?综述与专论?
生物技术通报
B IO TECHNOLO GY BULL ETIN
2009年第9期
诱导多能干细胞的研究进展
张鹏
(北京林业大学生物科学与技术学院,北京100083)
摘 要: 体细胞诱导成为多能性干细胞(induced p luri potent ste m cell,iPS cell )的研究成果被国际生命科学界誉为具有里程碑意义的创新之举。在短短3年多的时间里,这项研究已经在细胞重编程的机理研究、探索疾病的发生发展机制以及临床医学的应用等领域引发了很多突破性的进展,而且,这一非克隆干细胞技术的诞生,成功地避开了长期以来争论不休的伦理问题,极大地推动该领域和相关科学领域的发展。从iPS 细胞的研究历程、iPS 细胞的构建机理、iPS 细胞研究的最新应用成果以及iPS 细胞的发展前景和研究方向等方面进行了评。
关键词: 体细胞 多能干细胞 重编程 外源因子
Progress on I nduced Pluri potent Ste m Cells
Zhang Peng
(College of B iological Sciences and B iotechnology,B eijing Forestry U niversity,B eijing 100083)
Ab s trac t: The research on inducing s omatic cells int o p luri potent ste m cells has been seen as dramatic breakthr oughs in the ex 2
p l orati on of mechanis m of the disease and app lying in clinical medicine within three 2year ti m e .Moreover,the appearance of this non 2cl oning ste m cell technol ogy successfully avoid the l ong 2vexed questi on of ethics,is a str ong i m petus t o the field and related scientific fields .The paper focused on several as pects of iPS,including the research course,constituti on mechanis m,the latest app licati on,and devel opment p r os pects .
Key wo rds: Somatic cells Pluri potent ste m cells Rep r ogramm ing Exogenous gene
收稿日期:2009204209
作者简介:张鹏(19872),男,本科生,研究方向:细胞生物学;E 2mail:zhangpengdyx@https://www.doczj.com/doc/ef4195164.html,
1 i PS 细胞的研究概况
111 细胞重编程
细胞重编程是指成熟细胞由分化的状态被逆转
到一种未分化状态的过程[1]
。在核移植实验中被发现的细胞重编程现象,证明了体细胞能够被逆转到全能的状态,并且可以用于区分遗传学和表观遗传学的变化。目前,已经有多种实验方法可以实现体细胞的重编程。
体细胞核转移技术(s omatic cell nuclear trans 2fer,SCNT )是研究较早的体细胞重编程技术,它是将体细胞核移入去核卵母细胞中,经过培养,核移植后的细胞会经历一个重编程的过程,逆转到全能的状态。经过多年的研究,人们利用这种方法已经获得了多种核移植动物,也建立了来源于核移植胚胎的胚胎干细胞系。然而,此项技术具有很多的局限性:
实验条件要求高、技术繁杂;克隆的效率很低;涉及到胚胎的破坏,有伦理道德的限制。
其次,将成熟的体细胞与胚胎干细胞(ES 细胞)、胚胎癌细胞(EC 细胞)等具有多潜能的细胞融合,也可以在一定程度上使体细胞发生重编程[2,3]
。
Cowan 等[4]
发现,用病毒和聚乙烯乙二醇使ES 细胞与皮肤成纤维细胞融合,能获得稳定的杂交细胞,这种杂交细胞的分裂方式、细胞周期等与ES 几乎一样,拥有ES 的特征物质并能在一定药物诱导下分化为各种组织细胞。但这种方法也存在着明显的弊端,即体细胞与多能性细胞的染色体共存于一个细胞核中,使得融合的细胞具有两套染色体。同时,此项技术还面临着融合效率偏低,移植后会发生排斥现象等很多难以突破的技术障碍。
多能细胞的提取物与体细胞共孵育也可一定程
2009年第9期张鹏:诱导多能干细胞的研究进展
度上的实现体细胞的重编程。Taranger等[5]的研究表明,使用多能细胞的提取物来诱发体细胞重编程,能驱动体细胞新的基因表达模式。这种方法为研究体细胞重编程的调控机理开辟了新的途径,但目前还存在一定的争议,而且技术手段不成熟,所诱导的重编程效果也十分有限。
此外,最近的一些研究也表明,多能性干细胞还可以由某些类型的细胞在体外培养时自发产生。J iang等[6]发现,成年动物骨髓来源的细胞能在长期体外培养后形成多能性成体前体细胞(MAPCs)。精原干细胞在体外培养时偶尔能形成类似ES细胞的多能性干细胞的现象也相继被发现[7,8]。
总结上述方法,其重编程的效率和程度都非常有限,而且由于受到实验条件和政策的严格限制,发展和应用一直难以寻得突破,这使得科学界希望寻找到一种实用性强,又不会引起伦理争端的细胞重编程手段。
iPS细胞的构建方法是,通过导入与多能性相关的外源因子诱导体细胞核发生重编程,从而使体细胞转变成多能性干细胞。这是一种具有很强创新性的研究方法,与之前的方法相比,简便易行,重编程的效率和程度也都有了很大的提升。更重要的是,摆脱了材料来源和伦理学的诸多限制,因而该研究成果自诞生就引起了生命科学领域一次巨大的轰动,对今后重编程研究的发展也起到强有力的推动作用。
112 iPS细胞的研究简史
Takahashi和Ya manaka[9]将24个候选基因的c DNA序列分别装入逆转录病毒载体,将它们导入到小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和鼠尾成纤维细胞(TTF),在小鼠胚胎干细胞(ES)的培养条件下培养,结果发现被O ct4、Sox2、c2M yc和Klf44种基因组合感染的细胞获得了Fbx15+的多潜能干细胞系,该细胞系在细胞形态、生长特性、表面标志物等方面与小鼠ES细胞非常相似,研究小组将这种细胞命名为诱导性多能干细胞(iPS cell)。将iPS细胞注射到先天免疫缺陷的裸鼠皮下,得到包含三胚层细胞的畸胎瘤,进一步证明它具有类似ES细胞的发育潜能。
这一研究成果于2006年8月发表后,立刻引起了研究iPS细胞的热潮。一年后,另一研究小组W ernig等[10]证明了iPS细胞的实验可靠性,并与Ya2 manaka研究小组[11]同时发现iPS细胞能够通过种系传递,他们使用Oct4或者Nanog的内源性表达作为筛选标志取代了最初的Fbx15,得到的iPS细胞在形态学、基因表达状况和表观遗传修饰方面都与ES细胞十分相似。此外,这些iPS细胞可以产生嵌合小鼠,并能够嵌合到生殖系中。随后,另外两项研究相继报道了利用形态学作为筛选标准来建立iPS细胞的方法,这一方法在建立人类iPS细胞的研究中具有潜在的优势[12,13]。
2007年11月,两个研究小组同时宣布,人类体细胞被成功诱导为多能干细胞。Takahashi等[14]是利用慢病毒载体携带他们在小鼠实验中使用过的4种因子,实现了人类皮肤成纤维细胞的重编程;而Thom s on的实验小组[15]则独立从14种ES高表达基因中筛选出4种基因O ct4,Sox2,N anog和L in28,转入胎儿和幼儿成纤维细胞后获得类ES细胞。
随后,Daley小组[16]用实验手段排除了iPS细胞来自成纤维细胞中混有的极少量成体祖细胞的可能。来自中国的邓宏魁等[17]通过将多种因子联合4个基本的转化基因OCT4,SOX2,K L F4和c2M YC 诱导iPS细胞,再经过一个筛选平台对多种因子进行筛选,结果发现有2种因子p53si RNA和UTF1可提高iPS的转化效率达到100倍。
目前,iPS细胞的建立方法已经有了明显的改善,并且其安全性也在不断的提高,很多研究更是成功地将其应用于人类细胞的研究和疾病模型动物的治疗,说明这一方法具有较高的可操作性和稳定性,对将来的医学研究和临床应用极具价值。
2 i PS细胞的构建
iPS细胞的建立主要包括3个过程:将几个重要的多能性相关基因导入已分化细胞中;通过药物或形态学特征对转染的细胞进行筛选;对iPS细胞进行鉴定,证明其具有多能性。
211 诱导因子
Oct24和Sox2都是典型的多能干细胞特异转录因子。Oct24只在未分化的胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎癌细胞(EC细胞)和胚胎生殖细胞(EG细胞)中表达,当这些细胞被诱导分化为体细胞时,Oct24
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表达下降[18],由此可见,Oct24在动物胚胎发生中是
一个关键的调控因子,而且可能在维持细胞的全能
性及未分化状态中起着重要的作用。Sox2的表达
则并不局限于多能性细胞,但其对早期胚胎发育和
抑制分化起着十分重要的作用。Sox2在胚胎发育
过程中存在两个表达高峰,即囊胚内细胞团(I C M)
和神经干细胞时期,Sox2在这两种细胞中的高表达
与维持该细胞的状态并抑制细胞分化密切相
关[19,20]。有研究表明,Sox2基因敲除的小鼠能发育
至囊胚(可能与母源蛋白的持续存在有关),但不能
形成上胚层[21]。
c2M yc为卟啉2原癌基因,它是L if/ST AT3和W nt
信号通路的一个主要的下游基因,这两条信号通路对
于多能性的维持都很重要,其强制表达诱导ES细胞
分化和凋亡[22,23]。C2M yc可以激活转录,调节包括细
胞分裂和增殖相关基因的表达,从而打开整个染色质
结构,此外还调节非编码RNA的表达[24,25]。
Klf4既是原癌基因又是抑癌基因,它的过表达
可以维持Oct4的表达,并抑制ES细胞的分化[26]。
Klf4的强制表达可以促进小鼠ES细胞的自我更
新,而在体细胞的表达中强制表达可抑制DNA的复
制,阻滞细胞周期处于G
1/S期[27]。因此,它在细胞
增殖和分化之间起开关作用。
ES细胞的基因组有着很高的可塑性,其染色质
结构比较开放,具有转录活性,而体细胞的基因组可
塑性比较差,c2M yc可以诱导体细胞染色质结构发
生改变。因此可以合理推测,在重编程过程中,最初
由c2M yc将关闭的染色质打开,以便其他因子结合
开放的染色质,Klf4,Sox2和O ct4等因子得以对靶
基因的转录进行调节,通过它们的相互作用诱导细
胞进入多能状态。
Tho m s on等的研究是通过O ct4,Sox2,N anog和
L in28这4个基因的组合导入来实现人类成纤维细
胞转变为iPS细胞,说明iPS细胞的产生可以通过
不同的因子组合来诱导。这4个因子是否与Ya2
manaka小组的4个因子有着相似的作用方式还不
得而知,目前,人们对于转导因子诱导的重编程的机
理研究还刚刚开始。
212 iPS细胞的筛选
在导入相关基因之后,诱导的过程中,挑选可能
具有了多能性的细胞对于整个工作来说至关重要,
筛选的方式一直以来也是iPS细胞研究的重点,表1
列出了筛选方式的发展历程,并总结了各种方法的
特点。
表1 筛选方式的发展历程和特点
研究小组筛选方法特点
Ya manaka Fbx15作为报告基因,产生对
G418的抗性
细胞集落具有ES细胞的部分特征。然而,在基因表达模式和DNA甲基化模式
上都与ES细胞有所不同,且无法产生发育到期的嵌合小鼠
W ernig,Ya manaka 采用对多能性更为关键的O ct4
或者N anog作为报告基因
在各个方面都表现出与Es细胞极为相似的特征,但导入报告基因的技术仍然比
较困难,且很难避免插入突变
Maherali形态学标准不对供体细胞做任何额外的遗传修饰,筛选效果出色
213 iPS细胞的鉴定
细胞的多能性具有两个基本特征:强大的自我更新能力和分化潜能。目前所建立的iPS细胞都在形态和生长特性方面与ES细胞一致。人们也从细胞标志分子的表达、表观遗传状态、基因表达模式和发育潜能等方面对其进行了一系列的鉴定。21311 表面标志分子的鉴定 现在得到的克隆细胞普遍具有高核质比和明显的核仁,这些都是ES 细胞的典型特征,并且培养依赖性和增殖状态也都很类似ES细胞。流式细胞和免疫组化技术鉴定出
iPS细胞表达多能干细胞特异的表面标志SSE A21、SSE A23、SSE A24、TRA21260、TRA21281和T RA222 49/6E等,而这些蛋白在转染前的成纤维细胞并不表达,此外,与多能性相关的端粒酶活性也由零点上升到近似ES细胞的高水平[14,15]。
21312 表观遗传状态的鉴定 iPS细胞与ES细胞具有相似的DNA甲基化模式。iPS细胞重编程后, N anog、O ct24和R ex1等重要多能基因的启动子区CpG岛从高甲基化转变为类似ES细胞的低甲基化状态,表明这些启动子处于转录活性状态[11,14]。
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iPS细胞的组蛋白修饰也发生了相应的改变,通常H3K4三甲基化促进转录,而H3k27三甲基化抑制转录。人iPS细胞组蛋白CH I P(染色质免疫共沉淀)分析证实了iPS细胞的O ct24、Sox2、N anog和Gata6等多能基因的启动子区域具有高H3K4三甲基化和低H3K27三甲基化水平,与ES细胞一致而与转染前细胞有较大差异[14]。
21313 基因表达模式和发育潜能 目前得到的iPS 细胞的基因表达谱与ES细胞的基因表达谱基本上类似,只有少部分基因的表达不同。Maherali等[28]发现,在iPS细胞发生分化的同时,一条X染色体也发生了随机的失活。小鼠、人胚胎和成体来源的iPS细胞注射到裸鼠皮下,均可以获得包含三胚层细胞的畸胎瘤,而且iPS细胞不仅有发育成3个胚层的能力,并能参与生殖系的发育,这些都与正常的ES细胞相同。
3 i PS细胞的应用价值和发展方向
311 应用价值
iPS细胞这一极富创新性的研究具有重大的理论意义和实用价值,而且从根本上解决了干细胞研究一直以来存在着的伦理问题,在生物基础研究领域和生物医学领域都有着巨大的推动作用。
在基础研究方面,iPS细胞为研究细胞重编程提供了一个全新的视角,让人们对多能性的调控机制有了突破性的认识,而且它还为发育生物学、基因与蛋白质功能分析等领域提供了重要的模型。获得iPS细胞的方法相对简单和稳定,在技术上更具有优势。最近的研究中,Jeong Beom Ki m等[29]更是成功的只利用Oct4这一种转录因子就能完成了细胞的重编程,更少的诱导因子也就意味着更少的遗传操作和更高的安全性。
在生物医学方面,iPS细胞也具有广阔的应用前景。利用iPS细胞可以产生个体特异性的多能干细胞,移植用于治疗遗传和退行性疾病,可以最大限度地避免免疫排斥。Hanna等[30]用镰刀型贫血症小鼠的皮肤成纤维细胞建立了iPS细胞,通过对iPS 细胞的改造和分化得到了具有正常功能的造血前体细胞,移植到患有镰刀型贫血症的小鼠体内,极大的改善了小鼠的症状。而利用iPS细胞产生病症特异的多能干细胞,可用于研究组织功能和疾病机理,也为新药的开发提供了理想的模型。Thom s on研究小组[31]将一位患有脊髓性肌萎缩症(S MA)儿童的皮肤成纤维细胞诱导成为iPS细胞,并利用这些iPS 细胞培育出包含导致S MA疾病遗传缺陷的运动神经细胞,在试管内成功再现了神经细胞因疾病死亡的过程,这是首次使用患者iPS细胞重现病症的成功尝试。目前,虽然将这种方法安全地用于临床仍然还有重大的障碍需要克服,但它确是研究疾病发生机理和研发药物的重要工具。
312 发展方向
在iPS细胞的应用前景被广泛看好的同时,其产生的具体机制却始终没有确定,这是制约其继续发展和临床应用的一个障碍,是人们下一步亟待解决的问题。关于各种诱导因子在细胞重编程过程中所起的作用、起作用的时间顺序以及它们之间的协调关系等问题都还没有得到确切的答案,人们希望可以通过对这些问题的探索和继续的尝试以获得更高效、更安全的转导因子或者因子组合。
关于导入方法的研究一直是此领域的热点,传统的逆转录病毒导入方法有着很明显的弊端:可能会导致一些癌基因被激活,也可能导致某些重要基因功能受阻。目前,已经出现了各种替代方法,例如,Ya manaka研究小组[32]使用两个质粒完成了对iPS细胞的诱导。通过探索,人们渴望能得到更加便捷与安全的导入方法,这将有助于iPS细胞技术的普及和应用。
目前,研究人员获得iPS细胞的效率依然不高,这可能与转录因子、筛选方法以及细胞来源等多种因素有关。虽然从实际的角度考虑,只要能得到稳定的iPS细胞系对于很多研究来说已经足够了,而且与ES细胞的建立和核移植等方法相比,iPS细胞的获得效率相对较高,但是人们还是希望通过探索找到进一步提高转化率的方法,以利于研究的深入和普及。
现阶段iPS细胞的研究热潮有取代传统干细胞研究的趋势,但继续研究传统的干细胞还是有必要的,传统的胚胎干细胞是人们理解、分析iPS以及研究其疗效的标准。从iPS细胞上人们看到了它为人类疾病治疗所带来的希望和契机,然而由于还没有完全揭示iPS细胞的产生机理,技术手段上还存在
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着很多的问题,使得这一新技术对于临床应用还有很长的距离,对这些问题的研究和探索,将进一步加深人们对重编程和多能性调节机理的认识,也将对其今后的临床应用提供基础。
4 结语
iPS细胞自诞生以来,在短短的3年时间里,得到了飞速的发展,这得益于对过去大量知识的积累和运用,更在于观念和方法上的大胆创新,这种创新的意识正是激励人类科学前进的动力。目前,许多基于iPS细胞的理论思想但又有所突破的技术也越来越多的出现,例如,Zhou等[33]就利用患糖尿病的小鼠外分泌胰腺细胞,通过3种因子Ngn3,Pdx1和Mafa的组合使其重编程成为能够产生胰岛素的内分泌细胞,这是细胞从一种分化状态直接进入另一种分化状态,而中间不需要经历干细胞阶段的成功探索。今后,iPS细胞的研究会成为生命科学领域的一个重要方向,随着技术的不断进步,相信iPS细胞研究的进展会比人们想象中更为迅速。
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诱导性多功能干细胞 ——产生，发展，应用及展望 张博文，杨星九，李玖一，白末* 摘要：在胚胎干细胞研究因伦理道德和免疫排斥问题而受阻的时候，诱导性多功能干细胞(induced pluripotent stem cell，以下简称iPS细胞)的横空出世为干细胞研究指明了一条新的方向。近几年来iPS细胞研究取得了许多突破性的进展，其广泛的应用前景更向人们昭示着一个新的时代的到来。本文主要从iPS细胞的发展历程入手，综述了iPS细胞的理论及应用研究的关键进展，并对之后的研究进行了展望。 关键词：诱导性多功能干细胞，胚胎干细胞，病毒，癌变，细胞治疗 Abstract:When the embryonic stem cell research was blocked by ethical issues and immune rejection, induced pluripotent stem cell (hereinafter referred to as iPS cells), turned out for stem cell research indicated a new direction. iPS cells’ research in recent years has made many breakthroughs, prospects for its wide application to remind people of a new era. This article summarizes the theory and application of iPS cells, and the key to progress in the study, from the iPS cells to start the development process, and discussed the study in the future. Key words：induced pluripotent stem cell, embryonic stem cell, virus, Canceration, cell therapy IPS细胞是通过向体细胞中导入诱导基因，使体细胞重编程获得具有胚胎干细胞样特性的多能干细胞。iPS细胞的产生可谓干细胞领域的新里程碑。近几年，iPS细胞的研究突飞猛进，本文中结合最新的研究结果，综述了iPS细胞的产生背景、发展历程及其应用前景，并对今后iPS的研究发展进行了客观的展望。 1产生背景 干细胞(stem cells, SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。其中胚胎干细胞(Embrtibuc stem cell)更是具有全部的全能性，能够分化成人体内的所有细胞，具有非常广阔的应用前景。 早在上个世纪，人类就已经开始针对干细胞进行研究，试图通过各种不同的方法得到多能干细胞，其中突出的方法有胚胎干细胞（ES细胞）直接植入法；体细胞核转移 ----------------------------------------- *张博文，杨星九，李玖一：资料查阅与论文编写白末：资料查阅与论文整合
诱导多能干细胞技术 吴晶晶张颖朱晨煜 1116092015 1116092016 1116092017 【多能干细胞】 多能干细胞(Pluripotent stem cell，Ps)，具有分化出多种细胞组织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。骨髓多能造血干细胞是典型的例子，它可分化出至少十二种血细胞，但不能分化出造血系统以外的其它细胞。多能干细胞是当前干细胞研究的热点和焦点。它可以分化成体内所有的细胞，进而形成身体的所有组织和器官。因此，多能干细胞的研究不仅具有重要的理论意义，而且在器官再生、修复和疾病治疗方面极具应用价值。但是过去认为多能干细胞只能从人胚胎中获得。 【诱导多能干细胞】 【简介】 诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPS cells）通过基因转染技术(gene transfection)将某些转录因子导入动物或人的体细胞, 使体细胞直接重构成为胚胎干细胞（embryonic stem cell, ESC）细胞样的多潜能细胞。 最初是日本人山中伸弥于2006年利用病毒载体将四个转录因子（Oct4, Sox2, Klf4 和c-Myc）的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞的一种细胞类型。随后世界各地不同科学家陆续发现其它方法同样也可以制造这种细胞。 现在应用iPs已经成功培养和分化出心肌、神经、胰腺、骨等多种体细胞和不同的组织。但是，过去诱导多能干细胞必须应用逆转录病毒载体才能进行基因组整合。由于基因组整合的随机性，可发生突变，甚至可以引起癌症和遗传疾病。哈佛干细胞研究中心和麻省医院肿瘤中心的科学家，成功应用无害基因组整合病毒载体
文献综述 诱导性多能干细胞的研究进展及其在再生医学上的应用 摘要：通过特定转录因子的过表达使体细胞重编程为诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells， iPS 细胞），这一成果引起了整个生命科学领域的广泛关注. 由于 iPS 细胞不仅具有与人类胚胎干细胞（embryonic stem cell， ES 细胞）相似的基本特征，而且与 ES 细胞相比，不存在免疫排斥和伦理道德问题，因此，具有重要的临床应用潜能. 目前， iPS 细胞主要用于细胞分化和移植，并可提供体外的疾病模型，以便于研究疾病形成的机制、筛选新药以及开发新的治疗方法. 从 iPS 细胞的产生、诱导方法、生物学特征和在再生医学中的应用作以研究！ 关键词：诱导性多能干细胞；胚胎干细胞；重编程；再生医学 正文 1iPS 细胞的产生 主要经历了 3 个大的阶段. 1981 年，小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES 细胞）建系干细胞是近 30 年来生物学发展最快的领域（Evans 和 Kaufman），这些具有全能性的细胞在体外可以诱导分化为不同类型的细胞，为组织修复开辟了新途径. 尽管这些细胞来源于囊胚内细胞团，基本不存在去分化和重编程的问题，但自诞生之日起，就一直深受伦理道德和异体排斥等问题的困扰. 随着克隆羊“多利”的诞生，开创了体细胞在卵母细胞中去分化和重编程的先河. 2000 年，Munsie等从小鼠体细胞核移植囊胚中分离得到了小鼠 ES 细胞，从而拉开了治疗性克隆研究的序幕，使利用病人的健康体细胞对自身的病变组织进行修复成为了可能，尽管这一技术可以避免异体移植所造成的排斥反应，但仍然深陷伦理道德争论的漩涡之中.2006 年，Yamanaka 等将 4 个转录因子导入已分化的小鼠皮肤成纤维细胞，进而获得了类似于 ES 细胞的多能性干细胞，即“诱导性多能干细胞”（induced pluripotent stem cells，iPS 细胞）. 2007 年，Yu 等和 Takahashi 等又分别采用相同的基因改造的方法将人的体细胞逆转为类 ES 细胞，这些划时代的成果不仅解决了利用干细胞进行组织修复所面临的免疫排斥和伦理学问题，在利用病人正常细胞进行组织自我修复方面具有巨大的应用前景，而且是用来研究细胞去分化和基因组重编程的重要途径（不需要胚胎或卵母细胞）. 这个具有里程碑意义的发现揭开了再生医学领域的新篇章. 2iPS 细胞的诱导方法 迄今为止，短短几年的时间内 iPS 细胞的研究取得了突飞猛进的发展，仅诱导方式而言，从病毒方法如逆转录病毒、慢病毒和腺病毒，到非病毒的转座子载体和蛋白质均能介导外源转录因子诱导产生 iPS 细胞. 利用逆转录病毒和慢病毒载体诱导生成 iPS 细胞时，可能会引起外源基因整合到体细胞基因组，引起插入突变，如果将这些 iPS 细胞应用于临床治疗，会存在安全隐患. 因此，Aoi 等利用不与宿主细胞整合的腺病毒、质粒为表达载体瞬时转染靶细胞可以获得 iPS
诱导性多潜能干细胞(iPS cells)的研究进展 学生：吴淑可元培学院学号：00646145 摘要：诱导性多能干细胞被誉为生命科学领域新的里程碑, 本文将通过iPS细胞的由来、研究概况、制备方法以及应用前景四个方面来简述iPS细胞的发展历程和应用前景。 关键词：iPS细胞、转录因子、小分子化合物 1.iPS细胞的由来 2007年11月，日本和美国科学家分别宣布独立发现将普通皮肤成纤维细胞转化为多潜能干细胞的方法，得到的干细胞称为诱导多能干细胞iPS（induced pluripotent stem cells）细胞。这项发现一方面解决了利用胚胎进行干细胞研究在伦理、宗教和法律等诸多限制，另一方面也使得干细胞的研究来源更方便且制备相对简单易行，故iPS细胞一经问世，即在生命科学领域引起了一次轰动，被誉为生命科学领域新的里程碑。简单来说，iPS细胞就是借助基因导入技术将某些特定因子导入动物或人的体细胞，同时可选择性地在培养液中加入特定的小分子物质，即可将体细胞重编程为多潜能干细胞，这类细胞在克隆形态、生长特性、表面标志物、基因表达模式、表观遗传学特征、拟胚体(embryoidbodies，EBs)形成、畸胎瘤(teratoma)形成和嵌合体(chimeras)形成(针对小鼠)等方面与ES 细胞非常相似[1]。 2. iPS 细胞的研究概况 2006年8月，Yamanaka小组确定最少有4 种转录因子组合——Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4即可将成纤维细胞重编程为iPS细胞[2]。次年11～12月，该小组和Thomson小组先后将人的体细胞重编程为iPS细胞[3.4]。 2007年12月，Jaenisch小组用iPS细胞来源的造血前体细胞成功治疗镰状红细胞贫血，从理论和实践上为人类单基因遗传病治疗奠定基础，次年4月，该小组证实鼠iPS细胞来源的多巴胺能神经元移植进帕金森病大鼠脑内，可有效缓解其症状和改善其行为, 说明iPS对复杂疾病治疗的可能性[5]。 2008年4月，美国加利福尼亚大学科学家报告称，他们将实验鼠皮肤细胞改造成iPS细胞，然后成功使其分化成心肌细胞、血管平滑肌细胞及造血细胞。 2009年2月，日本东京大学科学家宣布，成功利用人类皮肤细胞制成的iPS细胞培育出血小板，而且从技术上说用iPS细胞培育人类红细胞和白细胞都是可能的；紧接着，日本庆应大学科学家又宣布，成功用实验鼠的iPS细胞培育出鼠角膜上皮细胞。同年3月，iPS细胞研究便相继迎来两项重大突破。英国和加拿大科学家发现了不借助病毒、安全将普通皮肤细胞转化为iPS细胞的方法；美国科学家则宣布，他们可以将iPS细胞中因iPS转化需要而植入的有害基因移除，保证获得的神经元细胞的基本功能不受影响。同时美国研究人员宣布，他们可以通过蛋白质，而非任何核酸材料，将普通皮肤细胞转化为iPS细胞。紧接着，2009年4月，美国科学家首次对遗传疾病Fanconi 贫血症患者皮肤细胞中的基因缺陷进行了修补，进而将这些组织转化成了能扭转疾患病情的干细胞，从而在基因重组过程中，制造出了无遗传缺陷、功能强大的诱导多功能干细胞（iPS细胞），并再次定向诱导分化出纠正患者遗传性贫血所需的健康血液细胞。 2009年6月，日本iPS之父证明了不同细胞来源的iPS具有不同的致瘤性。同时鉴于目前iPS诱导效率太低，提出了iPS诱导的种质模型和随机模型加以探讨。 2009年7月，iPS细胞研究在临床应用道路上又迈出非常重要的一步。据《自然》和《细胞：干细胞》杂志报道，中国上海和北京两个科学团队分别利用iPS细胞克隆出活体实验鼠，首次证明iPS细胞与胚胎干细胞一样具有全能性。该成果让人们看到了iPS细胞具有实用性。 (https://www.doczj.com/doc/ef4195164.html,/society/2009-07/24/content_11766251.htm) 3. iPS 细胞的制备方法 目前，iPS细胞制备流程如下。简言之：a．分离和培养宿主细胞；b．通过病毒(逆转录病毒、慢病毒或腺病毒) 介导的方式将外源基因导入宿主细胞；c．将病毒感染后的细胞种植于饲养层细胞上，并于ES 细胞专用培养体系中培养，同时在培养液中根据需要加入相应的小分子物质( 如Wnt3a、5-AZA、BIX-01294、VPA、TSA等)以促进
数、着床数与空白对照组比较差异均无显著性。胎鼠发育良好,内脏观察指标均未见异常。说明复方枸杞子口服液在本实验规定剂量下未引起母体毒性、胚胎及胎鼠毒性,无明显的致畸作用,为生育期妇女服用该药的安全性提供了实验依据。 实验结果显示,低剂量组胎鼠表现为体质量较重、身长较长(P<0.01);中剂量组表现为活胎率高(P<0.05),死胎率低(P<0.05);3个剂量组的胎鼠骨骼发育都较空白对照组好,尤其是高剂量组胎鼠骨骼发育完全,无胸骨异常胎鼠(P<0.05),也无肋骨异常胎鼠(P<0.01)。表明复方枸杞子口服液对胎鼠发育有一定保健作用,尤其对骨骼发育的影响较大,为今后复方枸杞子口服液的药效学研究奠定了基础。本实验不足之处在于由于胎鼠出生率低,实验结果有待于进一步的实验证实。 参考文献: [1]汪建龙.枸杞多糖药理作用的研究进展[J].时珍国医 国药,2005,16(10):1032-1033. [2]张庆.大枣多糖体外抗补体活性剂促进小鼠脾细胞的 增殖作用[J].中药药理与临床,1998,14(5):19-22. [3]保健食品检验与评价技术规范[S].国家食品药品监督 管理局,2003. [4]陈平雁.SPSS13.0统计学软件应用教程[M].北京:人 民卫生出版社,2005:255-269. 使用诱导性多能干细胞(i PS c ells)修复心脏 梅约临床和医疗中心(Mayo Clinic)研究人员进行的一项概念验证研究显示,诱导性多能干细胞(iPS cells)可用于心脏病治疗。诱导性多能干细胞是被重新编程从而进入一个类似胚胎干细胞状态的成年细胞。在该项研究中,研究人员对普通的成纤维细胞进行重新编程,有助于结痂的细胞(譬如那些因心脏病发作产生的细胞)转化为干细胞,修复因心肌梗死造成的心脏损伤。 该项研究结果于2009年7月20日提前发表于Circulation杂志在线版。 论文第一作者Ti mothy Nelson博士指出:“这项研究发掘了在心脏治疗中使用诱导性多能干细胞的真正潜力,使生物工程成纤维细胞获得修复和再生梗死心脏的能力。” 这是基于诱导性多能干细胞的技术首次用于心脏疗法。在此之前,诱导性多能干细胞仅用于帕金森氏症、镰状细胞性贫血和甲型血友病3种疾病模型,最终目标是使用诱导性多能干细胞修复损伤。在此过程中使用患者自身的细胞,避免了排斥反应的风险及抗排斥药物进行维持治疗的需要。该再生医学策略将有助于缓解受限于捐赠者短缺的器官移植需求。 论文通讯作者Andre Terzic博士指出:“这项诱导性多能干细胞创新性研究为转化应用奠定了基础。借助于核编程方面的进展,我们将能逆转成年细胞,在心血管再生医学中实现按需定制。” 该研究团队通过“干性相关”人类基因集(“stemness2related”human gene set)对成纤维细胞进行遗传重编程,使其反分化成诱导性多能干细胞,进而重新分化为新的心肌细胞。移植入受损的小鼠心脏后,诱导性多能干细胞在2周后实现嫁接,4周后明显有助于改善受损心脏结构和功能。相比之下,普通成纤维细胞则无此功效。 与非工程化成纤维细胞相比,诱导性多能干细胞能够恢复心脏病发作后缺失的心肌功能,阻止受损心脏功能损伤进程,并在心脏受损部位再生组织。 (C irculation,2009:published online before p rint,July20,2009) 883广东药学院学报 第25卷
诱导多能干细胞：过去，现在和未来 介绍 在2006年，我们发现，干细胞与胚胎干细胞相似的属性，可以同时引入四种基因（高桥和Yamanaka，2006年）从小鼠成纤维细胞产生。我们指定了这些细胞的iPS细胞。在2007年，我们报道了类似的方法适用于人类成纤维细胞，并通过因素引入了一把，人类iPS细胞可以生成（Takahashi等，2007）。就在同一天，詹姆斯·汤姆森的研究小组还报告了人类iPS细胞的生成，使用不同组合的因素（Yu等人，2007）。 合并三个科学流LED iPSCs的生产 像任何其他科学的进步，过去和现在的科学家在相关领域众多研究结果的基础上，建立了IPSC的技术。有三个主要的数据流的研究导致我们生产的iPS细胞（图1）。第一个数据流进行重新编程核移植。1962年，约翰·格登报道，他的实验室已经收到了成年青蛙肠细胞的细胞核（格登，1962）的未受精的卵子产生的蝌蚪。超过三十年后，伊恩·威尔莫特及其同事报道多莉诞生的第一只哺乳动物体细胞克隆产生的乳腺上皮细胞（威尔莫特等人，1997）。在这些成功的体细胞克隆显示出，即使是分化的细胞中含有的所有的发展所需要的整个生物体的遗传信息，而卵母细胞包含体细胞核重新编程的因素，可以。2001年，田田隆的研究小组发现，胚胎干细胞也含有因素，可以重编程体细胞（田田等人，2001）。第二个流是“大师”的转录因子的发现。在1987年，果蝇的转录因子，触角，异位表达时（Schneuwly等人，1987）表明，诱导形成的腿代替触角。在同一年，哺乳动物转录因子，调节因子MyoD ，显示转换成纤维细胞，成肌细胞（Davis等人，1987）。这些结果导致“主调节器，”一个给定的血统的命运决定和诱导的转录因子的概念。许多研究人员开始寻找各种谱系单主监管。尝试失败，也有少数例外（Yamanaka和布劳，2010）。 第三，同样重要的是，流是涉及胚胎干细胞的研究。自第一代在1981年小鼠胚胎干细胞（埃文斯和考夫曼，1981年，1981年，马丁），奥斯汀·史密斯和其他人已经建立了培养条件，使长期维持多能性（史密斯等人，1988）。维持小鼠胚胎干细胞的一个关键因素是白血病抑制因子（LIF ）。同样地，由于第一代的人胚胎干细胞（Thomson等人，1998年），碱性成纤维细胞生长因子（bFGF ）的最佳培养条件已经成立。 组合第一两个流的研究使我们假设，这是在卵母细胞或胚胎干细胞，体细胞重新编程到胚胎状态，设计实验，以确定该组合的多个因素的组合。使用信息所需要的文化多能干细胞的培养条件，我们就能够识别四个因素可以产生iPS细胞。 IPSC的技术成熟和理解 后不久，其他各组小鼠iPSCs的初次报告，概括了基于因子重编程的小鼠（Maherali等，2007年，Wernig等人，2007）和人类（Lowry等，2008年，公园等。2008B ）。iPS细胞技术的优点之一是它的简单性和重现性。许多实验室开始探索相关机制和修改程序。 尽管iPSCs的重复性，可以生成过程中的效率仍然很低，通常小于1 ％转成纤维细胞成为iPS细胞。最初这种低效率的提高iPS细胞的可能性，来自罕见的干或者未分化的细胞，成纤维细胞培养共存（山，2009A ）。然而，随后的研究表明，iPS细胞可以是来自于终末分化的淋巴细胞（罗等人，2009）和有丝分裂后的神经元（Kim等人，2011a的）。因此，大部分的，如果不是全部，体细胞有可能成为iPS细胞，尽管有不同的效率。 怎能只是一小部分因素诱导体细胞重编程？这是超出了本文的范围，提供一个概述的许多研究已经解决了这个重要的问题。从我的角度来看，许多科学家的共识似乎是重编程因子的启动重编程过程中有更多的不到1％的转染细胞，但该过程没有完成在大多数细胞中。知之甚少的随机事件似乎需要完全重新编程的地方（Hanna等人，2009年，山中伸弥，2009年a）。正如我在下面的讨论，培养条件似乎为动力，可以帮助促进全重编程功能。 最初的iPSCs可以使用逆转录病毒或慢病毒，这可能会造成插入突变，从而会带来风险转化
人类诱导性多能干细胞（iPS细胞） 技术指导手册 目录： 1. 前言 (1) 2. 人类胚胎成纤维细胞培养 (2) 3. 重编程载体构建 (3) 4.病毒包装 (4) 5.人类iPS细胞的诱导 (6) 6. iPS细胞鉴定 (8) 6.1碱性磷酸酶活性检测 (8) 6.2干细胞表面marker的免疫染色检测 (9) 6.3干性因子的去甲基化程度分析 (10) 6.4干细胞内源基因的表达分析 (13) 6.5端粒酶活性检测 (14) 6.6核型检测 (15) 6.7拟胚体形成 (15) 6.8畸胎瘤形成实验 (15) 7．干细胞技术培训及服务一览表 (15) 8．附录 (16) 1. 前言 iPS细胞最初从成纤维细胞重编程而来，因为它们准备和操作相对简单。其他细胞类型，包括来自外胚层、中胚层和内胚层的细胞也可以用于产生iPS细胞（Eminili et al 2008）。2006年Y amanaka 和Takahashi利用逆转录病毒系统在成鼠的成纤维细胞导入四个转录因子（Oct3/4,Sox2,c-Myc, 和Klf4，Y amanaka 因子），将其重编程为iPS细胞，它具有跟小鼠ES十分相似的特性，尤其重要的是，iPS细胞也能产生后代。2007年，iPS技术在人类体细胞中得以应用，人类iPS 细胞的产生对退行性疾病的治疗产生巨大的影响（Takahashi et al ;Yu et al, 2007）。由于iPS细胞具有和ES类似的功能，却绕开了胚胎干细胞研究一直面临的伦理和法律等诸多瓶颈，因此在医疗领域的应用前景非常广阔，成为干细胞研究的热点，《自然》和《科学》杂志分别将其评为2007年第一和第二大科学进展。随后，
关于诱导多功能干细胞的介绍和思考 ——2012年诺贝尔生理学或医学奖解读班级：生物技术基地姓名：林立梅学号：0131122635 【摘要】John B. Gurdon和Shinya Yamanaka获得2012年诺贝尔生理学或医学奖，他们的相继研究成果证明，成熟、分化的细胞可以被重新组装或诱导重新编程，变成未成熟的干细胞，能够发育成机体内所有种类的组织。 【关键字】重新编程干细胞诱导定向分化临床医学 【内容】 （一）两位科学家的实验概述 （1）约翰.格登：用“细胞核重编程”克隆出新动物 所谓“细胞核重编程”，就是将已经分化了的成年体细胞进行诱导，让其重新回到发育早期多能性干细胞状态，重新获得发育成各种类型细胞的能力。通俗一点讲，就是在细胞层面实现“返老还童”。 1962年，格登做了一个划时代的实验：他假设：这些细胞的基因组仍然包含着驱动它发育成机体所有不同类型的细胞所需的信息。并进行相关实验，将非洲爪蟾（Xenopus，一种蛙）卵细胞内不成熟的细胞核移除，然后把非洲爪蟾的成熟肠细胞的细胞核注入其中。在此过程中，他采用核标记技术（Elsdale et al，1960），将标记的供体细胞核移植到未标记的受体卵。在实验中，控制由囊胚或原肠胚（简称胚胎细胞核）穿插与转让肠细胞核。移植的胚胎中，所有那些超出了囊胚期的细胞中包含明显的被标记的核，可以证明它们来源于核移植而不是从卵核。核标记只出现在渡过了囊胚期胚胎中。整个实验的目的很简单，就是想看看这个卵子最终会变成什么。结果发现，一部分卵依然可以发育成蝌蚪；其中的一部分蝌蚪，可以继续发育成为爪蟾。 (2)山中伸弥：用基因技术制造出“诱导多能干细胞” 2006年Shinya Yamanaka教授从数据库中筛选出大约100个有可能在ES细胞中特别活跃的基因。再经过近4年的紧张工作，从这100个基因中筛选出24个活跃
项目名称：非整合人诱导性多能干细胞（iPS）及相 关技术用于β地中海贫血治疗的研究首席科学家：潘光锦中国科学院广州生物医药与健 康研究院 起止年限：2012.1至2016.8 依托部门：中国科学院
一、关键科学问题及研究内容 1、安全高效，具有临床实用性的非整合iPS新技术的优化及建立。 安全高效获得非病毒非整合iPSC的新技术 建立综合的诱导系统获得非病毒非整合的iPSC：利用mRNA及microRNA诱导体细胞获得iPSC，筛选能够加速iPSC重编程的小分子化合物及蛋白；筛选高效的iPSC诱导培养液。在此基础上，建立综合的诱导系统获得非病毒非整合的iPSC。 iPSC的鉴定：核型、基因表达、体外分化能力、体内多能性检测等多方面检测iPSC是否符合干细胞的标准；分子水平检测外源基因的插入；测序分析iPSC 的基因组稳定性。 建立非病毒非整合小鼠ESC样的人类iPSC（ESC-like-iPSC） 筛选能够稳定培养ESC-like-iPSC的培养环境：通过传统的病毒诱导获得小鼠ESC样的人类iPSC（ESC-like-iPSC）；筛选小分子化合物稳定培养 ESC-like-iPSC；筛选mRNA及microRNA支持ESC-like-iPSC的自我更新； 建立非病毒非整合ESC-like-iPSC：开发诱导获得ESC-like-iPSC的诱导系统；在全基因组表达、小RNA表达等方面比较两种不同的iPSC的差异。 2、利用体外受精胚胎建立多株正常人及地贫病人的ES细胞系。对比地贫iPS及ES，评价iPS多能性，安全性等应用指标。 建立非整合β地中海贫血病人iPS细胞库，约含各突变类型β地中海贫血iPS 细胞株50～100株。 优化和完善建立人胚胎干细胞的技术体系，并在此基础上建立地贫胚胎干细胞库。本研究拟对现有的胚胎干细胞培养技术进行改进：利用不同发育阶段的IVF
文章编号（Article ID）：1009－2137（2014）04－0883－06·专论·诱导性多能干细胞技术的研究进展及其应用前景 吴翠玲，张玉明* 南方医科大学南方医院小儿科，广东广州510515 摘要在分化的体细胞中表达转录因子可以诱导体细胞重编程，获得诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS cells）。这些细胞具有不断的自我更新能力和多向分化潜能，这些细胞重编程领域的突破性研究进展，为细胞重编程机制、人类疾病发病机制的研究及发展新的治疗方法提供了一种强有力的工具。iPS细胞技术是当前干细胞研究领域的热点之一，近年来取得了迅猛的发展。最初，研究者利用逆转录病毒作为载体将4种转录因子导入小鼠成纤维细胞诱导其重编程。近年来，iPS细胞的诱导方法不断改进，包括使用不整合入宿主细胞基因组的病毒载体、非病毒载体或者用基因敲除的方法切除导入的外源基因，从而产生了更为安全的iPS细胞系，许多小分子化合物也被证实能显著提高重编程效率。iPS细胞在再生医学、疾病模型的建立及药物筛选等领域正逐渐显现出它巨大的应用价值。本文回顾过去几年iPS细胞技术的研究进展，包括诱导方法的改进、iPS细胞诱导效率的提高和安全性的提高，并探讨iPS细胞的临床应用前景及当前研究存在的问题。 关键词干细胞；诱导性多能干细胞；体细胞重编程；临床应用 中图分类号Ｒ329．28文献标识码A doi：10．7534/j．issn．1009-2137．2014．04．001 Progress and Potential Applications of Induced Pluripotent Stem Cell Technology———Editorial WU Cui-Ling，ZHANG Yu-Ming* Department of Pediatrics，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou510515，Guangdong Province，China *Corresponding Author：ZHANG Yu-Ming，Associate Professor，Tutor of Master Postgraduate．E-mail：yumingzhang1966@hotmail．com Abstract Differentiated somatic cells can be reprogrammed to a pluripotent state through ectopic expression of specific transcription factors．These reprogrammed cells，which were designated as induced pluripotent stem（iPS）cells，are detected to exhibit unlimited self-renewal capacity and pluripotency．This breakthrough in stem cell research provides a powerful and novel tool for the studies on pathogenesis of diseases，reprogramming mechanism and development of new therapies．For this reason，the iPSC technology has currently become one of the hot topics in stem cells research．Ｒecently，major progress in this field has been achieved：initially，researchers succeeded in inducing the reprogramming of mouse fibroblasts by retroviral transduction of four specific transcription factors；in succession，the accelerated development of iPSC technology by employing non-integrating viral vectors，non-viral vectors or removing the introduced foreign genes via gene knock-out has ensured the yields of much safer iPSC；meanwhile，some researches discoversed the proofs that a number of micromolecular compounds were potent in accelerating the cellular reprogramming．For a prospect，iPSC are highly promising for regenerative medicine，disease modeling and drug screening．In this review，the recent progress in the generation of iPSC，prospects of their possible clinical applications and problems in the iPSC research are summarized and discussed． Key words stem cell；induced pluripotent stem cell；reprogramming；clinical application J Exp Hematol2014；（4）：883－888 2006年，日本京都大学的山中伸弥研究小组［1］报道了关于诱导性多能干细胞的研究成果，引起了极大反响并迅速成为干细胞领域的研究热点。该研究小组从24个候选基因中筛选出4个与细胞多能性密切相关的转录因子，利用逆转录病毒载体将这4个转录因子（Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc，以下简称OSKM）导入小鼠成纤维细胞内，使其重编程得到一种多潜能干细胞。这种细胞在形态学、生长特性、基因表达、畸胎瘤形成及嵌合体形成等方面都与胚胎干细胞非常相似，研究人员把这些细胞命名为诱导性多能干细胞。在iPS技术出现之前，实验研究的干细胞来源主要是从胚胎内细胞团直接分离得到 基金项目：广东省自然科学基金（S2011010003914）；国家自然科学基金（81270632）；广州市科技计划项目（2013j4100108） *通讯作者：张玉明，副教授，副主任医师，硕士研究生导师．E-mail：yumingzhang1966@hotmail．com 2014－02－08收稿；2014－04－23接受 · 388 · 中国实验血液学杂志Journal of Experimental Hematology2014；22（4）：883－888
诱导性多能干细胞 【关键词】干细胞; 细胞分化; 转录因子 诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPS）是通过基因转染技术(gene transfection)将某些转录因子导入动物或人的体细胞, 使体细胞直接重构成为胚胎干细胞（embryonic stem cell, ES）细胞样的多潜能细胞。iPS细胞不仅在细胞形态、生长特性、干细胞标志物表达等方面与ES细胞非常相似, 而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与ES细胞几乎完全相同。iPS细胞的研究受到人们广泛的关注, 是目前细胞生物学和分子生物学领域的研究热点。iPS细胞技术诞生还不到2年, 却为干细胞的基础研究和临床疾病治疗研究带来了前所未有的希望, iPS细胞技术的出现使人们从ES细胞和治疗性克隆等激烈的伦理学争论中解脱出来。但是, 目前制备iPS细胞的方法在安全性方面还存在一定问题, 因此探索一种高效、安全的iPS细胞的制备方法显得十分必要。 1 iPS细胞的制备方法 2006年T akahashi等［1］研究小组利用分别携带Oct4、Sox2、Myc和Klf4转录因子的4种逆转录病毒载体感染小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEFs), 经过G418药物筛选成功获得第1批iPS细胞。但是这批iPS细胞系中DNA甲基化的方式与自然存在的ES细胞不同, 而且这批iPS细胞不能形成畸胎瘤。Okita等［2］研究小组报道了第2批iPS细胞的产生。他们采用与制备首批iPS细胞相同的方法, 但是采用了不同的筛选基因。第2批iPS细胞系DNA甲基化的方式与自然存在的ES细胞的甲基化方式相同, 并且能形成畸胎瘤。2007年末, Takahashi和Yu等［3, 4］两研究小组分别在细胞和科学杂志上报道关于iPS研究里程碑的实验结果, 他们都成功获得了人的iPS细胞系。Yamanaka 采用与诱导小鼠iPS相同的方法, 成功将人成纤维细胞诱导成多干细胞。Thomson研究小组采用与Yamanaka不同的方法, 他们利用慢病毒载体运输Oct4、Sox2、Nanog和Lin28转录因子转染IMR90胚胎成纤维细胞, 并且成功地获得了人iPS细胞。2008年1月Nakagawa等［5］研究小组报道他们可以利用Oct4、Sox2和Klf4 3种转录因子将小鼠和人的成纤维细胞成功诱导出iPS细胞。Aoi等［6］研究小组将小鼠肝细胞和胃上皮细胞成功诱导为iPS。Stadtfeld等［7］实验小组利用Oct4、Sox2、c myc和Klf4 4种转录因子将胰岛细胞诱导为iPS细胞。 Hanna等［8］研究小组在细胞杂志上报道了他们将小鼠终末分化的B淋巴细胞诱导成iPS细胞的实验结果。他们采用类似于利用成纤维细胞制备iPS细胞的方法, 使用4种转录因子（Oct4、Sox2、c Myc和Klf4）及CCATT/增强子结合蛋白（C/EBPα）, 成功地将成熟B淋巴细胞诱导为iPS细胞。 Eminli等［9］研究小组利用逆转录病毒载体携带Oct4、Klf4和c Myc 3个转录因子将神经祖细胞诱导为iPS细胞, 之后Kim等［10］研究小组报道利用慢病毒载体携带Oct4和c Myc或Oct4与Klf4两种转录因子就可以将成人的神经干细胞诱导为iPS细胞。他们
多能干细胞整体实验 1、提供各类多能干细胞整体实验方案：客户根据课题标书及需做实验的主体内容，拟定并提供初步的项目方案，含课题申请书，实验方案，实验设计，实验思路，实验文献等与实验相关等内容和资料。或者由嘉美实验协助实验委托者完成各类多能干细胞整体实验方案的设计。 2、项目评估报价：公司技术团队根据客户提供的相关资料，综合评估项目可行性，与客户共同确定准确的实验项目执行方案，给出准确的实验价格。嘉美实验协助设计的课题直接给出准确的报价。 3、签订服务协议：签署服务协议并预付部分费用，做好实验初步准备及项目预安排。 4、执行服务项目：正式启动实验进程，全面展开实验，确保项目有效执行。 5、沟通项目进展：及时沟通反馈实验的最新进展，随时了解掌控实验的最新动态。 6、完成项目交付：支付剩余尾款，交付实验结果，正确应用实验结果，提供售后服务。 一、多能干细胞介绍 1、干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的特殊细胞类群。研究表明这类细胞存在于发育不同阶段的动物体内的多数组织和器官中。在体外适当的培养条件下干细胞可以被大量扩增和分化为具有特定功能的细胞。因此干细胞可以为临床疾病治疗提供移植所需要的细胞。同时由于药物筛选和安全性检验不可以直接在人体进行人的干细胞也成为大规模的新药筛选和药物研究的理想模型。 2、多能干细胞分类 根据干细胞增殖能力和分化潜能的不同可以把干细胞分为具有无限增殖和分化潜能的多能干细胞 (pluripotent stem cells) 和增殖和分化能力有限的组织干细胞或成体干细胞(tissue stem cells or adult stem cells)。多能干细胞包括胚胎干细胞(embryonic stem cells ES cells) 胚胎生殖干细胞(embryonic germ cells EG cells) 胚胎肿瘤细胞(embryonal carcinoma cells EC cells)和诱导
诱导性多能干细胞的应用 2006年，日本医学家山中伸弥等将4个转录因子基因导入已分化的小鼠皮肤成纤维细胞，将其重编程为类似于胚胎干细胞的多能性干细胞，即诱导性多能干细(Induced pluripotent stem cells,iPS cells)。这项技术避免了干细胞研究领域的免疫排斥和伦理道德问题, 是生命科学领域的一次巨大革命。与胚胎干细胞一样, iPS 细胞能够长期增殖并维持高度未分化状态, 在体内可分化为3个胚层来源的所有细胞, 进而参与形成机体所有组织和器官。在体外, iPS 细胞可定向诱导分化出多种成熟细胞。因此, iPS 细胞在理论研究和临床应用等方面都极具应用价值。 iPS细胞与再生医学是目前研究的热点。如多项研究在人类血液疾病的小鼠模型中进行了iPS细胞应用的尝试，并取得了初步成功。Hanna等在人源化的镰刀型贫血病小鼠模型上获取成纤维细胞，诱导建立了iPS细胞系，然后通过同源重组的方法将病变基因修正，接着把遗传修饰后的iPS细胞定向分化为造血干细胞，导入小鼠体内，贫血症状明显改善，这是首次利用iPS细胞进行的人类疾病治疗研究。iPS技术在治疗神经系统疾病中显示了很大的用途。Werning等对已建立的小鼠iPS细胞进行体外诱导培养，可以将其诱导分化为神经前体细胞和多巴胺能神经元，并移植到患有帕金森病小鼠体内能减轻其症状。最近一项研究利用帕金森症患者的皮肤细胞培育出了iPS 细胞，并能将其分化为多巴胺神经元细胞，这是帕金森症患者大脑中所缺少的一种重要细胞。因此，其有望成为治疗帕金森症等神经系统疾病的一种方法。虽然iPS细胞技术在再生医疗领域的尝试与应用还远未成熟，但随着iPS细胞基础与临床研究的深入，iPS细胞必将开辟再生医学领域的新纪元。
?综述与专论? 生物技术通报 B IO TECHNOLO GY BULL ETIN 2009年第9期 诱导多能干细胞的研究进展 张鹏 (北京林业大学生物科学与技术学院,北京100083) 摘 要: 体细胞诱导成为多能性干细胞(induced p luri potent ste m cell,iPS cell )的研究成果被国际生命科学界誉为具有里程碑意义的创新之举。在短短3年多的时间里,这项研究已经在细胞重编程的机理研究、探索疾病的发生发展机制以及临床医学的应用等领域引发了很多突破性的进展,而且,这一非克隆干细胞技术的诞生,成功地避开了长期以来争论不休的伦理问题,极大地推动该领域和相关科学领域的发展。从iPS 细胞的研究历程、iPS 细胞的构建机理、iPS 细胞研究的最新应用成果以及iPS 细胞的发展前景和研究方向等方面进行了评。 关键词: 体细胞 多能干细胞 重编程 外源因子 Progress on I nduced Pluri potent Ste m Cells Zhang Peng (College of B iological Sciences and B iotechnology,B eijing Forestry U niversity,B eijing 100083) Ab s trac t: The research on inducing s omatic cells int o p luri potent ste m cells has been seen as dramatic breakthr oughs in the ex 2 p l orati on of mechanis m of the disease and app lying in clinical medicine within three 2year ti m e .Moreover,the appearance of this non 2cl oning ste m cell technol ogy successfully avoid the l ong 2vexed questi on of ethics,is a str ong i m petus t o the field and related scientific fields .The paper focused on several as pects of iPS,including the research course,constituti on mechanis m,the latest app licati on,and devel opment p r os pects . Key wo rds: Somatic cells Pluri potent ste m cells Rep r ogramm ing Exogenous gene 收稿日期:2009204209 作者简介:张鹏(19872),男,本科生,研究方向:细胞生物学;E 2mail:zhangpengdyx@https://www.doczj.com/doc/ef4195164.html, 1 i PS 细胞的研究概况 111 细胞重编程 细胞重编程是指成熟细胞由分化的状态被逆转 到一种未分化状态的过程[1] 。在核移植实验中被发现的细胞重编程现象,证明了体细胞能够被逆转到全能的状态,并且可以用于区分遗传学和表观遗传学的变化。目前,已经有多种实验方法可以实现体细胞的重编程。 体细胞核转移技术(s omatic cell nuclear trans 2fer,SCNT )是研究较早的体细胞重编程技术,它是将体细胞核移入去核卵母细胞中,经过培养,核移植后的细胞会经历一个重编程的过程,逆转到全能的状态。经过多年的研究,人们利用这种方法已经获得了多种核移植动物,也建立了来源于核移植胚胎的胚胎干细胞系。然而,此项技术具有很多的局限性: 实验条件要求高、技术繁杂;克隆的效率很低;涉及到胚胎的破坏,有伦理道德的限制。 其次,将成熟的体细胞与胚胎干细胞(ES 细胞)、胚胎癌细胞(EC 细胞)等具有多潜能的细胞融合,也可以在一定程度上使体细胞发生重编程[2,3] 。 Cowan 等[4] 发现,用病毒和聚乙烯乙二醇使ES 细胞与皮肤成纤维细胞融合,能获得稳定的杂交细胞,这种杂交细胞的分裂方式、细胞周期等与ES 几乎一样,拥有ES 的特征物质并能在一定药物诱导下分化为各种组织细胞。但这种方法也存在着明显的弊端,即体细胞与多能性细胞的染色体共存于一个细胞核中,使得融合的细胞具有两套染色体。同时,此项技术还面临着融合效率偏低,移植后会发生排斥现象等很多难以突破的技术障碍。 多能细胞的提取物与体细胞共孵育也可一定程