植物内生菌分离方法
植物内生放线菌是一类大有开发潜力的微生物资源。目前使用的分离条件和技术尚不完善，容易被外源菌和内生真菌、细菌污染，因此内生放线菌尤其是稀有内生放线菌的选择性分离技术至少是今后一段时间研究的重点。介绍了植物内生放线菌选择性分离方法并提出值得研究的问题。 (
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nk0226 | 2009-07-25 11:13:09
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植物病毒与病毒防治
Plant Virology& Control of Plant Virology
32学时 2学分
一、课程性质、地位和任务
植物病毒与病毒防治是研究病原病毒与植物病毒病害相互关系的生物学科。本课程重点讲授植物病毒相关生物学特性与研究进展：病毒侵染寄主植物生理效应与抗病免疫；植物亚病毒病原等基础理论知识。同时，根据植物病毒基础研究需要，课程理论讲授与实验技能训练并重。通过本课程的学习，使学生进一步熟悉病毒病原与其它相关病原的区别要点，病害宏观及微观鉴定基本技术、方法、手段，并能在实践中应用。为独立开展植物病毒及病毒病害研究奠定基础。
二、课程教学的基本要求
要求学生重点掌握以下内容：
（1）植物病毒的传播途径及传毒机制；
（2）病毒侵染植物内部症状，侵染增殖过程；
（3）植物受病毒侵染的生理效应与抗病免疫；
（4）植物亚病毒病原的基本特性；
（5）植物病毒与病毒病害诊断鉴定的程序与方法。
三、课程理论教学大纲及学时分配
1. 绪论（2学时）
1.1 病毒的发现与病毒学的发展
1.2 研究病毒的意义与任务
1.3 植物病毒与其他病毒的关系
1.4病毒与其他微生物的区别
2. 病毒的分类与命名（3学时）
主要介绍病毒分类和命名的基本原则相关指标。重点：植物病毒的命名和分类系统。
2.1 病毒命名和分类的发展
2.2 病毒命名的系列
2.3 病毒分类的系列
2.4 植物病毒的命名和分类系统
3. 病毒侵染植物与增殖与增殖过程及遗传与变异（5学时）
主要讲授植物病毒侵染方式，在寄主体内的增殖过程，病毒遗传变异的本质。难点:病毒进入寄主细胞的方式及粒体装配。
3.1病毒粒体的吸附与侵入
3.2病毒粒体的脱壳与生物合成
3.3病毒粒体的装配与释放
3.4病毒的遗传与变异
3.5病毒的体外重新组与生物活性
4. 植物病毒的传播途径及传毒机制（5学时）
主要讲授病毒的介体传播和非介体传播的两大途径，以及不同介体传播机制与病害发生流行关系，难点：介体持久性传毒（口针传毒）与非持久性传毒（巡回传毒）机理。
4.1介体传毒
4.2非介体传毒
4.3种子与花粉传毒
4.4传毒机制
5. 病毒侵染植物生理效应与抗病免疫（5学时）
主要介绍病原侵染植物的内部症状（内含体）、病毒在植物体内的运转及生理活性物质改变与寄主抗病机理。难点：病毒侵染植物的生理变化与寄主的免疫反应。
5.1病毒侵染植物内部症状（内含体及其类型）
5.2病毒在植物体内的运输
5.3病毒侵染植物的生理效应
5.4寄主对病毒侵染的抗性反应类型
5.5植物抗病毒机制
6. 植物亚病毒病原种类（3学时）
主要介绍植物亚病毒病原种类，所致病害特点，亚病毒基本特性以及病毒实质差别。难点：亚病毒鉴定。
6.1类病毒的基本特性
6.2卫星RNA的基本特性
6.3拟病毒的基本特性
6.4亚病毒对寄主植物的影响
6.5亚病毒及其所致病害的诊断鉴定
7. 植物病毒与病毒病害诊断鉴定的程序与方法（4学时）
主要介绍植物病毒病害的生物学鉴定，血清学鉴定及电镜鉴定等相关方法手段。难点：不同鉴定方法的基本原理及实践应用。
7.1植物病毒生物学鉴定
7.2 组织学鉴定
7.3植物病毒血清学鉴定理化特性鉴定
7.4植物病毒的电镜鉴定技术
7.5 分子生物学鉴定
8. 植物病毒分离提纯的原理与方法 (3学时)
主要介绍植物病毒分离提纯的基本原理和方法步骤。难点：不同植物材料分离提纯过程中的技术要点。
8.1 植物病毒分离提纯的基本系统
8.2 不同植物材料分离提纯选用制剂
8.3 植物病毒分离提纯的方法步骤及原理
8.4 提纯病毒制剂的检测及应用
9. 植物病毒的血清学技术（2学时）
主要介绍植物病毒诊断鉴定的血清学技术及基本原理。难点：不同血清学技术的实践应用。9.1 抗原的定义及基本特性
9.2 抗体的定义及基本特性
9.3 机体免疫反应发生过程
9.4 抗血清的制备程序
9.5 病毒的血清学反应技术及应用
四、作业与考查
撰写有关植物病毒研究进展的专题综述论文1篇；论文要求4000字以上，查阅参考文献30篇以上，以此作为本课程成绩评定依据。
参考文献：
1、裘维番，植物病毒学，农业出版社，1982。
2、侯明生，植物病毒学导论，中国农业出版社，1999。
3、梁顺生等，植物血清学技术，农业出版社，1985。
（植物科学技术学院侯明生）
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609792397 | 2009-09-27 10:59:39
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内生菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官的细胞间隙或细胞内的细菌，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接产生扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。
在植物组织培养中，由于材料内部的内生细菌不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料带入培养过程，从而引起组培中的污染，称为内生细菌污染。
从污染状态来看，是发生于植物材料周围，一般会由培养基内向外延展，并且发生的时间也会比接触性污染要长，接触性的细菌一般在2－4天表现，内生菌则会超过4天，并且菌的种类也相对单一。
内生菌(Plant endophyte)是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的微生物，被感染的宿主植物(至少是暂时)不表现出外在病症，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。它不仅包括互惠共利的和中性的内共生微生物，也包括那些潜伏在宿主体内的病原微生物，这些微生物有细菌、真菌、放线菌等。自1898年Vogl从黑麦草种子内分离出第一株内生真菌以来，植物内生菌作为一种新的微生物资源受到了广泛的关注，从内生菌中寻找和发现新的活性化合物已成为国内外研究的又一热点。近年来，该领域的研究已取得一定进展，发现了一些有医用、农用价值的菌株和化合物。
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ereovrqwv | 2009-09-27 12:00:05
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内生菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官的细胞间隙或细胞内的细菌，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接产生扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。
在植物组织培养中，由于材料内部的内生细菌不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料带入培养过程，从而引起组培中的污染，称为内生细菌污染。
从污染状态来看，是发生于植物材料周围，一般会由培养基内向外延展，并且发生的时间也会比接触性污染要长，接触性的细菌一般在2－4天表现，内生菌则会超过4天，并且菌的种类也相对单一。
内生菌(Plant endophyte)是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的微生物，被感染的宿主植物(至少是暂时)不表现出外在病症，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。它不仅包括互惠共利的和中性的内共生微生物，也包括那些潜伏在宿主体内的病原微生物，这些微生物有细菌、真菌、放线菌等。自1898年Vogl从黑麦草种子内分离出第一株内生
真菌以来，植物内生菌作为一种新的微生物资源受到了广泛的关注，从内生菌中寻找和发现新的活性化合物已成为国内外研究的又一热点。近年来，该领域的研究已取得一定进展，发现了一些有医用、农用价值的菌株和化合物。 ,,内生菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官的细胞间隙或细胞内的细菌，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接产生扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。
,在植物组织培养中，由于材料内部的内生细菌不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料带入培养过程，从而引起组培中的污染，称为内生细菌污染。
,从污染状态来看，是发生于植物材料周围，一般会由培养基内向外延展，并且发生的时间也会比接触性污染要长，接触性的细菌一般在2－4天表现，内生菌则会超过4天，并且菌的种类也相对单一。
,
,内生菌(Plant endophyte)是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的微生物，被感染的宿主植物(至少是暂时)不表现出外在病症，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。它不仅包括互惠共利的和中性的内共生微生物，也包括那些潜伏在宿主体内的病原微生物，这些微生物有细菌、真菌、放线菌等。自1898年Vogl从黑麦草种子内分离出第一株内生真菌以来，植物内生菌作为一种新的微生物资源受到了广泛的关注，从内生菌中寻找和发现新的活性化合物已成为国内外研究的又一热点。近年来，该领域的研究已取得一定进展，发现了一些有医用、农用价值的菌株和化合物。 ,,内生菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官的细胞间隙或细胞内的细菌，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接产生扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。
,在植物组织培养中，由于材料内部的内生细菌不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料带入培养过程，从而引起组培中的污染，称为内生细菌污染。
,从污染状态来看，是发生于植物材料周围，一般会由培养基内向外延展，并且发生的时间也会比接触性污染要长，接触性的细菌一般在2－4天表现，内生菌则会超过4天，并且菌的种类也相对单一。
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,内生菌(Plant endophyte)是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的微生物，被感染的宿主植物(至少是暂时)不表现出外在病症，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。它不仅包括互惠共利的和中性的内共生微生物，也包括那些潜伏在宿主体内的病原微生物，这些微生物有细菌、真菌、放线菌等。自1898年Vogl从黑麦草种子内分离出第一株内生真菌以来，植物内生菌作为一种新的微生物资源受到了广泛的关注，从内生菌中寻找和发现新的活性化合物已成为国内外研究的又一热点。近年来，该领域的研究已取得一定进展，发现了一些有医用、农用价值的菌株和化合物。 ,,内生菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官的细胞间隙或细胞内的细菌，可通过组织学方法或从严格表面消
毒的植物组织中分离或从植物组织内直接产生扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。
,在植物组织培养中，由于材料内部的内生细菌不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料带入培养过程，从而引起组培中的污染，称为内生细菌污染。
,从污染状态来看，是发生于植物材料周围，一般会由培养基内向外延展，并且发生的时间也会比接触性污染要长，接触性的细菌一般在2－4天表现，内生菌则会超过4天，并且菌的种类也相对单一。
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,内生菌(Plant endophyte)是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的微生物，被感染的宿主植物(至少是暂时)不表现出外在病症，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。它不仅包括互惠共利的和中性的内共生微生物，也包括那些潜伏在宿主体内的病原微生物，这些微生物有细菌、真菌、放线菌等。自1898年Vogl从黑麦草种子内分离出第一株内生真菌以来，植物内生菌作为一种新的微生物资源受到了广泛的关注，从内生菌中寻找和发现新的活性化合物已成为国内外研究的又一热点。近年来，该领域的研究已取得一定进展，发现了一些有医用、农用价值的菌株和化合物。 ,,内生菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官的细胞间隙或细胞内的细菌，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接产生扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。
,在植物组织培养中，由于材料内部的内生细菌不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料带入培养过程，从而引起组培中的污染，称为内生细菌污染。
,从污染状态来看，是发生于植物材料周围，一般会由培养基内向外延展，并且发生的时间也会比接触性污染要长，接触性的细菌一般在2－4天表现，内生菌则会超过4天，并且菌的种类也相对单一。
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,内生菌(Plant endophyte)是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的微生物，被感染的宿主植物(至少是暂时)不表现出外在病症，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。它不仅包括互惠共利的和中性的内共生微生物，也包括那些潜伏在宿主体内的病原微生物，这些微生物有细菌、真菌、放线菌等。自1898年Vogl从黑麦草种子内分离出第一株内生真菌以来，植物内生菌作为一种新的微生物资源受到了广泛的关注，从内生菌中寻找和发现新的活性化合物已成为国内外研究的又一热点。近年来，该领域的研究已取得一定进展，发现了一些有医用、农用价值的菌株和化合物。 ,,内生菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官的细胞间隙或细胞内的细菌，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接产生扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。
,在植物组织培养中，由于材料内部的内生细菌不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料带入培养过程，从而引起组培中的污染，称为内生细菌污染。
,从污染状态来看，是发生于植物材料周围，一般会由培养基内向外延展，并且发生的时间也会
比接触性污染要长，接触性的细菌一般在2－4天表现，内生菌则会超过4天，并且菌的种类也相对单一。
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,在植物组织培养中，由于材料内部的内生细菌不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料带入培养过程，从而引起组培中的污染，称为内生细菌污染。
,从污染状态来看，是发生于植物材料周围，一般会由培养基内向外延展，并且发生的时间也会比接触性污染要长，接触性的细菌一般在2－4天表现，内生菌则会超过4天，并且菌的种类也相对单一。
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,在植物组织培养中，由于材料内部的内生细菌不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料带入培养过程，从而引起组培中的污染，称为内生细菌污染。
,从污染状态来看，是发生于植物材料周围，一般会由培养基内向外延展，并且发生的时间也会比接触性污染要长，接触性的细菌一般在2－4天表现，内生菌则会超过4天，并且菌的种类也相对单一。
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,内生菌(Plant endophyte)是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种
组织和器官内部的微生物，被感染的宿主植物(至少是暂时)不表现出外在病症，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。它不仅包括互惠共利的和中性的内共生微生物，也包括那些潜伏在宿主体内的病原微生物，这些微生物有细菌、真菌、放线菌等。自1898年Vogl从黑麦草种子内分离出第一株内生真菌以来，植物内生菌作为一种新的微生物资源受到了广泛的关注，从内生菌中寻找和发现新的活性化合物已成为国内外研究的又一热点。近年来，该领域的研究已取得一定进展，发现了一些有医用、农用价值的菌株和化合物。 ,,内生菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官的细胞间隙或细胞内的细菌，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接产生扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。
,在植物组织培养中，由于材料内部的内生细菌不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料带入培养过程，从而引起组培中的污染，称为内生细菌污染。
,从污染状态来看，是发生于植物材料周围，一般会由培养基内向外延展，并且发生的时间也会比接触性污染要长，接触性的细菌一般在2－4天表现，内生菌则会超过4天，并且菌的种类也相对单一。
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,在植物组织培养中，由于材料内部的内生细菌不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料带入培养过程，从而引起组培中的污染，称为内生细菌污染。
,从污染状态来看，是发生于植物材料周围，一般会由培养基内向外延展，并且发生的时间也会比接触性污染要长，接触性的细菌一般在2－4天表现，内生菌则会超过4天，并且菌的种类也相对单一。
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,内生菌(Plant endophyte)是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的微生物，被感染的宿主植物(至少是暂时)不表现出外在病症，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。它不仅包括互惠共利的和中性的内共生微生物，也包括那些潜伏在宿主体内的病原微生物，这些微生物有细菌、真菌、放线菌等。自1898年Vogl从黑麦草种子内分离出第一株内生
真菌以来，植物内生菌作为一种新的微生物资源受到了广泛的关注，从内生菌中寻找和发现新的活性化合物已成为国内外研究的又一热点。近年来，该领域的研究已取得一定进展，发现了一些有医用、农用价值的菌株和化合物。 ,,内生菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官的细胞间隙或细胞内的细菌，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接产生扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。
,在植物组织培养中，由于材料内部的内生细菌不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料带入培养过程，从而引起组培中的污染，称为内生细菌污染。
,从污染状态来看，是发生于植物材料周围，一般会由培养基内向外延展，并且发生的时间也会比接触性污染要长，接触性的细菌一般在2－4天表现，内生菌则会超过4天，并且菌的种类也相对单一。
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,内生菌(Plant endophyte)是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的微生物，被感染的宿主植物(至少是暂时)不表现出外在病症，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。它不仅包括互惠共利的和中性的内共生微生物，也包括那些潜伏在宿主体内的病原微生物，这些微生物有细菌、真菌、放线菌等。自1898年Vogl从黑麦草种子内分离出第一株内生真菌以来，植物内生菌作为一种新的微生物资源受到了广泛的关注，从内生菌中寻找和发现新的活性化合物已成为国内外研究的又一热点。近年来，该领域的研究已取得一定进展，发现了一些有医用、农用价值的菌株和化合物。
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yl2968 | 2010-01-03 20:09:49
有0人认为这个回答不错 | 有0人认为这个回答没有帮助
内生菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官的细胞间隙或细胞内的细菌，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接产生扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。
在植物组织培养中，由于材料内部的内生细菌不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料带入培养过程，从而引起组培中的污染，称为内生细菌污染。
从污染状态来看，是发生于植物材料周围，一般会由培养基内向外延展，并且发生的时间也会比接触性污染要长，接触性的细菌一般在2－4天表现，内生菌则会超过4天，并且菌的种类也相对单一。
内生菌(Plant endophyte)是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的微生物，被感染的宿主植物(至少是暂时)不表现出外在病症，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明
其内生。它不仅包括互惠共利的和中性的内共生微生物，也包括那些潜伏在宿主体内的病原微生物，这些微生物有细菌、真菌、放线菌等。自1898年Vogl从黑麦草种子内分离出第一株内生真菌以来，植物内生菌作为一种新的微生物资源受到了广泛的关注，从内生菌中寻找和发现新的活性化合物已成为国内外研究的又一热点。近年来，该领域的研究已取得一定进展，发现了一些有医用、农用价值的菌株和化合物。
病毒的分离纯化 我设计了一套方案，请大家批评指正： 1. 新鲜病叶200g，-70℃冰冻30分钟，以2倍体积0.2mol/L磷酸缓冲液（PH7.5，含0.1%巯基乙醇,2%TritionX-100,0.01mol/LEDTA）。组织捣碎机捣碎，双层纱布过滤。 2. 滤液中加入等体积的氯仿，冰浴激烈搅拌15分钟，充分乳化后2000 g离心15分钟 3. 上清液中加入6%聚乙二醇-6000，3%Nacl,0.5%TritionX-100（W/V）。冰浴搅拌，4℃下过夜，次日取出10000g离心20分钟。 4. 沉淀悬浮于0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.2，2%TritionX-100, 0.1%巯基乙醇，1mol/L尿素），2小时后，2000g离心10分钟。 5. 上清液中加入6%聚乙二醇-6000，3%Nacl,0.5%TritionX-100（W/V）。冰浴搅拌4小时，10000g离心30分钟。 6. 沉淀悬浮于0.02mol/L磷酸缓冲液（PH 7.2，2%TritionX-100,0.01mol/LEDTA，1mol/L尿素），4℃下4小时后，10000g离心10分钟。 7. 上清用10%～40%蔗糖密度梯度离心(30000r/min,1.5h)，收集病毒带，用0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.2，2%TritionX-100, 0.1%巯基乙醇，1mol/L尿素）稀释，123000g离心2小时。 8.沉淀用0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.2，2%TritionX-100, 0.1%巯基乙醇，1mol/L尿素）悬浮，5000g离心15分钟，上清即为提纯病毒制品。 lf_12345
植物内生菌分离方法 植物内生菌分离方法 匿名提问 2009-02-18 20:04:53 发布 自然科学学术 6个回答 回答 曲恋| 2009-02-18 20:45:40 有0人认为这个回答不错| 有0人认为这个回答没有帮助 植物内生放线菌是一类大有开发潜力的微生物资源。目前使用的分离条件和技术尚不完善，容易被外源菌和内生真菌、细菌污染，因此内生放线菌尤其是稀有内生放线菌的选择性分离技术至少是今后一段时间研究的重点。介绍了植物内生放线菌选择性分离方法并提出值得研究的问题。( 添加评论(0) nk0226 | 2009-07-25 11:13:09 有0人认为这个回答不错| 有0人认为这个回答没有帮助 植物病毒与病毒防治 Plant Virology& Control of Plant Virology 32学时2学分 一、课程性质、地位和任务 植物病毒与病毒防治是研究病原病毒与植物病毒病害相互关系的生物学科。本课程重点讲授植物病毒相关生物学特性与研究进展：病毒侵染寄主植物生理效应与抗病免疫；植物亚病毒病原等基础理论知识。同时，根据植物病毒基础研究需要，课程理论讲授与实验技能训练并重。通过本课程的学习，使学生进一步熟悉病毒病原与其它相关病原的区别要点，病害宏观及微观鉴定基本技术、方法、手段，并能在实践中应用。为独立开展植物病毒及病毒病害研究奠定基础。 二、课程教学的基本要求 要求学生重点掌握以下内容： （1）植物病毒的传播途径及传毒机制；
（2）病毒侵染植物内部症状，侵染增殖过程； （3）植物受病毒侵染的生理效应与抗病免疫； （4）植物亚病毒病原的基本特性； （5）植物病毒与病毒病害诊断鉴定的程序与方法。 三、课程理论教学大纲及学时分配 1. 绪论（2学时） 1.1 病毒的发现与病毒学的发展 1.2 研究病毒的意义与任务 1.3 植物病毒与其他病毒的关系 1.4病毒与其他微生物的区别 2. 病毒的分类与命名（3学时） 主要介绍病毒分类和命名的基本原则相关指标。重点：植物病毒的命名和分类系统。 2.1 病毒命名和分类的发展 2.2 病毒命名的系列 2.3 病毒分类的系列 2.4 植物病毒的命名和分类系统 3. 病毒侵染植物与增殖与增殖过程及遗传与变异（5学时） 主要讲授植物病毒侵染方式，在寄主体内的增殖过程，病毒遗传变异的本质。难点:病毒进入寄主细胞的方式及粒体装配。 3.1病毒粒体的吸附与侵入 3.2病毒粒体的脱壳与生物合成 3.3病毒粒体的装配与释放 3.4病毒的遗传与变异 3.5病毒的体外重新组与生物活性 4. 植物病毒的传播途径及传毒机制（5学时） 主要讲授病毒的介体传播和非介体传播的两大途径，以及不同介体传播机制与病害发生流行关系，难点：介体持久性传毒（口针传毒）与非持久性传毒（巡回传毒）机理。 4.1介体传毒 4.2非介体传毒 4.3种子与花粉传毒 4.4传毒机制 5. 病毒侵染植物生理效应与抗病免疫（5学时） 主要介绍病原侵染植物的内部症状（内含体）、病毒在植物体内的运转及生理活性物质改变与寄主抗病机理。难点：病毒侵染植物的生理变化与寄主的免疫反应。 5.1病毒侵染植物内部症状（内含体及其类型） 5.2病毒在植物体内的运输
犬流感病毒的分离鉴定及部分基因序列分析 摘要：使用Vero细胞接种临床症状疑似感染犬流感病毒（CIV）的犬肺组织，盲传3代，观察其病变情况，收集72 h培养液进行PCR鉴定、血凝特性及形态学观察，同时进行序列测定和分析，并制作系统进化树。结果表明，从犬肺中成功分离出一株犬流感病毒，该病毒能够凝聚豚鼠、猪、鸡抗凝血，电镜观察病毒呈圆形、长丝状等形态多样、大小不等的颗粒状;序列分析表明，与人源、犬源等10株有代表性的流感病毒基因同源性极高，只有少数地方發生了特异变异。这些数据的分析对于犬流感的防控有一定的参考价值。 关键词：犬流感病毒;分离鉴定;基因序列 中图分类号：S858.292 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2019）08-0009-02 犬流感是由犬流感病毒（CIV）引起的犬的一种接触性传染病，该病的主要临床症状表现为发热、流涕和咳嗽。CIV是犬传染性呼吸系统疾病的主要病原之一，其容易引起犬的支气管炎和支气管肺炎，损害呼吸道上皮细胞，给其他病原体的感染创造了条件。该病对于世界各国养犬业的发展也产生了一定的影响。 CIV在分类上属于副黏病毒科副黏病毒亚科如布拉病毒属。其与同属的猴病毒V型、人SV5分离株及人流感病毒等抗原性密切相关。当前，市场上虽然有相关疫苗，但是该病的发生率依然很高，之所以出现这种现象可能与该病毒的不断变异存在一定的关系。基于该原因，分离当前的流行变异株、了解序列变异情况对于该病的预防、诊断及治疗意义重大。本试验对一例疑似犬流感病例的肺组织中分离出的病毒进行了鉴定，并尝试对该病毒中的部分基因序列进行了分析，探讨了其出现遗传变异的情况。现将其报道如下。 1 材料与方法
病毒的分离鉴定
病毒的分离与鉴定 要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则： ①从患病者体内分离出病毒； ②在实验动物或寄主细胞中可以培养； ③证明这种培养物具有滤过性； ④在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症； ⑤能重新分离出病毒。 1.病毒的分离 1.1标本的处理 1.1.1标本的收集 a)粪便标本：将5g粪便标本和50ml PBS放入盛有20-25颗玻璃小 珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000×g，4℃离心6min。 b)拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml运载培养基中，将棉拭子中的 液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000×g 4℃离心30min。 c)组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的 PBS制备成20%的悬液，3000×g 4℃离心30min。 1.1.2 除菌处理 a)粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4℃过夜。 b)鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4℃作用
4小时。 c)对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病 毒、痘病毒等，则可加入等量的乙醚4℃过夜除菌。 1.2病毒的分离培养 病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。 1.2.1 鸡胚接种 a)鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以内的受精卵以保证规格质 量上的一致。 b)孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行,气室向上，孵育的最适 温度为38--39℃，相对湿度为40—70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。 c)检卵：鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况 （二天一次）。①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。 ②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管， 鸡卵内有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。③死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。 d)接种：
病毒的分离鉴定 Prepared on 22 November 2020
病毒的分离与鉴定 要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则： ①从患病者体内分离出病毒； ②在实验动物或寄主细胞中可以培养； ③证明这种培养物具有滤过性； ④在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症； ⑤能重新分离出病毒。 1.病毒的分离 1.1标本的处理 标本的收集 a)粪便标本：将5g粪便标本和50mlPBS放入盛有20-25颗玻璃小 珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000×g，4℃离心6min。 b)拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml运载培养基中，将棉拭子中的 液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000×g4℃离心30min。 c)组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的 PBS制备成20%的悬液，3000×g4℃离心30min。 除菌处理 a)粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4℃过夜。
b)鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4℃作用 4小时。 c)对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病 毒、痘病毒等，则可加入等量的乙醚4℃过夜除菌。 1.2病毒的分离培养 病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。 鸡胚接种 a)鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以内的受精卵以保证规格质 量上的一致。 b)孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行,气室向上，孵育的最适 温度为38--39℃，相对湿度为40—70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。 c)检卵：鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况 （二天一次）。①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。 ②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管， 鸡卵内有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。③死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。 d)接种：
第25章病毒感染的检查方法 与防治原则 第一节病毒的诊断 随着对病毒感染从生物学及分子生物学水平的研究进展，病毒的诊断技术已由传统方法扩展至新的快速诊断技术。病毒感染的快速诊断有利于对病毒感染者的治疗；例如对有些病毒（如疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒）感染已有较特异的抗病毒药物治疗。早期诊断及早期治疗对控制病毒感染十分重要。此外，从群体感染角度分析，确诊病毒感染的病原在监测病毒的流行病学（如新型流感病毒、肺出血型汉坦病毒的发现等）方面也有重要的现实意义。 标本的采集与送检用于分离病毒或检测病毒及其核酸的标本应采集病人急性期标本。根据不同病毒感染采取不同部位的标本（如鼻咽分泌物、脑脊液、粪便或血液）。由于病毒在室温中很易被灭活，应在采集和运送标本中注意冷藏。如欲检测抗体，早期单份血清可用于检测IgM抗体，而欲检测早期与恢复期的抗体效价的变化，则需采集早期与恢复期双份血清。血清抗体检测标本应保存于－20℃。 病毒的分离、培养与鉴定目前最常用的方法是细胞培养。在注明欲检测的病毒后，病毒分离培养的实验室将选择适当的原代培养细胞（敏感性高）及传代细胞系（便于在实验室保存）作病毒分离培养。接种标本后，细胞可出现病变或也可并不出现病变而需用血细胞吸附等方法检测是否有病毒增殖，并进一步还需用特殊的抗体鉴定病毒的种类，例如用特异荧光抗体染色或抗体中和试验等。当无病毒增殖时，可能标本中病毒含量较低，未被检出，则需要盲目传代3次后方可明确标本中是否存在病毒。这一分离与鉴定病毒的全过程有时可长达2～3个月，而且仅在有设备、实验条件及合格工作人员的实验室方可进行。虽然这种方法所需时间长、步骤多，但在确定病原上是“黄金标准”，即其准确性高而无误。如我国台湾省确定由肠道病毒71型引起多数患儿发生脑膜炎并致死的研究报道，就是由分离培养及鉴定病毒所确诊。如欲提高病毒感染细胞培养的敏感性，可将病毒接种于内有盖玻片的细胞培养瓶，经低温离心后，以增加病毒与细胞接触的机率。再将盖玻片进行培养，并用单克隆抗体染色，藉以通过检测病毒的早期抗原进行诊断。 在流感病毒的分离培养中，最敏感而特异的方法是鸡胚接种，并用血凝和血
病毒的分离与鉴定 （一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变→鉴定病毒种型(血清学方法)无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离… （一）病毒的分离 病毒分离的一般程序是： 检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状 鸡胚→病变或死亡 细胞培养→细胞病变 →鉴定病毒种型(血清学方法) 无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离心后，取上清接种；咽洗液、粪便、尿、感染组织或昆虫等污染标本在接种前先用抗生素处理，杀死杂菌。 1．细胞培养用分散的活细胞培养称细胞培养（Cell culture）。所用培养液是含血清（通常为胎牛血清）、葡萄糖、氨基酸、维生素的平衡溶液，pH7.2～7.4。细胞培养适于绝大多数病毒生长，是病毒实验室的常规技术。 原代细胞培养(Primary cell culture) 用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞，加一定培养液，37℃孵育1-2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞，如人胚肾细胞、兔肾细胞。原代细胞均为二倍体细胞，可用于产生病毒疫苗，如兔肾细胞生产风疹疫苗，鸡成纤维细胞产生麻疹疫苗，猴肾细胞生产脊液灰质炎疫苗。因原代细胞不能持续传代培养，故不便用于诊断工作。 二倍体细胞培养(Diploid cell cultune) 原代细胞只能传2-3代细胞就退化，在多数细胞退化时，少数细胞能继续传下来，且保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞。二倍体细
病毒的分离方法 一般情况下分离病毒可以用传代细胞、原代细胞或者直接用动物接种或者鸡胚接种，只有在找不到适合病毒生长的原代细胞或者传代细胞的情况下才运用动物接种或者鸡胚接种的方法分离病毒。 大致过程应该是这样的： 第一获取病毒分离样品，这个要求比较高，采集后如果不能立即操作则必须低温保存，并尽快送实验室操作。另外也可以冷冻保存，一般情况下病毒是不容易冻死的。当然某些特殊病毒除外，这需要查阅相关资料。 第二病毒分离操作，将获取病样研磨，并冻融至少一次，当然研磨过程中必须低温。同时研磨应充分，在研磨时可以加入生理盐水或PBS或者直接加细胞培养液，研磨完全后冻融一到三次，冻融的目的是为了让细胞完全破裂将细胞内的病毒释放到溶液中。然后低速离心，取上清用0.22微米的滤膜过滤，去过滤后的液体接种细胞。此时须注意，并不是所有病毒接种是都需要让细胞完全长满细胞瓶，一般是不能产生细胞病的病毒最好在细胞长到40%左右接种，而能产生细胞病变的则需要完全长满细胞瓶以后再接种病毒。接种过程中为避免污染可以加入双抗，或者其他抗生素。 第三接种后观察，某些能产生细胞病变的病毒很容易观察，直接在显微镜下就能看是否分离成功；如果病毒不产生细胞病变，则需要用其他的方法来检测，比如可用荧光抗体染色、PCR或者其他方法。不过大部分情况下第一代都不容易看到或者效果不好，这时你可以再传几代试试。如果再传四~五代以后都没有的话，那恭喜你，你失败了，或者你的方法有问题，或者根本就没有你要分离的病毒，或者在分离过程中你的病毒就已经死了。 用细胞分离病毒大概就是这个过程，当然某些病毒可能还没有相应的传代或者原代细胞，如果要分离就只能用易感动物了，操作都是相似的，无非都是采样、样品处理、接种、接种后检测观察、收集病毒而已。上面说到的方法都是从动物组织中分离，当然如果不是组织，比如你要从粪便或者尿液或取的拭子上分离，则可直接将其用生理盐水、PBS或细胞培养液稀释（要尽量摇匀如果是拭子的话应多挤压摇匀）然后离心取上清过滤接种细胞就可以了。
犬细小病毒的分离与鉴定 摘要：采用细胞培养法对疑似犬细小病毒的粪便和内脏进行了分离和鉴定，并对分离到的病毒进行生物学特性鉴定和动物回归试验。结果共分离到3株CPV，分离株在猫肾细胞F81产生明显细胞病变，血凝效价达1∶27～1∶210，细胞病变能被犬细小病毒阳性血清所抑制，接种幼犬后，分离株3可以引起试验犬发病死亡。 关键词：犬细小病毒；分离；鉴定 犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）属于细小病毒科细小病毒属，为单股、负义、线形无囊膜的DNA病毒[1]。CPV可引起犬的出血性肠胃炎和心肌炎，并使白细胞大量减少，在幼犬中的发病率和死亡率都很高[2]。CPV对多种理化因素和常用消毒剂具有较强的抵抗力，在4～10 ℃存活6个月，37 ℃存活2周，56 ℃存活24 h，80 ℃存活15 min，在粪便中可存活数月至数年[3]；该病毒对乙醚，氯仿和醇类有抵抗力[4]。CPV一年四季均可发病，以冬、春多发[5]，饲养管理条件骤变、长途运输、寒冷、拥挤均可促使该病发生[6]。病犬是主要传染源，其呕吐物、唾液、粪便中均有大量病毒[7]。根据临床症状和血清学反应，可做出准确诊断[8-13]。本研究通过对山东毒株分离，并对其部分生物学特性进行研究，为该病的防治和后续研究提供一定的理论基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂DMEM培养基为Gibco产品；小牛血清、谷氨酸胺、双抗、胰蛋白酶等购自大连宝生物TaKaRa有限公司；其他化学试剂均为分析纯试剂。 1.1.2 病料病料为2009～2011年聊城大学兽医院收集或其他养犬场送检的可疑CPV病料，包括20份粪便样品和10份脏器。 1.1.3 试验动物和细胞8只40～50日龄的山东细犬幼犬（抗CPV HI抗体效价小于1∶4），健康状况良好；猫肾传代细胞系（F81）和犬肾传代细胞系（MDCK）等由聊城大学农学院实验室保存。 1.2 方法 1.2.1 试剂的配制 1）1%猪红细胞悬液的制备。用20 mL注射器内吸入阿氏液3～5 mL，于健康猪前腔静脉采血10～15 mL，立即混匀，4 ℃保存备用。使用时用PBS洗涤保存的猪红细胞，1 000 r/min离心5 min，洗涤3次，取红细胞泥1 mL加稀释液100 mL，再加入小牛血清白蛋白0.1 g，即为1%猪红细胞悬液。 2）HA抗原配制。用移液器向V型血凝板每孔加稀释液25 μL，然后吸取25 μL经福尔马林灭活的CPV细胞培养物，在血凝板上倍比稀释，最后1孔不稀释，作为阴性对照；接着每孔加稀释液25 μL和1%猪红细胞悬液50 μL，于振荡器上振荡1 min混匀，于4 ℃冰箱静置1～2 h，待红细胞完全沉淀后判定。判定的方法是以50%红细胞凝集为终点，在对照孔红细胞完全不凝集，呈圆形小点
病毒的分离培养标准操作规程 1．目的：规范病毒分离及鉴定培养操作流程，保证试验结果的重复性和稳定性。 2．术语：EID50/0.1ml，ELD50/0.1ml，TCID50/0.1ml，CPE 3．操作程序与方法： 3.1 采样：对于病死或剖杀动物，采集病毒主要聚集组织部位，一般为淋巴结、脾脏、肺脏、血液等；对于活体动物，可用无菌棉拭子采集含病毒量最多部位（口腔、鼻腔、生殖道、肛门等）的分泌液。采集样品如不能立即处理，应冻存与-20℃备用。长 途运输应用冰盒或4℃低温保存。 3.2 样品处理：组织块可用剪刀剪碎并研磨，加入10倍体积含300-500UI/ml青、 链霉素的生理盐水（PBS），反复冻融2-3次。棉拭子可直接混于3-5倍体积含300-500UI/ml 青、链霉素的生理盐水（PBS），反复冻融2-3次。8000rpm离心15min，取上清液用0.22μm滤膜过滤，透过液即为病毒原液，收集保存，短期保存4℃，长期保存用液氮。 3.3接种培养：将病毒原液接种与特定细胞单层中，连续盲传4-6代，观察细胞是 否产生特异性CPE，并计算及TCID50/0.1ml。禽源类病毒可接适当日龄鸡胚或鸡胚成纤维细胞进行扩增和鉴定，并计算及EID50/0.1ml和ELD50/0.1ml。 3.4 病毒纯化：采用“有限梯度稀释法”结合“噬斑纯化法”对病毒进行纯化； 3.5 动物回归实验：分离培养并纯化好的病毒回归接种动物，观察动物病变是否为该病毒引起及病变特征是否典型。 3.6分子生物学鉴定：基因组提取并设计特异性引物，对分离病毒保守区基因片段 进行特异性扩增，并测序，从分子水平对其进行鉴定。 3.7血清学鉴定：用标准阳性血清与分离病毒作用一段时间后再次接种特异性细胞 或鸡胚验证病毒特异性。或者用荧光标记抗体与病毒作用后荧光显微镜下观察其特异性。 4.注意事项 4.1采样过程应做好自身防护，烈性病不得随意分离。 4.2 实验动物应及时焚烧或深埋等处理，避免病毒扩散到环境中。 4.3 纯化好毒种应及时做好扩毒并建立毒种库。 1
病毒的分离与鉴定 要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则： ①从患病者体分离出病毒； ②在实验动物或寄主细胞中可以培养； ③证明这种培养物具有滤过性； ④在原始宿主或相关种属能产生同样的病症； ⑤能重新分离出病毒。 1.病毒的分离 1.1标本的处理 1.1.1标本的收集 a)粪便标本：将5g粪便标本和50ml PBS放入盛有20-25颗玻璃小 珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000×g，4℃离心6min。 b)拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml运载培养基中，将棉拭子中的 液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000×g 4℃离心30min。 c)组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的 PBS制备成20%的悬液，3000×g 4℃离心30min。 1.1.2 除菌处理 a)粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4℃过夜。 b)鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4℃作用4 小时。
c) 对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、 痘病毒等，则可加入等量的乙醚4℃过夜除菌。 1.2 病毒的分离培养 病毒是严格的细胞寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。 1.2.1 鸡胚接种 a) 鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以的受精卵以保证规格质量上 的一致 。 b) 孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱进行,气室向上，孵育的最适温度 为38--39℃，相对湿度为40—70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。 c) 检卵：鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况（二 天一次）。①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管，鸡卵有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。③死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。 d) 接种：
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的一种繁殖障碍与呼吸困难的传染病。其特征为发病母猪厌食、发热，怀孕后期发生流产、死胎和木乃伊胎，幼龄仔猪发生呼吸道症状[1]。1987年在美国中西部首先发现该病，并分离到病毒，其后在北美、欧洲、亚洲等国家流行。目前该病已在全球范围内传播、蔓延。我国郭宝清等[4]于1996年首次从暴发流产的胎儿中分离到PRRSV。国内诸多血清学检测结果表明，该病在我国许多地方已有流行[5]。河南某猪场"猪场发生临床症状疑似PRRS的传染病，用间接ELISA法检测，呈PRRS 抗体阳性。从病猪肺、淋巴结病料中分离到1株疑似PRRSV，并对其进行了一系列的鉴定。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1病料采自河南某猪场疑似PRRS发病仔猪肺脏及淋巴结。 1.1.2细胞及血清细胞系Marc145、Vero、PK15均购自中国兽药监察所；阳性血清购自中国兽药监察所；阴性血清采自无PRRS病史猪场的新生仔猪血清，经中和试验证明为阴性。 1.1.3主要试剂及试剂盒RNasin、dNTP、反转录 Buffer、MMLV、rTaq酶均购自宝生物(大连)工程有限公司；琼脂糖为 Sigma公司产品；其他常规试剂均为分析纯；UNIQ10柱式Trizol 总RNA抽提纯化试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
1.1.4RTPCR引物设计根据GenBank公布的PRRSV美洲株ORF5核苷酸序列，参照文献[6]自行设计并由宝生物(大连)工程有限公司合成下述一对引物，引物扩增片段长度为720bp；上游引物P1 5′CTG GAG CCG TGC TAT CAT3′；下游引物P2 5′TCC ATT TCA TGA CAC CTG3′。 1.2方法 1.2.1细胞培养生长液为含100 mL/L新生牛血清(NCS)的RPMIl640培养液；维持液为含20 mL/L NCS的RPMIl640培养液。Marc145、Vero和PK15细胞均在体积分数为5%的CO2培养箱中于37 ℃培养至单层后传代培养。 1.2.2病料的处理无菌采集发病仔猪的淋巴结、肺脏、脾脏等组织并剪碎，用Hanks液研磨并制成5倍～10倍的乳悬液，反复冻融3次后，经5 000 r/min离心30 min，上清悬液用0.22μm微孔滤膜过滤后，－20 ℃保存备用。 1.2.3病毒的分离将上述处理的病料悬液1 mL分别接种于长成单层的 Marc145细胞、Vero细胞和PK15细胞，37 ℃吸附1 h，补加维持液至8 mL，继续培养3 d～5 d，反复冻融3次，收获培养上清液，同时设参考毒株、正常细胞作为对照。出现典型PRRSV细胞病变时按上述方法继续传代，供进一步检测备用，连传5代未出现CPE者判为阴性。
作业指导书第 1 页共 5 页第1版第1次修订 起草人：王军鹏审核人： 标题：流感病毒分离培养和鉴定标准操作规程批准人：批准日期：2013年12月18日实施日期：2013年12月18日 1. 范围 适用于实验室所有技术人员进行流感病毒的MDCK细胞分离和鉴定。 2. MDCK细胞培养程序 2.1 生物安全要求 MDCK细胞培养实验室生物安全级别：BSL-2 ，所有操作必须在BSL-2实验室的生物安全柜里进行。 2.2 材料 2.2.1 生长成片的MDCK细胞 2.2.2 无菌的T25细胞培养瓶 2.2.3 D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺） 2.2.4 青、链霉素母液（10000 U/mL青霉素G；10000μg/mL硫酸链霉素），分装后保存于 -20℃ 2.2.5 HEPES缓冲液，1M母液 2.2.6 胎牛血清 2.2.7 EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na），分装后保存于-20℃ 2.2.8 7.5%牛血清白蛋白组分V 2.2.9 1mL、10mL无菌移液管 2.2.10 70％～75％的酒精 注意事项：经常检查试剂使用的有效期。 2.3 实验步骤 这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。 2.3.1 D-MEM培养液的准备 500mL D-MEM液中加入： a）青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100μg/mL链霉素）。 b）7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL（终浓度：0.2%）。 c）HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。 2.3.2 细胞生长液的准备 胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。 2.3.3 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。 2.3.4 温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA胰酶。 2.3.5 重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。 2.3.6 加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加入1mL
第二十九讲病毒的分离与测定 教学目的：掌握病毒效价的测定方法 教学重点：噬斑法、终点法 教学难点：病毒的分离与鉴定 课时分布：1学时 教学过程： 一、病毒的分离与纯化 1、病毒的分离 病毒的分离是将疑有病毒的样品经处理后，接种于敏感的宿主，经培育后，通过检查其特异性病理表现或其它方法以肯定病毒的存在。 （1）标本的采集与处理标本应含有足够量的活病毒；加入抗菌素除细菌；研磨或超声波处理破碎细胞，让病毒充分释放出来；标本处理后立即接种，否则冷冻保藏。 （2）标本接种与感染表现接种实验宿主（动植物、细菌）、鸡胚或细胞（要求：操作简单、易于培养、产生的感染结果易判定）。噬菌体以噬菌斑为标记；动物病毒产生致细胞病变效应；植物病毒致敏感质感植物出现坏死斑或枯斑。 2、病毒纯化 通过分离得到的是病毒感染的宿主机体、组织或破细胞后的抽提物，或感染的宿主的体液、血液和分泌物，或培养液，须将杂质成分除去。 （1）病毒纯化的标准：纯化的病毒制备物应保持其感染性；纯化的病毒毒粒应具有均一性。 （2）病毒纯化的方法毒粒的主要成分是蛋白质，故可利用蛋白质提纯方法纯化；毒粒具一定的大小、形状和密度，可离心提取。 二、病毒的测定 在谷氨酸、抗菌素、酶制剂等生产中，经常出现不正常的发酵现象。发酵缓慢、发酵液含菌数下降、菌体畸形、耗糖缓慢或停止，镜检时发现有云雾状碎片，严重时以致倒罐。
1、病毒的物理颗粒计数 （1）电镜下直接计数 （2）血细胞凝集试验许多有包膜的动物病毒能在一定条件下凝集一定种类的脊椎动物红血球，凝集量与病毒浓度成正比。 此外，可根据病毒的抗原性质，与抗体发生特异性结合，利用分光光度计对病毒进行定量。但灵敏度较低，多在特殊情况下使用。总之，该方法测得的是有活力与无活力病毒数量的总和。 2、病毒的感染性测定 测定的是因感染所引起宿主或细胞发生某一特异性病理反应的病毒数量。 病毒感染单位：能引起宿主或宿主细胞一定特异性反应的病毒最小剂量。 病毒效价：指单位体积病毒悬液的感染单位数目。 （1）噬菌斑的测定 噬菌斑：噬菌体感染敏感细胞后，通过复制使宿主细胞裂解，释放大量噬菌体，扩散到周围的细胞中，继续侵染，从而在有噬菌体的地方形成一个透亮无菌近似圆形的空斑。它是phage存在的一种指示性指标。 在液体培养基中培养物变清。一个phage产生一个噬菌斑，故可根据在固培上形成的噬菌斑数测得phage的效价。通常是将噬菌体悬液分别与高浓度的敏感细菌以及半固体琼脂均匀混合后涂布在较高浓度的营养琼脂上，培养后计算噬菌斑数便可算出噬菌体效价。 ①双层平板法 底层培养基10ml 上层培养基4ml、凝固 指示菌0.2 ml、检样0.1 ml →32℃16-24h 测定前，事先配制含2%和1%的琼脂底层培养基和上层培养基，将铺成平板，用无菌吸管吸取一定量的指示菌和被测样品与上层培养基混合，冷到45℃迅速倒在底层平板上铺平，凝固后恒温培养16—20小时，如有phage存在，则在双层琼
流感病毒的快速检测方法 一、RT-PCR快速诊断方法 （一）生物安全要求 （二）病毒核酸提取 （三）RT-PCR （四）PCR 产物纯化 （五）流感病毒RT-PCR检测引物 二、免疫荧光方法检测流感病毒 （一）原理 （二）标本处理 （三）间接免疫荧光法 （四）结果判断 三、实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）快速诊断检测 （一）基本原理 （二）实验试剂 （三）实验步骤 四、快速诊断试剂盒 流感的快速检测方法，与传统的病毒分离鉴定相比具有快速、简便的特点。因此常用于流感暴发时早期病原学检测用。流感的快速诊断包括直接和间接免疫荧光法、ELISA、RT-PCR、Real-Time PCR快速诊断速方法、流感快速诊断试剂盒等。这里介绍RT-PCR、Real-Time PCR、免疫荧光快速诊断速诊断方法和几种流感快速诊断试剂盒优缺点。无论那种快速诊断都无法代替传统的病毒分离鉴定方法。 一、RT-PCR快速诊断方法 核酸检测是一种鉴定流感病毒基因组的有力方法，即使基因组含量很低或死病毒也可以检测到。本章将介绍检测流感病毒的聚合酶链式反应（PCR）。 流感病毒的基因组是负链RNA，在进行PCR扩增前必须合成与病毒RNA 互补的DNA，即为cDNA。逆转录酶（RT）就是用于合成cDNA的多聚酶，因此，扩增流感病毒基因组的过程称为RT-PCR。 RT-PCR需要一对型别特异引物，四种脱氧核苷酸（dNTPs），RNA模板，逆转录酶及Taq DNA 多聚酶；首先由逆转录酶将病毒的RNA逆转录合成cDNA，然后再进行聚合酶链反应经25～30个循环，使DNA产物达到倍增的效果。 （一）生物安全要求 生物安全级别与个人防护要求：生物安全二级实验室，防护要求与二级实验室的要求相同。并应遵守相应的生物安全规定。进行高致病性禽H5 RT-PCR快速检测时可以在生物安全二级实验室里进行，核酸提取在生物安全三级实验室的生物安全柜里完成。
病毒分离 病毒分离前样品的实验室处理方法病毒含量较高的样品浸出液或体液，可不经过病毒分离直接用于诊断鉴定。病毒含量较少的样品，则需通过病毒的分离增殖来提高诊断的准确性和鉴定的可靠性。病毒分离首先要对样品进行适当的处理，然后接种实验动物或培养的组织细胞。 (一) 组织器官样品的处理 1.用无菌操作取一小块样品，充分剪碎，置乳钵中加玻璃砂研磨或用组织捣碎机制成匀浆，随后加1-2 ml Hank’s平衡盐溶液制成组织悬液，再加1-2 ml继续研磨，逐渐制成10%-20%的悬液； 2.加入复合抗生素； 3.以800×g离心15min； 4.取上清液用于病毒分离。必要时可用有机溶剂去除杂蛋白和进行浓缩（见下文）。 (二) 粪便样品的处理 1.加4g的粪便于16ml Hank’s平衡盐容液中制成20%的悬液； 2.于密闭的容器中强烈振荡30min，如果可能则加入玻璃球； 3.以6000×g低温离心30min，取上清液再次重复离心； 4.用450nm的微孔滤膜过滤； 5.加二倍浓度的复合抗生素。然后直接用于病毒分离或进行必要的浓
缩后再行病毒分离。 (三) 无菌的体液（腹水、脊髓液、脱纤血液、水泡液等）和鸡胚液样品 可不做处理，直接用于病毒分离。 注：Hank’s平衡盐溶液和复合抗生素的配制见细胞培养溶液的配制。 (四) 样品的特殊除菌处理 样品经过上述一般处理即可用于病毒分离，但对某些样品用一般方法难以去除的污染，则应考虑配合如下方法进行处理。 1.乙醚除菌对有些病毒（如肠道病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、小RNA病毒等对乙醚有抵抗力）可用冷乙醚对半加入样品悬液中充分振荡，置4℃过液。取用下层水相分离病毒。 2.染料普鲁黄（Proflavin）除菌由于其对肠道病毒和鼻病毒很少或没有影响，常用作粪或喉头样品中细菌的光动力灭活剂。将样品用0.0001mol/L pH9.0的普鲁黄于37℃作用60min，随后用离子交换树脂除去染料，将样品暴露于白光下，即可使其中已经被光致敏的细菌或霉菌灭活。 3. 过滤除菌可用陶土滤器、瓷滤器、石棉滤器或者200nm孔径的混合纤维素酯微孔滤膜等除菌，但对病毒有损失。 4. 离心除菌用低温高速离心机以1800r/min（1 5.24cm）离心
第12章病毒感染的检查方法与防治原则 学习要点 一、病毒感染的检查方法 1.检材的采集与送检 病毒分离标本的采集原则是：①早期取材；②注意无菌操作；③正确处理含菌标本；④低温保存与尽快送检。 2.病毒的分离培养与鉴定 （1）动物接种 （2）鸡胚接种 （3）组织培养：原代细胞；二倍体细胞；传代细胞系 （4）病毒增殖的指标：①细胞的变化；②红细胞吸附；③干扰现象；④培养基pH改变。 3.病毒感染的血清学诊断 (1)中和试验； (2)补体结合试验； (3)血凝抑制试验 4.病毒感染的快速诊断 (1)形态学检查法：光学显微镜检查法；电镜和免疫电镜检查 (2)免疫学检查法：检查病毒抗原；检查病毒特异性IgM (3)检测病毒核酸：核酸杂交技术；PCR技术 二、病毒感染的防治原则 1.病毒感染的预防 (1)人工自动免疫用于人工自动免疫的生物制品有：①灭活疫苗；②减毒 活疫苗；③基因工程疫苗；还有亚单位疫苗、多肽疫苗、核酸疫苗等。 (2)人工被动免疫人工被动免疫常用的制剂有：动物免疫血清、人血清丙 种球蛋白、转移因子等。 2.抗病毒治疗 (1)抑制病毒穿入与脱壳金刚烷胺
(2)抑制病毒生物合成核苷类化合物（疱疹净、阿昔洛韦、阿糖腺苷、病毒唑、 叠氮脱氧胸苷、拉米呋啶等）；病毒蛋白酶的抑制物（沙喹纳伟、英迪纳伟等）；IFN及其诱生剂等。 (3)免疫制剂特异性免疫球蛋白、治疗性疫苗等。 (4)抗病毒中草药 复习题 一、名词解释 1.二倍体细胞 2.细胞病变效应 3.红细胞吸附试验 4.血凝抑制试验 5.减毒活疫苗 6.灭活疫苗 二、选择题 A1型题 1.从患者体内分离病毒，采集标本时的错误 ．．做法是： A.在发病早期采集 B.选取正确部位取材 C.标本冷藏 D.标本尽快送实验室 E.疾病恢复期取材 2.细胞病变效应不．包括： A.细胞圆缩、脱落 B.细胞融合 C.形成包涵体 D.干扰现象 E.细胞裂解 3.病毒凝集红细胞(血凝试验)的机制是： A.红细胞表面抗原和血凝素抗体结合 B.红细胞表面受体与病毒表面血凝素结合 C.红细胞表面病毒抗原与相应抗体结合 D.病毒与结合在红细胞表面的抗体结合 E.红细胞上的血凝素与病毒结合 4.预防病毒病最有效的方法是使用： A.抗毒素 B.抗病毒化学疗剂 C.中草药 D.疫苗 E.抗菌药物 5.以下描述正确的是 A.人工被动免疫接种的物质为抗原 B.人工被动免疫不能用于治疗
流感病毒检验 发表时间：2009-08-10T09:20:24.920Z 来源：《中外健康文摘》2009年第20期供稿作者：谭耀武 (黑龙江省宝清县八五三农场疾控中心黑龙江宝清 [导读] 流行性感冒病毒（influenza virus）简称流感病毒 【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085(2009)20-0277-01 流行性感冒病毒（influenza virus）简称流感病毒。流感病毒属正粘病毒科，可分为甲（A）、乙（B）、丙（C）3型。甲、乙、丙不仅反映了病毒被发现的前后顺序，更重要的是反映了对人危害程度的顺序，甲型常以流行的形式出现，可造成世界性的大流行，乙型常以局部流行的形式出现，丙型主要是侵犯婴幼儿。 1 样本采集 1.1采样液 Hank平衡盐、细胞培养液、牛肉浸液（小牛肉浸膏l0g、牛血清白蛋白2g，加蒸馏水至400ml、庆大霉素40mg、多粘菌素 B 0. 8mg，过滤除菌）等均可作采样液。 1.2采集鼻咽腔拭子标本（1）咽拭子：用棉签擦拭双侧扁桃体及咽后壁，将棉签头部浸人2～3ml采样液中。（2）鼻咽抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液。先将收集器头部插人鼻腔、接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的粘液，并用采样液刷洗收集器3次。（3）含漱液：用8～10以采样液漱口。 1.3收集血清标本血清标本应包括急性期和恢复期双份血清。急性期应在发病7天内采集，恢复期则在发病后2～4周采集。血液标本以2500r/min离心l5min，收集血清，弃血凝块。 1.4标本运送病毒分离标本采集后应立即低温保存，应尽快送至实验室。24～48h内样品可置4℃保存，如48h内未能进行接种，应置－70℃或以下保存。血清标本可在4汇存放一周，在－20℃长期保存。 1.5标本处理咽拭子标本，收集管于混合器充分震荡，用无菌镊子取出棉拭子并在管壁上反复挤压棉拭子后弃拭子，标本加入双抗（青霉素、链霉素）终浓度为l000IU/ml，混匀置4℃2h方可接种或低温保存；含漱液标本，混匀后自然沉淀，取上清液3ml，加双抗；鼻咽抽取物标本，取无菌毛细吸管将洗液反复吹打，把粘液打散，而后按上述方法进行处理；器官组织标本，先用无菌的乳钵磨碎，用生理盐水配成20％悬液，2000r/min离心l0min，取上清液3ml按上述方法进行抗菌处理。 2 检验方法 2.1材料和方法 2.1.1器材孵卵箱（38℃、33～35℃：各一个）、照卵器、卵盘、注射器、消毒剂、镊子、无菌生理盐水、毛细吸管、试管、液体石蜡和封口胶等。 2.1.2方法当今国内外常用狗肾传代细胞（MDCK）。将已长成单层的细胞管弃生长液，用含有l00IU/ml双抗HanK's液洗2遍，用0.2～0.4ml处理过的标本液接种于细胞管，每份标本接种4管，置35T吸附1～2h后弃标本液，加入病毒培养液，其量为生长液的2倍。如标本液清亮和进行病毒传代时，可不必吸附，直接加入。置33～35℃孵育7d。从第3d开始观察细胞病变（CPE），如细胞出现颗粒增多、变圆、脱落达+++～++++时进行收获。如果7d还不出现CPE，可收集病毒培养液做血细胞凝集试验，在做试验前将细胞管冻融1～2次，以提高病毒滴度。阳性者可测定其血凝滴度并鉴定之，阴性者混合4管细胞液盲传2代，仍为阴性则弃去。 2.3病毒鉴定新分离的病毒可用血细胞凝集抑制试验、补体结合试验和中和试验等方法进行鉴定。最常用和简单的方法是血细胞凝集抑制试验，必要时采用补体结合试验。 2.4快速诊断流感病毒的主要感染部位是呼吸道上皮细胞，在病人呼吸道标本的脱落细胞中含有流感病毒抗原，通过直接检查脱落上皮细胞内抗原即可诊断。标本最好采用负压抽吸法收集呼吸道分泌物。 2.5血清学诊断病毒分离是诊断流感最常用的方法之一，如因各方面因素未分离出病毒，血清学亦可作为一种代替手段，但必须收集急性期和恢复期双份血清，如恢复期血清特异性抗体较急性期增高4倍或以上，即可诊断。本章介绍两种常用的方法：血凝抑制试验和中和试验。