实验2灰色链霉菌的活化
一、实验目的
学习制备高氏一号斜面培养基的方法以及斜面接种技术。
二、实验原理
高氏一号斜面培养基是一种合成培养基，用于培养放线菌。
三、实验试剂与仪器
1. 菌种：灰色链霉菌；
2. 培养基：可溶性淀粉20g，硝酸钾1 g，氯化钠0.5 g，磷酸氢二钾0.5 g，硫酸镁0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，琼脂20 g，水1000毫升，PH7.2—7.4（配制时注意，可溶性淀粉要先用冷水调匀后再加入到以上培养基中）；
3. 器材：天平、500mL刻度量杯、小刀、牛角匙、玻棒、纱布、18mL×180mL试管、棉花、电炉、烧杯、记号笔、酒精灯、接种环等。
四、实验步骤
1. 高氏一号培养基的制备
（1）按配方称量药品，加热搅拌至琼脂完全熔化，补水至1000mL。趁热分装于
18mL×180mL试管，斜面以8mL为宜。
（3）分装完毕后，塞好棉塞并将试管捆扎好。高压蒸汽灭菌：121℃灭菌20min，灭菌后趁热摆斜面。
2. 斜面接种
接种是将纯种微生物，在无菌操作条件下，移植到已灭菌并适宜该菌生长繁殖所需要的培养基中。为了获得微生物的纯种培养，要求接种过程中必须严格进行无菌操作。一般是在无菌室内，超净工作台或实验台酒精灯火焰旁进行。
（1）左手拿试管菌种，右手拿接种环，先将金属环烧灼灭菌，再将接种环在空白培养基处冷却，挑取菌落，在火焰旁稍等片刻。
（2）左手将试管菌种放下，拿起斜面培养基。在火焰旁用右手小指和手掌边缘拔下棉塞并夹紧，迅速将接种环伸入空白斜面，在斜面培养基上轻轻划线，将菌体接种于其上。划线时由底部向上划一直线，一直划到斜面的顶部。注意勿将培养基划破，不要使菌体沾污管壁。
（3）灼烧试管口，在火焰旁将棉塞塞上。接种完毕，接种环上的余菌必须灼烧灭菌后才能放下。
（4）斜面置于28℃恒温箱中，培养5～6d观察结果。
实验3 灰色链霉菌的摇瓶种子制备
一、实验目的
学习制备摇瓶种子培养基的方法以及种子扩大培养技术。
二、实验原理
种子扩大培养简称种子扩培，是发酵工程的一个组成部分，其指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。其目的首先是出于接种量的需要与菌种的驯化，同时对于缩短发酵时间、保证生产水平也有帮助。
种子扩培的一般过程是：
斜面菌种→ 一级种子培养（摇瓶）→ 二级种子培养(种子罐) → 发酵
对于种子制备过程，其大致可区分为实验室阶段和生产车间阶段，前期不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此将这一培养过程称为实验室阶段的种子培养。而后期种子培养在种子罐里面进行，一般在工程上归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。并非所有的种子扩大培养都采用从摇瓶到种子罐的二级发酵模式，其实际发酵级数受到发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响。
摇瓶培养技术问世于本世纪30年代，由于其简便、实用，广泛用于微生物菌种筛选、实验室大规模发酵试验、种子培养等。摇瓶培养设备主要有旋转式摇床和往复式摇床两种类型，其中以旋转式最为常用。振荡培养中所使用的发酵容器通常为三角烧瓶，也有使用特殊类型的烧瓶或试管。振荡培养技术通常用于微生物菌种的筛选或生产工艺的改良和工艺参数的优化。
在摇瓶培养过程中振荡的目的在于改善活细胞的氧气和营养物的供给。摇瓶培养通常以特定生长条件下的培养物接种，也可用孢子接种。振荡培养是建立深层发酵的开始，就一特定微生物而言，振荡培养时存在一最佳培养基配方和最佳培养基容量。细胞或孢子接种浓度对试验的成功极为重要，不同的微生物细胞或孢子以及不同的振荡培养过程的接种浓度差异可能是十分显著的，且各自存在一最适浓度。
三、实验试剂与仪器
1. 菌种：灰色链霉菌（由实验二活化得到）；
2. 培养基：豆饼粉20g、淀粉40g、酵母膏5g、蛋白胨5g，硫酸铵3g，硫酸镁
0.25g，磷酸二氢钾0.2g，碳酸钙4g，自来水1000mL、pH7.2-7.4。
3. 器材：天平、500mL刻度量杯、小刀、牛角匙、玻棒、纱布、250mL三角瓶、棉花、电炉、烧杯、记号笔、酒精灯、接种环等。
四、实验步骤
1. 摇瓶种子培养基的制备
取干净三角烧瓶，250ml三角瓶分装培养基30-50ml，用棉塞包扎瓶口，再加牛皮纸包扎，在0.1MPa下灭菌45-60min。
2. 接种
将活化的菌种斜面，在无菌的条件下，注入10mL无菌水，震荡成孢子悬浮液（孢子浓度约为8×104个/mL）。待发酵培养基灭菌后冷却到28℃时，分别将孢子悬浮液接入三角瓶中，接种量为2mL，标好记号。
3. 培养与观察
28℃、200r/min旋转式摇床培养24h，观察菌丝体形态及浓度。
实验4 灰色链霉菌摇瓶发酵
一、实验目的
学习和掌握摇瓶发酵培养的原理和方法。
二、实验原理
链霉素是一种从灰链霉菌的培养液中提取的抗菌素，属于氨基糖甙碱性化合物，它与结核杆菌菌体核糖核酸蛋白体蛋白质结合，起到了干扰结核杆菌蛋白质合成的作用，从而杀灭或者抑制结核杆菌生长的作用。
链霉素是含有链霉胍的氨基糖苷类抗生素族中的主要成员，由链霉胍、链霉糖和N－甲基-L-葡萄糖胺构成的糖苷，其结构式如下。链霉素中链霉糖部分的醛基被还原成伯醇基后，就成为双氢链霉素，它的抗菌效能和链霉素大致相同，目前临床上使用的是链霉素或双氢链霉素的硫酸盐。
生产过程分为两大步骤：①发酵，将冷干管或沙土管保存的链霉菌孢子接种到斜面培养基上，于27℃下培养7天。待斜面长满孢子后，制成悬浮液接入装有培养基的摇瓶中，于27℃下培养45～48小时待菌丝生长旺盛后，取若干个摇瓶，合并其中的培养液将其接种于种子罐内已灭菌的培养基中，通入无菌空气搅拌，在罐温27℃下培养62～63小时，然后接入发酵罐内已灭菌的培养基中，通入无菌空气，搅拌培养，在罐温为27℃下，发酵约7～8天。②提取精制，发酵液经酸化、过滤，除去菌丝及固体物，然后中和，通过弱酸型阳离子交换树脂进行离子交换，再用稀硫酸洗脱，收集高浓度洗脱液──链霉素硫酸盐溶液。洗脱液再经磺酸型离子交换树脂脱盐，此时溶液呈酸性，用阴离子树脂中和后，再经活性炭脱色得到精制液。精制液经薄膜浓缩成浓缩液，再经喷雾干燥得到无菌粉状产品，或者将浓缩液直接做成水针剂。
三、实验试剂与仪器
1. 菌种：灰色链霉菌摇瓶种子（由实验三获得）
2. 摇瓶发酵生产培养基：水解糖160g、尿素5g（单独灭菌）、MgSO40.5g、
Na2HPO41.6g、玉米浆25~35g、FeSO4和MnSO4各20mg/L，消泡剂0.3g，，水1000mL，pH7.2。
3. 仪器：500m1三角烧瓶、旋转式摇床等。
四、实验步骤
1. 摇瓶发酵培养基的制备
取干净三角烧瓶，250ml三角瓶分装培养基30ml，用8层纱布包扎瓶口，再加牛皮纸包扎，在115℃下灭菌20min。
2. 接种
待发酵培养基灭菌后冷却到30℃时，按接种量8%~10%进行接种。
3. 培养与观察
32℃、100r/min旋转式摇床培养36h~40h，发酵过程中，补加灭菌尿素以增加氮源，维持pH值。
五、思考题
1. 观察菌丝形态，用试纸测发酵液的pH值，并补加灭菌尿素。
2. 试举例说明摇瓶培养技术的应用。
实验5 灰色链霉菌发酵产物活性测定
一、实验目的
学习和掌握抗生素抑菌性能的测定方法。
二、实验原理
抗生素是一种生理活性物质，它对生命现象很敏感，可以用抗生素的生物效能表示它的效价，其最小效价单元就叫做“单位”(U)。经由国际协商规定出来的标准单位，称为“国际单位”(IU)。通常各种抗生素的单位，是根据国家抗生素标准品测定出来的，是衡量药物有效成份的一种尺度。
抗生素的剂量常用重量和效价来表示。化学合成和半合成的抗菌药物都以重量表示，生物合成的抗生素以效价表示，并同时注明与效价相对应的重量。效价是以抗菌效能(活性部分)作为衡量的标准，因此，效价的高低是衡量抗生素质量的相对标准。
理论效价是指抗生素纯品的重量与效价单位的折算比率。一些合成、半合成的抗生素多以其有效部分的一定重量（多为1μg）作为一个单位，如链霉素、土霉素、红霉素等均以纯游离碱1μg作为一个单位。少数抗生素则以其某一特定的盐的1μg或一定重量作为一
个单位。如链霉素碱为1000单位/mg，链霉素硫酸盐为798单位/mg，金霉素和四环素均以其盐酸盐纯品1μg为1单位，青霉素则以国际标准品青霉素G钠盐0.6μg为1单位。
抗生素的效价常采用微生物学方法测定，它是利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性的原理来测定抗生素效价的方法，如管碟法（cylinder plate method）。管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（内径 6.0±0.lmm，外径8.0±0.lmm，高10±0.lmm），管内放人标准品和检品的溶液，经16~18小时恒温培养，抗生素扩散的有效范围内则产生透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。抑菌圈直径大小与抗生素浓度相关，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。抗生素效价常采用二剂量法。将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比例（2:1或4:1）的两种溶液，在同一平板上比较其抗药活性，再根据抗生素浓度对数和抑菌圈直径成直线关系的原理来计算供试品效价。取含菌层的双层平板培养基，每个平板表面放置4个小钢管，管内分别放入检品高、低剂量和标准品高、低剂量溶液。
本法的优点是灵敏度高，需用量小，测定结果较直观，测定原理与临床应用的要求一致，更能确定抗生素的医疗价值；而且使用范围广，较纯的精制品、纯度较差的制品、已知的或新发现的抗生素均能应用；对同一类型的抗生素不需分离，可一次测定其总效价，是抗生素药物效价测定的最基本方法。
三、实验试剂与仪器
1. 测定用指示菌：枯草芽孢杆菌[CCMCC(B) 63 501]
2. 仪器：分光光度计、离心机、培养箱、水浴锅、高压蒸汽灭菌锅、牛津小杯（不锈钢小管，内径6.0±0.lmm，外径8.0±0.lmm，高10±0.lmm）、培养皿等。
3. 培养基
（1）传代用培养基（用于枯草芽孢杆菌菌传代和保藏）：蛋白胨10g，牛肉膏
3.0g，氯化钠5.0 g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH7.2-7.5。
（2）生物测定用培养基（培养基I）
蛋白胨5g，牛肉浸出粉3g，琼脂15~20g，磷酸氢二钾3g ，蒸馏水1000mL，除琼脂外，混合上述成分，调节PH值使比最终的pH值略高0. 2-0.4，加人琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为7. 8?8. 0，在115℃，灭菌30分钟。
4. 试剂
（1）标准链霉素（标准品理论计算值为798.3u/mg）：0.6~1.6单位/mL
（2）0.85%NaCl溶液（生理盐水）100mL。
（3）1%pH7.8磷酸缓冲液：取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加水使溶解成1000ml，即得。
四、实验步骤
1枯草芽孢杆菌菌悬液的制备
将枯草芽孢杆菌接种于营养琼脂培养基斜面，在35~37℃培养7天，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上。用无菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。
2 上层培养基的准备
将已灭菌的生物测定用培养基100mL，融化后放入50℃恒温水浴中，待温度平衡后，加入枯草芽孢杆菌菌悬液5mL，充分摇匀，备用。
3 平板的制作
取灭菌培养皿，每皿用大口移液管吸入50℃左右的测定培养基20mL，水平放置，待凝固后用大口移液管吸入上层培养基5mL，将培养皿来回倾侧（要迅速），使含菌上层培养基均匀分布，凝固后备用，双碟不得少于4个。
4 放置小钢管
放置小钢管时，注意管与管之间不能太靠近，否则会引起相邻的两个抑菌圈之间的抗生素扩散区中的浓度增大，相互影响形成卵圆形或椭圆形抑菌圈。管与双碟边缘同样也不能太靠近，因为液面浸润作用，边缘的琼脂培养基菌层为非平面，会影响抑菌圈的形状。可在试验前在双碟的底上用尺测量，作好标记，试验中可以按照双碟底面标记放置小钢管，避免放置位置不恰当产生的问题。小钢管放置时，要小心地从同一高度垂直放在菌层培养基上，不得下陷，不得倾斜，不能用悬空往下掉的方法。放置之后，不能随意移动，要静置5min，使之在琼脂内稍下沉降稳定后，再开始滴加抗生素溶液。
5 滴加抗生素溶液
滴加抗生素要按照SH→TH→SL→TL（二剂量法，S代表标准品，T代表供试品，H 代表高浓度，L代表低浓度）的顺序滴加，在一双碟对角的2个不锈钢小管中分别滴装高浓度及低浓度的标准品溶液，其余2个小管中滴装相应的高低两种浓度的供试品溶液；高低浓度的剂距为2:1或4:1。液面应该与小钢管管口齐平，液面反光呈黑色。（抗生素液体加入量不能按滴计算，即使同一滴管，每滴的量也有差异。）如果抗生素溶液滴加过满，可以用无菌滤纸片小心吸去多余部分。
6 双碟中菌株的培养
滴加了抗生素溶液后的双碟忌震动，要轻拿轻放。在搬运到培养箱的过程中，可以预先在培养箱中垫上报纸铺平，再把双碟连同垫于桌上的玻璃板小心运至培养箱，缓慢推入箱内。双碟在35℃~37℃下培养约14~16h。时间太短会造成抑菌圈模糊，太长则会使菌株对抗生素的敏感性下降，在抑菌圈边缘的菌继续生长，使得抑菌圈变小。在培养过程中，如果温度不均匀（过于接近热源），会造成同一双碟上细菌生长速率不等，使抑菌圈变小或者不圆。所以把双碟放入培养箱时，要与箱壁保持一定的距离，双碟叠放也不能超过3个。培养中，箱门不得随意开启，以免影响温度。应经常注意温度，防止意外过冷过热。
7 抑菌圈测量
7.1 试验结果中抑菌圈直径不应该过大或者过小，在试验之前，可以先做一个关于用不同浓度菌液配制的琼脂培养基菌层预试验，选择抑菌圈直径在18～22mm的菌液浓度为试验用浓度（菌液浓度约为106个/mL）。批量试验中后期，菌液保存的时间过久，菌株就会逐渐衰亡，生长周期不一致，影响其对抗生素的敏感度，导致抑菌圈变大、模糊或者出现双圈。如若菌株不纯，也会造成这样的结果。因此，菌液在使用一段时间后，可以重新配制纯化或者减小原来菌液在使用中的稀释倍数。
7.2 用游标卡尺测量抑菌圈直径，可以在双碟底部垫一张黑纸，在灯光下测量。不宜取去小钢管再测量，因为小钢管中残余的抗生素溶液会流出扩散，使抑菌圈变得模糊。不能把双碟翻转过来测量抑菌圈直径，因为底面玻璃折射会影响抑菌圈测量的准确度。记录测量结果后进行效价计算。
五、思考题
1．为什么抗生素发酵常产用孢子接种？
2. 抗生素发酵与酒精发酵相比，在细胞生长和发酵动力学、发酵技术以及发酵过程等方面有何异同？
生物制药考试重点 第一章 药物是用于预防、诊断、治疗人的疾病。改善生活质量和影响人体生物学进程的物质。药物可分为化学药物、中药、生物药物三大类。P1 生物药物是指利用生物体、生物组织或其成分、综合应用多门学科的原理和方法进行加工、制造而成的一大类药物。P1 天然生化药物是指从生物体（动物、植物和微生物）中获得天然存在的生化活性物质。 抗生素是指由生物（包括微生物、植物和动物）在其生命过程中所产生的一类在微量浓度下就能选择性地抑制他种生物或细胞生长的生理活性物质及其衍生物。P2 生物制品，一般指的是用微生物及其代谢产物、原虫、动物毒素、人或动物的血液或组织等直接加工制成，或用现代生物技术方法制备的，用于预防、治疗、诊断特定传染病或其他有关疾病的药品。P3 自1982年重组人胰岛素投放市场以来，利用基因工程开发生物药物已经成为一个重要的发展方向。P4 1989年我国研发出第一个拥有自主知识产权的生物医药产品——重组人干扰素a-1b。（细胞因子）P5 生化制药主要是从动物、植物、微生物和海洋生物中提取、分离、和纯化生物活性物质，加工制造成为生化药物。天然的生化药物包括氨基酸、多肽、蛋白质、核酸、酶和辅酶、糖类、脂类药物等。P5 微生物制药是以发酵工程技术为基础、利用微生物代谢过程生产药物的制备技术。微生物制药生产的药物包括抗生素、酶抑制剂、免疫调节剂以及维生素、氨基酸、核苷酸等。P5 生物技术制药是利用现代生物技术（包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程和蛋白质工程等），生产多肽、蛋白质、酶和疫苗、单克隆抗体等。P5 迄今为止，已上市的基因工程药物多数以E.coli表达系统生产，其次是酿酒酵母和哺乳动物细胞（中国仓鼠卵细胞CHO和幼仓鼠肾细胞BHK）。P6 第二章 生物活性物质的制备技术很多，主要是利用它们之间特异性的差异，如分子大小、形状、酸碱度、极性、溶解度、电荷和对其他分子的亲和性等建立起来的。P9 传统的生化制药的基本工艺过程可分为：材料的选择和预处理，组织与细胞的破碎及细胞器的分离，活性物质的提取和纯化，活性物质的浓缩、干燥和保存。P9 细胞破碎后，一般采用差速离心方法分离细胞内质量不同的细胞组分，沉降于离心管内不同区域，分离后即所得所需组分。P14 某一物质在溶剂中的溶解度大小与该物质的分子结构及所使用的溶剂的理化性质有密切关系，一般遵循“相似相溶”的原则。P14 提取的原则是“少量多次”，即对于等量的提取溶液，分多次提取比一次提取的效果好得多。P14 生物活性物质的初步分离与纯化，一般采用沉淀分离法，即通过改变某些条件或加入某种物质，使溶液中某种溶质的溶解度降低，从而从溶液中沉淀析出。沉淀分离法包括盐析沉淀、等电点沉淀和有机溶剂沉淀等。P15 一般的透析时间是24h，每小时换水一次，整个过程在4.o C下进行。P16 电泳技术既可用于分离各种生物大分子，也可用于分析某种物质的纯度，还可用于相对分子质量的测定。P17 常用的干燥方法是真空干燥和冷冻干燥。P18
生物发酵工程实验 实验一................................ 利用酵母富集培养基分离酵母菌 实验二... ......................... 分离纯化酵母菌 实验三... ......................... 酵母菌的保藏 实验四............................... 大肠杆菌生长曲线测定及pH对生长曲线 的影响 实验五.............................. 发酵罐的构造及操作 实验六.............................. 发酵罐实灌灭菌操作 实验七.............................. 利用7L发酵罐对地衣芽孢杆菌进行补 料分批发酵培养 实验八..............................淀粉酶生成曲线的测定
实验一、利用酵母富集培养基分离酵母菌 一实验目的 1、通过本实验加深理解酵母富集培养基的原理和应用； 2、掌握涂布分离技术； 3、熟悉从自然样品土壤中分离酵母菌的具体操作方法 二实验原理 酵母菌主要分布于含糖高和酸度较高的自然环境中，在果园表土和浆果、蔬菜、花蜜和蜜饯等的表面很容易找到它们。在土壤中，由于各种微生物混杂在一起且酵母菌的数量相对比较少，故可以利用酵母菌富集培养基进行富集培养，该培养基含有较高的葡萄糖（5%）和较酸（pH为4.5）的环境，以及能抑制多种杂菌（许多细菌、放线菌和快速生长霉菌）的孟加拉红（玫瑰红），故十分有利于酵母菌的增值。 三实验材料 土壤（标注采集地点） 培养基：酵母富集培养基（5%葡萄糖、0.1%尿素、0.1%硫化铵、0.25%磷酸二氢钾、0.05%磷酸氢二钠、0.1%七水合硫酸镁、0.01%七水合硫酸铁、0.05%酵母膏、0.003%孟加拉红、1.9%琼脂 pH4.5） 移液枪、培养皿、天平、涂布棒、棉绳、250ml三角瓶、75%酒精棉花、摇床等 四实验步骤 1、采集土样：采集葡萄园或其他果园、菜地等的土壤若干（要求：先铲去2~3cm 的表土，再采集土样）适当研碎。 2、称取1g土样装入准备好的30/250ml蒸馏水中震荡均匀。 3、准备平板：将酵母菌富集培养基加热融化，待冷却至50℃左右后，倒2个平板，冷却待用。 4、用移液枪吸取200ul样品，用涂布法分离菌种。 5、恒温培养：将培养皿倒置后防于37℃恒温培养箱中培养2d。 五结果记录 将土壤来源，平板上得到的菌落特征和菌落数做表记录 六思考题 酵母菌富集培养基中为什么要加孟加拉红
实验 1 K L a 的测定方法 氧是难溶气体，在25℃和1个大气压下，纯水中溶解度为0.25 mol/m 3左右。在好氧发酵过程中，氧气由气相传递到液相，为微生物消耗。氧的传递过程限速阻力位液膜阶段，此时K l a 是描述氧的传递性能的重要参数。 1.目的 掌握利用亚硫酸盐测定容积氧体积传递系数的方法，了解氧传递在好氧发酵过程中的重要作用。 2原理 以Cu 离子为催化剂，溶解于水中的O 2能立即将水中的SO 32-氧化为SO 42-，其氧化反应的速度几乎与SO 32-浓度无关。实际上是O 2一经溶入液相，立即就被还原掉。这种反应特性使溶氧速率成为控制氧化反应的因素。其反应式如下： 2Na 2SO 3 2 2SO 4 剩余的Na 2SO 3与过量的碘作用 Na 2SO 3 + I 2 + H 2O Na 2SO 4 + 2HI 剩余的I 2用标准Na 2S 2O 3溶液滴定。 I 2+ 2Na 2S 2O 3 Na 2S 4O 6+2NaI ?O 2 ~ ?Na 2SO 3 ~ ?I 2 ~ ?Na 2S 2O 3 1 2 2 4 可见，每溶解1mol O 2，将消耗2mol Na 2SO 3，将少消耗2mol I 2，将多消耗4mol Na 2S 2O 3。因此可根据两次取样滴定消耗Na 2S 2O 3的摩尔数之差，计算体积溶氧速率。公式如下： 090036004tV VM tV VM N V ??= ???= 式中 N V ：两次取样滴定消耗Na 2S 2O 3体积之差， M ：Na 2S 2O 3浓度， ?t ：两次取样时间间隔，h V 0：取样分析液体积。 将上述N V 值代入公式C C N a k V L -= * 即可计算出k L a
发酵工程实验 目录 发酵罐的结构系统及使用方法实验一 实验二微生物的诱变育种乳酸菌的分离及乳酸饮料制作实验三 实验四大肠杆菌生长曲线的测定摇床培养枯草芽孢杆菌发酵条件的优化实验五
实验一发酵罐的结构系统及使用方法 一、实验目的： 1．了解发酵罐（气升式、搅拌式）的几大系统组成，即空气系统、 蒸汽系统、补料系统、进出料系统、温度系统、在线控制系统。 2．掌握发酵罐空消的具体方法及步骤 3．掌握发酵罐进料及实消的具体方法及步骤 4．掌握发酵罐各系统的控制操作方法 二、实验原理： 1．蒸汽系统： 三路进汽——空气管路、补料管路、罐体 2．温度系统： (1) 夹套升温：蒸汽通入夹套。 (2) 夹套降温：冷水通入夹套，下进水，上出水。 3．空气系统： 取气口→空压机：往复式油泵获得高脉冲的压缩空气 粗过滤器：由沙布包裹棉花压实成块状叠加制得，作用是去除部分细菌及大部分灰尘 （贮气罐）：空压机压缩使气体温度升高，经贮气使气体保温杀菌；压缩空气中有油污、水滴，且压力不稳，有一定的脉冲作用，会冲翻后面的过滤介质，贮气后可使油滴重力沉降，减小脉冲。（冷却塔）：有降温并稳定作用，同时经旋风分离器进行气液分离 (丝网分离器)：通过附着作用，逐步累积沉降而分离5微米以上的微粒 其作用介质为铜丝网 (加温器)：对压缩空气升温，除湿，使湿度达50%-60% 总过滤器：纱布包裹棉花加活性炭颗粒，逐层压紧而成。 分过滤器：平板式纤维，中间为玻璃纤维或丝棉，下面放水阀应适时打开放出油、水，再用压缩空气控干。 种子罐或发酵罐 4．补料系统：补培养基、消泡剂、酸碱等。 5．在线控制系统：热电偶（温度探关）、溶氧探头、pH探头（后二者实消时才安装，为不可再生探头，有限定使用次数，pH探头使用前要先校准）、控制柜、数据采集系统。 。)取样口(、出料口)接种口(、进出料系统：进料口6．
发酵工程与设备实验 1.决定摇瓶溶氧量的因素有哪些？它们如何影响摇瓶溶氧量？答：⑴摇瓶的透气性：8层纱布，纱布透气性越好，摇瓶溶氧量越大。⑵摇瓶的转速：转速越大，培养基流动越剧烈，增大与气体接触面积。⑶培养基的粘稠度：粘稠度越大，氧气越难进入，溶氧量越低。 2.采用磷钼蓝法测定发酵液中的植酸酶活性实验中，空白对照中并未发生酶和底物的水解反应，但经过显示后，颜色却呈较深的蓝色，试解释其原因。 答：①磷钼蓝受热，易被氧化成蓝色还原物。②植酸钠中含杂质磷太多。 3.红曲米发酵实验中，为何要添加酸水？无菌酸水如何制得？答：是为了洗脱菌种，同时为红曲霉生长创造酸性环境。 制备：取一烧杯的蒸馏水，往水中加入乳酸并调PH至4.0.然后取10ml配制好的溶液于干净的试管中，密封包扎后，放入高压灭菌锅灭菌，即可得到无菌酸水。 4.产植酸酶黑曲霉的分离实验中，为何选用植酸钙而不选用植酸钠？ 答：钠盐易溶解、钙盐难容，易形成透明圈，从而筛选。 5.产植酸酶黑曲霉的分离实验中，为什么不将脱氧胆酸钠溶液
和氯霉素眼药水加入到筛选培养基中一起灭菌？ 答：①脱氧胆酸钠会与铁盐高温时反应。②细菌性抗生素、自身就是杀菌的，且本身无菌，也不能灭菌。 6.请详细说明产植酸酶黑曲霉的分离实验的实验原理。 答：以植酸钙为唯一磷来源的选择培养基，同时以透明圈法，从土壤中分离筛选产植酸酶的黑曲霉 7.产植酸酶黑曲霉的摇瓶发酵实验中，摇瓶的作用有哪些？答：①气体和营养分布均匀②温度保持恒定③代谢产物分散④避免影响其他菌丝生长⑤防止细胞沉淀 8.植酸酶酶活力测定实验中，若显色后的反应体系测定吸光度值为2.23，说明什么问题？该如何调整实验方案？ 答：浓度过大，该稀释。 9.植酸酶活力测定时做标线的目的是什么？ 答：标线是反应吸光度与无机磷浓度之间的关系，待我们测的样品吸光度后即可在标线上读出对应无机磷浓度，从而进行酶活计算。 10.简述灭菌锅的使用方法及步骤。 答：①向锅内注入水至三脚架上边缘、预热。 ②放入物品，将直排气管并放入排气槽。 ③关盖，拧紧对应螺栓，打开开关加热 ④待压力达到0.05MPa，排冷空气，归零。
第一章绪论 填空题 1. 生物技术制药的特征 _高技术、高投入、高风险、高收益、长周期。 2. 生物药物广泛应用于医学各领域，按功能用途可分为三类，分别是_治疗药物、预防药物、诊断药物。 3. 现代生物药物已形成四大类型：一是应用DNA重组技术制造的基因重组多肽、蛋白 质类治疗剂；二是基因药物_______________ ；三是来自动物植物和微生物的天然生物药 物；四是合成与部分合成的生物药物； 4. 生物技术的发展按其技术特征来看，可分为 三个不同的发展阶段，传统生物技术阶段；近代生物技术阶段；现代生物技术阶段。 5. 生物技术所含的主要技术范畴有基因工程; 细胞工程；酶工程；发酵工程；蛋白质核酸工程和生化工程； 选择题 1?生物技术的核心和关键是（A ） A细胞工程B蛋白质工程C酶工程D 基因工程 2. 第三代生物技术（A ）的出现，大大扩大了现在生物技术的研究范围 A基因工程技术B蛋白质工程技术C海 洋生物技术D细胞工程技术 3. 下列哪个产品不是用生物技术生产的（D）A青霉素B淀粉酶C乙醇D氯化钠 4. 下列哪组描述（A ）符合是生物技术制 药的特征 A高技术、高投入、高风险、高收益、长周期B 高技术、高投入、低风险、高收益、长周期 C高技术、低投入、高风险、高收益、长周期 D高技术、高投入、高风险、低收益、短周期 5. 我国科学家承担了人类基因组计划（C ）的测序工作 A10% B5% C 1% D 7% 名词解释 （2）近代生物技术阶段的技术特征是微生物 发酵技术，所得产品的类型多，不但有菌体的初 级代谢产物、次级代谢产物，还有生物转化和酶 反应等的产品，生产技术要求高、规模巨大，技 术发展速度快。代表产品有青霉素，链霉素，红 霉素等抗生素，氨基酸，工业酶制剂等。 （3）现代生物技术阶段的技术特征是DNA 重 组技术。所得的产品结构复杂，治疗针对性强， 疗效高，不足之处是稳定性差，分离 纯化工艺更复杂。代表产品有胰岛素，干扰素和 疫苗等。 3. 生物技术在制药中有那些应用？ 生物技术应用于制药工业可大量生产廉价的防治 人类重大疾病及疑难症的新型药物，具体体现在 以下几个方面： （1）基因工程制药，利用基因工程技术可生 产岀具有生理活性的肽类和蛋白质类药物，基因 工程疫苗和抗体，还可建立更有效的药物筛选模 型，改良现有发酵菌种，改进生产工艺，提供更 准确的诊断技术和更有效的治疗技术等。随着基 因技术的发展，应用前景会更广阔。 （2）细胞工程和酶工程制药 该技术的发展为现代制药技术提供了更强大的技 术手段，使人类可控制或干预生物体初次生代谢 产物和生物转化等过程，使动植物能更有效的满 足人类健康方面的需求。 （3）发酵工程制药 发酵工程制药的发展主要体现在对传统工艺的改 进，新药的研制和高效菌株的筛选和改造等。 第二章基因工程制药 填空题 1. 基因工 程药物制造的主要步骤是：目的 基因的获得；构建DNA重组体;构建工程菌；目 的基因的表达；产物的分离纯化; 产品的检 验。 1. 生物技术制药 采用现代生物技术可以人为的创 造一些条件，借助某些微生物、 植物或动物来生产所需的医学药 品，称为生物技术制药。 2. 生物技术药物 一般说来，采用DNA重组技术 或其它生物新技术研制的蛋白 质或核酸来药物称为生物技术药 物。 3. 生物药物 生物技术药物是重组产品概念在 医药领域的扩大应用，并与天然 药物、微生物药物、海洋药物和 生物制品一起归类为生物生物药 物。 简答题 1.生物技术药物的特性是什 么？ 生物技术药物的特征是： （1）分子结构复杂 （2）具有种属差异特异性 （3）治疗针对性强、疗效高 （4）稳定性差 （5）免疫原性 （6）基因稳定性 （7）体内半衰期短 （8）受体效应 （9）多效应和网络效应 （10）检验特殊性 2.简述生物技术发展的不同阶段 的技术特征和代表产品？ （1）传统生物技术的技术特征 是酿造技术，所得产品的结构较 为简单，属于微生物的初级代谢 产物。代表产品如酒、醋、乙 醇，乳酸，柠檬酸等。
生物技术大实验 实验报告集 班级生物技术1212学号 1220212206 姓名宋扬 使用时间2015.12.14至2015.12.19 组别一 苏州科技学院化学与生物工程学院
实验室学生守则 一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施，服从教师及实验技术人员 的指导。 二、严格按照实验要求，做好实验预习,实验之前5分钟进入实验室，及时、 准确地完成实验任务，实事求是地完成实验报告，杜绝弄虚作假。 三、严格执行操作规定，爱护仪器设备及工具。凡不按教师的指导擅自操 作引起仪器、设备损坏者，应予赔偿。 四、爱护实验室公共财物，节约水电、材料和试剂。未经允许不得随便挪 动非实验需用的其他仪器，不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室 外。 五、持实验室的严肃安静，不得大声喧哗、嘻闹，严禁在实验室内抽烟和 吃东西。 六、严防事故，确保实验室安全，发现异常情况，应及时向有关教师和管 理人员报告。 七、每次实验结束后，主动整理好仪器设备，归还所借器材，关闭电源、 水源，按指导老师的要求做好实验结束工作及室内外的清洁卫生工作，经指导老师许可后，方可离开。 苏州科技学院化学与生物工程学院
实验报告
菌体量随着时间增加而增长，而辅酶Q10 含量也随着菌体量的增长而变大。后期因为菌体量的减少，也开始降低。下罐。 还原糖浓度（柱状图） 还原糖浓度不断下降，在24小时开始每隔一段时间补充葡萄糖，使葡萄糖含量维持在 一开始溶氧在100%，随着菌体生长发酵，开始下降，控制在30%左右，随着菌体增加，降为 粘，影响氧气传递。 前期消耗氮源，产氨，pH上升，随着菌体生长繁殖，消耗碳源，产酸， 源，使pH维持在6.8左右。当pH过低时，通过补加氨水，使pH维持稳定。
1、举出几例微生物大规模表达的产品,及其产生菌的特点？ A.蛋白酶表达产物一般分泌至胞外，能利用廉价的氮源，生长温度较高， 生长速度快 ,纯化、分离及分析快速；安全性高，得到 FDA的批准的菌种。 B.单细胞蛋白生长迅速，营养要求不高，易培养，能利用廉价的培养基或生 产废物。适合大规模工业化生产，产量高，质量好。安全性高，得到 FDA的批准的菌种。 C.不饱和脂肪酸生长温度较低，安全性高，能利用廉价的碳源，不饱和脂 肪酸含量高， D.抗生素生产性能稳定，产量高，不产色素，，能利用廉价原料 F.氨基酸代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单 2、工业化菌种的要求？ A能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物 B有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强C. 遗传性能要相对稳定 D.不易感染它种微生物或噬菌体 E.产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关） F.生产特性要符合工艺要求 4、讨论：微生物（包括动、植物）可以生产我们所需的一切产品，但是涉 及到工业化生产，对于某一种特定的产品，为何只有特定的微生物才具有大量 表达的潜力？ 在不同的环境条件下，微生物细胞对遗传信息作选择性的表达，实现代谢 的自动调节。代谢的协调能保证在任何特定时刻、特定的细胞空间，只合成必 要的酶系（参与代谢的多种酶）和刚够用的酶量。一旦特定物质的合成达到足 够的量，与这些物关系支持细胞自身的增殖（生产细胞），不支持（人的）目
的产物的过量生产（生产特定的初级代谢产物）。而工业化生产要求特定表达 某种或某类物质，只有正常代谢被打破，代谢协调失常的微生物才能达到要求 5、自然界分离微生物的一般操作步骤？ 样品的采取→预处理→培养→菌落的选择→初筛→复筛→性能的鉴定→菌种保藏 6、从环境中分离目的微生物时，为何一定要进行富集培养？ 自然界中目的微生物含量很少，非目的微生物种类繁多，进行富集培养， 使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下 的劣势种变成人工环境下的优势种，使筛选变得可能。 7、菌种选育分子改造的目的？ 防止菌种退化 ; 解决生产实际问题 ; 提高生产能力 ; 提高产品质量 ; 开发新产品 . 8、以目前的研究水平，土壤中能够培养的微生物大概占总数的多少？什么 是 16sRNA同源性分析？ 目前能够培养的微生物不到总数的 1%。以 16sRNA为靶基因，设计引物， 建立 pcr 扩增体系，再通过 DNA 测序进行细菌同源性分析。 9、什么叫自然选育？自然选育在工艺生产中的意义？ 自然选育就是不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过 程。
实验一酸奶的制作与乳酸菌的活菌计数(5学时) 实验目的： １、学习并掌握酸奶制作的基本原理与方法。 2、了解市售酸奶的生产工艺。 3、掌握乳酸菌活菌计数方法与操作。 实验原理: 乳酸菌在乳中生长繁殖,发酵分解乳糖产生乳酸等有机酸,导致乳的ｐH值下降，使乳酪蛋白在其等电点附近发生凝集。 乳酸菌属于兼性厌氧微生物,在无氧条件下生长繁殖较好，实验室条件下利用混菌培养的方法，尽可能让乳酸菌在无氧条件下生长，每个单菌落代表一个微生物细胞。实验内容: （一）酸奶制作 1、10%脱脂奶粉溶解于热水(80℃左右)中,充分搅拌均匀，配成调制乳； 2、添加蔗糖:为了缓和酸奶的酸味，改善酸奶口味,在调制乳中加人4-8%的蔗糖。 ３、灭菌：方法有两种：将乳加热至90℃，保温5min； 4、接种:往冷却到43－4５℃灭过菌的乳中加入乳酸菌，接种量为2%－５%。 5、分装:酸奶受到振动,乳凝状态易被破坏,因此，不能在发酵罐容器中先发酵然后再进行分装,须是将含有乳酸菌的牛乳培养基先分装到小容器中，加盖后送入恒温室培养，在小容器中发酵制成酸奶。 6、发酵:发酵的温度保持在40-43 ℃，一般发酵时间为3－6h。 发酵终点的确定有两种方法: 1)检测发酵奶的酸度，达到65－７0 T°。 2）倾斜观察，瓶内酸奶流动性差,而且瓶中部有细微颗粒出现。 7、冷却：发酵结束，将酸奶从发酵室取出,用冷风迅速将其冷印到1０℃以下,一般2 h,使酸奶中的乳酸菌停止生长，防止酸奶酸度过高而影响口感。 8、冷藏和后熟：经冷却处理的酸奶，贮藏在2-5℃的冷藏室中保存。 ９、感官指标 １）色泽：色泽均匀一致，呈乳白色,或稍带微黄色。 2）组织状态:凝块稠密结实均匀细腻，无气泡，允许少量乳清析出。 3)气味：具有清香纯净的乳酸味，无酒精发酵味,无霉味和其他外来不良气味。（二）乳酸菌活菌检测 ①、检测培养基：蛋白胨15g,牛肉膏５ｇ，葡萄糖20g，氯化钠５ｇ，碳酸钙10ｇ, 琼脂粉20ｇ，水１000ｍl,115~121℃灭菌20mｉn,灭菌后放置水浴52℃保温备用。
发酵工程习题及思考题库 一、填空题 1. 淀粉水解糖的制备可分为酸解法、酶解法和酸酶结合法 三种。 2. 糖酵解途径中的三个重要的关键酶是己糖激酶、磷酸丙糖激酶、丙酮酸激酶。 3. 甘油的生物合成机制包括在酵母发酵醪中加入亚硫酸氢钠 与乙醛起加成反应和在碱性 条件 下乙醛起歧化反应。 4. 微生物的吸氧量常用呼吸强度；耗氧速率两种方法来表示，二者的关系是 5. 发酵热包括生物热；搅拌热；蒸发热和辐射热等几种热。 6. 发酵过程中调节pH 值的方法主要有添加碳酸钙法；氨水流加法和尿素流加法。 7. 微生物工业上消除泡沫常用的方法有化学消泡和机械消泡两种。。 8. 一条典型的微生物群体生长曲线可分为迟滞期、对数期；稳定期；衰亡期四个生长时期。 9. 常用菌种保藏方法有斜面保藏法、沙土管保藏法、液体石蜡保藏法；真空冷冻保藏法等。 10. 培养基应具备微生物生长所需要的五大营养要素是碳源、氮源；无机盐；生长因子和水。 11. 提高细胞膜的谷氨酸通透性，必须从控制磷脂的合成着手或者使细胞膜受损伤。 12. 根据微生物与氧的关系，发酵可分为有（需）氧发酵；厌氧发酵两大类。 13. 工业微生物育种的基本方法有自然选育、诱变育种；代谢控制育种；基因重组和定向育种等。 14. 肠膜明串珠菌进行异型乳酸发酵时，产物为乳酸；乙醇；CO2。 15. 诱导酶指存在底物时才能产生的酶，它是转录水平上调节酶浓度的一种方式。 16. 发酵工业的发展经历了自然发酵，纯培养技术的建立，通气搅拌的好气性发酵技术的建立， 人工诱变育种代谢控制发酵技术的建立，开拓新型发酵原料时期，与基因操作技术相结合的 现代发酵工程技术 等六个阶段。 17. 去除代谢终产物主要是通过改变细胞的膜的通透性来实现。 18. 获得纯培养的方法有稀释法，划线法，单细胞挑选法，利用选择培养基分离法等方法。 19. 生长因子主要包括维生素，氨基酸，碱基，它们对微生物所起的作用是供给微生物自身不能 合成但又是其生长必需的有机物质。 20. 微生物生长和培养方式，可以分为分批培养，连续培养，补料分批培养三种类型。 21. 发酵动力学主要内容为细胞生长动力学、基质消耗动力学及产物形成动力学。 22. 影响种子质量的主要因素包括培养基，种龄与接种量，温度，pH 值，通气和搅拌，泡沫，染 菌的控制和种子罐级数的确定。 23. 空气除菌的方法有加热杀菌法，静电除菌法，介质过滤除菌法。 24. 发酵产物的浓缩和纯化过程一般包括发酵液预处理，提取，精制。 25. 菌种扩大培养的目的是为每次发酵罐的投料提供数量相当的代谢旺盛的种子。 26. 在微生物研究和生长实践中，选用和设计培养基的最基本要求是目的明确，营养协调，物理 化学条件适宜和价廉易得。 27. 液体培养基中加入CaCO3的目的通常是为了调节pH 值。 28. 实验室常用的有机氮源有牛肉膏，蛋白胨等，无机氮源有 硫酸铵，硝酸钠， 等。为节约成 本，工厂中常用尿素、液氨等作为氮源。 29. 乳酸菌进行同型乳酸发酵时通过EMP 途径，产物为乳酸，肠膜明串珠菌进行异型乳酸发酵时 通过HMP 途径，产物为乳酸、乙醇和二氧化碳 。 30. 操纵子是由结构基因，操纵基因和启动子组成。 31. 微生物发酵培养（过程）方法主要有分批培养、补料分批培养、连续培养、半连续培养四种。 32. 发酵过程控制的目的就是得到最大的比生产率和最大的得率。 () X c Q r O ?=2
实验一酸奶的制作与乳酸菌的活菌计数（5学时） 实验目的： 1、学习并掌握酸奶制作的基本原理与方法。 2、了解市售酸奶的生产工艺。 3、掌握乳酸菌活菌计数方法与操作。 实验原理： 乳酸菌在乳中生长繁殖，发酵分解乳糖产生乳酸等有机酸，导致乳的pH值下降，使乳酪蛋白在其等电点附近发生凝集。 乳酸菌属于兼性厌氧微生物，在无氧条件下生长繁殖较好，实验室条件下利用混菌培养的方法，尽可能让乳酸菌在无氧条件下生长，每个单菌落代表一个微生物细胞。实验内容： （一）酸奶制作 1、10%脱脂奶粉溶解于热水（80℃左右）中，充分搅拌均匀，配成调制乳； 2、添加蔗糖：为了缓和酸奶的酸味，改善酸奶口味，在调制乳中加人4-8％的蔗糖。 3、灭菌：方法有两种：将乳加热至90℃，保温5min； 4、接种：往冷却到43-45℃灭过菌的乳中加入乳酸菌，接种量为2%-5%。 5、分装：酸奶受到振动，乳凝状态易被破坏，因此，不能在发酵罐容器中先发酵然后再进行分装，须是将含有乳酸菌的牛乳培养基先分装到小容器中，加盖后送入恒温室培养，在小容器中发酵制成酸奶。 6、发酵：发酵的温度保持在40-43 ℃，一般发酵时间为3-6h。 发酵终点的确定有两种方法： 1）检测发酵奶的酸度，达到65-70 T°。 2）倾斜观察，瓶内酸奶流动性差，而且瓶中部有细微颗粒出现。 7、冷却：发酵结束，将酸奶从发酵室取出，用冷风迅速将其冷印到10℃以下，一般2 h，使酸奶中的乳酸菌停止生长，防止酸奶酸度过高而影响口感。 8、冷藏和后熟：经冷却处理的酸奶，贮藏在2-5℃的冷藏室中保存。 9、感官指标 1）色泽：色泽均匀一致，呈乳白色，或稍带微黄色。 2）组织状态：凝块稠密结实均匀细腻，无气泡，允许少量乳清析出。 3）气味：具有清香纯净的乳酸味，无酒精发酵味，无霉味和其他外来不良气味。（二）乳酸菌活菌检测 ①、检测培养基：蛋白胨15g，牛肉膏5g，葡萄糖20g，氯化钠5g，碳酸钙10g， 琼脂粉20g，水1000ml，115～121℃灭菌20min，灭菌后放置水浴52℃保温备用。
发酵工程实验指导书 辽宁石油化工大学环境与生物工程学院主编
《发酵工程》实验指导书 实验学时：24学时 适用专业：生物工程 生物技术是当前优先发展的高新技术之一，本课程是为了和生物工程专业理 论教学相配合，通过实践教学，培养学生对生物工程专业知识的具体实际应用的 能力。 发酵工程实验是以实验操作为主的技能课程，是生物工程专业学生的必修课， 是在学生学习了《生物化学及实验》、《微生物学及实验》等专业基础课及专业 实验课的基础上开设的，课程目的在于通过本课程的实验训练，使学生对整个微 生物生产过程有一个全面的认识和理解，既可培养他们实际操作的技能，又可达 到提高他们理论联系实际能力的目的。通过学习，使学生能掌握发酵工程常用的 实验方法和常见的发酵工程设备，为以后的学习和科研工作打下良好的基础。 本实验指导书包括： 实验一、细菌增殖曲线的测定（6学时） 实验二、土壤中放线菌的分离与纯化（6学时） 实验三、发酵菌株的初筛 实验四、枯草芽孢杆菌的紫外线诱变选育（6学时）（必做） 实验五、淀粉酶的固态发酵（6学时） 实验六、发酵过程中糖的利用（6学时） 实验七、玉米淀粉液化和糖化（6学时） 实验八、淀粉酶的固定化生产（6学时） 实验九、摇床培养确定酵母菌体的培养和营养条件（6学时）（必做） 实验十、小型连续发酵实验（6学时） 实验十一、甜酒酿的制作（6学时） 备注：实验一至实验七为基础实验，实验八至实验十一为设计性和综合性实验，除必做实验外，其他可选做。 实验总时间为24学时，包括设计实验、准备实验、进行实验、书写实验预习 及最终报告及所需仪器药品清单等。
实验一发酵菌株的初筛 一、实验目的与要求 目的： 1、从已分离到的细菌或真菌中筛选出能产生生理活性物质的菌株。 2、学习淀粉酶、蛋白酶产生菌的筛选方法。 要求： 1、复习微生物学及实验过程所学到的微生物培养的方法和过程，了解影响微生物生长各种条件因素。 2、独立查阅相关资料，设计实验方案，并对实验所需的各种药品、玻璃仪器及分析设备列出清单，写出详尽的试验过程及需要。 3、三人一组，互相配合，开展实验，动手完成实验，并记录并分实验中的实验现象、数据，必要时及时修改试验计划。 4、总结试验数据，经教师认定后，撰写实验报告。 二、实验原理 淀粉酶是一类淀粉水解酶的统称，它能将淀粉水解成糊精等小分子物质并进一步水解成麦芽糖或葡萄糖，淀粉被水解后，遇碘不再变蓝色，因此可以根据淀粉培养基上透明圈的大小来判断所选菌株的淀粉酶活力。 蛋白酶也是一类重要的工业用酶制剂，它能将蛋白质分解成短肽甚至氨基酸。根据三氯乙酸能将酪蛋白变性从而产生沉淀这一原理，可在平板培养基上直接筛选蛋白酶产生菌株。产酶菌株能将酪蛋白水解成小分子物质，菌落周围不形成沉淀蛋白而出现透明圈，根据透明圈大小还能判断产酶活力。 本实验以淀粉酶或蛋白酶产生菌株的筛选为例，介绍发酵菌种的初步筛选方法。 三、实验主要仪器设备及材料 1.菌株：自然界中分离到的目的菌株 2.淀粉酶产生菌筛选培养基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，氯化钠0.5%，可溶性淀粉0.2%。琼脂2%，pH 7.2-7.4。 3.蛋白酶产生菌筛选培养基：葡萄糖0.05,氯化钠0.5%，磷酸氢二钾0.05%，
第13讲第三章药发酵工程制药第一节发酵工程制药概第三章发酵工程制药发酵工程制药概述抗生素类药物概述β-内酰胺抗生素的 生产大环内酯类抗生素的生产四环素类抗生素的生产氨基糖苷类抗生素的生产 思考题 发酵工程制药概述发酵工程制药的研究范畴发酵工程制药的工艺特点与要求发 酵工程药物研究开发的一般程序 发酵工程制药的研究范畴发酵工程药物包括抗生素在内，发酵工程药物包括抗生素在内，一系列通过微生物发酵生产的抗细菌、抗真菌、抗微生物发酵生产的抗细菌、抗真菌、病毒、抗肿瘤、抗高血脂、病毒、抗肿瘤、抗高血脂、抗高血压作用的药物，以及抗氧化剂、酶抑制剂、的药物，以及抗氧化剂、酶抑制剂、免疫调节剂、强心剂、镇定剂、调节剂、强心剂、镇定剂、止痛剂等的总称。包括:抗生素、维生素、氨基酸、包括:抗生素、维生素、氨基酸、核苷或核苷酸、药用酶和辅酶、核苷酸、药用酶和辅酶、其他药理活性物质。 发酵工程制药的工艺特点与要求发酵工程药物生产的工艺过程: 无菌空气菌种孢子种子发酵发酵液预处理提取精制产品检验产品包装 菌种工艺的特点与要求 (1)菌种要求品系纯正，生产能力高，遗传性状稳定。菌种要求品系纯正，生产能力高，遗传性状稳定。 ( 2 ) 制备的各阶段种子均要求无其它微生物的污染、生命制备的各阶段种子均要求无其它微生物的污染、力强、保存期短。力强、保存期短。 ( 3 ) 为了确保种子质量和安全，种子制
备对人员、用具、为了确保种子质量和安全，种子制备对人员、用具、设备和操作场所都要有严格操作和管理规程。设备和操作场所都要有严格操作和管理规程。 ( 4 ) 要定期对菌种进行分离复壮，以防菌种退化，确保菌要定期对菌种进行分离复壮，以防菌种退化，种的纯粹和生产能力稳定。种的纯粹和生产能力稳定。 ( 5 ) 要有生产能力相同而遗传性状不同的几个备用菌种，要有生产能力相同而遗传性状不同的几个备用菌种，以备现有生产菌种污染噬菌体或出现其他异常情况时替换?替换。 ( 6 ) 菌种保存应采用冷冻干燥管或液氮管，可长期保持菌菌种保存应采用冷冻干燥管或液氮管，种存活和生产能力稳定。种存活和生产能力稳定。 发酵工艺的特点与要求 (1)原材料要求质量稳定;(包括产地、规格、仓原材料要求质量稳定;(包括产地、规格、储条件及储藏时间) 储条件及储藏时间) (2)发酵起始和过程中使用的原材料、设备、空气发酵起始和过程中使用的原材料、设备、等都要经过严格的灭菌; (3)设备密封性能好，无渗漏; 设备密封性能好，(4)发酵全过程要求用无菌压缩空气、保持罐内压发酵全过程要求用无菌压缩空气、力大于大气压; (5)发酵过程要求不间断地进行通气和搅拌，以保发酵过程要求不间断地进行通气和搅拌，持氧的充分供应和良好的混合状态; (6)微生物生长与抗生素合成呈现明显的分阶段现象，故也应进行分阶段的控制。故也应进行分阶段的控制。 提炼工艺的特点与要求 ( 1 ) 微生物药物一般对热、酸、碱、酶不稳定，故应尽量微生物药物一般对热、酶不稳定，在低温、在低温、清洁和严格控制的化学环境下快速操作; ( 2 ) 根据选择性、分离因素和经济性，选择适当的几步提根据选择性、分离因素和经济性，炼工艺组合，炼工艺组合，以达到所需要成品纯度; ( 3 ) 树立高度的质量意识，对原材料、辅料、半成品、成树立高度的质量意识，对原材料、辅料、半成品、品和
精心整理实验一酸奶的制作与乳酸菌的活菌计数（5学时） 实验目的： 1、学习并掌握酸奶制作的基本原理与方法。 2、了解市售酸奶的生产工艺。 3、掌握乳酸菌活菌计数方法与操作。 实验原理： 乳酸菌在乳中生长繁殖，发酵分解乳糖产生乳酸等有机酸，导致乳的pH值下降，使乳酪蛋白在其等电点附近发生凝集。 乳酸菌属于兼性厌氧微生物，在无氧条件下生长繁殖较好，实验室条件下利用混菌培养的方法，尽可能让乳酸菌在无氧条件下 实验内容： 1、10% 2 3 4 5 6 1 2 7 8 9 1 2 3 121℃灭菌 10－1样品溶液；再从中取1ml至添加9.0ml无菌生理盐水三角瓶中，稀释至10－2，以此类推稀释至10－8，即稀释了1亿倍; ③、倒培养平板，从上述已稀释了1亿倍的乳酸菌悬液中取1ml，在无菌操作台上注入9.0cm培养皿中，再将已经灭了菌的保持 在52℃水浴锅中的呈溶解状态的培养基，倒入15毫升左右于培养皿中，全部浸到培养皿，与菌悬液充分混合均匀（倒入培养基后，马上用手转动培养皿，转动几下，让其混合均匀），然后等其凝固再移入培养箱中培养，注意最后一步倒平皿必须在超净台无菌操作，以免杂菌污染。每次稀释均要换灭好菌的移液管。 ④、培养条件：37℃恒温培养箱培养48～72h。 ⑤、培养完毕后，取出进行计数，因为是稀释了1亿倍，所以一个透明圈菌落代表1亿/克，如果有200个透明圈，则是200亿/ 克。 实验器材及试剂： 菌种：市售酸奶试剂：白糖奶粉培养基各成分
器材：培养箱、电炉、铝锅5L，培养皿，酸奶发酵瓶（自带） 实验结果： 1、详细描述自己制作的酸奶结果： 答：制作后酸奶与市场所售酸奶比较，比市场所售酸奶更稠密，酸奶的香味与酸味明显，制作成功 2、记录个人酸奶中各菌数测定的平行数据，计算最终平均值。 答：最终培养基上未出现乳酸菌菌落，全部为杂菌菌落，因此无法统计酸奶中的菌含量 3、同时用图片记录实验过程中各现象与结果并对图进行注释。 答：制备乳酸菌时，瓶子上方留有一部分空间，并未使乳酸菌完全处于无氧环境中发酵，但乳酸菌是兼性厌氧菌，因此在存在少量氧气的环境中，乳酸菌也可以生长，酸奶制备成功。但在平板接种时，由于污染杂菌，乳酸菌并未长出。乳酸菌计数失败。 思考题： 实验目的： 1 2 3 实验原理： 的一种， )， 细胞。 实验内容： 1 2 每置37℃控温摇床培养。转速200r·min-1，至芽孢率达90%以上时停止，约需24h。 3、固体发酵培养基：麸皮60%，稻草粉10%，玉米粉5%，豆粕25%，硫酸镁0.05%，硫酸铵0.5%，料水比为1:1.1。 4、三角瓶固体发酵培养： 每250mL三角瓶装量20-30g（湿重），固体发酵培养基原料试剂混合料，加水，料水比为1:1.1，搅拌均匀，培养基经121℃灭菌30min，降温后接种量为2%(V/M：V—液体菌种体积数，M—固体发酵培养基的质量)，然后置37℃培养箱中静止培养，间时拍打，使其均匀生长。至脱落芽孢率为80%以上时，停止发酵，约需48h。 （二）枯草芽孢菌活菌检测 ①、检测培养基：葡萄糖0.2%，NaCl0.5%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，琼脂粉2%，pH7.0。115℃灭菌20min，灭菌后放置水浴 52℃保温备用。 ②、稀释：取10克样品放入添加90ml无菌水的带玻璃珠的250ml三角瓶中，摇床180rpm震荡30min，即为10－1样品溶液； 再从中取1ml至添加9.0ml无菌生理盐水的三角瓶中，稀释至10－2，……以此类推稀释至10－8，即稀释了1亿倍;
兰州大学 生命科学学院发酵工程实验 谷氨酸发酵实验
摘要：谷氨酸棒杆菌在合适的培养基中经摇瓶培养能快速生长，为发酵实验准备菌种。还原糖的消耗和谷氨酸的生成是衡量谷氨酸发酵是否正常的重要标志，所以在发酵过程中，要求每两个小时测定一次还原糖的含量，并据此作出发酵的糖耗曲线。 关键字：种子的制备、发酵罐、谷氨酸棒杆菌、PH的调节 引言： 了解发酵工业菌种制备工艺和质量控制，为发酵实验准备菌种。 了解发酵罐罐体构造和管道系统，掌握对发酵罐及其管道系统的灭菌方法。 了解发酵罐的操作，完成谷氨酸发酵的全过程。 还原糖的消耗和谷氨酸的生成是衡量谷氨酸发酵是否正常的重要标志，在发酵后期当还原糖降至1％以下时，表明谷氨酸发酵已经完成。所以在发酵过程中，要定时测定还原糖的含量，要求每两个小时测定一次，并据此作出发酵的糖耗曲线。掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用比色法测定还原糖的方法。 学习使用茚三酮比色法检测发酵液中谷氨酸浓度的方法。谷氨酸棒杆菌通常在0-12小时为生长期，12小时后为产酸期，所以应该从12小时以后开始检测谷氨酸的含量，每两个小时取一次样。 原理: 谷氨酸棒杆菌在合适的培养基中经摇瓶培养能快速生长，得到大量健壮的种子。谷氨酸棒杆菌生长速度较快，接种量一般在1-2%。 谷氨酸发酵是有氧发酵，发酵罐由蒸汽管道、空气管道、加料出料管道等组成，在实验之前必须先对发酵罐进行空消。 谷氨酸产生菌是代谢异常化的菌种，对环境因素的变化很敏感，在适宜的培养条件下，谷氨酸产生菌能够将50％以上的糖转化成谷氨酸，而只有极少量的副产物。如果培养条件不适宜，则几乎不产生谷氨酸，仅得到大量的菌体或者由发酵产生的乳酸、琥珀酸、а－酮戊二酸、丙氨酸、谷氨酰胺、乙酰谷氨酰胺等产物。生产上的中间分析只测定一些主要数据，只能显示微生物代谢的一般概况而不能反映细微的生化变化。因此，进一步完善生化分析项目，从生化角度对发酵进行控制，从而确定最适宜的工艺条件是提高发酵水平的重要课题之一。 在NaOH存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。 L-氨基酸与茚三酮在加热下可发生特有的氨基酸显色反应，产物显示其特有的蓝紫色。不同谷氨酸与茚三酮反应得到的显色产物的最大吸收波长不同，即λ不同；加之显色深浅不同,反应出相应氨基酸的不同含量。以此为依据，可为ma x 谷氨酸定性及定量。在pH 5～6 范围内氨基酸的显色反应最灵敏。 器材与试剂： 试管、三角瓶、高压灭菌锅、摇床、培养箱、显微镜、蒸汽发生器、生物发酵系统、空气压缩机、分光光度计，水浴锅，电炉，18mm×180mm试管。
第一章绪论 选择题 1.生物技术的核心和关键是（A ） A 细胞工程 B 蛋白质工程 C 酶工程 D 基因工程 2. 第三代生物技术（ A ）的出现，大大扩大了现在生物技术的研究范围 A 基因工程技术 B 蛋白质工程技术 C 海洋生物技术D细胞工程技术 3.下列哪个产品不是用生物技术生产的（D ） A 青霉素 B 淀粉酶 C 乙醇 D 氯化钠 4. 下列哪组描述（A ）符合是生物技术制药的特征 A高技术、高投入、高风险、高收益、长周期 B高技术、高投入、低风险、高收益、长周期 C高技术、低投入、高风险、高收益、长周期 D高技术、高投入、高风险、低收益、短周期 5. 我国科学家承担了人类基因组计划（C ）的测序工作 A10% B5% C 1% D 7% 名词解释 1.生物技术制药 采用现代生物技术可以人为的创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医学药品，称为生物技术制药。 2.生物技术药物 一般说来，采用DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质或核酸来药物称为生物技术药物。 3.生物药物
生物技术药物是重组产品概念在医药领域的扩大应用，并与天然药物、微生物药物、海洋药物和生物制品一起归类为生物生物药物。 简答题 1.生物技术药物的特性是什么？ 生物技术药物的特征是： （1）分子结构复杂 （2）具有种属差异特异性 （3）治疗针对性强、疗效高 （4）稳定性差 （5）免疫原性 （6）基因稳定性 （7）体内半衰期短 （8）受体效应 （9）多效应和网络效应 （10）检验特殊性 2.简述生物技术发展的不同阶段的技术特征和代表产品？ （1）传统生物技术的技术特征是酿造技术，所得产品的结构较为简单，属于微生物的初级代谢产物。代表产品如酒、醋、乙醇，乳酸，柠檬酸等。 （2）近代生物技术阶段的技术特征是微生物发酵技术，所得产品的类型多，不但有菌体的初级代谢产物、次级代谢产物，还有生物转化和酶反应等的产品，生产技术要求高、规模巨大，技术发展速度快。代表产品有青霉素，链霉素，红霉素等抗生素，氨基酸，工业酶制剂等。 （3）现代生物技术阶段的技术特征是DNA重组技术。所得的产品结构复杂，治疗针对性强，疗效高，不足之处是稳定性差，分离纯化工艺更复杂。代表产品有胰岛素，干扰素和疫苗等。 3.生物技术在制药中有那些应用? 生物技术应用于制药工业可大量生产廉价的防治人类重大疾病及疑难症的新型药物，具体体现在以下几个方面： （1）基因工程制药，利用基因工程技术可生产出具有生理活性的肽类和蛋白质类药物，基因工程疫苗和抗体，还可建立更有效的药物筛选模型，改良现有发酵菌种，改进生产工艺，提供更准确的诊断技术和更有效的治疗技术等。随着基因技术的发展，应用前景会更广阔。 （2）细胞工程和酶工程制药