒体 细胞凋亡 线粒体作为真核细胞能量代谢中心已为人熟知,然而近年来的研究发现,线粒体在细胞的另一重要生理活动 细胞凋亡中还扮演着重要角色。细胞凋亡即细胞程序性死亡(programmed cell death),是一种由基因编程调控的细胞主动自杀过程,细胞凋亡在胚胎发育、机体内环境的稳定、细菌和病毒感染细胞的清除过程中起重要作用,许多疾病的发生与细胞凋亡失控有关,而线粒体在细胞凋亡过程中起着重要作用。 1 线粒体膜的通透性改变与细胞凋亡 线粒体起着启动细胞凋亡的重要作用,其主要机制与线粒体渗透性转换孔(mitochondrial permeability transi tion pore,mtPTP)开放有关,mtPTP位于线粒体内膜和外膜的交界处,是一种由多种蛋白组成的复合体。mtPTP参与调节线粒体基质中的Ca2+、pH值电荷等,维持线粒体内环境的稳定性,保持氧化还原通路的畅通。mtPTP平时允许不大于0.15 104的小分子物质通过。当线粒体内Ca2+超载、自由基对线粒体膜造成氧化损伤,或者是能量产生下降时,均可引起mtPTP开放。在细胞凋亡发生早期,线粒体膜mtPTP打开,线粒体内膜电位( m)降低,一方面使得线粒体内的死亡促进因子(deathe-promoting factor,DPF)释放出来,促进凋亡的进行;另一方面,又使得细胞质进入线粒体基质,由此引起膜质子的转运异常,导致线粒体处于高渗状态,线粒体基质扩张,细胞骨架蛋白受压,直接导致细胞凋亡。 2 线粒体释放物与细胞凋亡 研究发现,线粒体内含有许多促死亡因子,包括细胞色素C,凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF),胱冬酶原及其他线粒体蛋白等。这些因子从线粒体中释放出来以后,以不同的方式参与到细胞凋亡的过程,影响细胞凋亡的进程。 2.1 细胞色素C的释放与细胞凋亡 1996年德克萨斯西南医学院研究中心王晓东研究小组发现细胞色素C参与细胞凋亡的过程。当细胞受凋亡信号刺激后,细胞色素C能迅速从线粒体释放到胞浆中,在细胞色素C含量丰富的细胞中,细胞将进入快速凋亡机制,释放出来的细胞色素C参与激活凋亡的酶通路,细胞内仍有许多未释放的细胞色素C,它们维持电子传递和有氧呼吸,从而产生足够的ATP,为细胞凋亡提供足够的能量。而在细胞色素C含量较少的细胞中,由于细胞色素C的大量释放,使电子传递链受阻,ATP产量骤减,无法提供足够的能量,因而使细胞走向与凋亡完全不同的坏死过程。 72h,凋亡细胞数从6.65%增加到16.42%;若处理96h 后,凋亡细胞数从4.71%增加到21.94%,这说明染料木黄酮可诱导前裂腺癌细胞的凋亡,通过这种办法可预防前列腺癌的发生。 另外,许多不同种类的化学物质(如亚硝胺类、杂环胺类、多环氮氢化物和糖醛核呋喃等)、外界微生物的侵袭、高温和放射线等化学的、物理的和生物的因素是影响癌细胞的生长和凋亡的外源性调节因素。还有一些常规使用的肿瘤化疗药物(如顺铂、维甲酸、羟基脲等)和 射线都可诱导多种肿瘤细胞凋亡。 4 结论 在正常机体内,细胞增殖和细胞凋亡处于一种动态平衡。故癌的发生和细胞的生与死密切相关。一方面,细胞的过度增殖导致了癌的发生,一些化学预防剂抑制癌发生的一个重要机制就是抑制细胞增殖;另一方面,细胞凋亡过程的失调也是癌发生的另一原因。研究细胞凋亡与癌发生的关系,进而诱导细胞凋亡对癌的预防具有重要的意义。 参考文献 1 Davis JN et al.Nutr Cancer,1998,32:123 131. 2 Li M et al.Cancer Epidemiol Biom Prev,2000,9(6):545 550. 3 方福德等.分子生物学前沿技术.北京医科大学、中国协 和医科大学联合出版社,1998,76 174. 4 贾旭东.细胞增殖和细胞凋亡和癌的发生和预防.国外 医学卫生学分册,2001,28(2):65 68. (B H) 17 2003年第38卷第5期 生 物 学 通 报