α文章编号:10083464(2003)02013207
能降解天然纤维素的地衣芽孢杆菌GXN 151的分离鉴定及其一个纤维素酶基因(cel 5A )的克隆和测序分析
刘永生1,冯家勋2,3,段承杰2,3,莫新春2,柏学亮2,张成刚1,唐纪良2,3,马庆生2
(1 中国科学院沈阳应用生态研究所,辽宁沈阳110015;2 广西大学分子遗传学研究所,广西南宁530005;
3 广西大学微生物及植物遗传工程教育部重点实验室,广西南宁530005)
摘要:从广西大学农场陈旧稻草堆中分离出1株具有降解天然纤维素稻草粉、甘蔗渣粉活性的细菌
GXN 151,经形态观察、16S r DNA 序列分析和丙酸盐利用试验将其鉴定为地衣芽孢杆菌(B acillus lichenif or m is )。通过连接经B a m H I 酶切的pB luescri p t KS (+)和回收得到的经S au 3A I 部分酶切的GXN 151的3～10kb DNA 在大肠杆菌JM 109中构建了该菌的含7099个克隆的基因文库,文库克隆中插入片段最大的为1110kb ,最小的为311kb ,平均大小为416kb ,含GXN 151基因组中任一基因的概率P 为9916%。筛选该文库获得8个表达羧甲基纤维素酶活性的克隆,DNA 测序和PCR 分析表明,该8个克隆可归为3类不重叠的独立克隆,其中一个克隆pGXNL 2的测序分析表明其上的cel 5A 基因为1626bp ,可编码含542个氨基酸的羧甲基纤维素酶,Cel 5A 的N -末端的42个氨基酸具有信号肽特征,它的第66～321氨基酸为家族5糖基水解酶(glyco syl hydro lase )功能域、第391～472氨基酸为家族3碳水化合物结合组件(carbohydrate -bind 2ing module ,CBM )。本工作首次报道地衣芽孢杆菌能降解结晶纤维素及从该种细菌中克隆到纤维素酶基因。
关键词:天然纤维素;降解;地衣芽孢杆菌;家族5糖基水解酶;碳水化合物结合组件
中图分类号:Q 781;Q 9391124 文献标识码:A
Isola ti on and i den ti f i ca ti on of a na tura l cellulose degradi n g B acillus
lichenif orm is stra i n GXN 151and clon i n g and sequenc i n g of
a cellula se gene cel 5A fro m the bacter i u m
L I U Yong
sheng 1,FEN G J ia xun 2,3,DUAN Cheng jie 2,3,M O X in chun 2,BA I Xue liang 2,ZHAN G Cheng gang 1,TAN G J i liang 2,3,M A Q ing sheng 2
(1 Shenyang In stitute of A pp lied Eco l ogy ,Ch inese A cade m y of Sciences ,Shenyang 110015,Ch ina ;2 In stitute of M o lecular Genetics ,Guangx iU n iv .,N ann ing 530005,Ch ina ;
3 T he Key L abo rato ry of M icrobial and P lan t Genetic Engineering at Guangx iU n iv .,T he M in istry of Educati on of Ch ina ,N ann ing 530005,Ch ina )
Abstract :A bacterial strain GXN 151w h ich can efficien tly degrade natural cellul o se such as rice stra w and bagasse ,w as is o lated from rice stra w haystack at the far m land of Guangx iU n iversity 1T he strain w as iden tified as B acillus lichenif or m is by mo rpho l ogy ,16S rRNA gene sequence analysis and testing fo r uti 2lizati on of p rop i onate 1A genom ic library of GXN 151w as con structed in E scherich ia coli JM 109by ligating 第22卷 第2期V o l 122,N o 12
广西农业生物科学Journal of Guangx iA gric .and B i o l .Science 2003年6月 June,2003
α收稿日期:20030417
基金项目:“国家863计划”(2001AA 214151);“国际科技合作重点项目计划”(2002AA 217121)
作者简介:刘永生(1973),男,内蒙古集宁人,中国科学院沈阳应用生态研究所2000级博士研究生,冯家勋为 通迅联系人。
B a m H I -digested pB luescri p t KS (+)vecto r w ith recovered 3～10kb S au 3A I -partially digested GXN 151DNA 1T he library con tain s 7099cl ones w ith biggest in sert of 1110kb ,s m allest in sert of 311kb ,and the average in sert size of 416kb 1T he library has 9916%chances (P =9916%)to cover any given gene in the genom e of GXN 1511E igh t cl ones exp ressing carboxym ethylcellulase (
C M Case )activity w ere is o lated by screen ing th is library 1DNA sequencing and PCR -based screen ing of the eigh t cl ones re 2vealed that these cl ones fell in to 3types of non -overlapp ing independen t cl ones 1Sequencing analysis re 2vealed that cel 5A gene on pGXNL 2w as 1626bp ,encoding an enzym e w ith 542a m ino acids 1T he N -ter m inal 42a m ino acids of Cel 5A w as characteristic of signal pep tide 1Am ino acid 66～321of Cel 5A
fo r m ed fa m ily 5glyco syl hydro lase catalytic dom ain ,and a m ino acid 391
～472of the enzym e fo r m ed fa m i 2ly 3carbohydrate -binding module (CBM )1T h is is the first repo rt that B acillus lichenif or m is can degrade natural cellul o se and a cellulase gene w as cl oned from th is bacterium 1
Key words :natural cellul o se ;degradati on ;B acillus lichenif or m is ;fa m ily 5glyco syl hydro lase ;carbohydrate -binding module (CBM )
纤维素是地球上最丰富的可再生的生物质(bi om ass )资源。据报道,全球每年通过光合作用产生的纤维素高达1155×109吨,其中89%尚未被人类利用[1]。纤维素是多个葡萄糖残基以Β-1,4-糖苷键连接而成的多聚物,其基本重复单位为纤维二糖。天然纤维素的基本结构是由原纤维构成的微纤维束集合而成。在天然纤维素中,木质素和半纤维素形成牢固结合层,紧密地包围纤维素。纤维素的利用与转化对于解决世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有重要意义。纤维素可通过纤维素酶的作用降解为葡萄糖,后者可作为重要的工业原料生产酒精、丙酮等化工产品。纤维素酶是能将纤维素降解为葡萄糖的三类酶的总称,即内切Β1,4葡聚糖酶(endo Β1,4glucanase ,EC 3121114)、外切葡聚糖酶(exoglucanase ,又称纤维二糖水解酶cell obi ohydro lase ,EC 31211191)和Β-葡萄糖苷酶(Βgluco sidase ,EC 31211121)[2]。
自然界中大多数细菌不能降解结晶纤维素,目前对其纤维素酶系统研究的比较多的人工分离纯化的能降解结晶纤维素的细菌主要有瘤胃厌氧细菌白色瘤胃球菌(R um inococcus albus )、产琥珀酸丝状杆菌(F ibrobacter succinog enes )、堆肥厌氧细菌热纤梭菌(C lostrid ium ther m ocellum )、解纤维梭菌(C lostrid i 2um cellu loly ticum )、土壤好氧细菌粪肥纤维单胞菌(Cellu lo m onas f i m i )和混合纤维弧菌(Cellv ibrio
m ix tus )等
[2～4]。厌氧细菌形成分泌到细胞外的纤维素酶体(cellul o s om e )来降解结晶纤维素[5],还没有证据表明好氧细菌也形成纤维素酶体。本工作的目的是分离能高效降解结晶纤维素的好氧细菌,并从中克隆纤维素酶基因,为进一步研究纤维素降解机理及通过分子进化技术改善酶特性使其能在生产中应用奠定基础。本文报道了能降解天然纤维素稻草、甘蔗渣的好氧细菌的分离、鉴定及其一个纤维素酶基因的克隆和序列分析。
1 材料与方法
111 材料
11111 细菌菌株和质粒 本工作所用细菌菌株及质粒见表1。
11112 培养基和培养条件 以含A vicel 为唯一碳源的固体培养基作为分离培养基(g L ):A vicel 10,(N H 4)2SO 4114,K 2H PO 41173,KH 2PO 40127,(N H 4)2CO 3013,CaC l 20104,M gC l 20102,N aC l 013,琼脂15;天然纤维素为经水洗多次的稻草粉或甘蔗渣粉,以终浓度1%的量用于取代上述培养基中的
A vicel 来检测细菌对天然纤维素的降解能力。检测丙酸盐利用的Si m mon s 培养基(g L )为:丙酸钠210,
N aC l 510,M gSO 4?7H 2O 012,(N H 4)2H PO 4110,K 2H PO 4?3H 2O 110,琼脂15,溴百里酚蓝水溶液011,pH 为618[8]。地衣芽孢杆菌的完全培养基为GBM 培养基[9],培养温度为50℃。大肠杆菌的培养用L uria -Bertan i 培养基[7]()331第2期刘永生等:能降解天然纤维素的地衣芽孢杆菌GXN 151的分离鉴定及其一个纤维素酶基因(cel 5A )的克隆和测序分析
表1 供试细菌菌株和质粒
Table1 Bacter i a l stra i n s and pla s m i ds used i n th is study
菌株或质粒Strains or Plas m ids
有关特性
Relevant attributes
参考文献或来源
References or Sources
菌株Strains
地衣芽孢杆菌GXN151能降解天然纤维素,如稻草、甘蔗渣本工作
大肠杆菌JM109rec A1,end A1,gy r A96,thi,hsd R17,sup E44rel A1Κ-,?(lac-p ro AB),F’,tra D36,p ro AB,lac Iq Z?M13[6]
质粒Plas m ids
pB luescri p t KS(+)Amp r,lac ZΑ,[7]
pGXNL1pB luescri p t KS(+)上克隆有GXN151DNA,表达C M Case活性本工作
pGXNL2pB luescri p t KS(+)上克隆有GXN151DNA,表达C M Case活性,同pGXNL1重叠本工作
pGXNL5pB luescri p t KS(+)上克隆有GXN151DNA,表达C M Case活性,同pGXN P8重叠本工作
pGXNL7pB luescri p t KS(+)上克隆有GXN151DNA,表达C M Case活性,同pGXNL1重叠本工作
pGXNL9pB luescri p t KS(+)上克隆有GXN151DNA,表达C M Case活性本工作
pGXN P8pB luescri p t KS(+)上克隆有GXN151DNA,表达C M Case活性本工作
pGXN P11pB luescri p t KS(+)上克隆有GXN151DNA,表达C M Case活性,与pGXN P8为同一克隆本工作
pGXN P12pB luescri p t KS(+)上克隆有GXN151DNA,表达C M Case活性,同pGXNL1重叠本工作
11113 酶及试剂 T4DNA连接酶和限制性内切酶购自P rom ega,虾碱性磷酸酶(Sh ri m p A lkaline Pho s phatase,SA P)购自Am ersha m B i o sciences,蛋白酶K、溶菌酶、胶回收及质粒提取试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司,A vicel和羧甲基纤维素(carboxyl m ethylcellul o se,C M C)为Sigm a公司产品,其它均为分析纯试剂。
112 方法
11211 天然纤维素降解菌的分离、筛选 从广西大学农场稻草堆、甘蔗渣堆中距表面30～50c m的不同部位各取20克腐烂的稻草、甘蔗渣,梯度稀释后分别涂布于含A vicel的分离培养基上,于50℃培养24h长出细菌单菌落后,将单菌落点接到含A vicel的培养基上培养后,用刚果红染色法检测菌落周围有无水解圈[10]
,选取生长迅速、周围形成的水解圈大的菌落分别点接于含稻草粉或甘蔗渣粉的培养基上检测其对天然纤维素的降解能力。
11212 天然纤维素降解菌的鉴定 根据形态观察、16S r DNA序列比较和生理生化检测对筛选到的细菌菌株进行鉴定。以降解菌的总DNA为模板,以F27(5’-A GA GT T T GA TCA T GGCTCA G-3’)和R1497(5’-TA CGGT TA CCT T GT TA CGA CT T-3’)为引物扩增其16S r DNA。PCR反应体系和反应程序见文献[11]。丙酸盐利用检测是将细菌点接到Si m mon s培养基平板上,50℃培养36h后观察培养基颜色的变化[8]。
11213 DNA操作和质粒转化 地衣芽孢杆菌GXN151总DNA的提取参照方法[12]。其它的DNA操作及质粒DNA对大肠杆菌的电击法转化均按Sa m brook等所描述的方法[7]。
11214 含纤维素酶基因的克隆的筛选 将基因文库克隆点接到含015%羧甲基纤维素(carboxyl2 m ethylcellul o se,C M C)的LA平板上培养后,用刚果红染色法检测菌落周围有无水解圈[10]。
11215 DNA测序及分析 用双脱氧核苷酸法在AB I377DNA自动测序仪上测定DNA核苷酸序列。用N CB I上的软件对DNA序列进行分析。用简单组件结构研究工具(Si m p leM odular A rch itecture R e2 search Too l,S M A R T,h ttp: s m art1e m bl-heidelberg1de)分析蛋白质的氨基酸序列,地衣芽孢杆菌GXN151的16S rRNA基因的部分序列和cel5A基因的序列GenBank索引号分别为:A Y291582和A Y291583。
431广西农业生物科学第22卷
2 结果
图1 菌株GXN 151对培养基中甘蔗渣粉、稻草粉和Av i cel 的水解F i g .1 The hydrolysis of baga sse powder 、r i ce straw powder and
Av i cel i n m ed i a by the stra i n GXN 15111含甘蔗渣的培养基(M edium con tain ing bagasse pow der );21含稻草粉的培养基(M edium con tain ing rice straw pow der );31含A vicel 的培养基(M edium con tain ing A vicel )
211 天然纤维素降解细菌的分离
从广西大学实验农场陈旧稻草堆和
甘蔗渣堆中各分离到3株和4株能同时
降解A vicel 、稻草粉和甘蔗渣的细菌,这
7株细菌在分离培养基或GBM 培养基
上形成的菌落大小相当,均不透明呈褐
色或奶油色,隆起呈山丘状或裂叶状,边
缘不整齐呈毛发状。细胞革兰氏染色均为阳性、长杆状,从形态上看这7株细菌似乎为同一种细菌,我们选取在含天然纤维素的培养基上形成水解圈最大的一
株细菌作进一步鉴定和克隆基因工作,
并将其命名为GXN 151(见图1)。
212 菌株GXN 151的鉴定图2 电子显微镜下的GXN 151
F i g
.2 Stra i n GXN 151under the electron m i croscope 菌株GXN 151在电子显微镜下为长杆状,
大小为013～015Λm ×210～310Λm ,周生鞭毛
(图2),GXN 151革兰氏染色阳性,形成芽孢。
用F 27和R 1497作引物,以GXN 151总DNA
作模板扩增得到一个115kb DNA 片段。双向
双链测序获得了该产物1440bp 的DNA 序
列,搜寻GenBank 表明该序列和地衣芽孢杆菌
(B acillus lichenif or m is )的16S r DNA 的同源性
为99%,说明GXN 151很可能是地衣芽孢杆
菌,将GXN 151接种到Si m mon s 培养基上培养
36h 后,培养基由原来的绿色变为蓝色,则进
一步证实GXN 151为地衣芽孢杆菌。213 GXN 151基因文库的构建用S au 3A I 部分酶切GXN 151的基因组DNA ,电洗脱法回收3～10kb DNA 片段,用T 4DNA 连接酶将回收片段与经碱性磷酸酶处理的B a m H I 酶切的pB luescri p t KS (+)载体连接,将连接反应产物电转化E 1coli JM 109后,在含氨苄青霉素(50Λg mL )、IPT G (40Λg mL )和X -Gal (40Λg mL )的LA 平板上筛选转化子。随机共挑取了7099个白色转化子作为文库克隆保存,随机选取其中29个转化子提取质粒DNA ,B a m H I 酶切检测大小,结果每个克隆均有外源DNA ,其中插入片段最大的为1110kb ,最小的为311kb ,平均大小为416kb ,根据L 1C larke -J 1Carbon 公式N =ln (1-P )
ln (1-f )[13],该基因文库含有GXN 151基因组中任一基因的概率P 为9916%。
214 含羧甲基纤维素酶基因的克隆的筛选
将文库克隆一一点接到含015%C M C 的LA 平板上,培养后用刚果红染色检测菌落周围有无水解圈,结果共筛选到8个菌落周围有水解圈的克隆(图3),进一步提取该8个克隆的质粒DNA 并转化E 1coli JM 109,随机挑取由每个质粒转化得到的10个转化子检测,结果所有转化子都表达羧甲基纤维素酶(carboxym ethylcellulase ,C M Case )活性,从而证明上述8个克隆确实含有GXN 151的纤维素酶基因,分别命名为pGXNL 1,pGXNL 2,pGXNL 5,pGXNL 7,pGXNL 9,pGXN P 8,pGXN P 11和pGXN P 12。
531第2期刘永生等:能降解天然纤维素的地衣芽孢杆菌GXN 151的分离鉴定及其一个纤维素酶基因(cel 5A )的克隆和测序分析
图3 从菌株GXN 151基因文库中筛选得到的表达羧甲基纤维素酶活性的克隆F i g .3 Clones expressi n g carboxy m ethylcellula se acti v ity fro m the geno m i c l i brary of GXN 151上排从左至右分别为pGXNL 1,pGXNL 2,pGXNL 5,pGXNL 7;下排从左至右分别为pGXNL 9,pGXN P 8,pGXN P 11,pGXN P 12C l ones from left to righ t in the upper row :pGXNL 1,pGXNL 2,pGXNL 5,
pGXNL 7;C l ones from left to righ t in the l ow er row :pGXNL 9,pGXN P 8,pGXN P 11,pGXN P 12 分别以该8个克隆的质粒
DNA 为模板,以通用正向、反向
引物为引物测序,获得了这些克
隆的插入片段的两末端450bp
左右的序列,序列分析发现用正
向、反向引物分别测得的
pGXN P 8、pGXN P 11两末端序列
起点一样,说明pGXN P 8、
pGXN P 11为同一克隆,用引物
步行(p ri m er w alk ing )方法测得
了pGXN P 11反向引物方向1
580bp DNA 序列,该序列和用
正向引物测得的pGXNL 5的一
末端序列重叠,说明pGXNL 5、
pGXN P 8和pGXN P 11可归为一类重叠克隆。代表克隆为
pGXN P 11。用反向引物分别测得
的pGXNL 1、pGXN P 12一末端
序列相互重叠,双向双链测定了pGXNL 2的DNA 序列,该序列和用正向引物分别测得的pGXNL 1、pGXN P 12一末端序列的不同位置重叠,根据pGXNL 2上cel 5A 基因序列设计一对引物,分别以pGXNL 5、pGXNL 7、pGXNL 9和pGXN P 8DNA 为模板进行PCR ,结果pGXNL 7给出一个和对照pGXNL 2一样大小的PCR 产物,说明pGXNL 1、pGXNL 2、pGXNL 7和pGXN P 12可归为一类重叠克隆,代表克隆为pGXNL 2。克隆pGXNL 9不和上述两类克隆重叠,独立成为一类克隆。结果我们将从文库中筛选得到的8个表达C M Case 活性的克隆归为3类不重叠的独立克隆,代表克隆分别为pGXN P 11、pGXNL 2和pGXNL 9。
215 基因cel 5A 的序列分析
基因cel 5A 的开放阅读框(open reading fra m e ,OR F )由1626个核苷酸组成,编码一个含542个氨基酸的蛋白质,该蛋白质的预计分子量大小为59,652道尔顿,等电点p I 为9134。在其推测的起始密码子A T G (核苷酸位置1789)的上游相隔5bp 处有一个潜在的核糖体结合位点(ribo s om e binding site ,RBS ,又叫Sh ine -D algarno 序列)序列A GGA GT ,该序列可使mRNA 和细菌核糖体16SrRNA 的3’端碱基互补配对[14]。OR F 在核苷酸位置3415处以赭石(O ch re )终止密码子TAA 结束。在其编码区上游,我们发现一个可能的启动子序列,即35区为T T GA TA (核苷酸位置1721～1726),10区为T T TA T T (核苷酸位置1743～1748),两者相隔16bp ,该序列和大肠杆菌的Ρ70所识别的保守的启动子序列(相隔17bp 的T T GA CA 和TA TAA T )非常相似[15]。在终止密码子TAA 下游没有发现典型的不依赖于Θ因子的转录终止子。
216 Cel 5A 的氨基酸序列分析
用S M A R T 软件分析由DNA 序列推测的地衣芽孢杆菌GXN 151的Cel 5A 的组件结构,结果
Cel 5A 前体的N 末端的42个氨基酸是可能的信号肽,其氨基酸66
～321为家族5糖基水解酶(glyco 2syl hydro lase )功能域、391～472为家族3碳水化合物结合组件(carbohydrate -binding module ,CBM )。搜寻PDB 、P I R -PSD 和S W ISS -PRO T 数据库,发现Cel 5A 的家族5催化功能域和家族5的其它内切-Β-1,4-葡聚糖酶的催化功能域具有广泛的相似性,如和B acillus ag arad herans 内切葡聚糖酶Cel 5A (PDB 索引号1A 3H )的催化功能域具70%的相同性,和好碱的芽孢杆菌属一菌株的内切葡聚糖酶Cel 5(11)70%,(631广西农业生物科学第22卷
ch ry santhe m i )纤维素酶Cel 5(PDB 索引号1EGZ )的催化功能域具45%的相同性。和枯草芽孢杆菌纤维素酶前体Bgl C (P I R -PSD 索引号G 69593)的催化功能域具90%的序列相同性,和枯草芽孢杆菌菌株DL G 的内切-Β-1,4-葡聚糖酶前体(Sw iss -P ro t 索引号P 07983)的催化功能域也具90%的序列相同性,和胡萝卜软腐欧文氏菌(E r w inia carotovora )内切葡聚糖酶V 前体Cel V (Sw iss -P ro t 索引号Q 47096)的催化功能域具69%的相同性。
地衣芽孢杆菌GXN 151的Cel 5A 的家族3CBM 和家族3的其它CBM 具有广泛的相似性,如和热纤梭菌的纤维素酶体支架蛋白A (cellul o s om al scaffo lding p ro tein A )的CBM (PDB 索引号1NBC )具35%的序列相同性(序列相似性为54%),和解纤维梭菌的支架蛋白的CBM (PDB 索引号1G 43)具30%的序列相同性(序列相似性为46%)。和上述枯草芽孢杆菌纤维素酶前体Bgl C 的CBM 具69%的序列相同性,和上述枯草芽孢杆菌菌株DL G 的内切-Β-1,4-葡聚糖酶前体的CBM 也具66%的序列相同性。
3 讨论
(1)目前已知能降解天然纤维素的厌氧细菌大部分形成分泌到细胞外的纤维素酶体,纤维素酶体含支架蛋白和多个酶组分,结构复杂[5]。报道能降解天然纤维素的好氧细菌不多,主要是纤维单胞菌属(Cellu lo m onas )和纤维弧菌属(Cellv ibrio )的一些种,但还没有证据表明它们也形成纤维素酶体[4]。又由于细菌基因组较小,好氧细菌分离培养简单易行,因此,能降解天然纤维素的好氧细菌是研究纤维素降解分子机理的好材料。国内外还未见能降解天然纤维素的地衣芽孢杆菌的报道。
(2)由于细菌的16S rRNA 在进化上具有很高的保守性,通过将某一未知细菌的16S rRNA 编码基因(16S r DNA )的序列与数据库的16S r DNA 序列进行同源性比较,可初步确定该细菌的种属地位[16]。本工作根据16S r DNA 序列分析并结合细菌的形态特征、培养特征,快速地将天然纤维素降解菌GXN 151初步鉴定为地衣芽胞杆菌。根据芽胞杆菌属典型菌种检索表[8],只有地衣芽胞杆菌才能利用丙酸盐作为碳源,GXN 151能使Si m mon s 培养基变为蓝色,即呈阳性反应,这是培养基中丙酸盐被利用的结果,由此可将GXN 151鉴定为地衣芽胞杆菌。
(3)根据公式计算,本工作所构建的GXN 151的基因文库含该菌基因组中任一基因的概率P 为9916%,说明建库质量符合要求。采用基于酶活性的平板直接筛选法筛选该文库,共获得8个表达C M 2Case 活性的克隆,DNA 测序和PCR 分析表明该8个克隆可归为3类不重叠的独立克隆,这主要是用S au 3A I 部分酶切GXN 151基因组DNA 导致的。这些克隆都在含C M C 的LA 平板上表达C M Case 活性,说明克隆的基因可以在大肠杆菌中表达且表达的产物可以被大肠杆菌的分泌系统分泌到胞外。进一步将这些克隆点接到含A vicel 的平板上,结果都不能降解A vicel ,说明这些克隆中可能不含有完整的纤维二糖水解酶基因,也可能含完整的基因但在大肠杆菌中不表达,或表达了不分泌。国内外未见从地衣芽孢杆菌中克隆纤维素酶基因的报道。
(4)地衣芽孢杆菌GXN 151的Cel 5A 从N 末端到C 末端依次由信号肽、家族5糖基水解酶催化功能域、家族3CBM 组成。应用S M A R T 来寻找数据库中具有同样的这种功能域结构形式的蛋白质,结果发现有16个纤维素酶和Cel 5A 的功能域结构形式一样,这16个酶中,来自枯草芽孢杆菌、芽孢杆菌属的其它种和胡萝卜软腐欧文氏菌的分别为6个、5个和3个,如枯草芽孢杆菌菌株DL G 的内切-Β-1,4-葡聚糖酶前体(Sw iss -P ro t 索引号P 07983)、胡萝卜软腐欧文氏菌内切葡聚糖酶V 前体Cel V (Sw iss -P ro t 索引号Q 47096)。说明酶的功能域结构形式可能在进化上具有一定的保守性。GXN 151的Cel 5A 的催化功能域和B acillus ag arad herans 内切葡聚糖酶Cel 5A (PDB 索引号1A 3H )的催化功能域具70%的序列相同性,和好碱的芽孢杆菌属一菌株的内切葡聚糖酶Cel 5(PDB 索引号1L F 1)的催化功能域具70%的序列相同性,该两种菌的Cel 5A 、Cel 5都被证实具有内切-Β-1,4-葡聚糖酶活性,且两者的催化功能域的结构都已被测定[17,18],说明GXN 151的Cel 5A 很可能是一个内切731第2期刘永生等:能降解天然纤维素的地衣芽孢杆菌GXN 151的分离鉴定及其一个纤维素酶基因(cel 5A )的克隆和测序分析
831广西农业生物科学第22卷
面结合使催化功能域更接近不可溶纤维素而有利于对纤维素的降解,CBM的存在对外切葡聚糖酶的作用尤其重要,内切-Β-1,4-葡聚糖酶的CBM也可切断天然纤维素的表面而释放小颗粒,内切-Β-1,4-葡聚糖酶可和外切葡聚糖酶协同作用在降解结晶纤维素中起非常重要的作用[19],本工作所克隆鉴定的cel5A基因的产物Cel5A很可能是GXN151的降解结晶纤维素的酶系统的一个重要组分。
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(责任编辑 裴润梅)