高通量测序基础知识简介 陆桂 什么是高通量测序？ 高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）是对传统Sanger测序（称为一代测序技术）革命性的改变,一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。 什么是Sanger法测序（一代测序） Sanger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。 什么是基因组重测序（Genome Re-sequencing） 全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点，以及结构变异等，具有重大的科研和产业价值。 什么是de novo测序 de novo测序也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的基因组图谱。获得一个物种的全基因组序列是加快对此物种了解的重要捷径。随着新一代测序技术的飞速发展，基因组测序所需的成本和时间较传统技术都大大降低，大规模基因组测序渐入佳境，基因组学研究也迎来新的发展契机和革命性突破。利用新一代高通量、高效率测序技术以及强大的生物信息分析能力，可以高效、低成本地测定并分析所有生物的基因组序列。 什么是外显子测序（whole exon sequencing） 外显子组测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。外显子测序相对于基因组重测序成本较低，对研究已知基因的SNP、Indel等具有较大的优势，但无法研究基因组结构变异如染色体断裂重组等。
高通量测序常用名词汇总 一代测序技术：即传统的Sanger 测序法，Sanger 法是根据核苷酸在待定序列模板上的引物点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以 A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧 核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-0H基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G A、T或C处终止，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，通过检测得到DNA碱基序列。 二代测序技术：n ext gen eration seque ncing ( NGS又称为高通量测序技术，与传统测序相比，二代测序技术可以一次对几十万到几百万条核酸分子同时进行序列测定，从而使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序 (Deep sequencing )。NGS主要的平台有Roche(454 &454+), lllumina ( HiSeq 2000/2500、GAIIx、MiSeq)，ABI S0LiD 等。 基因：Gene是遗传的物质基础，是DNA或RNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列。基因通过复制把遗传信息传递给下一代，使后代出现与亲代相似的性状。 DNA：Deoxyribonucleic acid ，脱氧核糖核酸，一个脱氧核苷酸分子由三部分组成：含氮碱基、脱氧核糖、磷酸。脱氧核糖核酸通过3',5'- 磷酸二酯键按一定的顺序彼此相连构成长链，即DNA 链，DNA链上特定的核苷酸序列包含有生物的遗传信息，是绝大部分生物遗传信息的载体。RNA：Ribonucleic Acid ，，核糖核酸，一个核糖核苷酸分子由碱基，核糖和磷酸构成。核 糖核苷酸经磷酯键缩合而成长链状分子称之为RNA链。RNA是存在于生物细胞以及部分病 毒、类病毒中的遗传信息载体。不同种类的RNA链长不同，行使各式各样的生物功能，如
高通量测序在临床分子诊断中的应用与展望 对于单基因遗传病，以往临床实验室主要借助于Sanger测序、等位基因特异性聚合酶链反应（allele-specific polymerase chain reaction，AS-PCR）、荧光原位杂交、DNA印记杂交等技术进行检验。NGS技术针对癌症、心血管疾病、肾病、糖尿病等复杂性疾病的遗传学筛查与诊断提供了便捷的途径。另外，NGS技术在病原微生物的快速鉴定、药物的靶向治疗以及产前筛查等多个领域具有潜在的应用优势。 1 测序技术的发展及性能比较 2006年，Illumina公司推出了Solexa测序平台。目前，该公司已经推出了多种型号的测序平台，如MiSeq、HiSeq、NextSeq等系列，其中MiSeq系列适合于小型基因组测序，HiSeq系列适用于大型基因组测序。2007年，美国应用生物系统公司推出SOLiD测序平台。该平台采用五轮测序法以4色荧光标记寡核苷酸的连接合成为基础，测序准确性得以提高。2010年，美国生命科学公司和太平洋生物科学公司分别发布了半导体测序平台和第3代单分子实时（single molecule realtime，SMRT）DNA测序平台。这2种测序技术与以往的基于光学信号的检测技术不同，半导体测序平台通过半导体芯片直接感应在序列合成过程中磷酸二酯键3'OH基团释放的质子；第3代测序仪通过纳米孔技术记录单个聚合酶在不受干扰情况下连续合成，其中PacBio RS II每次运行能够产生60 000×16条序列，每条序列的平均长度达8 500 bp。 一般来说，以上每种测序仪在序列读段长度、准确性、测序通量、价格等多个方面存在一定的差异。焦磷酸测序平台测序读段较长，测序通量较低，成本相对较高；Illumina系列平台产生的读段相对较短，测序费用相对较低，应用比较广泛；SOLiD测序平台在通量和准确性方面相对以上2种类型的测序平台有明显改善，但是测序长度更短；半导体测序平台以及SMRT测序平台相比其他测序平台运行时间较短，另外单分子测序平台减少了测序前的扩增准备工作，测序读段较长，但是测序成本和错误率都相对较高[8-10]。一些常用的测序仪的测序原理和性能见表1。
基因组测序基础知识 ㈠De Novo测序也叫从头测序，是首次对一个物种的基因组进行测序，用生物信息学的分析方法对测序所得序列进行组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。 目前国际上通用的基因组De Novo测序方法有三种： 1. 用Illumina Solexa GA IIx 测序仪直接测序； 2. 用Roche GS FLX Titanium直接完成全基因组测序； 3. 用ABI 3730 或Roche GS FLX Titanium测序，搭建骨架，再用Illumina Solexa GA IIx 进行深度测序，完成基因组拼接。 采用De Novo测序有助于研究者了解未知物种的个体全基因组序列、鉴定新基因组中全部的结构和功能元件，并且将这些信息在基因组水平上进行集成和展示、可以预测新的功能基因及进行比较基因组学研究，为后续的相关研究奠定基础。 实验流程： 公司服务内容 1.基本服务：DNA样品检测；测序文库构建；高通量测序；数据基本分析（Base calling，去接头， 去污染）；序列组装达到精细图标准 2.定制服务：基因组注释及功能注释；比较基因组及分子进化分析，数据库搭建；基因组信息展 示平台搭建 1.基因组De Novo测序对DNA样品有什么要求？
(1) 对于细菌真菌，样品来源一定要单一菌落无污染，否则会严重影响测序结果的质量。基因组完整无降解(23 kb以上)， OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；每次样品制备需要10 μg样品，如果需要多次制备样品，则需要样品总量=制备样品次数*10 μg。 (2) 对于植物，样品来源要求是黑暗无菌条件下培养的黄化苗或组培样品，最好为纯合或单倍体。基因组完整无降解(23 kb以上)，OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；样品总量不小于500 μg，详细要求参见项目合同附件。 (3) 对于动物，样品来源应选用肌肉，血等脂肪含量少的部位，同一个体取样，最好为纯合。基因组完整无降解(23 kb以上)，OD值在1.8～2.0 之间；样品浓度大于30 ng/μl；样品总量不小于500 μg，详细要求参见项目合同附件。 (4) 基因组De Novo组装完毕后需要构建BAC或Fosmid文库进行测序验证，用于BAC 或Fosmid文库构建的样品需要保证跟De Novo测序样本同一来源。 2. De Novo有几种测序方式 目前3种测序技术 Roche 454，Solexa和ABI SOLID均有单端测序和双端测序两种方式。在基因组De Novo测序过程中，Roche 454的单端测序读长可以达到400 bp，经常用于基因组骨架的组装，而Solexa和ABI SOLID双端测序可以用于组装scaffolds和填补gap。下面以solexa 为例，对单端测序(Single-read)和双端测序(Paired-end和Mate-pair)进行介绍。Single-read、Paired-end和Mate-pair主要区别在测序文库的构建方法上。 单端测序(Single-read)首先将DNA样本进行片段化处理形成200-500bp的片段，引物序列连接到DNA片段的一端，然后末端加上接头，将片段固定在flow cell上生成DNA簇，上机测序单端读取序列(图1)。 Paired-end方法是指在构建待测DNA文库时在两端的接头上都加上测序引物结合位点，在第一轮测序完成后，去除第一轮测序的模板链，用对读测序模块(Paired-End Module)引导互补链在原位置再生和扩增，以达到第二轮测序所用的模板量，进行第二轮互补链的合成测序(图2)。 图1 Single-read文库构建方法图2 Paired-end文库构建方法
(5)高通量测序：环境微生物群落多样性分析 微生物群落多样性的基本概念 环境中微生物的群落结构及多样性和微生物的功能及代谢机理是微生物生态学的研究 热点。长期以来，由于受到技术限制，对微生物群落结构和多样性的认识还不全面， 对微生物功能及代谢机理方面了解的也很少。但随着高通量测序、基因芯片等新技术 的不断更新，微生物分子生态学的研究方法和研究途径也在不断变化。第二代高通量 测序技术（尤其 是Roche 454高通量测序技术）的成熟和普及，使我们能够对环境微生物进行深度测序，灵 敏地探测出环境微生物群落结构随外界环境的改变而发生的极其微弱的变化，对于我 们研究微生物与环境的关系、环境治理和微生物资源的利用以及人类医疗健康有着重 要的理论和现实意义。 在国内，微生物多样性的研究涉及农业、土壤、林业、海洋、矿井、人体医学等诸多领域。以在医疗领域的应用为例，通 过比较正常和疾病状态下或疾病不同进程中人体微生物群落的结构和功能变化，可以 对正常人群与某些疾病患者体内的微生物群体多样性进行比较分析，研究获得人体微 生物群
落变化同疾病之间的关系；通过深度测序还可以快速地发现和检测常见病原及新发传 染病病原微生物。研究方法进展 环境微生物多样性的研究方法很多，从国内外目前采用的方法来看大致上包括以下四 类：传统的微生物平板纯培养方法、微平板分析方法、磷脂脂肪酸法以及分子生物学 方法等等。 近几年，随着分子生物学的发展，尤其是高通量测序技术的研发及应用，为微生物分 子生态学的研究策略注入了新的力量。 目前用于研究微生物多样性的分子生物学技术主要包 括:DGGE/TGGE/TTGE 、 T-RFLP 、SSCP、FISH 、印记杂交、定量 PCR、基因芯片等。 DGGE 等分子指纹图谱技术，在其实验结果中往往只含有数十条条带，只能反映出样品中少数 优势菌的信息；另一方面，由于分辨率的误差，部分电泳条带中可能包含不只一种 16S rDNA 序列，因此要获悉电泳图谱中具体的菌种信息，还需 对每一条带构建克隆文库，并筛选克隆进行测序，此实验操 作相对繁琐；此外，采用这种方法无法对样品中的微生物做 到绝对定量。生物芯片是通过固定在芯片上的探针来获得微
2020版：高通量测序技术临床规范化应用北京专家共识（遗 传病部分） 遗传病是指由于基因突变或染色体数目或结构变异导致的疾病。根据遗传物质的改变情况，可分为单基因病、多基因病、染色体病、线粒体遗传病和体细胞遗传病[1]。目前，人类在线孟德尔遗传数据库（OMIM）已经收录了6 000多种分子基础已知的遗传病[2]。因为遗传异质性和表型多样性，以往的检测方法例如Sanger测序和染色体芯片分析（CMA）等在成本、通量和诊断敏感性等方面难以满足临床应用需求。近年来，高通量测序即下一代测序（NGS）技术因其可同时对多个基因，甚至全外显子组和全基因组进行测序，现已被广泛应用于遗传病诊断领域，极大地提高了遗传病诊断的预期[3]。但与以往技术相比，基于NGS技术的检测操作步骤多，对人员能力要求高，不规范使用或过度使用都有可能给受检者及其家庭造成不可预期的困扰和伤害，为保障高通量测序技术在遗传病临床检测中的规范应用，在借鉴国内外相关指南、标准、规范和权威发表的文献，以及《高通量测序技术临床检测规范化应用北京专家共识（第一版通用部分）》[4] （以下简称"通用共识"）的基础上，北京市临床检验中心、北京医学会检验医学分会、首都医科大学临床检验诊断学系、北京市医学检验质量控制和改进中心牵头起草了《高通量测序技术临床规范化应用北京专家共识（第一版遗传病部分）》。本共识中的声明内容为专家讨论并推荐的要点。 遗传病高通量测序实验室建设的总体要求
遗传病高通量测序实验室建设时，在实验室环境条件（通风、温湿度、洁净和防震等）、仪器设备配备及日常维护与定期校准和人员专业知识及能力要求等总体上应满足"通用共识"的要求[4]，实验室分区设计则在遵循"通用共识"中所阐述的"32字原则"上，同时要考虑遗传变异检测的特点。实验室应根据不同的遗传检测项目、检测流程、测序平台、建库策略及工作量大小制订切实可行的分区方案。基于杂交捕获方法进行遗传病目标区域捕获测序（亦称"靶向测序"）和全外显子组测序（WES）时，实验室区域应包含：试剂准备区、样本制备区、打断区（适用时）、文库制备区、扩增一区（文库预扩增和纯化）、杂交捕获区、扩增二区（文库扩增和富集）、测序区、电泳区（适用时）等区域。如采用酶法进行基因组片段化则无需划分独立打断区。对于没有PCR扩增（PCR-free）过程的全基因组测序（WGS），因不存在靶向区域捕获这一过程，实验流程和分区更为简单，只需试剂准备区、样本制备区、打断区（适用时）、文库制备区、测序区、电泳区（适用时）等区域即可。如实验室使用自动化建库流程，在确认不会产生交叉污染的情况下，某些区域可以适当合并。 对于多检测技术流程、多检测项目、多测序平台共存的检测实验室，则可在遵循"通用共识"基本原则的基础上，适当共用一些区域[5]，为了避免检测结果之间的相互干扰，胚系变异检测和肿瘤体细胞突变检测的"湿实验"过程中的核酸提取及建库过程相关区域宜分开。 实验室应根据所选测序平台及建库流程进行各分区内仪器的配置，以满足实验要求。各仪器应建立使用、维护和校准（适用时）标准操作程序（SOPs）及相应记录，以保证仪器正常运行。
临检实验室建设标准与要求 一、高通量测序（NGS）实验室简介 1.1NGS实验室又叫高通量测序检测实验室。NGS是下一代测序技术(N EXT G ENERATION S EQUENCING)即高通量测序技术的简称。高通量测序技术是 对传统S ANGER测序（称为一代测序技术）革命性的改变,可同时对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能,也称为深度测序 (D EEP SEQUENCING)。 1.2由于NGS技术对所检测的核酸模板进行大量扩增，容易出现实验室污 染导致检测结果准确性下降；另外NGS技术要求高、影响因素多，实验过程处理不当易导致检测结果准确性下降或检测失败。因此临床基因扩增检验实验室技术验收和规范化管理是NGS技术本身需要，也是在临床上顺利应用该技术前提。 二、NGS实验室临床应用的基本条件 2.1必须拥有符合临检中心相关规定的标准NGS实验室。 2.2检测设备必须符合标准NGS实验室设置要求：高通量测序仪及配套服 务器；高通量测序检测试剂盒；通用电脑；自动分析软件，实验室样本信息管理系统等。 2.3检测人员必须通过专门的技能培训，并获得省级以上卫生计生行政部门 颁发的临床基因扩增检验技术上岗证书。NGS实验室必须建立严格的实验室管理制度、建立标准化操作程序（SOP）、建立系列质量管理文
件等，确保实验室日常运行符合国家卫生部的要求，确保检测结果准确、确保实验室卫生安全，确保实验室长期稳定运行。 2.4NGS临床应用必须在无菌无尘环境下进行操作。 三、NGS实验室建设基本要求 3.1主体结构 主体为彩钢板、铝合金型材。室内所有阴角、阳角均采用铝合金50内圆角铝，从而解决容易污染、积尘、不易清扫等问题。结构牢固，线条简明，美观大方，密封性好。 3.2标准的各区分隔和气压调节 将检测过程分成试剂准备、样本制备、PCR扩增和高通量测序四个独立的实验区。整个区域有一个整体缓冲走廊。每个独立实验区设置有缓冲区，同时各区通过气压调节，使整个检测实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染并降低扩增产物对人员和环境的污染。 可打开缓冲区和PCR扩增区的排风扇往外排气，在实验区的外墙上和各扇门上都安装有风量可调的回风口，空气通过回风口向室内换气。 3.3消毒 在每个实验区和缓冲区顶部以及传送窗内部安装有紫外灯，供消毒用。在各区还设置移动紫外线灯，对实验桌进行局部消毒。 3.4机械连锁不锈钢传递窗
案例一 虽然RNA-seq早已被大家所熟知，特别是在高通量测序越来越便宜的今天，但是RNA-seq数据的分析仍令多数小菜抓狂。多个软件的使用，参数设置，参考基因组准备，输出结果的解读等等，都让很多初次接触测序数据或者非生物信息专业的人头疼不已。 哈哈，不用怕，有云生信，这都不是事儿！今天我就向大家简单介绍一下如何用云生信做RNA-seq数据的常规分析。不过在此之前，我要稍稍啰嗦一下RNA-seq的常规分析流程，请不要拍砖头。图1是RNA-seq数据从产生到分析的常规分析流程：根据实验设计，提取细胞RNA，并将RNA提交给测序公司，就可以坐等测序数据了。测序公司会根据客户提供的RNA进行建库，上机测序。拿到测序数据后，就到了我们大显身手的时候了。首先，我们要对测序结果做个简单的质量评估，剔除低质量的数据。然后，根据基因组数据（这里我们讲的是基因组数据已知的物种，基因组未知的有套独立的流程，这里不讲），将测序数据组装。根据组装结果，计算基因或转录本的表达量。最后，同芯片数据一样，我们可以根据表达量数据做很多分析，如差异表达分析，网络分析（包括蛋白互作网络，共表达网络等），也可以结合临床数据做分析（如预后，亚型分类、关联，药效等）。 图1. RNA-seq常规分析流程
叨叨完毕，进入正题。 进入尔云后，打开“测序数据处理”模块，我们会看到图2的结果。在这一模块，我们可以完成RNA-seq数据分析的前两步：1、数据质控和过滤低质量数据；2、基因组组装，计算基因表达量。对于上面两部，尔云又根据是双端测序还是单端测序，分了两块。以edgeR 为例，输出的DEGs.txt就是根据我们设定的参数得到的差异表达基因的列表，有geneSymbol, logCPM, PVlue信息。 图2. 测序数据处理模块 质控结束后，尔云会给出全部的质控结果。图3是以demo数据为例的双端测序的质控结果，好多好多呀，可以下了慢慢看。建议主要关注一下xxx_qc_TABLE，该表格是对质控前后的数据统计，反应了测序的好坏。Clean_xxx.fq是质控后的干净的fastq数据，是第2步组装的输入文件。 图3.质控结果 组装完成后，会返回一个expression.txt的表达矩阵文件，该文件是下一步差异表达分析的输入分析。 得到表达矩阵后，我们就可以进入到第3步差异表达数据分析。进入尔云的“差异分析”模块（如下图所示），它针对芯片和测序两种检测技术提供了不同的分析方案。对于RNA-seq
高通量测序技术在微生物多样性与功能研究方面的应用 一、高通量测序技术简介 进入21世纪，随着基因组计划的完成，人类进入后基因组时代，对测序技术的迫切需求，促使测序技术迅猛发展，进而形成第2代测序技术——高通量测序的时代。其中最具代表性的测序平台包括罗氏公司(Roche)的454测序仪(Roch GS FLX Sequencer)，Illumina公司的Solexa基因组分析仪(Illumina Genome Analyzer)和ABI的SOLiD测序仪(ABI SOLID Sequencer)。 1、Illumina Genome Analyzer和HiSeq 2000 IIllumina公司的新一代测序仪(包括CenomeA nalyzer及其升级版HiSeq 2000)利用基于单分子簇的边合成边测序技术(Sequencing by SynthesisSBS)和专有的可逆终止化学反应，可以在短时问内获得大量数据。测序特点：①通量高，目前一台机器在两周内最高可产出360 G的数据；②准确率高，≥98.5%，同时也有效地解决了多聚重复序列的读取问题；③成本低，低于传统Sanger测序技术成本的1%；④DNA序列的读取长度不断增加，当前单条序列读长可达到150 bp；⑤可以进行Pair-End(PE)双向测序，PE文库插入片段大小范围可由150 bp到10 kb。正确选择插入片段长度有利于高重复序列含量基因组的组装，这进一步扩展了该技术的应用范围。 2、Roche GS FLX Titanium System 2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统—Genome Sequencer 20 System，被《Nature》杂志以里程碑事件报道，开创了新一代测序技术的先河。测序特点：①速度快，一个测序反应耗时10 h，获得4-6亿个碱基对，比传统的Sanger测序的方法快100倍；②读长长，单条序列的读长平均可达到450 bp；③通量高，每个反应可以得到超过100万个序列读长； ④准确度高，读长超过400 bp时，单一读长的准确性可以超过99%；⑤可以进行Pair-End测序研究。 3、AB SOLiD system AB SOLiD sequencer是由ABI公司研发的新一代高通量基因测序分析系统，该技术以用四色荧光标记寡核苷酸进行连续的连接反应为基础，能够对单拷贝扩增的DNA片段进行大规模高通量并行测序，根据双碱基编码原理进行数据比对。
附件三生物信息学分析 一、基础生物信息学分析 1.有效测序序列结果统计 有效测序序列：所有含样品barcode（标签序列）的测序序列。 统计该部分序列的长度分布情况。 注：合同中约定测序序列条数以有效测序序列为准。 图形示例为： 2.优质序列统计 优质序列：有效测序序列中含有特异性扩增引物、不含模糊碱基、长度大于可供分析标准的序列。 统计该部分序列的长度分布情况。 图形示例为：
3.各样本序列数目统计： 统计各个样本所含有效测序序列和优质序列数目。 结果示例为： 4.OTU生成： 根据序列的相似性，将序列归为多个OTU（操作分类单元），以便后续分析。 5.稀释曲线（rarefaction 分析） 根据第4条中获得的OTU数据，做出每个样品的Rarefaction曲线。本合同默认生成OTU相似水平为0.03的rarefaction曲线。 rarefaction曲线结果示例：
6.指数分析 计算各个样品的相关分析指数，包括： ?丰度指数：ace\chao ?多样性指数：shannon\simpson ?本合同默认生成OTU相似水平为0.03的上述指数值。 多样性指数分析结果示例： 注：默认分析以上所列指数，如有特殊需要请说明。 7.Shannon-Wiener曲线 利用各样品的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建曲线，反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性。当曲线趋向平坦时，说明测序数据量足够大，可以反映样品中绝大多数的微生物信息。绘制默认水平为：0.03。 例图：
8.Rank_Abuance 曲线 根据各样品的OTU丰度大小排序作丰度分布曲线图。结果文件默认为PDF格式（其它格式请注明）。 例图： 9.Specaccum物种累积曲线（大于10个样品） 物种累积曲线( species accumulation curves) 用于描述随着抽样量的加大物种增加的状况，是理解调查样地物种组成和预测物种丰富度的有效工具，在生物多样性和群落调查中，被广泛用于抽样量充分性的判断以及物种丰富度( species richness) 的估计。因此，通过物种累积曲线不仅可以判断抽样量是否充分，在抽样量充分的前提下，运用物种累积曲线还可以对物种丰富度进行预测。
高通量测序与功能分析 微生物群落测序是指对微生物群体进行高通量测序，通过分析测序序列的构成分析特定环境中微生物群体的构成情况或基因的组成以及功能。借助不同环境下微生物群落的构成差异分析我们可以分析微生物与环境因素或宿主之间的关系，寻找标志性菌群或特定功能的基因。对微生物群落进行测序包括两类，一类是通过16s rDNA，18s rDNA，ITS区域进行扩增测序分析微生物的群体构成和多样性；还有一类是宏基因组测序，是不经过分离培养微生物，而对所有微生物DNA进行测序，从而分析微生物群落构成，基因构成，挖掘有应用价值的基因资源。 以16s rDNA扩增进行测序分析主要用于微生物群落多样性和构成的分析，目前的生物信息学分析也可以基于16s rDNA的测序对微生物群落的基因构成和代谢途径进行预测分析，大大拓展了我们对于环境微生物的微生态认知。 目前我们根据16s的测序数据可以将微生物群落分类到种（species）（一般只能对部分菌进行种的鉴定），甚至对亚种级别进行分析， 几个概念： 16S rDNA（或16S rRNA）：16S rRNA基因是编码原核生物核糖体小亚基的基因，长度约为1542bp，其分子大小适中，突变率小，是细菌系统分类学研究中最常用和最有用的标志。16S rRNA基因序列包括9个可变区和10个保守区，保守区序列反映了物种间的亲缘关系，而可变区序列则能体现物种间的差异。16S rRNA基因测序以细菌16S rRNA基因测序为主,核心是研究样品中的物种分类、物种丰度以及系统进化。 OTU：operational taxonomic units (OTUs)在微生物的免培养分析中经常用到，通过提取样品的总基因组DNA，利用16S rRNA或ITS的通用引物进行PCR 扩增，通过测序以后就可以分析样品中的微生物多样性，那怎么区分这些不同的序列呢，这个时候就需要引入operational taxonomic units，一般情况下，如
高通量测序在病原微生物学方面的研究进展 近年来，随着测序技术的不断发展，实现对大量分离菌高通量，更准确的序列分析，以及对细菌种群进行高分辨率的系统发育分析，极大地提高了对病原微生物产生、适应和传播的认识。高通量测序（high throughput generation sequencing，HTS）技术是人类和动物基因组学研究领域中最热门的话题，与基于Sanger方法的最复杂的毛细管测序仪相比，该技术可以产生的数据多100倍。 与传统的第一代测序，又称Sanger测序相比，在DNA测序方面，HTS技术具有快速、廉价和高通量的优点，使得细菌基因组学研究发生了巨大的变化。高通量“台式”测序仪的出现的使实验室能够独立于专业测序中心进行测序工作，同时，HTS高分辨率的特点可以确定病原菌克隆的分子机制，辅助研究人员推断出全球大流行以及局部暴发期间的传播途径，甚至可以对患者个体在感染期间进行细菌种群进化分析。与传统的杂交方法相比，HTS还提供了转录组分析的潜力，包括覆盖全基因组范围及准确定量等，且深度测序辅助对细菌突变体文库的构建，以确定病原菌在体内生长或在其他特定生长条件下存活所需的决定因素。本文将对HTS在细菌病原体方面的近期研究进展进行阐述。
一、感染过程中细菌进化的研究 感染性疾病的进展和结果往往取决于宿主与病原体如何相互作用，采用HTS技术进行的研究为定殖和感染过程中细菌病原体的进化提供了新的见解。例如，研究发现，在感染过程中，由于选择性压力（例如与其他微生物共同感染、宿主的免疫反应及抗生素的应用等），某些固定的亚种中会随机出现有利与病原菌的突变，同时，在感染期间还可以发生抗生素耐药性的突变。相较于与传统的PCR扩增技术和一代Sanger测序，HTS的超基因组学方法可以从微生物群分析得到更大的多样性。例如，与健康者相比，肺囊性纤维化患者的微生物多样性降低与更严重的炎症相关，并且微生物的代谢途径的明显发生改变。 二、确定疾病暴发的来源和传播途径 传统的细菌分型方法鉴别力较低，无法在传染病暴发的流行病学调查中发挥精准的作用。全基因组序列可以为分离株之间核苷酸提供最高水平的分辨率，可识别医院内部和医院之间以及社区之间的传播。应用该种新方法可以确定传播的起源是某单一菌株还是多个菌株共同引起。
基于二代高通量测序的环境微生物多样性分析 一般认为土壤、海洋、肠道等生态系统中的微生物数量繁多、种类多样。传统的培养方法只限于对环境样品中极少部分（0.1%-1%）可培养的微生物类群的研究，而变性梯度凝胶电泳（DGGE）、克隆文库等常规的分子生物学方法也因操作复杂、成本高、痕量菌发现困难等因素无法达到深入分析环境微生物多样性的目的。高通量测序技术的出现，极大的促进了对环境中不可培养微生物以及痕量菌的研究，为环境微生物多样性的研究开启了新的研究热潮。 微生物群落中物种的多样性依然是目前研究的重点。对群落结构的研究，将有助于了解种群结构的稳定性，进而了解种群内物种间的相互依赖、相互制约的内在联系，为将来构建功能性种群服务。鉴于微生物群落是一个多物种的集合体，其中高达95%以上的微生物物种无法分离也不能独立培养，拼装出每个独立个体的基因组现在也无法实现，细菌16S 或真菌ITS测序分析依然是现阶段微生物群落多样性和多态性分析的基石。 一、高通量测序背景介绍 高通量测序技术，可以一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，使得对PCR扩增产物直接进行序列测定成为可能。极大的促进了对环境中不可培养微生物以及痕量菌的研究，为环境微生物多样性的研究开启了新的研究热潮。目前高通量测序的主要平台代表有Illumina公司的Solexa基因组分析仪（Illumina Genome Analyzer）、罗氏公司(Roche)的454测序仪（Roch GS FLX sequencer）和ABI的SOLiD测序仪（ABI SOLiD sequencer）。微生物多样性分析中，以Illumina 及454测序平台应用最为广泛。 二、工作流程 1 PCR引物的设计 2 PCR扩增条件摸索 3琼脂糖凝胶电泳检测结果 4 全部样品进行PCR 5 PCR产物的凝胶回收及检测 6 PCR产物精确定量（Qubit 2.0 ）
高通量测序技术在无创产前检测中的应用 摘要：随着以高通量、自动化为显著特征的二代测序技术的发展，基于该技术的无创产前检测(NIPT)在临床上迅速得以应用。国际上发表了一系列与NIPT相关的指导意见，我国卫计委也于今年发布了技术规范。文章将对NIPT技术规范进行解读，并对高通量测序技术在NIPT应用中的优势、局限性和临床应用要点进行评价。 染色体非整倍体是胎儿出生缺陷最常见病因之一，其中以21-三体综合征、18-三体综合征最为常见，占所有足月妊娠的0.2%~0.3%。对先天性遗传病进行产前筛查和产前诊断是优生优育的重要保证。自1970年以来，针对上述胎儿染色体疾病的产前筛查和产前诊断已逐渐应用到临床上，并在降低出生缺陷方面得到了良好的效果。 从取材方法进行分类，产前检查分为有创性和无创性两种。有创性产前诊断是目前诊断胎儿染色体疾病的的金标准，主要是指通过绒毛活检术、羊水穿刺术和脐静脉穿刺术采集胎儿细胞或组织，进行细胞核型分析获取胎儿染色体信息，有创检测的准确率为98%~99%，但伴有0.5%~1.0%的流产风险，同时也会伴有羊水渗漏、宫内感染等风险。因此，有创产前诊断目前仅应用于筛查高风险、高龄妊娠或家庭中生育过遗传病患儿等情况。传统的无创性产前检查主要有超声检查和孕妇血清学检测等方法，使用这些方法进行检测可避免对胎儿和孕妇造成的危害，但是其灵敏度及特异性有限。近20年来，基于超声检查和孕妇各种蛋白或激素的血清学筛查相结合的产前筛查发展迅速。产前母体血清学筛查的目标疾病是21、18-三体综合征和神
经管缺陷，当假阳性率控制在5%时，在早孕期、中孕期、早中孕期的检出率分别为82%~87%、81%、94%~96%[1]，这些方法的假阳性率较高，为后续有创性产前诊断带来较大的临床压力与实验室压力。 常规产前筛查和有创性产前诊断方法的局限性促使研究者积极开发一种针对胎儿染色体非整倍体及其他染色体异常的、无创伤性的高精度检测方法。1997年Lo等[2]通过孕育男性胎儿的孕妇外周血血浆Y染色体PCR扩增的方法证明了孕妇外周血循环中存在胎儿游离DNA(cell free fetal DNA，cffDNA)，开启了基于cffDNA无创产前检测(non-invasive prenatal testing，NIPT)方法。其后，利用各种分子诊断技术对cffDNA的检测已经在胎儿性别鉴定、Rh血型鉴定、X连锁隐性遗传病、先天性多囊肾检测等方面得到应用，但由于方法繁琐、耗费时间长、精度低、费用较高等问题，一直难以推广于临床。 近年来，随着以高通量、自动化为显著特征的二代测序技术的发展，基于该技术的NIPT在临床上迅速得以应用。今年，国家卫生计生委妇幼司发布了第一批高通量测序技术临床应用试点单位，同时发布了《高通量基因测序产前筛查与诊断技术规范(试行)》。如何充分理解并合理规范应用NIPT，如何正确解读技术规范，将NIPT作为常规产前筛查方法时有哪些注意事项，我国产前筛查和产前诊断体系中NIPT该如何正确定位等，本文将对这些问题进行深入探讨。 一、母血中胎儿游离DNA的特性
N G S在临床中的应用集团企业公司编码：（LL3698-KKI1269-TM2483-LUI12689-ITT289-
高通量测序在临床分子诊断中的应用与展望对于单基因遗传病，以往临床实验室主要借助于Sanger测序、等位基因特异性聚合酶链反应（allele-specificpolymerasechainreaction，AS-PCR）、荧光原位杂交、DNA印记杂交等技术进行检验。NGS技术针对癌症、心血管疾病、肾病、糖尿病等复杂性疾病的遗传学筛查与诊断提供了便捷的途径。另外，NGS技术在病原微生物的快速鉴定、药物的靶向治疗以及产前筛查等多个领域具有潜在的应用优势。 1测序技术的发展及性能比较 2006年，Illumina公司推出了Solexa测序平台。目前，该公司已经推出了多种型号的测序平台，如MiSeq、HiSeq、NextSeq等系列，其中MiSeq系列适合于小型基因组测序，HiSeq系列适用于大型基因组测序。2007年，美国应用生物系统公司推出SOLiD测序平台。该平台采用五轮测序法以4色荧光标记寡核苷酸的连接合成为基础，测序准确性得以提高。2010年，美国生命科学公司和太平洋生物科学公司分别发布了半导体测序平台和第3代单分子实时（singlemoleculerealtime，SMRT）DNA 测序平台。这2种测序技术与以往的基于光学信号的检测技术不同，半导体测序平台通过半导体芯片直接感应在序列合成过程中磷酸二酯键 3'OH基团释放的质子；第3代测序仪通过纳米孔技术记录单个聚合酶在不受干扰情况下连续合成，其中PacBioRSII每次运行能够产生60000×16条序列，每条序列的平均长度达8500bp。
环境微生物群落多样性分析 微生物群落多样性的基本概念 环境中微生物的群落结构及多样性和微生物的功能及代谢机理是微生物生态学的研究热点。长期以来，由于受到技术限制，对微生物群落结构和多样性的认识还不全面，对微生物功能及代谢机理方面了解的也很少。但随着高通量测序、基因芯片等新技术的不断更新，微生物分子生态学的研究方法和研究途径也在不断变化。第二代高通量测序技术（尤其是Roche 454高通量测序技术）的成熟和普及，使我们能够对环境微生物进行深度测序，灵敏地探测出环境微生物群落结构随外界环境的改变而发生的极其微弱的变化，对于我们研究微生物与环境的关系、环境治理和微生物资源的利用以及人类医疗健康有着重要的理论和现实意义。 在国内，微生物多样性的研究涉及农业、土壤、林业、海洋、矿井、人体医学等诸多领域。以在医疗领域的应用为例，通过比较正常和疾病状态下或疾病不同进程中人体微生物群落的结构和功能变化，可以对正常人群与某些疾病患者体内的微生物群体多样性进行比较分析，研究获得人体微生物群落变化同疾病之间的关系；通过深度测序还可以快速地发现和检测常见病原及新发传染病病原微生物。 研究方法进展 环境微生物多样性的研究方法很多，从国内外目前采用的方法来看大致上包括以下四类：传统的微生物平板纯培养方法、微平板分析方法、磷脂脂肪酸法以及分子生物学方法等等。 近几年，随着分子生物学的发展，尤其是高通量测序技术的研发及应用，为微生物分子生态学的研究策略注入了新的力量。 目前用于研究微生物多样性的分子生物学技术主要包括:DGGE/TGGE/TTGE、T-RFLP、SSCP、FISH、印记杂交、定量PCR、基因芯片等。DGGE等分子指纹图谱技术，在其实验结果中往往只含有数十条条带，只能反映出样品中少数优势菌的信息；另一方面，由于分辨率的误差，部分电泳条带中可能包含不
高通量测序中常用的生物信息分析名词解释 1. 什么是Read? 高通量测序平台产生的序列就称为reads。 (测序读到的碱基序列片段，测序的最小单位；) 2. 什么是Contig? 拼接软件基于reads之间的overlap区，拼接获得的序列称为Contig（重叠群）。 (由reads通过对overlap区域拼接组装成的没有gap的序列段；) 3. 什么是Scaffold? 基因组de novo测序（没有参考基因组的测序，需要研究人员从头拼接得到的序列），通过reads拼接获得Contigs后，往往还需要构建454 Paired-end库或Illumina Mate-pair库，以获得一定大小片段（如3Kb、6Kb、10Kb、20Kb）两端的序列。基于这些序列，可以确定一些Contig 之间的顺序关系，这些先后顺序已知的Contigs组成Scaffold。 (通过pair ends信息确定出的contig排列，中间有gap) 4. 什么是Contig N50？ Reads拼接后会获得一些不同长度的Contigs。将所有的Contig长度相加，能获得一个Contig总长度。然后将所有的Contigs按照从长到短进行排序，如获得Contig 1，Contig 2，Contig 3...………Contig 25。将Contig按照这个顺序依次相加，当相加的长度达到Contig总长度的一半时，最后一个加上的Contig长度即为Contig N50。举例：Contig 1+Contig 2+ Contig 3 +Contig 4=Contig总长度*1/2时，Contig 4的长度即为Contig N50。
高通量测序在病原微生物学方面的研 究进展 近年来，随着测序技术的不断发展，实现对大量分离菌高通量，更准确的序列分析，以及对细菌种群进行高分辨率的系统发育分析，极大地提高了对病原微生物产生、适应和传播的认识。高通量测序（high throughput generation sequencing，hts）技术是人类和动物基因组学研究领域中最热门的话题，与基于sanger 方法的最复杂的毛细管测序仪相比，该技术可以产生的数据多100倍。 与传统的第一代测序，又称sanger测序相比，在dna测序方面，hts技术具有快速、廉价和高通量的优点，使得细菌基因组学研究发生了巨大的变化。高通量“台式”测序仪的出现的使实验室能够独立于专业测序中心进行测序工作，同时，hts高分辨率的特点可以确定病原菌克隆的分子机制，辅助研究人员推断出全球大流行以及局部暴发期间的传播途径，甚至可以对患者个体在感染期间进行细菌种群进化分析。与传统的杂交方法相比，hts 还提供了转录组分析的潜力，包括覆盖全基因组范围及准确定量等，且深度测序辅助对细菌突变体文库的构建，以确定病原菌在体内生长或在其他特定生长条件下存活所需的决定因素。本文将对hts在细菌病原体方面的近期研究进展进行阐述。
一、感染过程中细菌进化的研究 感染性疾病的进展和结果往往取决于宿主与病原体如何相互作用，采用hts技术进行的研究为定殖和感染过程中细菌病原体的进化提供了新的见解。例如，研究发现，在感染过程中，由于选择性压力（例如与其他微生物共同感染、宿主的免疫反应及抗生素的应用等），某些固定的亚种中会随机出现有利与病原菌的突变，同时，在感染期间还可以发生抗生素耐药性的突变。相较于与传统的pcr扩增技术和一代sanger测序，hts的超基因组学方法可以从微生物群分析得到更大的多样性。例如，与健康者相比，肺囊性纤维化患者的微生物多样性降低与更严重的炎症相关，并且微生物的代谢途径的明显发生改变。 二、确定疾病暴发的来源和传播途径 传统的细菌分型方法鉴别力较低，无法在传染病暴发的流行病学调查中发挥精准的作用。全基因组序列可以为分离株之间核苷酸提供最高水平的分辨率，可识别医院内部和医院之间以及社区之间的传播。应用该种新方法可以确定传播的起源是某单一菌株还是多个菌株共同引起。 三、有助于了解病原性克隆出现的分子基础 对大量紧密相关的分离菌株进行测序可帮助我们重建高分辨率的系统发育树，有助于对病原菌克隆株出现和传播的潜在过程进行深入了解。例如，基于hts的进化研究，证明了第七次霍乱大流行由三个独立事件组成，后两个是由于霍乱弧菌获取复方新