w e s t e r n的操作步骤 Document number【AA80KGB-AA98YT-AAT8CB-2A6UT-A18GG】
W e s t e r n B l o t操作全过程一，收蛋白
a（如果要收集死细胞）
1.取冰，将4°C离心机提前降温。
2.将死细胞收集到离心管：孔板内的细胞用PBS洗1-2遍，用适量
的胰酶消化，用离心管内的原培养液将孔板内细胞吹打下来，收集到离心管，室温离心1000rpm，5min。
3.弃上清，将离心管倒扣在滤纸上，尽量吸尽残留上清。
4.视细胞量的多少加入细胞裂解液。（1×Cell Lysis Buffer：
PMSF=100：1，1×Cell Lysis Buffer，PMSF-20°C保存。PMSF 常温易降解，拿出时间不得超过30min，必须放置冰上。）
5.冰上裂解15min，将裂解液转移至EP管离心，4°C，12000rpm，
15min。
6.小心将上清转移至另一EP管，记下吸取的量。如：100μL。
7.将收集好的蛋白保存与—20°C。（可长期保存）
b （如果不收集死细胞）
1．弃上清，孔板PBS洗1-2遍，吸尽PBS。在孔板中视细胞量的多少加入相应细胞裂解液。（同上）
2．冰上裂解15min，用细胞刮在孔板里将细胞刮刮。（不同的孔不能用同一个刮子，刮前用水冲洗，擦干。）
3．将裂解液转移至EP管离心，4°C，12000rpm，15min。
4．小心将上清转移至另一EP管，记下吸取的量。
5．将收集好的蛋白保存与—20°C。（可长期保存）
二，测蛋白浓度
BCA法（或者按照自己的试剂盒说明操作）
1.需96孔板，测蛋白浓度的A液，B液，标准蛋白，要测的样品蛋
白。
2.按要测的样品蛋白的数量来配AB液，每孔需AB混合液80μl
（A：B=50：1）。例：有5个样品，加上5个标准蛋白和空白对照。共有11个孔。则A液取11×80=880μl，B液取880÷
50=17.6两液混匀，加入96孔板，每孔80μl。然后加入标准蛋白及样品蛋白4μl。（标准蛋白先配好浓度125，250，500，1000，2000）
3.将孔板放入37°C温箱孵育30min。
4.用酶标仪测蛋白浓度。
5.记下蛋白浓度，根据要上样的μg量算出μl量。例：蛋白浓度
为1000，需上样15μg。则需上样15÷1000=？上样量不超过20μl。
三，配胶
1.将薄板和厚板用洁净的布擦干净，对齐，夹好。（板必须擦干
净，下端对齐，否则容易漏胶。）
2.配分离胶，根据要跑的蛋白分子量，配相应浓度的胶。
3.快速将分离胶加入薄厚板之间，不能太满，留出浓缩胶的部分。(浓缩胶高度大约1CM)
4.在分离胶上灌水，要缓慢，为了让胶凝的更好。
5.30分钟左右，分离胶凝了，将水倒掉，滤纸吸干，找好梳子。制
浓缩胶。
6.灌胶，快速插入相应的梳子。
7.约15min胶可以凝固。
四，煮蛋白
1.煮蛋白前将蛋白中加入6×SDS+DTT(即上样缓冲液)。例样品蛋白
共有100μl，则需加100÷5=20μl 6×SDS+DTT。混匀。（加有DTT的SDS应-20°C保存。DTT应-20°C保存。SDS：DTT=9：1）。
2.将蛋白沸水煮10min。煮过的蛋白在两周内有效。
五，上样，跑胶，转膜
1.电泳巢内加入电泳液，夹好胶板。拔去梳子。
2.每孔上样量不超过20μl，每块胶应上有Maker。剩余的孔里上1
×SDS。
3.蛋白上样前要震荡混匀。
4.浓缩胶80V，分离胶120V。
5.转膜
半干法转膜或者湿转自己的试验条件决定。
根据分子量的大小，按照Maker的位置裁胶，根据胶的大小，剪相应大小的NC膜。（NC膜要先用甲醇活化）。
六，封闭
5%牛奶（TBST稀释的脱脂牛奶）室温封闭1-2h，
七，封一抗
摸清抗体要用的浓度。用TBST或5%牛奶加抗体。室温1-2h，或4°C过夜。
用过的抗体要回收，做记号，用的第几次。放入-20°保存。
八，洗膜
用TBST摇床上洗3遍，每次10min。（一抗不要摇的太剧烈）
九，封二抗
摸清二抗的浓度。室温45min-2h。抗体回收，做记号，用的第几次。放入-20°保存。
十，洗膜
用TBST摇床上洗3遍，每次10min。（二抗可以摇的稍快些）
十一，发光
1.在发光板内放入干净的可以夹住NC膜的薄膜，放好已经洗好
的膜。用滤纸吸干膜上的水。
2.拿齐发光板，发光液，1ml的枪及枪头（至少两根），胶片，
一张滤纸，一个离心管。
3.进入暗室，反锁好门，开红灯，在离心管内配发光液，A液：
B液=1：1。先A后B。切记换枪头，打开薄膜，将AB液混
匀，均匀的洒在NC膜上。盖上薄膜，将多余的发光液推开，
以防水多膜移动。漏出薄膜外的可用滤纸吸干。
4.关灯，看见荧光，盖上胶片。胶片盖上之前先在左上角（个
人习惯）折个角，好辨认方向。
5.根据荧光强度按压几秒或几分钟。将胶片放入洗片机冲洗。
6.等片子完全洗好，可开灯。
或者DAB显色需要买试剂盒。
十二，扫描保留结果