课程名称： 生物化学实验 指导老师： 史影 成绩： 实验名称： 酶的基本性质实验——底物专一性、激活剂和抑制剂、最适温度 同组学生姓名： 陈莞尔，潘盛警
Ⅰ.酶的基本性质——底物专一性 一、实验目的
1.了解酶的专一性。
2.掌握验证酶的专一性的基本原理及方法。
3.学会排除干扰因素，设计酶学实验。 二、基本原理
酶是具有高度专一性的有催化功能的蛋白质。酶蛋白结构决定了酶的功能——酶的高效性，酶促反应要比无机催化反应快数十倍。
酶催化的一个重要特点是具有高度的底物专一性，即一种酶只能对一种或一类底物其催化作用，对其他底物无催化反应。根据各种酶对底物的选择程度不同，可分成下列几种：
1.相对专一性。一种酶能催化一类具有相同化学键或基团的物质进行某种类型的反应。
2.绝对专一性：有些酶对底物的要求非常严格只作用于一种底物，而不作用于任何其他物质。如脲酶只能催化尿素进行水解而生成二氧化碳和氨。如麦芽糖酶只作用于麦芽糖而不作用其它双糖，淀粉酶只作用于淀粉，而不作用于纤维素。
3.立体异构专一性：有些酶只有作用于底物的立体异构物中的一种，而对另一种则全无作用。如酵母中的糖酶类只作用于D-型糖而不能作用于L-型的糖。
本实验以唾液淀粉酶和蔗糖酶对淀粉和蔗糖水解反应的催化作用来观察酶的专一性。用Benedict 试剂检测反应产物。
Benedict 试剂是碱性硫酸铜溶液，具有一定的氧化能力，能与还原性的半缩醛羟基发生氧化还原反应，生成砖红色氧化铜沉淀。
Na 2CO 3+ 2H 2O 2NaOH + H 2CO 3 CuSO 4+ 2NaOH Cu(OH)2+ Na 2SO 4
专业：____生物工程 姓名：_____陈传鑫 学号：___3090104963 日期：____2011.3.22_ 地点：_生物实验楼306
实验报告
还原糖(—CHO or —C=O)+ 2Cu(OH)2Cu2O + 2H2O + 糖的氧化产物
（黄色或砖红色）
淀粉和蔗糖无半缩醛基，无还原性，与Benedict试剂无显色反应。淀粉被淀粉酶水解后产生葡萄糖，蔗糖被蔗糖酶水解后产生果糖和葡萄糖，产物都是还原糖，因此能被Benedict 试剂氧化生成砖红色的Cu2O沉淀。
三、实验材料与试剂
1、实验材料
⑴蔗糖酶(样品Ⅳ）；⑵新鲜唾液（含唾液淀粉酶）；
2、实验试剂
⑴蔗糖酶液
蔗糖酶液(样品Ⅳ）加蒸馏水适当稀释，备用；
⑵唾液淀粉酶液（学生自制）
取0.5mL唾液至25ml量筒中，用蒸馏水（稀释）到25ml，用棉花过滤备用。唾液稀倍数因人而异，可稀释50～400倍，甚至更高；
⑶5%蔗糖（A.R.）溶液；
⑷0.5%淀粉溶液（含0.3%NaCl）；
⑸Benedict试剂；
四、实验器材与仪器
1.漏斗，
2.脱脂棉花；
3.恒温水浴（37℃，100℃）；
4.量筒；
5.试管；
6.烧杯；
7.吸量管。
五、实验内容
酶的专一性实验，按下表操作。
六、结果分析和讨论
结果：⑴①、②、③号试管均呈硫酸铜的蓝色，说明这3支试管内无还原糖，淀粉和蔗糖均未水解；
⑵④号试管呈砖红色说明试管内淀粉被水解，⑤号试管呈蓝色说明试管内蔗糖未水解，⑥号试管呈蓝色说明无还原糖，从这三支试管看出唾液淀粉酶只对淀粉有催化活性，不能催化蔗糖水解，具有对淀粉的底物专一性；
⑶⑧号试管呈黄绿色，说明试管中部分蔗糖被水解，但未水解完全，⑦号试管呈蓝色说明淀粉未水解，⑨号试管呈蓝色说明无还原糖，从这三支试管看出蔗糖酶只对蔗糖的水解有催化作用，对淀粉无催化作用，具有对蔗糖的底物专一性。
七、思考题
1．观察酶专一性实验为什么要设计这3组实验？每组各有何意义？蒸馏水有何用？
答：第一组作为整个实验的空白对照组，检测Benedict试剂对实验结果的颜色有何影响。
第二组作为检测淀粉酶的专一性实验组，第三组作为检测蔗糖酶的专一性的实验组。蒸馏水作为每一个组中的空白对照，与组内其余两组进行对照。
2．将酶液煮沸10min后，重做二、三的操作，观察有何结果？
答：二、三组的实验结果将和一组相同，即每组中3支试管都呈蓝色，因为酶在煮沸过程中已经变性，失去催化活性，故不能催化各自对应底物的水解反应。
3．在此实验中，为什么要用0.5%淀粉(0.3%NaCl)溶液？0.3%NaCl的作用是什么？
答：0.3%NaCl中的Cl-是作为激活剂激活唾液淀粉酶的活性，使实验结果不至于因为唾液淀粉酶的活性不足而导致不同。
Ⅱ. 影响酶活性的因素——激活剂和抑制剂
一、实验目的和要求
1. 了解激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响。
2. 学习检定激活剂和抑制剂影响酶促反应速度的原理和方法。 二、实验基本原理
在酶促反应过程中，酶的活性常收到某些物质的影响，有些物质能使酶的活性增加，称为激活剂；某些物质它们并不引起酶蛋白变性，但能使酶分子上的某些必需基团（主要是指酶活性中心上的一些基团）发生变化，因而引起酶活力下降，甚至丧失，致使酶反应速度降低，称为酶的抑制剂。 酶的激活剂种类：
1、一些简单的无机离子，如Mg2+、Cl-等；
2、一些中等大小的有机分子，如抗坏血酸等也是激活剂，它们对某些含巯基的酶具有激活作用；
3、有些酶的催化作用易受某些抑制剂的影响，因而能除去抑制剂的物质也可称为激活剂，如EDTA 能除去重金属，因而能解除重金属对酶的抑制作用。
4、具有蛋白质性质的大分子物质，这些激活剂是指可对某些无活性的酶原起作用的酶。 酶的抑制剂有许多种：如重金属离子（Ag+、Hg2+、Pb2＋、Cu2＋等）、CO 、氯化物、H2S 、砷化物、氟化物、生物碱、有机磷农药等都是抑制剂。
少量的激活剂或抑制剂就能影响酶的活性，而且常具有特异性。值得注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，各种激活剂对酶的作用是不同的。
本实验利用淀粉被水解的不同阶段产物与碘有不同颜色反应，定性观察唾液淀粉酶在酶促反应中激活或抑制现象。淀粉经酶促水解为葡萄糖的不同阶段的产物与碘作用的颜色反应如下：
淀粉 紫色糊精 红色糊精
无色糊精 麦芽糖 葡萄糖 显蓝色 显紫色 显红色 不显色 不显色 不显色 （ 碘色） （碘色） （碘色）
I 2
仍为多糖 （无还原性） （有还原性）
本实验中，Cl- 为唾液淀粉酶的激活剂；Cu2+为唾液淀粉酶的抑制剂。利用淀粉酶别水解不同阶段产物与碘有不同的呈色反应，观察唾液淀粉酶的酶促反应中的激活和抑制现象。水解程度通过水解混合物遇碘溶液所呈现的颜色变化判断。
三、实验材料与试剂
1、实验材料
新鲜唾液
2、实验试剂
⑴唾液淀粉酶（学生自制）
取唾液1ml至25ml量筒中，用蒸馏水稀释至25ml，用棉花过滤备用。唾液稀释倍数因人而异，可稀释50～400倍，甚至更高。
⑵0.1% 淀粉溶液
⑶1.0% 氯化钠溶液
⑷1.0% 硫酸铜溶液
⑸1.0% 硫酸钠溶液
⑹碘化钾-碘液
四、实验器材和仪器
1.试管及试管架
2.量筒
3.漏斗
4.脱脂棉花
5.点滴板
6.吸量管
7.恒温水浴（37℃）
五、实验步骤
注意：⑴找出准确的保温时间，是本实验是实验能否成功的关键步骤之一，唾液淀粉酶液浓度可根据个人情况而定，通过37℃水浴溶保温计时，反应时间最好在8～15min以内，只有确定准确的保温时间才能进行实验。（2）加入酶液后，务必充分摇匀，保证酶与全部淀粉液接触的反应才能得到理想的颜色梯度变化结果。（3）碘化钾–碘液不要过早地加到点滴板上，以免碘液挥发，影响显色效果。
六、结果讨论与分析
结果：①反应时间在17min中时能明显区分各管颜色不同。
②试管1中颜色最深，说明CuSO4可以抑制淀粉酶的活性；试管2中颜色最浅，基本呈碘色，故淀粉酶活性最高，说明NaCl可以激活淀粉酶的活性；试管3、4中颜色基本一致，且深浅居于试管1、2之间，淀粉酶活性一般，说明Na+、SO42-对淀粉酶活性都没有影响。故总体上看，可以得出Cl-是唾液淀粉酶的激活剂，Cu2+是唾液淀粉酶的抑制剂。
③同时，因为各管的结果颜色都偏深，所以使用的唾液淀粉酶样品活性不高，这与区分各管颜色差别需要反应时间较长（17min）相符合。
七、思考题
1. 激活剂可分哪几类？本实验中NaCl、硫酸铜是属于哪种类型？
答：激活剂可分为：简单无机离子、中等大小有机分子、能出去抑制剂的物质、具有蛋白质性质的大分子物质等。NaCl属于简单无机离子；CuSO4属于重金属抑制剂。
2. 本实验中，1，2，3，4管各有何用意？为什么要设计第3管和第4管？
答：1管可观察抑制剂对反应影响的现象，2管可观察激活剂对反应影响的现象，第3管可以将1管中的Na+和2管中的SO42-对反应的影响去除，4管作为空白对照。
3. 抑制剂与变性剂有何不同？试举例说明。
答：抑制剂只改变酶的催化活性，并不使蛋白质变性，其影响是可逆的；变性剂破坏了蛋白质的高级结构，使蛋白质变性，并且多数变性剂的影响是不可逆的。如：Cu2+是唾液淀粉酶的抑制剂，但如果将Cu2+去除淀粉酶的活性又可以变为正常水平。
Ⅲ. 影响酶活性的因素——温度，最适温度测定
一、实验目的和要求
1. 了解温度对酶活力的影响；
2. 学习测定最适温度的原理和方法；
二、实验基本原理
酶的催化反应受温度影响很大，每一种酶所催化的反应，在一定条件下，仅在某一温度范围内表现出最大的活力，即反应速度最大时的温度，这个温度称为该酶促反应的最适温度，高于或低于最适温度时，反应速度逐渐下降。因此，酶促反应与温度的关系，用酶活力对温度作图，通常具有钟罩形曲线特征。
温度与酶活力的关系测定是选择一定的条件，把底物浓度、酶浓度、反应时间、pH等固定在最适状态下，然后在一系列不同温度条件下，进行反应初速度测定，以酶反应初速度对温度作图，可以得一个钟罩形的曲线，即为温度—酶活性曲线，在某温度有一酶活力最大值，这个温度即为最适温度。
实验①利用唾液淀粉酶为试验对象，在0℃～65℃之间选择不同的温度，进行酶活力测定。根据淀粉被唾液淀粉酶水解的程度的不同，遇碘呈现颜色的变化来判断酶活力的大小及最适温度。
实验②采用蔗糖酶为试验对象，在室温至75℃之间选择不同温度进行酶活力测定。蔗糖酶的活力常以其反应产物还原糖（葡萄糖）的生成量来表示。测定还原糖的方法很多，本实验选择3,5–二硝基水扬酸法测定还原糖量。在碱性条件下，3,5–二硝水杨酸与还原糖溶液共热后被还原成红色氨基化合物，并在一定浓度范围内，还原糖的量与反应溶液所呈棕红色物质颜色的深浅程度成正比。因此，可以用分光光度法测定酶促反应后生成的还原糖量，从而测定蔗糖水解的速度和酶活力。
三、实验材料与试剂
1、实验材料
⑴蔗糖酶液(样品Ⅳ）加蒸馏水适当稀释，备用；⑵新鲜唾液。
2、实验试剂
⑴0.2mol/L醋酸缓冲液（pH4.6）⑵5%蔗糖（A.R.）溶液（W/V）
⑶3,5—二硝基水扬酸（简称DNS）试剂⑷0.5%淀粉溶液（含0.3%NaCl）
⑸IK-I2溶液
四、实验器材与仪器
1.试管及试管架， 2．恒温水浴， 3．吸量管, 4．滴管, 5．点滴板，6．分光光度计， 7．制冰机。
五、实验步骤
⑴温度对唾液淀粉酶活力的影响
按下表操作
温度-酶活力曲线图 ⑵温度对蔗糖酶活力的影响 颜
色
深浅
温度（℃） 0 70
37 深 浅 50
5%蔗糖溶液(ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
预热3min
稀释酶液(样品Ⅳ）(ml) (作相应的预温）
H2O
0.5
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 保温反应10 min
3,5–二硝基水杨酸（ml） 1 1 1 1 1 1
混匀后，100℃加热5min
蒸馏水（ml） 5 5 5 5 5 5
A5200 0.341 1.165 1.320 0.668 0.075
六、结果分析讨论
⑴温度对唾液淀粉酶活力的影响
从温度对唾液淀粉酶的活力曲线可以看出，当温度为50℃时颜色最浅，即淀粉水解最完全，唾液淀粉酶的活性最高；在50℃两边唾液淀粉酶的活性都随着温度的改变而降低，故本组实验的唾液淀粉酶的最适温度在50℃左右。
唾液淀粉酶的活性并不是在正常的人体体温37℃时最适，根据激活剂和抑制剂探索中的结果颜色普遍偏深，主要原因认为是本组的唾液淀粉酶样品活性不高，故样品的最适温度较正常情况有所提高，不是37℃而是本次实验测得的50℃。
⑵温度对蔗糖酶活力的影响
由试剂在520nm波长的吸光度对温度作图得到如上图的A520-T曲线。由图线看出蔗糖酶在50℃时活性最高，故蔗糖酶的最适温度为50℃。同时由曲线看出温度高于70℃后酶活性显著下降，这是因为此时酶已经因为高温发生了变性，失去了大部分的催化活性，故催化能力大大减弱。
七、思考题
1．什么是酶的最适温度？有何用途？
答：酶的最适温度是酶促反应在速率最大时的温度。在最适温度下，酶的催化活性最高，此时酶促反应的效率最高，可由此最快的获得产物。
2．酶反应的最适温度是酶特性的物理常数吗？它与哪些因素有关？
答：不是特征常数。它和pH、抑制剂和激活剂存在与否、底物浓度等因素都有关。
3．通过以上几个酶学实验，总结酶有哪些特性？影响酶活性的因素有哪些？在实际应用中应注意哪些问题？
答：酶有底物专一性、高效性、有最适温度等特性。影响酶活性的因素有pH、温度、底物浓度、激活剂和抑制剂。在实际应用中应该注意多种不同的因素对酶活性的总体影响，而不能只看一种或某几种因素的单独影响。
孝感学院生命科学技术学院实验报告 专业：学号：姓名：分数：实验一还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法一、目的与要求 掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。 二、实验原理 还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，如乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。 还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540 nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1．实验材料小麦面粉(1000 g) 2．主要仪器 （1）具塞玻璃刻度试管：20 mL×11 （2）滤纸（3）烧杯：100 mL×2 （4）三角瓶：100 mL×1 （5）容量瓶：100 mL×3 （6）刻度吸管：1mL×1；2 mL×2； 10 mL×1 （7）恒温水浴锅（8）煤气炉（9）漏斗（10）天平（11）分光光度计 3．试剂 （1）1mg/mL葡萄糖标准液 准确称取80 ℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100 mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100 mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。 （2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂 3,5－二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.5 g DNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000 mL 容量瓶中，加入2 mol/L氢氧化钠溶液325 mL，再加入45 g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000 mL。 （3）碘-碘化钾溶液：称取5 g碘和10 g碘化钾，溶于100 mL蒸馏水中。 （4）酚酞指示剂：称取0.1 g酚酞，溶于250 mL 70%乙醇中。 （5）6 M HCl和6 M NaOH各100 mL。（分别取59.19 mL 37 %浓盐酸和24克NaOH定容至100mL） 四、操作步骤 1. 制作葡萄糖标准曲线 批阅教师：年月日
生物化学实验知识点整理 实验一 还原糖的测定、实验二 粮食中总糖含量的测定 1.还原糖测定的原理 3,5-二硝基水杨酸与还原糖溶液共热后被还原成棕色的氨基化合物,在550nm 处测定光的吸收增加量，得出该溶液的浓度，从而计算得到还原糖的含量 2.总糖测定原理 多糖为非还原糖，可用酸将多糖和寡糖水解成具有还原性的单糖，在利用还原糖的性质进行测定，这样就可以分别求出总糖和还原糖的含量 3.电子天平使用 4.冷凝回流的作用： 使HCl 冷凝回流至锥形瓶中，防止HCl 挥发，从而降低HCl 的浓度。 5.多糖水解方法： 加酸进行水解 6.怎样检验淀粉都已经水解： 加入1-2滴碘液，如果立即变蓝则说明没有完全水解，反之，则说明已经完全水解。 7.各支试管中溶液的浓度计算 8.NaOH 用量：HCl NaOH n n = 9.不能中途换分光光度计,因为不同的分光光度计的光源发光强度不同 10.分光光度计的原理：在通常情况下，原子处于基态，当通过基态原子的某辐射线所具有的能量（或频率）恰好符合该原子从基态跃迁到激发态所需的能量（或频率）时，该基态原子就会从入射辐射中吸收能量，产生原子吸收光谱。原子的能级是量子化的，所以原子对不同频率辐射的吸收也是有选择的。这种选择吸收的定量关系服从式/E h hc νλ?==。 实验证明，在一定浓度范围内，物质的吸光度A 与吸光样品的浓度c 及厚度L 的乘积成正比，这就是光的吸收定律，也称为郎伯-比尔定律 分光光度计就是以郎伯比尔定律为原理，来测定浓度 11.为什么要水解多糖才能用DNS 因为DNS 只能与还原糖溶液在加热的条件下反应生成棕红色的氨基化合物，不能与没有还原性的多糖反应。 12.为什么要乘以0.9 以0.9才能得到多糖的含量。 13.为什么要中和后再测？ 因为DNS 要在中性或微碱性的环境下与葡萄糖反应 实验三 蛋白质的水解和纸色谱法分离氨基酸、实验四 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度 1.纸色谱分离氨基酸分离原理 由于各氨基酸在固定相（水）和流动相（有机溶剂）中的分配系数不同，从而移动速度不同，经过一段时间后，不同的氨基酸将存在于不同的部位，达到分离的目的。 2.天然氨基酸为L 型 3.酸式水解的优点是：是保持氨基酸的旋光性不变，原来是L 型，水解后还是L 型，由于甘氨酸所有的R 基团是氢原子，所以它不是L 型
一、实验目的： 1、熟悉工作曲线的制作方法及注意事项； 2、掌握3, 5-二硝基水杨酸（DNS）比色定糖的原理和方法； 3、掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法； 4、掌握酶蛋白分离提纯的原理； 5、掌握酶的比活力测定及其计算方法； 6、掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法； 7、运用正交试验法确定温度、pH值、离子浓度的最适条件。 称量技术： 1、了解电子天平的用途 2、了解电子天平的工作原理 3、掌握电子天平的使用方法 4、掌握电子天平使用前后的注意事项 离心技术： 1、了解离心机的基本原理和用途 2、了解离心机的类型和用途 3、了解离心机的型号和控制版面 4、掌握离心机的使用方法 5、掌握离心机使用的注意事项 层析技术： 1、了解层析技术的基本原理 2、了解层析技术的分类情况 3、了解各种层析技术的原理 4、掌握凝胶层析技术 光谱分析技术： 1、学习掌握紫外可见、荧光、红外光谱分析技术原理 2、了解仪器结构和分类 3、熟练掌握常用仪器的使用方法和注意事项 电泳技术： 1、了解电泳的基本原理 2、了解电泳的类型
3、学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理 4、掌握垂直板电泳的操作技术 5、掌握琼脂糖凝胶电泳的操作技术 6、了解转移电泳的基本原理和操作方法 7、了解双向电泳的基本原理和操作方法 二、实验原理： 1、蔗糖酶的提取： ①酵母菌的基本特征： 单细胞，椭圆形、圆形或柱形。长5-30μm，宽1-5μm。 ②生物材料破碎方法： （1）机械（匀浆）法 ①研钵 ②玻璃或Teflon研棒匀浆器（50mL）Teflon：聚四氟乙烯 先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机高，适用于少量组织和脏器。 ③高速组织捣碎机（0.5-1L） 将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3 体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 ④高压匀质机（XL） 高压下的细胞通过阀门流出时，细胞内外压力同时降低，但由于细胞膜的作用，胞外压力瞬间降至常压，而胞内压力相比之下降低较慢，从而在细胞内外形成压力差，使细胞膜破裂。 优点：快速，产热小，对蛋白损伤小，破碎效率高。一次破碎效率可达90%以上 （2）超声波处理法 用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，常在30 至60Hz 频率下处理10-15 分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。（3）反复冻融法 将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内的水形成冰粒而剩余的细胞液中盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。设备简单、效率不高，时间长，注意蛋白酶！ （4）化学处理法 有些动物细胞可采用十二烷基磺酸钠(SDS)、去氧胆酸钠等细胞膜破坏。
【实验操作考核要点】 一、目的要求 1．掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。 2．了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。 3．正确操作使用刻度吸管和可调微量移液器。 4．熟练运用溶液混匀的各种方法（视具体情况，采用合适的混匀方法）。 5．正确掌握溶液转移的操作。 6．正确操作使用分光光度计。 二、操作考核内容 按百分制计。 1．吸量管操作（20分）； 2．可调式微量移液器操作（20分）； 3．溶液混匀操作（视具体情况，采用合适的混匀方法）（15分）； 4．溶液转移操作（10分）； 5．分光光度计比色操作（25分）。 6．整体表现（10分）。 三、操作考核标准 （一）吸量管操作（20分，每项操作5分） 1．执管 要求右手拿吸量管，左手拿橡皮球，只能用食指而不能用拇指按压吸量管上口来调节吸取液量的刻度；吸液、排液整个操作过程吸量管应始终保持垂直。 2．坐姿 要求腰、背保持竖直，看刻度时眼睛保持平视。 3．吸取溶液 吸量管插入液面深度约0.5cm，不能一插到底，也不能插入过浅而吸进空气致使溶液进入橡皮球内；调控吸量管吸取液量的刻度时，吸量管尖应离开液面靠在容器内壁上。 4．排出液体
吸量管尖应靠上受纳容器内壁，让管内溶液自然流出。不能用橡皮球吹压，而且在流净后吸量管尖停靠受纳容器内壁至少3秒。 （二）可调式微量移液器操作（20分，每项操作5分） 1．设定容量值 转动加样器的调节旋钮，反时针方向转动旋钮，可提高设定取液量。顺时针方向转动旋钮，可降低设定取液量。在调整设定移液量的旋钮时，不要用力过猛，并应注意使取液器显示的数值不超过其可调范围。 2．吸液 （1）选择合适的吸头安放在取液套筒上，稍加扭转压紧吸嘴使之与套筒之间无空气间隙； （2）把按钮压至第一停点，垂直握持加样器,使吸头浸入液面下2~3毫米处,然后缓慢平稳地松开按钮，吸入液体，等一秒钟，然后将吸头提离液面，贴壁停留2-3秒，使管尖外侧的液滴滑落。 3．放液 （1）将吸头口贴到容器内壁底部并保持100°~40°倾斜； （2）平稳地把按钮压到第一停点，等一秒钟后再把按钮压到第二停点以排出剩余液体； （3）压住按钮，同时提起加样器，使吸头贴容器壁擦过，再松开按钮。按吸头弹射器除去吸头。 4．压放按钮时保持平稳；加样器不得倒转；吸头中有液体时不可将加样器平放。取液器吸嘴为一次性使用。实验完毕，将取液器读数调至最大量程值，竖立放于支架上。 （三）溶液的混匀（操作流程中下划实线的三处，每项操作5分，共15分）1．肝糖原的提取与鉴定操作中，肝匀浆上清液中加5ml 95%乙醇后的混匀最好用倾倒混匀，也可用滴管或吸量管吸、吹混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。 2．肝糖原定量测定中，肝组织消化液沸水浴后全部转入100 ml容量瓶，加水至刻线后的混匀应采用倒转混匀。 3．肝糖原定量测定中，加蒽酮溶液后的混匀，可将试管倾斜约45o再作旋转混匀。因蒽酮溶液（浓硫酸配制）比重大于样品水溶液很多，一加入便沉于管
《生物化学实验》内容 课程类型：制药工程专业必修 实验总学时：32课时 开设实验项目数：8个 适用对象：2017制药工程1、2班 实验教师：段志芳 一、实验目标及基本要求 生物化学实验是一门独立的实验课程，培养学生生物化学实验基本操作技能、实验数据处理能力、分析问题解决问题的能力和实事求是的科学态度。 二、实验内容
三、成绩 包括实验时的表现（实验出勤、安全卫生、操作对错、损坏器皿情况等，占50%）及实验报告的完成情况和完成质量（占50%），每个实验按总分为100分为满分进行打分，共8个实验，总评取平均值。 四、要求 （1）实验过程中同组人可以配合进行； （2）实验报告独立完成，同组人数据相同，不得抄袭他组数据；（3）实验过程若出现失误应向老师汇报后再进行重做； （4）对实验结果进行简单的分析. 实验一植物组织中可溶性总糖的提取 一、实验目的 1. 掌握可溶性总糖的概念和性质。 2. 掌握可溶性总糖提取的基本原理。
3．掌握溶解、过滤、洗涤、定容等基本操作技术。 二、实验原理 可溶性糖是指易溶于水的糖，包括绝大部分的单糖、寡糖，常见的有葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖等。它们在植物体内可以充当能量的储存、转移的介质、结构物质和功能分子如糖蛋白的配基。总糖主要指具有还原性的葡萄糖、果糖、戊糖、乳糖和在测定条件下能水解为还原性的单糖的蔗糖、麦芽糖以及可能部分水解的淀粉。可溶性总糖提取方法包括：热水提取法、酶提取法、超声波提取法等。其溶于热水，不溶于60%以上乙醇，所以用热水提取、乙醇沉淀除去部分醇溶性杂质。本实验利用可溶性糖溶于水的特性，将植物磨碎，用热水将组织中的可溶性糖提取出来，结合实验二得到总糖浓度，已知溶液体积和原料重量，可以求出总糖含量。 三、实验用品 1.仪器设备：电子天平（精确到0.0g，配称量纸若干）；可控温电 加热板或电炉或电热套或水浴锅均可。可共用。 2.玻璃器皿：研钵1套；100mL锥形瓶1个；25mL量筒1个；玻 璃棒1根；100mL烧杯2个；胶头滴管1支；过滤装置1套（铁架台1台+铁圈1个+玻璃漏斗1个+100mL容量瓶1个+洗瓶1个）； 不锈钢刮勺1个；剪刀1把。此部分为每组所用，集中到小框里，放置各实验台上。 3.药品试剂：新鲜植物叶片；蒸馏水。 4.其他：9cm滤纸若干（与玻璃漏斗配套）；纸巾若干；标签纸若
生物化学实验须知 一、实验目的 1．培养学生严谨的科学作风，独立工作能力及科学的思维方法。 2．学习基础的生物化学实验方法，为今后的学习与研究准备更好的条件。 3．培养学生爱护国家财物、爱护集体、团结互助的优良道德品质。 4．培养学生的书面及口头表达能力。 二、实验的总要求 1．按教研室予先公布的实验进度表，了解各次实验的具体内容，并认真做好预习。弄清各步骤的意义，避免教条或机械式做实验。 2．进行实验不仅要求结果良好，而且要求敏捷高效。为达到此目的，实验者应注意：①一切步骤都按正规操作法进行；②样品与试剂勿过量取用；③宜粗者勿细（例如粗天平称量物品即足够准确时，不用分析天平，用量筒取液足够准确时，不用吸量管）；④试剂、仪器防止污染及破损，保持实验环境的整洁。⑤注意力集中，避免差错。 3．实验中观察要仔细，记录要详尽、及时与客观，不得于实验后追记，应直接记在实验报告本中，而且无论实验成功与失败，都应记下。对于失败的实验，要分析其原因。 4．实验室是集体学习与工作的场所，实验时应保持肃静，不得大声喧哗，以免影响他人的工作与思考。对师长尊敬，对同学要团结友爱。实验后应清洗整理用过的仪器及清理自己的实验场所。 三、实验报告 实验报告的书写是培养学生书面表达能力和科学作风的重要手段之一，实验者应该重视。实验报告的内容包括下列各项：实验名称、实验日期、实验目的、实验原理、实验步骤、实验记录、计算（定量测定、解释）、讨论或小结。实验记录除应包括“实验总要求”的第3项要求外，还应包括原始记录。原始记录是随做随记的第一手记录，应由指导教师签字认可。书写实验报告要字迹工整，语句通顺。书写工整的实验报告，是尊师的重要表现之一。 四、组织与分组 1．每一个班学习委员负责①实验报告的收集与分发；②安排清扫值日名单； ③反映同学学习情况及对教学工作的意见；④其它临时性的工作。 2．一般实验都为两个学生单独进行。有的实验要4人一组，由相邻两学生组成固定小组。小组的成员在指导教师的同意下，可作适当的调整。
生物化学实验报告：蛋白质分子量的测定— —凝胶层析法 实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法 一、实验目的 1.掌握凝胶层析的基本原理。 2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。二、实验原理 凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。若分子大小介于上述完全排阻或完全渗
入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流出。总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终于它们被排阻和扩散的程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。 将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。实质上Vt是Vo，Vi与Vg三部分组成，Vo称为“孔隙体积”或“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。Vg为凝胶本身的体积。洗脱体积与Vo与Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi 式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部与外部的分配系数。它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长度粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得，上式可以改写为:Kd=(Ve-Vo)/Vi 上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液通过实际测量求得；Vi可g×Wr求得。因此，对一层析柱胶床来说，只要通过实际实验得知某一物质的洗脱体积就可算出它的Kd值。
一、解词 1、总氮量水中各种形态无机和有机氮的总量 2、酶的抑制作用是指在某个酶促反应系统中，某种低相对分子质量的物质加入后，导致酶活力降低的过程。 3、酶的最适温度酶催化活性最高时的温度 4、蛋白质的等电点每个蛋白都存在一个pH使它的表面净电荷为零即等电点 5、盐析增加中性盐浓度使蛋白质、气体、未带电分子溶解度降低的现象 6、蛋白质变性蛋白质在某些物理和化学因素作用下其特定的空间构象被改变，从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失6、酶的专一性酶对底物及其催化反应的严格选择性通常酶只能催化一种化学反应或一类相似的反应 7、激活剂能提高酶活性的物质大部分是离子或简单的有机化合物 8、抑制剂凡能使酶催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质 9、酶催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体 二、填空 1、球蛋白可在半饱和中性硫酸铵溶液中析出，清蛋白可在高盐浓度溶液中析出。 2、在PH3.0、和9.5时的电场中，卵清蛋白（PI4.6）移动方向分别为负移 动，正移动。 3、唾液淀粉酶的最适温度是37 4、还原糖与本乃狄试剂共热现象生成生成砖红色沉淀。 5、维生素C也称抗坏血酸，它具有很强还原性 6、用苔黑酚浓盐酸溶液可以鉴定核糖核酸 7、当溶液的PH低于蛋白质等电点时，蛋白质分子带正电荷；当溶液的 PH大于蛋白质等电点时，蛋白质分子带负电荷； 10．凯氏定氮法测定蛋白质含量消化终点颜色为清澈的蓝紫色色。 11．蛋白质变性的实质是空间结构被破坏。 12．常用的RNA提取方法有苯酚法、、高盐法等。 13、维持蛋白质亲水胶体稳定的因素是蛋白质颗粒表面的电荷层 和水化膜、 14、蛋白质在等电点时，主要以两性离子离子形式存在；当溶液的P H＞PI 时，蛋白质分子以负离子形式存在；当溶液的P H＜PI时，蛋白质分子带正离子形式存在。 15、蛋白质分子中氮的平均含量为 5.16% ，样品中的蛋白质含量常以测 氮量乘以 6.25 、即 6 。 三、选择 1、盐析法沉淀蛋白质的原理( ) A 与蛋白质结合成不溶性蛋白盐 B 次级键断裂蛋白质的构象改变 C 中和电荷，破坏水化膜 D 调节蛋白质溶液的等电点 2、以下哪项不是酶的特性（） A 酶是生物催化剂，催化效率极高 B 易受Ph，温度等外界因素的影响 C 能加速化学反应但不改变反应平衡点 D 有高度特异性 3、RNA和DNA的最大紫外吸收值是在（） A 280nm B 260nm C 510nm D 620nm 4、．凯氏定氮法使用的混合催化剂硫酸钾-硫酸铜配比为（） A 1:3 B 5:1 C 3:1 D 1:1
临床生物化学实验原理、分析方法及检测技术 中国中医研究院广安门医院临床检测中心 生物化学实验——是把化学(分析技术)和生物化学(实验反应原理)的方法应用于疾病的诊断、治疗、监控的实验分支。 一个生化实验的最后测定结果应包括四大部分来完成。 一、实验反应原理及分析方法（理论依据） 二、实验检测技术（手段）生化仪的分析技术。 三、质量控制程序（质量保证）室内质控、室间质评、仪器、试剂、人员五要素。 四、临床意义（目的）咨询服务、异常结果的解释。 实验反应原理及分析方法(理论依据) 一个生物化学实验的反应原理设计，首先要找出所检测的化学特性，如测定体液（首先是血液）中酶的含量血液中除少数酶（如凝血溶血酶、铜氧化酶及假性胆碱脂酶等）含量较多外，血液正常生理状况下含量微乎其微。一般每毫升含微微克（Pg）水平，要直接测定如此微量物质是相当困难的。用免疫化学方法可测定全部酶蛋白分子含量（不论其有无活性）而用化学方法测定只能测定酶的催化活性，间接计算出酶的含量。目前利用酶具有催化活性这一特性，在临床上已普遍应用测定酶蛋白，同时还可以测定三大代谢的产物，如糖、脂类、蛋白质、这样也就建立起利用酶促反应的一级反应测定代谢物的方法。一级反应—反应速度与底物浓度成正比，因此只有当酶反应为一级反应时，才能准确测定底物含量，（如测定血糖、总甘油三脂、总胆固醇等）。从此在临床试剂盒的方法中出现了以酶为试剂测定各种代谢产物。 临床化学方法的分类 特别是自动生化仪方法的特点 以往临床化学实验都采用比色法进行各个项目的测定，这是因为比色法具有微量、迅速、准确的优点，特别适合于微量的生物体体液中各项物质测定。 在一般比色法中，手工使用比色计或分光光度计可以测定各种反应溶液的吸光度，但由于很难控制测定时间和反应温度，很难准确记录反应过程中吸光度变化，因此，毫不奇怪在很长一段时间内我们所使用的方法，都是在呈色反应达到完全或者反应达到平衡时，吸光度达到稳定时才进行测定。即所谓平衡法或终点法。 但自从自动生化仪出现后，从根本上改变了上述情况。通过各项先进技术，人们可以精确测定反应的动态过程。并可以准确计算任何一段反应时间内的反应速率，这样大大开阔了临床化学家对方法选择。除经典的终点法外还可以进行动态测定。这样不仅缩短了操作时间，大大提高了工作效率，还可进行一些用常规比色方法不能进行的测定。如测定酶反应的初速 度（V o ）等等。测酶初速度（V o ）只能用分光光度法。 因此，用好自动生化仪一个重要前提必须对自动生化仪可以提供的测试方法类型有所了解。 生化自动分析仪特点： 1 精确测定反应的动态过程； 2 准确计算任何一段反应时间内的反应速率； 3 除经典的终点法外还可以进行动态测定。 分析方法的分类
生物化学实验报告册 1．实验前应认真预习实验指导，明确实验目的和要求，写出预实验报告。 2．进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律，不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。 3．严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时请教指导老师。 4．严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用，对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法，才能开始使用；仪器发生故障，应立即关闭电源并报告老师，不得擅自拆修。 5．取用试剂时必须“随开随盖”，“盖随瓶走”，即用毕立即盖好放回原处，切忌“张冠李戴”，避免污染。 6．爱护公物，节约水、电、试剂，遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 7．注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时，管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。 8．废纸及其它固体废物严禁倒入水槽，应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱，必须事先用水稀释，方可倒入
水槽内，并放水冲走。 9．以实事求是的科学态度如实记录实验结果，仔细分析，做出客观结论。 实验失败，须认真查找原因，而不能任意涂改实验结果。实验完毕，认真书写实验报告，按时上交。 10．实验完毕，个人应将试剂、仪器器材摆放整齐，用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好，方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理，保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等，并严格执行值日生登记制度。 实验报告通过分析总结实验的结果和问题，加深对有关理论和技术的理解与掌握，提高分析、综合、概括问题的能力，同时也是学习撰写研究论文的过程。 1．实验报告应该在专用的生化实验报告本上、按上述格式要求书写。 2．实验报告的前三部分①实验原理、②实验材料、③实验步骤要求在实验课前预习后撰写，作为实验预习报告的内容。预习时也要考虑并设计好相应实验记录的表格。 3．每项内容的基本要求 实验原理：简明扼要地写出实验的原理，涉及化学反应时用化学反应方程式表示。 实验材料：应包括各种来源的生物样品及试剂和主要仪
生物化学实验 一、名词解释： 分配层析法电泳同工酶酶活性分光光度法层析技术比活力 二、填空题： 1. 测定蛋白质含量的方法有，，和。 2. CAT能把H2O2分解为H2O和O2，其活性大小以来表示，当CAT与H2O2反应结束，再用测定未分解的H2O2。 3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以作为载体的一种区带电泳，这种凝胶是由和交联剂在催化剂作用下聚合而成。化学聚合法一般用来制备_____________胶，其自由基的引发剂是，催化剂是______________；光聚合法适于制备大孔径的_________________胶，催化剂是______________。 4.层析技术按分离过程所主要依据的物理化学性质进行分类，可分成以下几种：_______________，_______________，_______________，_______________和________________。 5. 使用离心机离心样品前，必须使离心管__________且对称放入离心机。 6. 米氏常数可近似表示酶和底物亲合力，Km愈小，表示E对S的亲合力愈，Km愈大，表示E对S 的亲合力愈。 7. 分光光度计在使用之前必须预热，注意预热及样品槽空时必须_________（打开、合上）样品池翻盖。 8. CAT是植物体内重要的酶促防御系统之一，其活性高低与植物的密切相关。 9. 纸层析实验中，____________形成固定相，____________流动相。 10. 聚丙烯酰胺凝胶是是由和交联剂在催化剂作用下聚合而成的，在具有自由基团体系时，两者就聚合。引发产生自由基的方法有两种：和。11. 层析技术按按固定相的使用形式进行分类，可分成以下几种：_______________，_______________，_______________和________________。 三、问答题： 1、简述4种测定蛋白质含量的方法及其原理。 2、简述不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中的三个不连续及三种物理效应。 3、试分析影响电泳的主要因素有哪些？ 参考答案： 生物化学实验 一、名词解释： 1、电泳：指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。 2、同工酶：指催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。 3、分配层析法：用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离目的的一种实验方法。
生物化学实验讲义 化学工程与技术学院 基础部
实验一酪蛋白的制备 一、目的 学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。 二、原理． 牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。 三、器材 1 、离心机2、．抽滤装置 3、精密pH试纸或酸度计 4、电炉 5、烧杯 6、温度计． 四、试剂与材料 1、牛奶2500mL 2、95％乙醇1200mL 3、无水乙醚1200mL
4、0.2mol／L pH 4.7醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL 5、．乙醇—乙醚混合液2000mL 五、操作 1、将100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入 预热至40℃、pH 4.7的醋酸缓冲液100 mL。用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟(3 000r／min)。弃去清液，得酪蛋白粗制品。 2、用水洗沉淀3次，离心10分钟(3000r／min)， 弃去上清液。 3、在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬 浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。 4、将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯晶。 5、准确称重，计算含量和得率。 含量：酪蛋白g／100mL牛乳(g％)
得率： 测得含量 100 % 理论含量 思考题 1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？ 实验二小麦萌发前 后淀粉酶活力的比较 一、目的 1.学习分光光度计的原理和使用方法。 2.学习测定淀粉酶活力的方法。 3.了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。 二、原理 种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。 2（C6H10O5）n +nH2O nC12H22O11 麦芽糖有还原性，能使3，5---二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基-5-硝基水扬酸。后者可用分光光度计测定。
《生物化学》实验教学大纲 课程类别：专业基础 适用专业：本科临床学专业 课程总学时：实验学时：32 实验指导书：生物化学与分子生物学实验教程 开课实验室名称：生化实验室 一、目的和任务 生物化学是一门在分子水平上研究生命现象的学科，也是一门重要的实验性较强的基础医学课程．随着医学的发展，该学科已渗透到医学的各个领域。生物化学实验技术已被广泛地应用于生命科学各个领域和医学实验的研究工作。生物化学实验是生物化学教学的重要组成部分，它与理论教学既有联系，又是相对独立的组成部分，有其自身的规律和系统。我们根据国家教委对医学生物化学课程基本技能的要求，开设了大分子物质的常用定量分析法、酶活性分析、电泳法、层析技术、离心技术及临床生化，使学生对生物化学实验有一个比较系统和完整的概念，培养学生的基本技能和科学思维的形成，提高学生的动手能力。 二、基本要求 1.通过实验过程中的操作和观察来验证和巩固理论知识，加深学生对理论课内容的理解。 2.通过对实验现象的观察，逐步培养学生学会观察，比较，分析和综合各种现象的科学方法，培养学生独立思考和独立操作的能力。 3.通过对各类实验的操作和总结，培养学生严谨的科学态度。 4.进行本学科的基本技能的训练，使学生能够熟练各种基本实验方法和实验技术的操作。 三、考试方法及成绩评定方法 四、说明 实验教材及参考书： 1.揭克敏主编：生物化学与分子生物学实验教程（第2版）。科学出版社，2010 参考资料： 1..袁道强主编：生物化学实验（第1版）。化学工业出版社，2011 五、实验项目数据表
2）要求：0：必修1选修 3）类型：0：演示1：验证2：综合3：设计 4）每组人数：指教学实验项目中一次实验在每套仪器设备上完成实验项目的人数。 六、各实验项目教学大纲 实验一蛋白质的沉淀反应 【预习要求】 预习四个小实验的具体实验原理和操作内容。 【实验目的】 1. 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识； 2. 了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 【实验内容】 （一）蛋白质的盐折 1. 原理 大量中性盐类如硫酸铵((NH4)2SO4)、硫酸钠(Na2SO4)和氯化钠(NaCl)等加入到蛋白质溶液后，可引起蛋白质颗粒因失去水化膜和电荷而沉淀。各种蛋白质分子的颗粒大小和电荷数量不同，用不同浓度中性盐可使各种蛋白质分段沉淀。例如血清中的球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中沉淀。当硫酸铵浓度达到饱和时血清中的白蛋白使沉淀下来。盐析沉淀蛋白质时能保持蛋白质不变性，加水稀释降低盐浓度，能使沉淀的蛋白质重新溶解，并保持其生物活性。因此，利用盐析法可达到分离提纯蛋白质的目的。 2. 操作步骤 ①取小试管1支、加入5％鸡蛋清溶液20滴，饱和硫酸铵溶液20滴，充分摇匀后静置5min，记录结果。
生物化学实验报告 动物营养研究所 树润 2015.10.12 猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活性测定一．实验目地 1.通过实验了解活性物质的分离提取。 2.了解超氧化物歧化酶的基本功能与应用。 二．实验原理 超氧化物歧化酶是一种酸性蛋白，是唯一以自由基为底物 的酶，具有清除自由基的功能酶，在酶分子上共价连接金属辅 基，因此它对热、PH、以及某些理化性质表现出异常的稳定性。 该酶首次从牛红细胞中分离得到，是一种蓝色含铜蛋白，之后， 研究发现该蛋白酶具有催化氧发生歧化反应的能力，因此将其 命名为超氧化物歧化酶1-2。超氧化物歧化酶是一种能专一地清 除超氧离子自由基（O2-）的金属酶，它具有抗衰老、抗辐射、 抗炎抗癌等作用，因而在医药（如关节炎、红斑狼疮等疾病的 治疗3）、化妆品(有防晒抗炎效果4)、食品工业（SOD灵芝菌5 等）等方面具有了广泛的应用前景。 超氧化物歧化酶是广泛存在于生物体的一种金属酶, 可催化超氧阴离子自由基(O2-)与H+发生歧化反应, 生成H2O2和 O2。SOD催化下述反应：2H++2O2-→H2O2+O2。
超氧化物歧化酶按照它所含金属离子的不同，可分为 Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体，呈 蓝绿色；Mn-SOD呈紫红色；Fe-SOD呈黄褐色。 SOD提取、纯化制备方法各异, 常用方法有经典的溶剂沉淀法、盐析法、超滤法和层析法等6-7。本实验采用有机溶剂沉淀法8以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行纯化。酶活力测定可用以下方法：邻苯三酚自氧化法9、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法、亚硝酸法等。 该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单 位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率 达50%的酶量定义为一个酶单位。 样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮 蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合呈现蓝色。在一 定围，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可 用比色法测定，测定围1-1000μg。 三．实验试剂与器材 1.实验试剂 ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%乙醇、氯仿、考马斯 亮蓝G-250、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/L EDTA钠盐 溶液、3mmol/L邻苯三酚溶液等 2.实验器材
12级生物化学实验2期末复习题-考试
生物化学实验（2）理论习题 一、名词解释题 1、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的点泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。当蛋白质的分子量在15KD到200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系，可以用来测定蛋白质亚基的分子量。 2、电泳：带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳 3、层析分离技术：是一种物理的分离方法，利用多组分混合物中各组分物理化学性质的差别，使各组分以不同的程度分布在两个相中。 4、吸附色谱法：利用同一吸附剂对混合物中不同成分吸附能力的差异，从而使各成分达到分离目的的色谱法。 5、离子交换层析：以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。 6、分配层析：根据一种或多种化合物，在两种不相
融合的溶剂间的分配来分离物质的方法。 7、亲和层析：是利用生物活性物质之间的专一亲和吸附作用而进行的层析方法。是近年来发展的纯化酶和其他高分子的一种特殊的层析技术。 8、凝胶层析（凝胶色谱）：混合物随流动相经过凝胶层析柱时，由于各组分流经体积的差异，使不同分子量的组分得以分离的层析方法。 9、电渗作用：指在电场作用下液体(通常是水)相对于和它接触的固定的固体相作相对运动的现象。 10、担体：担体是一种化学惰性的，多孔性的固体微粒，能提供较大的惰性表面，使固定液以液膜状态均匀地分布在其表面。 11、死时间：从进样到惰性气体峰出现极大值的时间称为死时间.。 12、保留时间：被分离样品组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时的时间，也即从进样开始到出现某组分色谱峰的顶点时为止所经历的时间，称为此组分的保留时间。 13、高效液相色谱法：，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，
生物化学实验报告 姓名：郭玥 学号： 3120100021 专业年级： 2012级护理本科 组别：第8实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心
【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：XX】 实验目的：1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 5、了解柱层析技术 实验原理：1、蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。 2、不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别， 可分离纯化各种蛋白质。 3、盐析法：盐析法是在蛋白质溶液中，加入无机盐至一定浓度或达饱和状态，可 使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。蛋白质溶液中加入中性盐后，由 于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃 至消失。中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷 大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。
4、离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆 的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。 5、醋酸纤维素薄膜电泳原理：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。 它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中 各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电 泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α 2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。 实验材料：人混合血清葡聚糖凝胶（G-25)层析柱 DEAE纤维离子交换层析柱饱和硫酸铵溶液 醋酸铵缓冲溶液 20%磺基水杨酸 1%BaCl 溶液氨基黑染色液 2 漂洗液 pH8.6巴比妥缓冲溶液 电泳仪、电泳槽 实验流程：盐析（粗分离）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→DEAE纤维素离子交换层析（纯化）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定） 实验步骤： （一）盐析+凝胶柱层析除盐：
生物化学实验习题及参 考答案 Document number【980KGB-6898YT-769T8CB-246UT-18GG08】
生物化学实验习题及解答 一、名词解释 1、pI； 2、层析； 3、透析； 4、SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳； 5、蛋白质变性； 6、复性； 7、Tm 值； 8、同工酶； 9、Km值； 10、DNA变性；11、退火；12、增色效应 二、基础理论单项选择题 1、用下列方法测定蛋白质含量，哪一种方法需要完整的肽键（） A、双缩脲反应 B、凯氏定氮 C、紫外吸收 D、羧肽酶法 2、下列哪组反应是错误的（） A、葡萄糖——Molish反应 B、胆固醇——Libermann-Burchard反应 C、色氨酸——坂口（Sakaguchi）反应 D、氨基酸——茚三酮反应 3、Sanger试剂是（） A、苯异硫氰酸 B、2，4-二硝基氟苯 C、丹磺酰氯 D、-巯基乙醇 4、肽键在下列哪个波长具有最大光吸收（） A、215nm B、260nm C、280nm D、340nm 5、下列蛋白质组分中，哪一种在280nm具有最大的光吸收（） A、色氨酸的吲哚基 B、酪氨酸的酚环 C、苯丙氨酸的苯环 D、半胱氨酸的硫原子 6、SDS凝胶电泳测定蛋白质的相对分子量是根据各种蛋白质（） A、在一定pH值条件下所带的净电荷的不同 B、分子大小不同 C、分子极性不同 D、溶解度不同 7、蛋白质用硫酸铵沉淀后，可选用透析法除去硫酸铵。硫酸铵是否从透析袋中除净，你选用下列哪一种试剂检查（） A、茚三酮试剂 B、奈氏试剂 C、双缩脲试剂 D、Folin-酚试剂 8、蛋白质变性是由于（） A、一级结构改变 B、亚基解聚 C、空间构象破坏 D、辅基脱落 9、用生牛奶或生蛋清解救重金属盐中毒是依据蛋白质具有（） A、胶体性 B、粘性 C、变性作用 D、沉淀作用 10、有关变性的错误描述为（）
医学生物化学基本实验 第一节蛋白定量分析实验 蛋白质是一切活细胞和有机体的最重要组成成分，它是构成人体及所有动物机体组织的主要部分。蛋白质是由二十种氨基酸以肽键相互连接而成的复杂的高分子化合物。蛋白质含量可通过它们的物理化学性质，如折射率﹑比重﹑紫外吸收﹑染色等测定而得知，或用化学方法，如微量凯氏定氮﹑folin-酚试剂、双缩脲反应等方法来测定，表2-1为五种蛋白质的测定方法的比较。 表五种蛋白质测定方法比较 方法灵敏度原理干扰物质 凯氏定氮法(Kjedahl法) 0.2～1.0mg 将蛋白质转化为氮，用 酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙 酸沉淀蛋白质而分离） 双缩脲法(Biuret法) 1～20mg 多肽键加碱性铜离子 生成紫色络合物 硫酸铵；Tris缓冲液； 某些氨基酸 Folin-酚试剂法(Lowry法) 5μg 磷钼酸-磷钨酸试剂被 Tyr和Phe还原 硫酸铵；Tris缓冲液； 甘氨酸；各种硫醇 考马斯亮蓝法(Bradford法) 1～5μg 考马斯亮蓝染料与蛋 白质结合时其λmax由 465nm变为595nm 强碱性缓冲液； TritonX-100； SDS 紫外吸收法50～100μg 蛋白质中的酪氨酸和 色氨酸残基在280nm 处的光吸收 各种嘌呤和嘧啶；各种 核苷酸 实验一双缩脲法测定蛋白质含量 【实验目的】 掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和标准曲线的绘制。 【实验原理】蛋白质分子中含有许多肽键，与双缩脲结构类似，在碱性溶液中能与铜离子结合成紫色的化合物（称双缩脲反应）。在一定浓度范围，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，故可用比色法测定蛋白质的含量。含有两个以上肽键的物质才有此反应，故氨基酸无此反应。 【实验内容与方法】 1. 标准曲线的制作 (1) 取小试管7支，编号，按表2-2操作 表2-2 双缩脲法操作步骤