水稻愈伤组织诱导与之植株再生培养体系的建立
1：研究的目的和意义
1.1：研究的目的
1.1.1. 以水稻成熟胚为外植体，寻求一个科学的实验方法，探讨愈伤组织的产生规律。
1.1.
2. 用相同的培养方式对不同类型的籼稻品种和粳稻品种成熟胚进行组织培养，比较不同类型的水稻品种成熟胚愈伤组织诱导率之间的差异。
1.1.3. 通过植株再生培养体系,寻求提高水稻成熟胚的再生频率的方法，建立水稻不同种间成熟胚高效的培养体系。
1.2：研究的意义
1.2.1. 水稻种子是水稻组织培养研究中使用最早的外植体,与其它外植体相比,种子胚具有再生周期短,再生植株育性好,取材不受生长季节的限制,灭菌容易,外植体均匀,重复性好等优点,因而是一种理想的研究材料。但种子胚也存在诱导率不高,品种差异明显等限制因素[1]。为了不断优化该体系的各个环节,人们做了大量研究,有关的研究报道也较多。杨跃生等[2]以籼稻栽培种成熟胚诱导形成的愈伤组织为材料,对影响植株再生的一些因素进行了研究。发现与N6相比MS培养基中的无机大量成分严重抑制再生植株根系生长,但MS的无机微量成份对诱导植株再生的效果则较明显。较高浓度的BA利于诱导更多的植株再生,而较低的BA 浓度则利于壮苗和植株根系的形成。增加诱导培养基或分化培养基中的渗透压和琼脂浓度,维代培养时加入适量的激动素或6-节基氨基嚓吟以及在分化培养基中加入活性炭、玉米素和AgNO3等均可提高水稻愈伤组织的分化成苗率[3]。另有研究则发现脱水处理能有效促进水稻愈伤组织的植株再生[4-6]。
目前用于作物转基因的外植体,主要有胚性悬浮细胞系,成熟胚愈伤组织,幼胚及其愈伤
组织,花药愈伤组织,分生组织盘,萌发的胚!叶或根,茎尖分生组织等,其中成熟胚具有取材方便,不受季节的限制,在转基因研究中有着较为广阔的应用前景，但是到现在为止,适合不同籼稻品种的有效组织培养体系还未建立,特别是釉稻品种成熟胚的组织培养效果很差,因此,严
重影响了籼稻基因工程的开展，为此,进行籼稻愈伤组织的高频率诱导,胚性愈伤组织的保持及高频率绿苗分化的研究,是一项极其重要的水稻细胞工程和基因工程研究的基础工作，因此,研究籼稻成熟胚的组织培养特性,建立杂交水稻亲本成熟胚再生体系具有极其重要的理论和现实意义。
花药培养是水稻组织培养研究和应用较多的外植体,并已经取得了喜人的成果。自从Guha妞和Maheshwari首次从植物花药培养出再生植株以来,目前世界上已有260多种植物成功地获得了花粉植株[9]。仅我国在水稻上选育的品种就有60多个,小麦20多个,推广面积已达179万公顷,增产创收约5亿元[7]。通过花药培养可以加速后代纯合、快速组合多种性状、缩短育种进程、简化选育程序。然而,水稻花药培养的愈伤组织诱导率相当低,籼稻花药组织培养的诱导率一般不超过5%,且幼苗白化率高,绿苗率低于1%[8]。
2：国内外研究的动态
2.1. 基因型对水稻成熟胚培养的影响
基因型是影响水稻品种再生能力的最关键因素之一，在同一培养条件下,愈伤组织诱导率和再生率在不同水稻品种之间存在很大的差异。王志成[10]以扬稻6号和培矮645成熟胚为实验材料,MS为诱导培养基,发现该2个品种在同一培养基上的诱导率存在很大差异,扬稻6号的为72.33%,而培矮645的为49.45%。向阳[11]等人以粕稻品CDR22，Duoxi，K17B成熟胚为实验材料,DNB为培养基诱导愈伤组织。发现3个不同釉稻品种的诱导率存在很大差异,其中CDR22的诱导率达到80%,而Duoxi的为73%, K17B的为35.5%。肖向文[12]等人以蜀恢527，给恢20号，给恢35号，给恢101，R21等5个籼稻品种为实验材料,比较这些籼稻品种愈伤组织在同一培养基上的再生频率,其中绍恢35号再生率最高为35.5%,缙恢101最低的仅为5%。因此可见不同类型的釉稻品种对同一培养条件的反应差异很大,究其原因主要是不同品种之间基因型差异导致不同品种对同一培养条件反应之间的差异。
2.2. 外源激素对粕稻成熟胚培养的影响
外源激素是培养基的极其重要成分,对启动细胞分裂,分化和器官发生具有重要作用。其中2,4一二氯苯氧乙酸(2,4-D)是植物组织培养中最常用的愈伤组织诱导剂,它能有效地诱导植物细胞的脱分化。
2.3. 培养基对粕稻成熟胚组织培养的影响
在植物组织培养中常用的培养基有N6,B5,CC,MS等。在组织培养过程中,各种不同成分的培养基对同一外植体材料造成了培养力的差异。易自力[13]等人通过研究认为CC培养基比较适合籼稻愈伤组织的诱导和继代。但是,不同籼稻品种采用同样的CC培养基,不同品种之间的诱导率仍然产生很大的差异。所以,我们可以根据各种不同培养基成分的特点进行搭配以组合成新的培养基来提高籼稻品种成熟胚愈伤组织诱导率。马炳田[14]等人以N6大量元素, MS微量元素。B5有机成分组合成NMB培养基,对蜀恢527，蜀恢163，蜀881，R128，D62B
等杂交籼稻亲本品种的成熟胚进行愈伤组织的诱导,获得了较高的诱导率。周玲艳[15]等人以MS大量元素，BS微量，有机元素组合成MB培养基,对籼稻品种培矮64S成熟胚进行愈伤组织诱导,获得了较高的诱导率。此外培养基对愈伤组织继代和分化阶段也产生很重要的影响。研究结果表明,在愈伤组织继代阶段,采用不同培养基交替继代方式有利于愈伤组织胚性状态的保持；在愈伤组织分化阶段,在不同分化培养基的愈伤组织的分化率差异显著阴,可见,在籼稻成熟胚组织培养过程中,不同品种及不同培养阶段所需营养元素的成分差别很大,因此,在对不同的粕稻品种成熟胚进行组织培养时,首先应筛选出适合其培养的培养基。
2.4. 存在的问题
2.4.1. 水稻成熟胚组织培养技术虽然发展快,到目前为止已经取得了一定的积极成果,但是，还没有建立起一套完整而有效的水稻成熟胚组织培养再生体系。这主要是因为水稻成熟胚组织培养受其外植体基因型的影响特别大,不同水稻品种对同一组织培养条件的反应有极大的差异。因此,必须加强水稻基因型与成熟胚培养力的内在关系研究,以便从基因水平上提高釉稻成熟胚的培养力。
2.4.2. 水稻成熟胚组织培养的愈伤组织诱导率较低,继代易褐化,而月愈伤组织的胚性状态不好,严重阻碍了基因工程在水稻品种改良上的应用,。因此,应加强提高其愈伤组织诱导率，降低愈伤组织褐化率和提高愈伤组织胚性状态的研究。
2.4.
3. 水稻成熟胚组织培养愈伤组织的分化率较低,加大了试验工作量,延长了研究周期。因此,还应深入进行提高愈伤组织分化率的研究。
3. 主要研究的内容
3.1 不同水稻品种愈伤组织的诱导。
3.2. 愈伤组织的继代增值。
3.3. 水稻不定芽的诱导与增值。
3.4. 生根培养和炼描移栽。
4. 材料和方法
4.1. 材料
本试验所用材料由西南科技大学植物分子育种实验室提供，
常规籼稻品种：
常规粳稻品种：
4.2. 方法
4.2.1. 培养基
诱导愈伤组织培养基：MS+2，4-D+VB1（不同的浓度）+30g/L 蔗糖+0.7%琼脂粉。pH5.8（见下表一）
表一：两种主要生长调节物质及VB1组合配比表及愈伤组织诱导率编号2,4-D/(mg·L-1) 6-BA(mg·L-1) VB1/(mg·L-1) 平均愈伤率/%
1 2.0 0 0.5
2 2.0 0.2 1.0
3 2.5 0.5 2.0
4 2.
5 0.2 2.0
5 2.5 0.5 0.5
6 3.0 0 1.0
7 3.0 0.5 1.0
8 5.0 0 2.0
9 5.0 0.2 0.5
表二：不同浓度的2,4-D对水稻愈伤组织诱导率的影响
2.4-D浓度(mg·L-1)
品种一品种二品种三
总胚数萌发率/% 诱导率/% 总胚数萌发率/%诱导率/%总胚数萌发率/%诱导率/%
0.1 100
0.5 100
1.0 100
1.5 100
2 100
2.5 100
3.0 100 5.0 100
继代培养基：MS+2，4-D（3.0mg/L）+ABA（不同浓度）+30g/L 蔗糖+0.7%琼脂粉，pH5.8(见下表三)。mg·L-1
表三：ABA对愈伤组织生长的影响
编号ABA/(mg·L-1) 愈伤组织块数量/块胚性愈伤组织百分率/%
1 0
2 0.1
3 0.2
4 0.3
5 0.4
6 0.5
分化培养基：MS+6-BA（不同的浓度）+KT（不同的浓度）+NAA （不同的浓度）+30g/L 蔗糖+0.7%琼脂粉，pH5.8（见下表四）。
表四：6-BA、KT、NAA 的不同配比对胚性愈伤组织分化的影响
编号6-BA/
(mg·L-1) KT/
(mg·L-1)
NAA/
(mg·L-1)
组织块数
量/块
分化率/%
1 0.5 2.0 0.1
2 0.5 4.0 0.3
3 0.5 6.0 1.0
4 1.0 2.0 0.1
5 1.0 4.0 0.3
6 1.0 6.0 1.0
7 2.0 2.0 0.1
8 2.0 4.0 0.3
9 2.0 6.0 1.0
表五：诱导培养基中加6-BA对愈伤组织分化不定芽的影响
6-BA浓度(mg·L-1)
品种一品种二品种三
愈伤组
织数
再生组织
数
再生组织
率
愈伤组织
数
再生组织
数
再生组织
率
愈伤组织
数
再生组织
数
再生组织
率
0.5
0.5
1.0
1.0
2.0
2.0
表六：培养基继代对愈伤组织分化芽的影响
品种重复次数愈伤组织数芽诱导率/% 芽数/块诱导效率/% 品种一 1
2
品种二 1
2
品种三 1
2
生根培养基：1/2MS+NAA （0.2mg/L）+30g/L 蔗+0.7%琼脂粉，pH5.8
4.2.2. 愈伤组织诱导
选取有生活力的饱满种子，在超净工作台上用浓度为75%的酒精消毒2min，无菌水冲洗3～5 次后用0.1%升汞消毒15～20min，再用无菌水冲洗3～4遍，置于适量无菌水中浸泡16～20h，倒出水，置于铺有滤纸的培养皿中，用解剖针从盾片处挑出成熟胚。盾片向上接种于愈伤组织诱导培养基上，每皿接种30～50 粒成熟胚。
4.2.3. 分化
选取浅黄色、颗粒状、质地较坚硬密实的愈伤组织,接种到预分化培养基上,进行预分化培养,26℃,暗培养2周;再接种到分化培养基上,进行分化培养,26℃,每天光照16h。
4.2.4. 根的诱导
当愈伤组织在分化培养基上产生的绿芽长到Zcm高时,小心地将绿芽转接到生根培养基上,进行生根培养,26℃,每天光照16h.当根长到约3cm长,苗高12一15cm时将培养瓶移至室外,打开瓶盖,进行炼苗.炼苗2一3d后取出小苗,小自洗去根部培养基,使用盆栽的方法进行培养。
5. 技术路线图
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粉蕉愈伤组织的诱导1 朱军，黄惠琴，方哲，鲍时翔 中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口 (571101) E-mail：bsxhhq@https://www.doczj.com/doc/f06318520.html, 摘要：香蕉是一种重要的热带水果。本文就影响粉蕉愈伤组织诱导的因素（外植体来源、生长调节剂种类、浓度等）进行了研究。其诱导的最佳条件是：以未成熟雄花花序或球茎为外植体，MS＋2,4-D 4 mg/L＋IAA 1 mg/L＋NAA 1 mg/L，28℃下暗培养。以球茎所诱导的愈伤组织诱导率可达89.1%。 关键词：香蕉，愈伤组织，诱导 中图分类号：S668 1. 引言 近年来，利用植物生产人类疫苗和其他药用蛋白越来越受到人们的重视。作为世界上重要的热带水果和粮食作物的香蕉（Musa spp.），因其果实营养丰富、生产周期短、可鲜食等特点而成为理想的植物生物反应器，因此香蕉转基因技术研究尤其显得重要。由于利用愈伤组织作为转化受体并诱导胚状体而再生的转基因香蕉可降低嵌合体发生[1]，且胚性愈伤组织可大量增殖、保存时间长，因此愈伤组织作为香蕉转基因受体受到越来越多研究者的重视。但香蕉是一种愈伤诱导率极低的作物，且品种间差异极大[1～5]。这极大的限制了香蕉转基因技术的研究。本文就粉蕉愈伤组织诱导进行了探讨，希望为我国香蕉转基因技术的研究提供参考。 2. 材料与方法 2.1 材料 选取香蕉品种粉蕉(Musa spp., ABB)为试验材料。 2.2 方法 2.2.1 外植体表面消毒 剥去未成熟雄花花序的苞叶，直至4 cm左右；在70%(体积分数)的酒精中浸泡1 min；再用1 g/L升汞(HgCl)浸泡10 min；取出，用无菌水彻底冲洗汞。假茎、球茎、幼叶取自试管苗，故无须消毒。 2.2.2 不同外植体的处理 选取粉蕉未成熟雄花花序、假茎、球茎、幼叶为外植体。分别将香蕉未成熟雄花花序剥去苞叶直至1.5 cm左右，沿轴线纵切成4块，再横切成厚约1 mm的薄片；假茎切成厚约1 mm左右的薄片；球茎切成小块；幼叶切成10 mm×10 mm方块接入愈伤组织诱导培养基中培养。 1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金资助课题(No.20050565004) 的资助。
实验二愈伤组织诱导及观察 一.实验目的 通过愈伤组织诱导的操作，使同学们了解进行植物组织培养时的一些关键操作技术和方法，如外植体的选择、培养基母液配制、使用液配制、分装灭菌、外植体表面消毒、接种、培养、愈伤组织诱导原理和方法以及接种后污染率，愈伤组织诱导率的统计与观察。使同学们能够亲身体会、了解激素对外植体的作用，还使同学们了解无菌培养的无菌操作，清楚植物体的带菌部位等。 二.实验内容 （一）、实验原理 植物组织培养是指在无菌条件下，对离体植物组织（器官或细胞）分离并在培养基中培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组，因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出全能性，从已经分化定型的细胞，脱分化，成为恢复分裂能力的细胞，并能重新生长发育成完整的植株。愈伤组织就是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的一团细胞。在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。 愈伤组织的形成 从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。 起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素(如机械损伤、改变光照
小麦愈伤组织诱导与其再生培养体系的建立 前言：小麦属于禾本科植物，麦粒在植物学上称为颖果，在种子学上则称为种子，通常称为小麦。麦粒皮色有红白之分，红皮的叫红麦，白皮的叫白麦。由于品种和受环境影响不同，红皮小麦又有深红色和红褐色；白皮小麦又有白色、乳白色或黄白色之分。 一：目的及意义 我国小麦目前的状况有以下几点：1 我国是农业大国，小麦面积4亿亩、产量9000万吨左右，分别占世界总量的 12%和18%，均居世界第一位。2 我国春小麦主要分布在东北、西北及华北北部。据中国粮油信息中心的数据显示，预计中国 03/04市场年度（7月至次年6月）春小麦播种面积仅为190万公顷，较上年度减少5％，这是多年来中国春小麦种植面积首次低于200万公顷；预计03/04年度春小麦产量为580万吨，较02/03年度下降7.48%。我国的小麦种植面积不断的减小，总产量也在不断减少。由于我国目前存在的状况，农业大国，主产小麦，但小麦的产量的质量都不是很好，种植面积又在减少，本研究主要是提高小麦的产量和质量。 二：综述国内外对小麦的研究状况 2.1 小麦愈伤组织诱导及原生质体的分离与纯化张小红，闵东红，邵景侠（西北农林科技大学，陕西杨凌712100） 试验方法：以普通小麦的幼穗和幼胚为外植体进行了愈伤组织诱导，及由幼胚愈伤组织进行了原生质体分离和纯化试验，研究了幼穗和幼胚外植体及低温预处理等因素对愈伤组织诱导的影响，在原生质体分离中研究了酶浓度和配比、酶解时间及蔗糖浓度等因素对幼胚愈伤组织原生质体游离和纯化的影响。结果表明：小麦幼穗离体培养时，以1.0~1.5 cm长度的幼穗有利于愈伤组织的诱导；小麦幼穗和幼胚外植体采后低温储藏时不易超过3 天，时间太长会影响愈伤组织诱导；2.0%纤维素酶＋0.5%果胶酶+0.6 M甘露醇分离原生质体较好，最佳酶解时间为 4~6 h，原生质体产量和活力较高。 2.2 小麦愈伤组织诱导及其植株再生研究进展王廷璞，陈荃，崔爱明，刘瑞媛，马伟超 （天水师范学院生命科学与化学学院，甘肃天水741001） 试验方法：小麦组织培养体系的建立与完善是应用植物基因工程改良小麦品质的重要基础和保证，综述了近年来小麦愈伤组织诱导及植株再生的研究情况。研究资料表明：小麦组织培养中，不同来源和不同生理状态的小麦外植体（幼胚、幼穗、花药、成熟胚、叶、根等），在愈伤组织诱导和获得再生植株的能力方面均显示了优点和不足。不足之处是在生产过程中，不断受到生物、非生物等因素的胁迫，严重影响其产量及品质。 2.3小麦愈伤组织诱导及其再生能力影响因素的研究贾海燕, 王洪刚 ( 山东 农业大学农学院, 山东泰安 271018) 试验方法：以农艺性状较好的24 份小麦品种( 系) 为材料, 筛选出了愈伤组织诱导率高且植株再生能力强的基因型材料山农995604 和F281- 10, 在此基础上对影响愈伤组织的分化能力以及较长时间保持分化能力的因素进行了研究。结果表明, 在愈伤组织的继代过程中, 保持较高浓度的2, 4- D, 或对愈伤组织进行交替继代培养有利于较长时间保持其再生能力。最佳取材时间在开花后15d 左右,
水稻愈伤组织转化 一、实验目的 1.掌握植物组织培养的基本原理； 2.学习水稻愈伤组织的诱导方法； 3.学习农杆菌转化法的原理，掌握农杆菌转化水稻愈伤组织的方法； 4.学习转基因植株的各种鉴定方法（包括PCR检测、GUS染色、Southern-blot、Western-blot、FISH 等），同时能够操作PCR与GUS染色鉴定的方法。 二、实验原理 1.植物组织培养 植物组织培养（plant tissue culture）是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体和花药等，在人工控制的培养基上培养，使其生长、分化以及形成完整植株的技 术。自1902年Haberlandt 首先用紫鸭跖草( Tradescantia )的叶片栅栏组织进行培养来，植物组织培养已有100余年历史。用于离体培养的各种植物材料称为外植体（explant）。根据外植体的类 型，又可将组织培养分为：器官培养、组织培养、胚胎培养、细胞培养以及原生质体培养等。（从这个角度讲，本学期的实验属于胚胎培养。）植物组织培养的理论基础是植物细胞全能性。 2.基因工程 基因工程技术是在离体条件下对不同生物的遗传物质(DNA)进行人为“加工”，并按照人们的意愿重新组合，以改变生物的性状和功能，然后再通过适当的载体将重组DNA转入生物体或细胞 内，并使其在生物体内或细胞中表达，从而获得新的生物机能。这种利用基因工程技术获得的植 物一般称为“基因工程植物”。自1983年首次获得转基因植物以来，转基因技术发展十分迅速， 成功进行转基因的植物已达60多种，在世界上批准进入田间试验的转基因植物已超过500例，有些转基因产品已进入市场。通过基因工程改良作物品种在未来的农业生产中日益显示出巨大潜力。 3.农杆菌转化法 转基因的方法有很多，对于植物而言，最常用的是农杆菌转化法和基因枪法。农杆菌转化法使用的是根癌农杆菌，其内含Ti质粒：
班级：植物092 姓名：徐炜佳学号：0901080223 愈伤组织的诱导和培养 一、实验目的及意义 植物愈伤组织的诱导和培养在植物科学的基础研究和应用研究中都有重要的意义。通过本次实验，可以初步掌握植物外植体材料消毒、接种的无菌操作技术，愈伤组织的诱导方法和愈伤组织继代培养的方法。 二、实验原理 植物组织与细胞培养是应用无菌操作的方法培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择适当的消毒剂对植物外植体进行表面消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得植物组织培养，成功的基本前提和重要保证。由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织（callus）。植物生长调节剂如2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）等是诱导外植体形成遇上组织的重要因素。 三、实验仪器与药品 超净工作台，酒精灯，镊子，剪刀，解剖刀，75%乙醇，酒精消毒棉 材料：烟草无菌苗，甘薯无菌苗 四、实验步骤 1.按下表分别配制培养基
将配置的四种培养基分别分装入20个培养瓶，高温灭菌后水平放置凝固 2.接种前，将实验所需器具放入超净工作台，打开紫外灯灭菌20~30min，关闭紫外灯，开启通风开关。洗手后用酒精喷洒消毒手、手臂、实验材料及培养基外部等进入超净工作台的部分。进入超净工作台，用酒精棉擦拭台面（手勿伸出工作台），台面完全风干后点燃酒精灯。 3.接种开始时，将镊子及手术刀在酒精中浸泡，并在酒精灯外焰上烧炽片刻，充分冷却。取幼嫩的烟草（甘薯）叶片，用手术刀切割成小片，再用镊子将其接种至相应的培养基上，每瓶接种3~5片，封口后取出超净工作台，标注姓名、日期、培养基和接种材料。 4.将上述培养材料常温暗培养，每隔7天观察一次，并记录培养情况 五、实验结果
水稻愈伤组织的诱导 李希 北京科技大学化学与生物工程学院生物科学与技术系，北京，100083 摘要：以水稻种子为外植体，研究了外植体的消毒方法和接种技术，了解了水稻愈伤组织诱导的过 程。结果表明水稻种子接种在诱导培养基上两天已产生愈伤组织发芽2mm，四天愈伤组织呈现浅黄色发芽5-10mm，6天愈伤组织颜色加深发芽1-2cm，8天愈伤组织为橙黄色发芽2-3cm，无杂菌污染。 关键词：水稻种子外植体诱导愈伤组织 引言 自Niizeki和Oono1968年首次获得水稻花粉植株以来，水稻组织培养取得了很大的进展，如各种水稻品种愈伤组织的诱导、继代、植株再生培养基的筛选，遗传特性，基因工程转化体系的建立等等。水稻种子愈伤组织的诱导是这些研究的基础，因此掌握外植体的消毒方法和接种技术，了解了水稻愈伤组织诱导的过程至关重要。以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养时，在一定的诱导培养条件下都能诱导形成愈伤组织。外植体源自自然环境均为带菌状态，在接种前都必须进行消毒。对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用。本次试验使用的诱导剂为2,4-D，诱导率为100%。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1实验材料 水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）； 1.1.2仪器设备及用具 超净工作台培养室、培养皿：￠9cm×2 枪形镊量筒：100mL×2 三角瓶：50mL×2(无菌)；废液缸；保鲜膜；标签纸 1.1.3试剂及培养基 试剂：75%酒精，2% NaCLO，无菌水(每组1瓶400mL) 培养基：诱导培养基：MS+2,4-D 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L（pH5.8） 1.2 实验方法 1.2.1 MS固体培养基配制： 由于实验室中的MS培养基已含有蔗糖和琼脂，所以直接按照41.5g/L的浓度配置。实验中配置50ml培养基，需依次加入2.075gMS，0.1mg2,4-D； 用NaOH或HCl调节PH=5.8； 高压蒸汽锅121℃灭菌20min。 1.2.2接种室、培养基及用具表面消毒 用75%酒精棉球试擦超净工作、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，20分钟以表面消毒。之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30分钟后可进行无菌操作。 1.2.3种子去壳 选取饱满、无霉变成熟水稻种子，用手工脱去谷壳（注意保持胚完整），准备20粒去壳种子，
0．填空 1.根据培养的材料,植物组织培养分:愈伤组织培养、(器官培养、细胞格养、原生质体培养(悬浮培养 2.植物组织培养的发展分为三个阶段:萌芽阶段、奠基阶段，快速发展和快速发展和应用阶段 3，1902年,Haberlandt提出了植物细胞“全能性”学说,1934年, White出版了《植物组织培养手册》培养等类型从而使植物组织培养为一门新兴学科。 一．填空、 1，组织培养实验室必要的设备有超净工作台、高压灭菌器、调机、_天平、显微镜、_蒸馏水，发生器，酸度计 养基成分主要包括①无机营养成分、②有机营养成分)、_③植物生长调节物质、_④碳水化合物、⑤其它物质 3、培养基最常用的碳源是_蔗糖,使用浓度在1%-5%常用3% 4、糖在植物组织培养中是不可缺少的,它不但作为离体组织棱以生长的碳源而且还能维持培养基渗透压 5、在固体培养时琼脂是使用最方便、最好的凝固剂和支持物般用量6-10g/L之间 6.驯化的目的:在于于提高试管苗对外界环境条件的适应性,提高其光合作用的能力,促使试健壮,提高苗的移裁成活 7、生长素/细胞分裂素的高低决定着外植体的发育方向,其比值高:有利于根的形成和愈伤组织的形成:低:有利于芽的形成 8、培养基灭菌一般在108kPa的压力下,锅内温度达_121℃C,维持_20-30min、 9.选择外植体时应选择①选择优良的种质、②选健壮的植株、③选最适的时期和④选取适宜的大小。 10、诱导胚状体比诱导芽的优点:(1)数量多、(2)速度快、_(3)结构完整 11、试管苗的生态环境:高温且恒温、高湿、弱光、无菌 12、培养基中加入活性炭的目的:利用其吸附能力,减少一些有害物质的影响大 13、筛选培养基的方法:单因子试验法、多因子试验法、广谱实验法 14、植物培养技术:灭菌、接种种、培养、驯化四个环节 15、试管苗的驯化注意:基质、温、光、水、肥、气的综合管理 二．填空 1.绝大多数培养植物再生植株时都先经过愈伤组织阶段 2.愈伤伤组织形成大致经历诱导期、分裂期一和分化期三个时期 3、愈用植物生长调节物质时要注意:种类和浓度生长素和细胞分裂素的比值4.愈伤组织的形态发生方式主要有不定芽方式和胚状体方式 5.组织培养细胞再分化包括四个水平:细胞水平的再分化、组织水平的再分化、器官水平的再分化(器宣发生)和植株水平的分化 三．填空: 1.植物器官培养主要是指植物的根、茎、叶、花器和幼小果实的无菌培养。 2、茎尖培养根据培养目的和取材大小分为茎尖分生组织培养和普通茎尖培养两种类型。前者主要是对茎尖长度不超过,最小只有几十微米的茎尖进行培养,目的是获得无病毒植株:后者是对几毫米乃至几十毫米长的茎尖、芽尖及侧芽的培养,目的是离体快繁 3.不定芽产生的途径一是从外植体上直接产生二是从由外植体诱导产生的愈伤组织上产生 4.离体叶培养是指包括叶原基、叶栖、叶鞘、叶片、子吐等叶组织的无菌培养 5.在离体叶培养中,6-BA和KT利于芽的形成;24D利于愈伤组织的形成 四．填空 1、胚胎培养包括幼胚培养、成熟胚培养、胚乳培养、胚珠培养以及子房培养 2、离体胚的培养分为二种类型:。成熟胚培养和_幼胚培养六
水稻愈伤组织的诱导 一、实验目的 1、掌握外植体的消毒方法和接种技术； 2、了解愈伤组织诱导的过程。 二、实验原理 以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养时，在一定的诱导培养条件下都能诱导形成愈伤组织。愈伤再经分化培养，通过器官发生途径或体细胞胚胎发生途径可再生成植株。 外植体源自自然环境均为带菌状态，在接种前都必须进行消毒。对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用；对于多茸毛表面粗糙不平的材料，要加展著剂（吐温20）以增强消毒效果。 三、实验材料与用具 1、材料：水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）； 2、试剂：75%酒精，2% NaCLO，无菌水(每组1瓶400mL)； 3、培养基：诱导培养基：NB+2,4-D 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L（pH5.8）； 4、仪器设备：培养室、超净工作台、培养皿（￠9cm）2个、枪形镊、量筒（100mL）2个、三角瓶（50mL、无菌）2个、废液缸、保鲜膜、标签纸。 四、实验步骤 1、接种室、培养基及用具表面消毒 用75%酒精棉球试擦超净工作台、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，照射20分钟以表面消毒。之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30分钟后可进行无菌操作。 2、种子去壳 选取饱满、无霉变、成熟的水稻种子，手工脱去谷壳（注意保持胚完整），每人准备30粒去壳种子，并按照分组放到三角瓶中。 3、操作者双手的清洗与消毒
在进入无菌室之前，各操作者先用自来水清洗干净双手并晾干，然后进入无菌室，坐在超净台前位子上后，用含75%酒精的酒精喷壶喷洒双手对双手进行消毒，在超净台风口待双手酒精风干后进入超净工作台。（注意：酒精喷壶喷洒双手时切记不要把酒精喷到超净台的有机玻璃板上！） 4、超净台面的表面消毒（以下工作在超净工作台内进行） 用枪形镊子从含75%酒精棉球的容器中取一团棉球，仔细把整个超净台面擦试一遍，尽量降低超净台面的带菌量，并将废棉球丢到废液缸中，然后点亮超净台里面放置的酒精灯。 5、外植体消毒（分组操作，每组由一位代表操作完成外植体的消毒工作） 将脱谷壳米粒转到一50mL 无菌三角瓶→加适量无菌水洗一次（以没过种子为准，下同）→弃水，倒入75%酒精适量，摇动搅拌，放置30秒（过程中适当轻摇动混匀）→弃酒精→加适量无菌水洗一次→弃水→倒入适量2% NaCLO ，不时摇动搅拌，共处理30分钟→弃NaCLO →用无菌水洗3次，每次停留1分钟→倒去无菌水，将种子从三角瓶转到带无菌滤纸的无菌培养皿中吸干。 6、接种与观察 将吸干的消毒种子用无菌的镊子接入培养基并均匀放置，每皿接10粒，每人共接种2皿。接种完成后，将培养皿盖上并用保鲜膜封口，然后将接种有材料的培养皿移出超净台，贴上标签写明日期、接种人，按照班级统一放入一篮子，再将篮子放入培养室进行25℃暗培养。注意每隔2-3天前来观察一次实验现象，1周后调查计算污染率，14天后调查计算愈伤组织诱导率。 五、实验结果 本次实验我组未出现被污染的种子，污染率均为0 。说明实验过程中，我组成员操作规范，保证所接种的种子均不受到污染。 最后，我组的2个培养皿分别可以诱导出7和8株水稻苗，诱导率分别为70% ×100% 形成愈伤组织的种子数 污染率(%)= ×100% 污染的种子数 接种的总种子数 诱导率 (%)= 接种的总种子数
中 国 海 洋 大 学 实 验 报 告 姓名： 马宁 专业年级： 生命基地班2009级 学号： 040212009020 课程： 植物生理学实验 题目： 植物愈伤组织诱导培养基的配制 一 .实验目的 1、掌握植物组织培养基母液配制的原则。 2、掌握植物MS 培养基的配制方法。 3、学会使用高压灭菌锅。学会植物组织含水量、自由水和束缚水含量的测定 二 .实验原理 概念： 1.植物组织培养： 将植物的器官组织以至单个细胞，应用无菌操作方法，使其在人工条件下，能够分裂、增殖、分化发育成一完整植株的过程。 2.愈伤组织及脱分化、再分化： 植物的组织在人工培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，可以重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织，这一过程称为“脱分化作用”。而已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称为“再分化作用”。植物激素在“再分化”过程中起着重要作用，生长素和细胞分裂素的比例，决定了根和芽的分化。 培养基配置见下表 化合物 含量 mg/L 母 液 吸取母 液量 ml/L 编号 浓度 mg/ml 称量 mg 配制量 ml NH 4NO 3 1650 1 33 16500 500 25 KNO 3 1900 38 19000 KH 2PO 4 170 3.4 1700 MgSO 4.7H 2O 370 7.4 3700 CaCl 2.2H 2O 440 2 8.8 4400 500 25
三 .主要仪器试剂 三蒸水、蔗糖、琼脂、用分析纯试剂：NH4NO3、KNO3、KH2PO4、MgSO4?7H2O 、CaCl2?2H2O 、 ZnSO4?7H2O 、MnSO4?4H2O 、H3BO3预先配制好的不同组分的培养基母液、2-4D 溶液、烧杯、移液管、铁缸子、玻璃棒、手套、加热器等。 四.实验操作步骤 1、母液的配制（教师配好） 1）配制母液的好处和原则 （1）好处 a.可减少每次配制称量药品的麻烦. b.减少极微量药品在每次称量时造成的误差。 母液配成10~100倍，2－4℃冰箱中保存，用时按比例稀释。 （2）原则：按照药品的种类和性质（相似）分别配制，避免形成沉淀。 2）实验中用到的各母液 ZnSO 4.7H 2O 8.6 3 0.86 430 500 5 MnSO 4.4H 2O 22.3 2.23 1115 H 3BO 3 6.2 0.62 310 NaMoO 4.2H 2O 0.25 4 0.25 125 500 0.5 CuSO 4.5H 2O 0.025 0.025 12.5 CoCl 2.6H 2O 0.025 0.025 12.5 KI 0.83 5 0.083 41.5 500 5 Na-EDTA 37.3 6 7.46 3730 500 2.5 FeSO 4.7H 2O 27.8 5.56 2780 盐酸硫胺素 0.1 7 1 25 25 0.05 盐酸吡多醇 0.5 8 1 25 25 0.25 肌醇 100 9 20 1000 50 2.5 甘氨酸 2 10 1 50 50 1 烟酸 0.5 11 1 25 25 0.25
实验1 愈伤组织的诱导 1、实验目的 （1）学习植物材料表面灭菌的常规方法； （2）了解接种的无菌操作技术； （3）学习诱导植物器官形成愈伤组织的方法。 2、实验原理 植物组织培养是应用无菌操作的方法，培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择合适的消毒剂对植物外植体进行消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得组织培养成功的前提和重要保证。 由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上，可以通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织。 3、实验仪器和试剂 仪器：超净工作台、光照培养箱、酒精灯、打火机、记号笔、脱脂棉、75%酒精及棉球。 无菌器材：无菌吸水纸（定性滤纸）、灭菌培养皿、无菌水、镊子、解剖刀。 植物材料：直根胡萝卜、烟草叶片。 试剂：95%乙醇、0.1%氯化汞。 培养基：MS+1mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+10g/L琼脂,pH5.8 4、实验步骤 （1）接种前，用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，将培养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯及接种间紫外灯，照射约30 min，然后关闭紫外灯，通风20 min后，打开日光灯即可进行无菌操作。 （2）外植体预处理：将胡萝卜根用流动的自来水冲洗干净，用小刀削去其表皮1-2mm，切成大约15-20mm厚的块段。 （3）以75%乙醇棉将手擦试一遍。以下操作全部在无菌条件下进行。
（4）外植体消毒：用0.1%的升汞消毒1min-3min（烟草叶片消毒10秒钟左右）,然后用无菌水中漂洗3次，每次2分钟。 （5）将胡萝卜片放入垫有无菌滤纸的培养皿中，一手用消毒好的镊子固定胡萝卜，一手用灭菌后的解剖刀切除胡萝卜块段截面的表面部分，余下部分切成包含形成层的长、宽约5mm，厚约5mm的小块。在完成切割后，将解剖刀和镊子放入95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌之后，放回原处，待冷却后即可使用。注意：在每一次使用镊子、解剖刀后，都要对其消毒一次。 （6）接种：在酒精灯焰附近处，用无菌镊子夹取胡萝卜薄片并迅速半插入琼脂培养基上，每皿放4-5片，注意将近根尖的一面接触培养基。将培养皿口在酒精灯焰上小心地轻转灼燎数秒，立即用封口膜封好瓶口。 （7）培养：将接种后的三角瓶放到光照培养箱中，在25℃下的黑暗中培养3-4周。 5、结果记录与分析 （1）接种1周-10天后，调查、计算污染率： 污染率(%)=污染的材料数/接种材料数×100% （2）每周观察并记录胡萝卜外植体产生愈伤组织的情况，包括出现愈伤组织前培养物的形态，愈伤组织出现的时间以及愈伤组织的形态特征（愈伤组织的颜色、质地等），4周后调查、计算愈伤组织诱导率： 诱导率（%）=形成愈伤组织的材料数/接种材料数×100% 6、思考题 （1）分析影响愈伤组织诱导的主要因素。 （2）以胡萝卜为材料为什么要强调要切取含有形成层部分，胡萝卜其它部分（如茎、叶、花）能否诱导出愈伤组织？ 实验二真菌菌丝DNA提取 1实验目的 学习利用CTAB法少量提取真菌菌丝体DNA，同时掌握在DNA提取中各
水稻愈伤组织的诱导 、实验目的 1、掌握外植体的消毒方法和接种技术； 2、了解愈伤组织诱导的过程。 二、实验原理 以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养时，在一定的诱导培养条件下都能诱导形成愈伤组织。愈伤再经分化培养，通过器官发生途径或体细胞胚胎发生途径可再生成植株。 外植体源自自然环境均为带菌状态，在接种前都必须进行消毒。对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用；对于多茸毛表面粗糙不平的材料，要加展着剂（吐温20）以增强消毒效果。 三、实验材料与用具 1、材料：水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）； 2、试剂：75%酉精，2% NaCLO无菌水（每组1瓶400mL）; 3、培养基：诱导培养基：NB+2,4-D 2mg/L+蔗糖30g/L+ 琼脂8g/L （pH5.8）; 4、仪器设备：培养室、超净工作台、培养皿（C 9cm）2个、枪形镊、量筒（100mL 2 个、三角瓶（50mL无菌）2个、废液缸、保鲜膜、标签纸。 四、实验步骤
1、接种室、培养基及用具表面消毒 用75%酒精棉球试擦超净工作台、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，照 射20分钟以表面消毒。之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30 分钟后可进行无菌操作。 2、种子去壳 选取饱满、无霉变、成熟的水稻种子，手工脱去谷壳（注意保持胚完整），每人准备 30 粒去壳种子，并按照分组放到三角瓶中。 3、操作者双手的清洗与消毒 在进入无菌室之前，各操作者先用自来水清洗干净双手并晾干，然后进入无菌室，坐在超净台前位子上后，用含75%酒精的酒精喷壶喷洒双手对双手进行消毒，在超净台风口待双手酒精风干后进入超净工作台。（注意：酒精喷壶喷洒双手时切记不要把酒精喷到超净台的有机玻璃板上！） 4、超净台面的表面消毒（以下工作在超净工作台内进行） 用枪形镊子从含75%酒精棉球的容器中取一团棉球，仔细把整个超净台面擦试一遍，尽量降低超净台面的带菌量，并将废棉球丢到废液缸中，然后点亮超净台里面放置的酒精灯。 5、外植体消毒（分组操作，每组由一位代表操作完成外植体的消毒工作） 将脱谷壳米粒转到一50mL无菌三角瓶一加适量无菌水洗一次（以没过种子为准，下同）一弃水，倒入75%酉精适量，摇动搅拌，放置30秒（过程中适当轻摇动混匀）一弃酒精f加适量无菌水洗一次f弃水f倒入适量2% NaCL O不时摇动搅拌，共处理30分钟一弃NaCL f用无菌水洗3次，每次停留1分钟f倒去无菌水，将种子从三角瓶转到带无 菌滤纸的无菌培养皿中吸干。 6、接种与观察
水稻愈伤组织的诱导实验 报告 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020
水稻愈伤组织的诱导 一、实验目的 1、掌握外植体的消毒方法和接种技术； 2、了解愈伤组织诱导的过程。 二、实验原理 以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养时，在一定的诱导培养条件下都能诱导形成愈伤组织。愈伤再经分化培养，通过器官发生途径或体细胞胚胎发生途径可再生成植株。 外植体源自自然环境均为带菌状态，在接种前都必须进行消毒。对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用；对于多茸毛表面粗糙不平的材料，要加展着剂（吐温20）以增强消毒效果。 三、实验材料与用具 1、材料：水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）； 2、试剂：75%酒精，2% NaCLO，无菌水(每组1瓶400mL)； 3、培养基：诱导培养基：NB+2,4-D 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L（）； 4、仪器设备：培养室、超净工作台、培养皿（￠9cm）2个、枪形镊、量筒（100mL）2个、三角瓶（50mL、无菌）2个、废液缸、保鲜膜、标签纸。 四、实验步骤
1、接种室、培养基及用具表面消毒 用75%酒精棉球试擦超净工作台、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，照射20分钟以表面消毒。之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30分钟后可进行无菌操作。 2、种子去壳 选取饱满、无霉变、成熟的水稻种子，手工脱去谷壳（注意保持胚完整），每人准备30粒去壳种子，并按照分组放到三角瓶中。 3、操作者双手的清洗与消毒 在进入无菌室之前，各操作者先用自来水清洗干净双手并晾干，然后进入无菌室，坐在超净台前位子上后，用含75%酒精的酒精喷壶喷洒双手对双手进行消毒，在超净台风口待双手酒精风干后进入超净工作台。（注意：酒精喷壶喷洒双手时切记不要把酒精喷到超净台的有机玻璃板上！） 4、超净台面的表面消毒（以下工作在超净工作台内进行） 用枪形镊子从含75%酒精棉球的容器中取一团棉球，仔细把整个超净台面擦试一遍，尽量降低超净台面的带菌量，并将废棉球丢到废液缸中，然后点亮超净台里面放置的酒精灯。 5、外植体消毒（分组操作，每组由一位代表操作完成外植体的消毒工作） 将脱谷壳米粒转到一50mL无菌三角瓶→加适量无菌水洗一次（以没过种子为准，下同）→弃水，倒入75%酒精适量，摇动搅拌，放置30秒（过程中适当轻摇动混匀）→弃酒精→加适量无菌水洗一次→弃水→倒入适量2% NaCLO，不时摇动搅拌，共处理30分
一.实验目的 通过愈伤组织诱导的操作，使同学们了解进行植物组织培养时的一些关键操作技术和方法，如外植体的选择、培养基母液配制、使用液配制、分装灭菌、外植体表面消毒、接种、培养、愈伤组织诱导原理和方法以及接种后污染率，愈伤组织诱导率的统计与观察。使同学们能够亲身体会、了解激素对外植体的作用，还使同学们了解无菌培养的无菌操作，清楚植物体的带菌部位等。 二.实验内容 （一）、实验原理 植物组织培养是指在无菌条件下，对离体植物组织（器官或细胞）分离并在培养基中培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组，因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出全能性，从已经分化定型的细胞，脱分化，成为恢复分裂能力的细胞，并能重新生长发育成完整的植株。愈伤组织就是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的一团细胞。在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。 愈伤组织的形成 从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。 起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素(如机械损伤、改变光照强度、增加氧等)和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸的合成。机械损伤能诱导植物体细胞开始分裂，如伤口上会出
植物组织培养基的配制与植物愈伤组织诱导 一、实验目的； 通过植物组织培养基和植物愈伤组织诱导实验的学习和训练，使学生了 解植物组织培养的基本原理和操作技术，初步掌握MS固体培养基制备 方法、外植体的常规灭菌技术以及愈伤组织诱导方法。 二、实验原理： 根据植物细胞全能性原理，培养植物材料。即在无菌条件下，将植物的器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）放在人工培养基上进行培养，通过细胞分裂，形成一团薄壁细胞，即愈伤组织。愈伤组织可以在适宜的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下进行再分化，重新产生出植物的各种器官和组织，进而发育成完整的植株。 三、实验内容实验包括以下3部分内容: 实验1-1、植物组织培养基母液的配制和保存 实验1-2、MS培养基的配制与灭菌 实验1-3、胡萝卜愈伤组织的诱导 实验1-1植物组织培养基母液的配制和保存 1、目的要求学习植物组织培养基母液的配制方法，为培养基的配制 做准备。 2、基本原理植物培养基是植物离体培养的组织或细胞赖以生存的营养基质，是为离体培养材料提供近似活体生存的营养环境，主要包括水、大量元素、微量元素、铁盐、有机复合物、糖、凝固剂和植物生长调节等物质。
在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将培养基成分首先配 制成比实际培养基浓度大若干倍的母液，然后在配制培养基时，再根据所需浓度，按比例稀释。本实验以MS培养基为例，学习培养基母液的 配制。 MS培养基母液可分为：MS大量元素母液、MS微量元素母液、MS铁盐母液和MS有机化合物母液等。另外，还要配制生长激素母液，在不同类型的培养基中使用。 3、实验仪器设备和试剂3.1仪器、用具 分析天平、酸度计（或pH试纸）、冰箱、药匙、玻棒、称量纸、滴管、洗瓶、记号笔、烧杯（50ml、100ml、200ml）、容量瓶（100ml、500ml、 1000ml）、磨口试剂瓶（100mL、200mL、500ml、1000ml）、量杯、量 筒、移液抢、微波炉等。 3.2试剂 （1）95%乙醇、1mol/L NaOH、1mol/L HCl。 （2）MS培养基成分： ①大量元素（母液I ）: NHNO、KNO CaCb2H2O MgSO7mO KHPO; ②微量元素（母液口）: KI、HBQ MnSQ4H2O ZnSQ.7H2O NQM0Q.2H2O CuSQ5H2O C0CI2.6H2Q；③铁盐（母液川）:FeSQ.7H2Q NQ.EDTA.2H2Q； ④有机成分（母液,维生素和氨基酸）：肌醇、盐酸吡哆醇（维生素&）、烟
植物组织培养在实际当中的应用 摘要：植物细胞要表现出全能性，须经过脱分化、再分化等一系列过程。在实际应用中可用胚状体作为特定的优良基因型个体的无性繁殖手段，同时在研究胚胎发育中也有很重要的理论意义。随着科学技术的不断进步，植物组织培养这门崭新的技术将日益普及和深入，成为现代农业生产中重要的技术手段 关键字：脱分化,愈伤组织,原生质体,脱毒苗,培养基 形成芽的培养基条件常有不同，可以同时在组织培养中形成，一般说，培养物中形成的芽如胡萝卜悬浮培养，油菜愈伤组织等。在组织培养中通过根、芽诱导再生植株方式有三种：一种在芽产生之后，于芽形成的基部长根而形成小植株，一种是在根上生长出芽来，另一种即在愈伤组织的不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株植物。除营养芽之外，在组织培养中有时也有花芽的形成，如烟草、花生等。也有变态器官的形成，如百合鳞片切块分化出的芽，形成小鳞茎，唐菖蒲茎端可诱导形成小球茎，马铃薯的茎切段可以形成块茎。 在很多禾谷类作物的组织培养中发现，用较高浓度的生长素（2，4-D）诱导形成的愈伤组织，当培养在除去生长素，或适当浓度的活性较低的生长素中时，就可以诱导芽的形成。Nitsch等用Linsmaier(LM)培养基附加10-5摩尔2，4-D 培养水稻愈伤组织可以生根，一旦转入无生长素的培养基时就能产生芽。Rangan 将小米愈伤组织从含生长素的培养基转移到无生长素的培养基，一个星期内就形成了芽。 但在另一些例子中激素比例控制器官分化的问题则出现完全相反的情况。苜蓿在有2，4-D和细胞分裂素的培养基中，可以形成愈伤组织，转入不加以上两种激素的培养基中能分化，但分化的情况与原来的激素比例有关。如果愈伤组织是在高细胞分裂素/生长素比例的培养基中形成的，易于生根，而在高生长素/ 细胞分裂素比例的培养基中形成的，易于生根，而在高生长素/细胞分裂素比例的培养基中形成的愈伤组织，则易生芽。由此看来，分化与激素的关系同植物的
中国海洋大学实验报告 2015 年 4 月23 日姓名###云年级BBB专业UUUUUU学号HHHHHHHHHHHH 课程细胞工程学实验题目植物愈伤组织诱导实验 一、实验目的 1、掌握植物愈伤组织诱导、继代、器官分化的原理； 2、掌握植物组织接种培养的整个无菌操作的过程； 3、熟悉超净工作台的使用。 二、实验原理 植物组织培养是将植物的器官组织以至单个细胞，应用无菌操作方法，使其在人工条件下，能够分裂、增殖、分化发育成一完整植株的过程。植物的组织在人工培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，可以重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织，这一过程称为“脱分化作用”。而已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称为“再分化作用”。植物激素在“再分化”过程中起着重要作用，生长素和细胞分裂素的比例，决定了根和芽的分化。超净工作台是一种水平单向流型局部空气净化设备。 三、实验仪器试剂 1、仪器：镊子、解剖刀、烧杯、酒精灯、试剂瓶、含有培养基的培养瓶、培养皿、金属盘、记号笔 2、用品：胡萝卜、75%酒精、10%次氯酸钠、无菌水 四、实验步骤： （1）用70～75%的酒精棉擦拭双手和操作台面，进行常规的无菌操作准备。
（2）将植物体用准备好的自来水冲洗后,用酒精棉擦拭取材部位表面, 于70%酒精中浸沾数秒钟。 （3）将材料放入已灭菌的100ml试剂瓶中，加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡5分钟。（4）弃次氯酸钠浸泡液，再加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡10分钟。 （5）弃次氯酸钠浸泡液，用准备的无菌水浸泡漂洗3～4次，每次1～2分钟，用无菌镊子搅动。 （6）将已灭菌的植物材料置于平板内，按无菌操作要求剥去外皮，用解剖刀切成5mm 厚的薄片，弃去两头的两片，取中间部分的薄片，用镊子将其接种在愈伤组织诱导培养基上，注意圆片的切口朝向培养基，每瓶4～6片，均匀分散。 （7）将瓶口和瓶盖在酒精灯火焰上方一过，拧紧瓶盖。 （8）在培养瓶下部的培养基高度位置作记号。 （9）将接种后的三角瓶，培养于25℃光照条件下20天左右. （10）实验结束后用过的仪器等恢复原样，清洁实验台面，一切东西归位。 五、实验现象及结果 （1） 刚开始正常生长，从第二节实验课开始直至实验课结束，持续观察中发现组织块
实验一植物愈伤组织诱导培养基的配制 一、实验目的 1、掌握植物愈伤组织诱导、继代、器官分化的原理。 2、培养基的配制，灭菌等基本实验操作技术。 二、实验原理 植物组织培养是将植物的器官组织以至单个细胞，应用无菌操作方法，使其在人工条件下，能够分裂、增殖、分化发育成一完整植株的过程。植物的组织在人工培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，可以重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织，这一过程称为“脱分化作用”。而已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称为“再分化作用”。植物激素在“再分化”过程中起着重要作用，生长素和细胞分裂素的比例，决定了根和芽的分化。 三、仪器试剂 培养皿及培养架、光照培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、解剖刀、弯头镊子、剪子、100ml烧杯、培养皿（或不锈钢浅盘）、封口膜、棉线、橡皮筋、次氯酸钠（或HgCl2）、MS 培养基全部试剂、植物激素及生长调节物质、无水乙醇、工业酒精、胡萝卜 四、实验步骤 1、培养基的制备 ①用于配制培养基的水最好是三蒸水。 ②所用的各种化学药品：分析纯级别的试剂，避免药品的交叉污染和混杂。 ③配制培养基最方便的方法是预先配制好不同组分的培养基母液，存放在2～4℃冰箱内，使用时按比例稀释配用即可。 2、MS培养基的制备 ①按照配方配制培养基时,先将储存母液按顺序摆放好，根据欲配制的总体积，量取各种不同体积的母液，加入2，4-D(2mg/L)，先加三蒸水至大约400ml。 ②称取加入蔗糖(浓度3%)，调节pH至5.7-5.8。
③加入琼脂（8-9g/L）加热搅拌溶解，沸腾后立即端离火源（第一个大气泡从缸底上升顶破泡沫层），分装在100ml的三角培养瓶中（一般以容器的1/3～1/4体积为宜），拧紧瓶盖。（培养基的pH值直接影响培养物对离子的吸收，过酸或过碱不仅影响到培养材料的生长，而且还影响到琼脂的凝固。 经高压高温灭菌后，由于某些成分的降解或氧化，酸度会增加（pH值一般可降低0.2），因此调整pH值时应加以考虑。） 3、灭菌 放入高压蒸汽灭菌锅灭菌，1.1kg·cm-2，121℃保持15～20分钟即可。为保证灭菌彻底，在增压前应先将灭菌锅内的冷空气排尽，当灭菌完成后，应切断热源，待锅内气压接近“0”时，方可打开放气阀，将余气放尽，再打开灭菌锅。 4、培养基的存放 经高压灭菌的培养基凝固后，宜放在培养室中预培养3～5天，若没有污染才可使用。暂时不用的培养基应放置在10℃以下保存，而含有生长调节物质的培养基则在4～5℃低温下保存更好。 5、植物愈伤组织诱导培养基的制备 1、每2人一小组，自由组合，固定。每5小组为1中组 2、MS培养基的配制 a、母液的配制（已准备好） b、培养瓶洗刷（每人一个） c、每中组配制500mlMS培养基，（含琼脂4.5g，蔗糖15g，2,4-D母液1ml），调节 PH，分装，灭菌 3、每人准备100ml/瓶去离子水→灭菌（无菌水) 4、每人100ml烧杯/试剂瓶→灭菌（无菌烧杯） 5、每2人一套平板，清洗，灭菌 每一中组的同学分工合作完成上述工作 五、实验结果 MS培养基植被完成。植物组织培养前期准备完成。 六、思考题 注意事项： 1、实验过程中保持安静 2、不浪费 3、学会试剂的配制，母液的稀释等 4、提前预习实验 5、所有的东西都要即时标记好，日期，名称，浓度等(标注可以组别-姓名，如1-姓名或1-姓名单字母缩写） 6、自己用过的器皿要自己洗刷，并灭菌，以备下组同学使用。 7、实验结束后用过的仪器等恢复原样，清洁实验台面，一切东西归位，每天最后一组同学统一打扫卫生。 思考题： 1、培养基配制应注意哪些问题？ 答：1、试剂称取时要准确；2、不要浪费；3、注意调节pH；4、器皿要清洗干净；5、培养基分瓶时要及时否则会凝固。