基因工程应用实例及基因工程前景展望
基因工程应用实例及基因工程前景展望
高一（6）
陈韬
1、什么是基因工程（又称基因拼接技术和DNA重组技
术）？
是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物
学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。
2、原理？
基因重组：通过将外源基因通过体外重组后导入受体细胞
内，从而使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表
达。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的一一DNA
提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把
它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入
某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中
进行正常的复制和表达，从而获得新物种。
3、应用？
（1）农牧业、食品工业
运用基因工程技术，不但可以培养优质、高产、抗性好的农作物及畜、禽新品种，还可以培养出具有特殊用途的动、植物。
1. 转基因鱼
2. 转基因牛
3. 转黄瓜抗青枯病基因的甜椒
4. 转鱼抗寒基因的番茄
5. 转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯
6. 不会引起过敏的转基因大豆 (2) 环境保护
基因工程做成的 DNA 探针能够十分灵敏地检测环境中的 病
毒、细菌等污染。
利用基因工程培育的指示生物能十分灵敏地反映环境污 染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸 收和转化污染物。
(3) 医药卫生
1. 基因工程药品的生产：
⑴基因工程胰岛素
⑵基因工程干扰素
⑶其它基因工程药物
2. 基因诊断与基因治疗:
7. 超级动物 8. 特殊动物 9. 抗虫棉
?SCID的基因工程治疗
高中生物基因工程知识详解 高中生物基因工程的基本工具 1. “分子手术刀”——限制性核酸内切酶( 限制酶) (1) 来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 (2) 功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 (3) 结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 2. “分子缝合针” 一一DNA连接酶 (1) 两种DNA1 接酶(E•coliDNA 连接酶和T4-DNA 连接酶) 的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E•coliDNA 连接酶来源于T4 噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起 来;而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 (2) 与DNA聚合酶作用的异同：¬¬¬DNA 聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
3. “分子运输车”——载体 (1) 载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保 存。 ②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 (2) 最常用的载体是¬¬ 质粒, 它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 (3) 其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒高中生物基因 工程的应用 1. 植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。 2. 动物基因工程：提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。 3. 基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。 误区提醒 ①动物基因工程主要是为了改善畜产品的品质，而不是为了产生体型巨大的个体。 ② DNA分子作探针进行检测时应检测单链，即将待测双链DNA分子打开。 ③ Bt毒蛋白基因控制合成的Bt毒蛋白并无毒性，进入昆虫
基因工程 绪论 1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。作动词：基因的分离和重组的过程。 2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。供体、受体和载体是基因工程的三大要素。 3、基因工程诞生的基础 三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。 三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现 3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶 1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。 2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数 3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割 4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。 5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。 6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。 7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。 8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。 9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。
第二章Enzymes 第四节DNA连接酶Ligase 一、DNA连接酶的发现 二. 连接条件 必须是两条双链DNA。 DNA3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）。需要能量。 三、连接反应的机理 1、A TP（NAD+)提供激活的AMP。 2、A TP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。 3、AMP 与连接酶的赖氨酸-氨基相连。 4、AMP 随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA 一条链的5’端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。 5、3’-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。 Ligase：只连“Nick切口”，不连“Gap缺口” 四. 两种DNA连接酶 1. E. Coli DNA ligase 来源：E.coli 适用：粘性末端（PEG与高浓度一价阳离子存在可连平末端） 2. T4 ligase 来源：T4 phage 适用：粘性末端及平末端 T4 vs. E.coli T4 DNA ligase制备容易，价格便宜，能进行各种类型连接反应，应用更广泛！ 五.Ligase的反应温度 最佳温度： 界于酶作用速率和末端结合速率之间，一般认为是4-15℃比较合适。 六. DNA分子连接的四种形式 1. 粘性末端； 2. 平末端； 3. 平末端加尾； 4. 平末端加衔接物(linker)或接头(adaptor) (1)Digestion and Ligation 1．粘性末端连接 Problem: (自我环化作用) 解决方法：a、双酶切（两种内切酶）b、去磷酸 2.平末端连接 粘性末端连接效率高于平末端约100倍！ 解决方法：化平末端为粘性末端 3. 平末端连接---同聚物加尾法（1）末端脱氧核苷酸转移酶 功能：5’至3’单链聚合 作用特点：单链；无模版 作用机理： a: 用5’-特异的核酸外切酶处理DNA分子，以便移去少数几个末端核苷酸, 获得3’-OH的单链延伸末端。 b: 加入dA TP/dTTP和末端脱氧核苷酸转移酶组成的反应混合物中，DNA分子的3-OH末端将会出现单纯由poly(dA)和poly(dT)组成的DNA单链延伸。 c: 获得poly(dA)和poly(dT)尾巴，就会彼此连接起来。缺点： 当poly(dA)，Poly(dT)不严格等长时,重组DNA分子会有缺口。 需要用DNA聚合酶I填补，然后用DNA连接酶连接最后的缺口。 4. 平末端连接 ---衔接物连接法与接头连接法 (1) 平末端的衔接物连接法 衔接物的5’末端和待克隆的DNA片段的5’-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化。通过T4 DNA连接酶的作用使两者连接起来。用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和克隆载体分子。 (2) 平末端的接头连接法 将具有某种限制性酶(BamHI)粘性末端的典型DNA 接头分子与平末端的DNA片段连接后，后者变成具有粘性末端的DNA分子。 七.热稳定的DNA连接酶——来自嗜热高温放线菌 热稳定的DNA连接酶的应用： 寡核苷酸连接测定法（oligonucleotide ligation assay, OLA） 连接酶链式反应（ligation chain reaction, LCR） 寡核苷酸连接测定法的作用 检测突变 寡核苷酸连接测定法的作用：检测突变。 1. 寡核苷酸连接测定法 （1）原理: 两条寡聚核苷酸探针分子，同一种与之互补变性的靶DNA之间的杂交作用,这两条寡聚核苷酸探针分子在靶DNA分子上的位置是彼此相邻的。 当他们同靶DNA链是完全碱基配对时，便可以被连接酶连接起来。 结合点或靠近结合点处存在和靶DNA错配的碱基两个探针之间不能形成磷酸二脂键。 精品文档
基因工程基础知识填 空
专题一基因工程 1. 1 DNA重组技术的基本工具 一、基因工程的基本概念 1. 概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过_____________和___________等技术，赋予生物以新的 __________，从而创造出更符合人们需要的新的__________和___________。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做 _________________。 ★2. 基本原理：______________ ★3. 理论基础 (1) 不同生物的基因可以拼接的结构基础——细胞生物的遗传物质都是_______，都是以_____________为基本单位构成的双链大分子。 (2) 目的基因转入后可以表达的基础——所有生物共用一套__________。 (3) 生物遗传信息的表达都遵循 _________。 ★★4. 优点 (1) 目的性强，能_______的改造生物的性状。 (2) 克服________________的障碍。 二、限制性核酸内切酶——分子手术刀 1. 简称：__________。 2. 来源：主要是从__________中分离纯化而来。 ★3. 功能特点：特异性，即识别双链DNA 分子某种特定__________，并且使每一条链中____________的两个核苷酸之间的 _________断开。 4. 酶切结果：_______末端和_______末端。 画出EcoRⅠ酶切后的结果： ↓ GAATTC CTTAAG ↑ 三、DNA连接酶——“分子缝合针” ★1. 作用实质：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的________。 2. 作用前提：两个DNA分子必须含有 _________。 3. 种类 (1) E·coli DNA 连接酶 ①来源：___________ ②功能：只能连接___________ (2) T4DNA连接酶 ①来源：____________ ②功能：既可以连接___________，又可以连接_________，但连接_________时效率比较低。 ★【拓展】比较DNA连接酶与DNA聚合酶 四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” ★1. 基因工程中最常用的载体——_______ 收集于网络，如有侵权请联系管理员删除
v1.0 可编辑可修改 基因工程的定义：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造， 将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。 基因工程的基本过程：切、接、转、增、检 基因工程理论依据：a) 生物的遗传物质是DNA。b) DNA的双螺旋结构和半保留复制机理。 c) 遗传信息的传递方式（中心法则）和三联体密码子系统的建立 遗传工程：指以改变生物有机体性状为目标，采用类似工程技术手段而进行的对遗传物质的操作，以改良品质或创造新品种。包括细胞工程和基因工程等不同的技术层次。 克隆。指由同个祖先经过无性繁殖方式得到的一群由遗传上同一的DNA分子、细胞或个体组成的特殊生命群体。 限制性核酸内切酶。是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。 限制性内切酶由三个基因位点所控制：hsd R---限制性内切酶， hsd M---限制性甲基化酶， hsd S---控制两个系统的表达。Hsd S －识别特定DNA序列，Hsd M－甲基化，Hsd R －限制性内切酶功能。 命名法：例如Haemophilus influenzue）d 株中分离的第三个酶：Hin d III 同裂酶:不同来源的限制酶具有相同的识别位点和切割位点。同尾酶：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶 粘性末端：DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这样的DNA末端，称之。 酶活性单位。在合适的温度和缓冲液中，在50μl反应体系中，1小时内完全切割1微克DNA所需的酶量为1个酶活性单位U。 星活性：指限制性内切酶在非标准条件下，对与识别序列相似的其它序列也进行切割反应，导致出现非特异性的DNA片段的现象。引起星活性原因：若使用buffer不当, 会有star activity，而star activity是指限制酶对所作用的DNA及序列失去专一性, 当酶辨认切割位置的能力降低，导致相似的序列或是错误的辨认序列长度也会作用，而产生错误的结果。 连杆：化学合成的8～12个核苷酸组成的寡核苷酸片段。以中线为轴两边对称，其上有一种或几种限制性核酸内切酶的识别序列，酶切后
专题一基因工程 一【高考目标定位】 1、专题重点：DNA重组技术所需的三种基本工具；基因工程的基本操作 程序四个步骤；基因工程在农业和医疗等面的应用；蛋白质工程的原理。 2、专题难点：基因工程载体需要具备的条件；从基因文库中获取目的基 因；利用PCR技术扩增目的基因；基因治疗；蛋白质工程的原理。 二【课时安排】2课时 三【考纲知识梳理】 第1节DNA重组技术的基本工具 教材梳理： 知识点一基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。 注意：对本概念应从以下几个面理解： 知识点二基因工程的基本工具 1.限制性核酸切酶——“分子手术刀” （1）限制性切酶的来源：主要是从原核生物中分离纯化来的。 （2）限制性切酶的作用：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。（3）限制性切酶的切割式及结果：①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。 2.DNA连接酶——“分子缝合针” （1）来源：大肠杆菌、T4噬菌体 （2）DNA连接酶的种类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。 （3）作用及作用部位：E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸
二酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。注意：比较有关的DNA酶 （1）DNA水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基 （2）DNA解旋酶：能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：使DNA解成两条长链的法除用解旋酶以外，在适当的高温（如94℃）、重金属盐的作用下，也可使DNA 解旋。 （3）DNA聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。（4）DNA连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。注意比较DNA聚合酶和DNA连接酶的异同点。 3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” （1）分子运载车的种类：①质粒：常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的环状的裸露的DNA分子，独立于拟核之外。②病毒：常用的病毒有噬菌体、动植物病毒等。 （2）运载体作用：①是用它做运载工具，将目的基因转运到宿主细胞中去。②是利用它在受体细胞对目的基因进行大量复制。 （3）作为运载体必须具备的条件：①在宿主细胞中保存下来并大量复制②有多个限制性切酶切点③有一定的标记基因，便于筛选。 思维探究：知识点3、4、5主要是介绍DNA重组技术的三种基本工具及其作用。限制酶──“分子手术刀”，主要是介绍限制酶的作用，切割后产生的结果。在这部分容学习时，应关心的问题之一是：限制酶从哪里寻找？我们可以联想从前学过的容──噬菌体侵染细菌的实验，进而认识细菌等单细胞生物容易受到自然界外源DNA的入侵。那么这类原核生物之所以长期进化而不绝灭，有保护机制？进而联想到可能是有什么酶来切割外源DNA，而使之失效，达到保护自身的目的”。这样就对“限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来”的认识提高了一个层次。 基因进入受体细胞的载体──“分子运 输车”的学习容，不能仅仅着眼于记住这几个 条件，而应该深入思考每一个条件的涵，通过 深思熟虑，才能真正明确为什么要有这些条件 才能充当载体。 教材拓展： 拓展点一限制酶所识别序列的特点 限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱
基因工程原理复习题思考题 5、简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。 同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。 同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。 不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。） 6、连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？ 类型：DNA连接酶和RNA连接酶 异同点： 相同点：都能以DNA为模板，从5'向3'进行核苷酸或脱氧核苷酸的聚合反应。 不同点：DNA聚合酶识别脱氧核糖核苷酸，在DNA复制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在转录中起作用。 7、试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。（传说中的网上答案） 1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。 2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。 3、足够多的载体和插入片段是最重要的。 4、平端的连接对于离子浓度很敏感 5、尽可能缩小连接反应的体积 6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好 8、基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？ 1）大肠杆菌DNA聚合酶 2）Klenow fragment 3）T7 DNA聚合酶 4）T4 DNA聚合酶 5）修饰过的T7 DNA聚合酶 6）逆转录酶 7）Taq DNA聚合酶 第四章基因克隆的载体系统 1、作为基因工程载体，其应具备哪些条件？ 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）； 具有合适的筛选标记； 具有较高的外源DNA的载装能力； 具有多克隆位点（MCS）； 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。 3、载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？ 基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。 4、质粒转化原理，影响转化率的因素有哪些？
专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指通过，对生物的基因进行，然后导入，并使在受体细胞中，产生人类所需的基因产物的技术。基因工程又被称为。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”—— （1）来源： 主要是从中分离纯化出来的。 （2）功能： 能够识别双链DNA分子的某种的核苷酸序列，并且使每一条链中部位的两个核苷酸之间的断开，因此具有。 （3）结果： 经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：和。 2.“分子缝合针”—— (1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较： ①相同点：都缝键。 ②区别： E·coliDNA连接酶来源于，只能将双链DNA片段互补的之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合，但连接平末端的之间的效率。 (2)与DNA聚合酶作用的异同： DNA聚合酶只能将加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接的末端，形成磷酸二酯键。 3.“分子运输车”—— （1）载体具备的条件： ① ② ③ （2）最常用的载体是，它是一种 （3）其它载体： (二)基因工程的基本操作程序 第一步： 1.目的基因是指：。 2方法1；2；3. 原核基因最好采取获得，真核基因最好利用。 3.PCR技术扩增目的基因 （1）原理： （2）过程： 第一步：加热至90～95℃ 第二步：冷却到55～60℃， 第三步：加热至70～75℃， 第二步： 1.目的：使目的基因在受体细胞中。 2.组成： （1）启动子：是一段有特殊结构的，位于基因的，是识别和结合的部位，能启动基因，最终获得所需的。 （2）终止子：也是一段有特殊结构的，位于基因的。使终止。 （3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中，从而将筛选出来。常用的标记基因是。 第三步： 转化的概念： 2.常用的转化方法： 将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是，其次还有等。
生物选修3知识点 专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过，赋予生物以，创造出。基因工程是在 上进行设计和施工的，又叫做。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”—— （1）来源：主要是从中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别的核苷酸序列，并且使每一条链中的两个核苷酸之间的断开，因此具有。（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式： 和。 2.“分子缝合针”—— (1)两种DNA连接酶（）的比较： ①相同点：都缝合键。 ②区别：来源于大肠杆菌，来源于T4噬菌体， 只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来； 而能缝合两种末端，但连接的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。 DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 必须需要模板 3.“分子运输车”—— （1）载体具备的条件：①。 ②，供外源DNA片段插入。 ③，供重组DNA的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是 ,它是一 种 。
（3）其它载体： (二)基因工程的基本操作程序 第一步： 1.目的基因是指：基因。 2.原核基因采取获得，真核基因是。人工合成目的基因的 常用方_ 和_。 3. 从基因文库中获取 基因文库（1）概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。 （2）类型：基因组文库和部分基因文库（如cDNA文库） （1）原理： （2）过程：第一步：加热至90～95℃； 第二步：冷却到55～60℃，； 第三步：加热至70～75℃，。 第二步：（核心步骤）
复习：基因工程（又称为DNA重组技术、基因拼接技术） 一、基础填空（共60分） 1、基因工程，其运用的原理是（1分），目的是（1分） 2、操作工具： （1）手术刀——限制酶：其作用是识别，并使断开（2分），产生两种末端分别为（2分）。 （2）分子缝合针——DNA连接酶：其作用是将拼接成新的DNA分子，形成（2分）；种类有、（2分） （3）分子运输车——运载体： 其作用是将（1分），种类有（3分），运载体需满足的条件有：、、 、（4分）。 3、实施基因工程的步骤如下： （1）第一步：获取目的基因，方法有、、（3分）（2）第二步即核心步骤，为（1分） 其目的是使目的基因（2分）， 其组成包括（2分）。 启动子启动转录，它是酶的部位（1分），而起始密码子启动位于mRNA上；标记基因的作用是为了（2分），如可作为这种基因（1分）。（3）第三步：将目的基因导入受体细胞。 目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持和的过程，称为（2分）。 将目的基因导入植物细胞的常用方法是，其特点是（2分）；导入动物细胞的方法是（1分），导入微生物细胞的方法是（1分）。 （4）第四步，目的基因的检测与鉴定。 分检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因所用方法为（1分）， 子目的基因是否转录出了mRNA，检测方法是（1分） 水基因探针是指（2分）平检测目的基因是否翻译成蛋白质的方法（1分），是从转基因生物中提取（1分），用相应的（1分）进行杂交。 个体水平：进行实验（1分）。 4、基因工程的应用 用转基因动物生产药物，如（1分），需要将药用蛋白基因与（1分）连接在一起，导入动物受精卵内，其乳汁中将含有药物； 也可用来治疗疾病，如基因治疗，是指把导入，使，从而达到治疗疾病的目的（2分）； 另外基因芯片这项高新技术也迅速发展起来，主要用于（1分）。 5、蛋白质工程，又称为（1分） （1）蛋白质工程的目标：（2分） （2）蛋白质工程是指以为基础，通过，对或，以满足（4分）。 （3）过程：从预期的蛋白质出发设计预期的蛋白质推测应有的找到相对应的（基因）（4分）。
基因工程难题详细解析 1.一位科学家正在使用氨苄青霉素敏感型菌株进行研究，该菌株不能利用乳糖，这是因为它的乳糖操纵基因异常。该科学家有两种质粒，一种含有正常的乳糖操纵基因，另一种含有氨苄青霉素抗性基因。她运用限制酶和DNA连接酶，获得了一些含有这两个基因的重组质粒。然后在一个仅以葡萄糖为唯一能源的培养基中培养该细菌，并向其中加入高浓度的重组质粒，使细菌增殖。再将实验组细菌（含重组质粒）和对照组细菌（不含重组质粒）放人下图所示环境中让其生长。请回答下列问题： （1）在基因工程的基本操作程序中，______________是基因工程的核心。限制酶是基因工程中常用的工具，若要提取限制酶，可选择的生物是______________ （举出一例）。本实验中使用限制酶的作用是：____________________________。 （2）在以葡萄糖为唯一能源的培养基中加入高浓度的质粒，为了促进细菌更好的吸收重组质粒，还应用______________处理细菌，使细菌处于______________。该培养基以葡萄糖为能源是因为__________________________________________。 （3）若没有新的突变发生，细菌最有可能在哪些培养基上生长出菌落?（） A．只有1、2和4号B．只有3、5和6号C．只有1、2、3和4号D．只有4、5和6号 （4）如果在准备制作重组质粒时未使用DNA连接酶，则细菌最可能在______________号和______________号平板上长出菌落。 （5）若该科学家用该培养基进行另一项实验如下图，在该培养基中用乳糖为唯一能源，则细菌能在哪一培养基中长出菌落（） A．只有10号 B．只有8号 C．7号和8号 D．8号和10号 1（1）基因表达载体的构建 大肠杆菌（只要答出的生物属于原核生物即可给分，只答原核生物不给分） 在质粒DNA上切割（合理给分） （2）Ca2+感受态葡萄糖是单糖，可被细菌吸收，确保细菌均能在此培养基中均能正常生长（意思对即或给分） (3) C (4) １号4号(5) C 1解析（1）限制酶主要存在于原核生物（2）乳糖只能被被部分细菌利用，所以不能用乳糖 (3) 5号和6号培养基都存在氨苄青霉素，但不含重组质粒的菌株无氨苄青霉素抗性基因 (4) 未使用DNA 连接酶时，含重组质粒的菌株只含乳糖操纵基因或只含氨苄青霉素抗性基因。不管哪种重组质粒，都可在1号平板上长出菌落，但只含乳糖操纵基因的菌株不能在2号或3号培养基上生存(5) 含重组质粒的菌株既
第一章 1.基因工程:是在分子水平上进行的遗传操作，指将一种或多种生物体（供体）的基因或基因组提取出来，或者人工合成的基因，按照人们的愿望进行严密的设计，经过体外加工重组，转移到另一种生物体（受体）的细胞内，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。 2.基因工程的基本过程为哪些？切—接—转—增—检 ①获得目的基因：从供体细胞分离出基因组DNA，用内切酶将外源DNA切开。——切（同时选择运载目的基因的载体）②目的基因与载体DNA拼接：用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，形成DNA重组分子。——接③重组体分子导入受体细胞：借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中。——转 ④短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中。——增⑤筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞。——检 3.哪些基因是真核生物特有的？ ①假基因：核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同，但却不能合成出功能蛋白质的失活基因。②基因家族：由功能相关的基因成套组合形成③重复序列 哪些是原核生物特有的：插入序列。哪些是真核和原核共有的：移动基因、重叠基因 第二章 1.寄主细胞控制的限制与修饰 宿主控制限制——核酸限制性内切酶 宿主控制修饰——修饰的甲基转移酶 以λ(k)噬菌体侵染E.coli B菌株为例解释寄主控制与修饰的现象。 （简述寄主控制的限制与修饰现象。 ?大多数细菌的噬菌体侵染都存在着一些功能性障碍。所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。R/M体系：寄主是由两种酶活性配合完成的 一种是修饰的甲基转移酶——修饰 另一种是核酸内切限制酶——限制 R/M体系的作用： ?保护自身的DNA不受限制； ?破坏外源DNA使之迅速降解； 2. 简述Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型核酸内切酶的基本特性。 （1）Ⅰ型酶基本特性
专题1 基因工程 ※基因工程的概念： 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 ﹡原理：基因重组 ﹡目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 ﹡意义：能够打破生物种属的界限（即打破生殖隔离，克服远源杂交不亲和的障碍），在分子水平上定向改变生物的遗传特性。 ﹡操作水平：DNA分子水平 【思考】： （1）基因工程的物质基础是：所有生物的DNA均由四种脱氧核苷酸组成。 （2）基因工程的结构基础是：所有生物的DNA均为双螺旋结构。 （3）一种生物的DNA上的基因之所以能在其他生物体内得以进行相同的表达，是因为它们共用一套遗传密码子。 一、基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 （3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端（回文结构特点）。 ①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。 ②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶
（1）分类：根据酶的来源不同，可分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类 （2）功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 ★两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键 ②区别：E．coIiDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能使黏性末端之间连接； T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低。 (3)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 （4）与DNA分子相关的酶
(1) 连接酶 ①来源: 结接成果— ②功能：只能连接. 四.基因进入受体细胞的载体一“分 (2) T4DNA连接酶 子运输车” ①来源: ②功能：既可以连接. 又可以连接 时效率比较低。 【拓展】比较DNA连接酶?与DNA ONA连接 酶DNA聚合酶 作 用 实 质 都是催化两个核晋酸之间形成 是 否 需 模板 — 连 接 0 NA链 链链 作用 过程 在两个 DNA片段之 间形成 将 加 到已存在的核昔 酸链上，形成 作用 将两个 ONA片段连 合成 聚介酶 1.基因工程中最常用的载体 ⑴来源: 等微生物 (2)结构：裸露的、结构简单、独立于 之外，并具有 分子。 2.基因的载体必须具备的条件 个限制酶切 削位点，供外源DNA片段(基丙)插入其 中 。 (2)能在宿主细胞内 介到染色体DNA上，随染色体DNA进行 (3)有特姝的. ，如四环素抗性基因等，供重组DNA的鉴定和选择。 (4)必须是 彳j 害。 (5 ) 进行操作。 的，不会对受体细胞 适合，以便提取和在体外 3.载体的种类：除质粒外，还有
4.在进行基因工程操作中，真正被用作的 。 载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行 1. 2基因工程的基本操作程序 一.基因工程的基本操作程序③PCR扩增的前提：要有一段已知目的 的获取。基因的，以便根据这一序列合成引 2?的构建。 3.将目的基因 4,目的基因的 二、目的基因的获取 1.目的基因主要是的结构基因。 2?获取目的基因的方法 （1）从基因文库中获取目的基因 ①基因文库概念：将含有某种生物不同 基因的许多，导入 的群体中储存?各个分別含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。 ②基因文库分类：可分为 库和，文库（如cDNA文 库）。 ⑵利用PCR技术扩增目的基因 ①PCR技术是的缩写。PCR 是一项在生物体 的核酸合成技术。 ② PCR技术的原理：ONA ④PCR扩增的条件： （目的基因），原料—— （即dCTP、d&TP、dGTP、dTTP）.耐高温的 （Taq 酶）。 ⑤PCR扩增的过程 a变性：加热到90?95°C, ONA受热变性后 b?复性（退火人冷却到55-60r. 结合 C.延伸：加热到70?75乜，在热稳＞1^的 （Taq酶）的作用下进行延伸 ⑥结果：目的基因以__________ 的方式成指 数形式扩增。 ⑶人工合成法：如果基因比较. 学方法宜接人工合成。 比较 用化【拓展】PCR技术和DNA复制的
第一章基因克隆 基因工程的基本技术有哪些？ 答：对核算分子的分离、纯化、回收、分析和检测、切割、连接和修饰，以及序列测定、诱变、扩增和转移等基因操作技术。 构建基因文库一般使用什么作为载体？ 答：一般使用大肠杆菌作为载体 克隆与亚克隆？ 答：克隆在一等程度上等同于基因的分离。亚克隆是将目的基因所对应的小段的DNA片段找出来。 PCR对基因克隆有什么作用？ 答：现在基因克隆可以不用通过构建基因文库来实现，可以通过理性设计和PCR扩增获得大多数所需要的基因。但是尽管如此，在不知道基因序列的情况下，如相互作用的基因，表达调控因子，新基因等，还需要构建基因文库来进行基因克隆。 第二章分子克隆工具酶 限制与修饰系统？ 答：限制系统可以排除外来DNA。限制的作用实际就是降解外源DNA，维护宿主稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，宿主通过甲基化来达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的作用。并且能够保证自身的DNA不被降解。 使用最广泛的限制酶？ 答：EcoR I是应用最广泛的限制性内切酶 限制性内切酶的命名？ 答：宿主属名第一字母、种名头两个字母、菌株号+序列号。 如：HindIII 限制与修饰系统分类？ 答：至少可分为3类。II类所占比例最大，其酶分子为内切酶与甲基化分子不在一起，识别位点为4-6bp的回文序列，切割位点为识别位点中或者靠近识别位点。其限制反应与甲基化反应是分开的反应。不需要ATP的参与。 限制酶识别的序列长度？结构？
答：一般为4-6个bp，即每256和每4096个碱基中存在一个识别位点。回文序列，不对称序列，多种不同序列，间断对称序列 限制酶产生的末端？ 答：1、黏末端2、平末端3、非对称突出末端 什么是同裂酶？分类？ 答：识别相同序列的限制酶称为同裂酶。但他们的切割位点有可能不同。分为：1、同位同切酶2、同位异切酶3、同工多位酶4、其他 限制性内切酶的作用是什么？它的反酶是什么？ 答： 什么是同尾酶？ 答：许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相通的，切实对称的，即他们可产生相同的黏性突出末端。 酶切的缓冲液中一般含有什么？作用是？ 答：调控pH的缓冲剂：稳定溶液的pH M g2+：稳定酶的作用，提高酶的活性，提高酶的特异性 DDT（二硫苏糖醇）：防止DNA二聚化，影响酶切结果 BSA（小牛血清蛋白）：防止了酶的贴壁效应（可使酶变形），同时减少非特异性吸附，对酶有稳定和促进的作用。 酶切的反应温度？反应时间？中止酶切的方法? 答：反应温度大多为37℃，时间一般为2-3h。中止的方法是在65℃下反应20min。 什么星星活性？抑制其发生的办法？ 答：在极端非标准条件下，限制酶能够切割与识别序列相似的序列，这个改变的特性称为星星活性。抑制星星活性的措施有很多，如减少酶的用量（可避免过分酶切）、减少甘油浓度、保证反应体系中唔有机溶剂或乙醇、提高离子强度到100-150mmol/L（如果不会抑制酶活性的话）和降低反应pH至pH7.0以及保证使用M g2+作为2价阳离子。 影响酶活性的因素有？ 答：可分为内因和外因 外因是可预见的，可控的：反应条件、底物的纯度（是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当、反应提及的选择以及反应时间的长短等。 内因有：星星活性、底物甲基化和底物构象（线性还是超螺旋） 原核细胞有几种DNA聚合酶？其特点是什么？ 答：DNA聚合酶I是单链多肽，可催化单链或者双链DNA的延长；DNA聚合酶II则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；DNA聚合酶III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶。
1.2基因工程的基本 操作
1.2基因工程的基本操作程序 一、教材分析 《基因工程的基本操作程序》是人教版选修3专题1基因工程中第2节内容，本节是《基因工程》专题的核心，上承《DNA重组技术的基本工具》一节，下接《基因工程的应用》。 对于基因工程，学生接触得很少，文字描述中会感到抽象，为此，教材中采用形象化得呈现方式简述了基因工程基本操作程序的四个步骤。例如，基因文库中把基因组文库比作国家图书馆，而把cDNA文库比作某市图书馆，这样便于学生理解和掌握。此外，在教材处理中还呈现主干，割舍枝杈，将非主干内容以《生物技术资料卡》、《拓展视野》等方式呈现，做到有主有次。二、学情分析 学生经过上一节的学习已经掌握DNA重组技术所需三种基本工具的作用及基因工程载体所需条件等知识，具备学习基因工程的基本操作程序一节的基础；而且经过一年必修教材的学习，学生的生物基础知识较扎实，思维的目的性、连续性和逻辑性已初步建立。但基因工程一节对学生来说难点较多，如果处理不好，会变成简单的死记硬背。因此在教学过程中，应在教师引导下适时加强学生解决问题和运用概念图等生物学语言归纳结论等方面的能力。 三、教学目标 知识与技能： 1.简述基础理论研究和技术进步催化了基因工程 2.简述基因工程的原理和基本步骤 能力目标
1.学会运用概念图总结基因工程的基本步骤及方法 2.尝试运用基因工程原理，提出解决某一实际问题的方案 情感态度与价值观 1.关注基因工程的发展 2.认同基因工程的应用促进生产力的提高 四、教学重点与难点 教学重点 基因工程基本操作程序的四个步骤 教学难点 ⑴从基因文库中获取目的基因 ⑵利用PCR技术扩增目的基因 五、教学过程： 第1课时 （一）、目的基因获取： 1.目的基因 (1)主要是指编码蛋白质的基因。(2)也可以是一些具有调控作用的因子。2．获取方法 (1)从基因文库中获取： ①基因文库的含义：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。 ②
基因工程 一、基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在 二、基因工程的基本工具 1、限制性核酸内切酶-----“分子手术刀” 2、DNA连接酶-----“分子缝合针” 3、基因进入受体细胞的载体-----“分子运输车” 1．“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）存在：主要存在于原核生物中。 （2）特性：特异性，一种限制酶只能 识别一种特定的核苷酸序列，并且能在 特定的切点上切割DNA分子。 （3）切割部位：磷酸二酯键 （4）作用：能够识别双链DNA分子的 某种特定核苷酸序列，并且使每一条链 中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸 二酯键断开。
（5）识别序列的特点： （6）切割后末端的种类：DNA 分子经限制酶切割产生的DNA 片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA 的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中轴线处切开时，产生的则是平末端。
2．“分子缝合针”——DNA连接酶 （1）作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。 （2）类型 相同点：都连接磷酸二酯键 3．“分子运输车”——载体 (1)载体具备的条件： ①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一个至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 (2)最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 (3)其他载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒。 (4)载体的作用: ①作为运载工具，将目的基因送入受体细胞。 ②在受体细胞内对目的基因进行大量复制。 【解题技巧】 (1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。 (2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。 (3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。 (4)获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生4个黏性末端或平末端。 (5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。 (6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。 (7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能将目的
基因工程各章知识点 第一章绪论 1．基因工程的首例操作实验 三大理论基础：DNA是遗传物质、DNA的双螺旋结构和半保留复制、遗传密码的破译和遗传物质传递方式的确定 三大技术基础：限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割、DNA连接酶的发现与DNA片段的连接、基因工程载体的研究与应用 基因工程的诞生： 72年，P.Berg首次实现体外DNA重组：体外用EcoRI分别切割SV40和λDNA,并用T4 DNA连接酶连接成为重组的杂种DNA分子 73年，S.Cohen 体外重组DNA并转化：具Kanr的E.Coli质粒R6－5和具Tetr的E.Coli质粒pSC101切割并连接转化的大肠杆菌具有双重抗性 S.Cohen 和H.Boyer首次实现真核基因在原核中表达：将非洲爪蟾的DNA与E.Coli质粒（pSC101）体外切割并连接，转化大肠杆菌 2．基因工程的基本概念 基因工程是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种新物体（受体）内，使之稳定遗传并表达出新产物或具有新性状的DNA体外操作技术，也称为分子克隆或重组DNA 技术。 供体、载体、受体是基因工程的三大基本元件。 3．基因工程的基本操作过程 a分离目的DNA片段：酶切、PCR扩增、化学合成等。 b重组：体外连接的DNA和载体DNA，形成重组DNA分子。 c转化：将重组DNA分子导入受体细胞并与之一起增殖。 d筛选：鉴定出获得了重组DNA分子的受体细胞。 e对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。 第二章载体 1．理解用PBR322和PUC18作载体的克隆外源基因的原理。答案不确定 PBR322作载体的克隆外源基因的原理:PBR322质粒具有12 种限制性内切酶的单一识别位点：Tet r 基因内有7个酶切位点：Bam HⅠ，SalⅠ：Amp r基因内有3 个酶切位点：PstⅠ。Eco RⅠ和HindⅢ不在抗生素基因内，不导致插入失活。 如果在pBR322质粒的Tet r基因内位点插入外源DNA片断，将切断了tet r基因编码序列的连续性，使tet r 失去活性，产生出Amp r Tet s表型的重组pBR322质粒，转化入Amp s Tet s的大肠杆菌细胞。先涂布在含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出具Amp r菌落，再将它们影印于含四环素的选择性培养基上。插入外源片断的重组质粒不能在这种培养基上生长，这样就找出了含重组质粒的大肠杆菌。如果在pBR322质粒的Amp r基因内位点插入外源DNA片断，则反之。 PUC18作载体的克隆外源基因的原理：