药物生物技术
Pharmaceutical Biotechnology2013，20（3）：203 206
血管内皮生长因子受体2胞外区3（KDＲ3）血管抑制活性研究曹婉璐，张娟*，涂孝洁，许卓斌，金海珍，王旻*
（中国药科大学生命科学与技术学院，江苏南京210009）
摘要血管内皮生长因子（VEGF）是一种重要的血管生成调节因子。血管内皮生长因子受体2（VEGFＲ2，人VEGFＲ2也称为Kinase insert domain-containing receptor，KDＲ）是VEGF的特定膜受体之一。血管内皮生长因子阻断剂可以通过阻断VEGF-VEGFＲ2信号通路来调节重要的抑癌过程。目前尚没有研究VEGFＲ2胞外3区（KDＲ3）抑制血管活性的文献。因此，该研究旨在用大肠杆菌表达可溶性KDＲ3，并研究其抑制血管生成的活性。采用表面等离子体共振（SPＲ）技术检测到可溶性表达KDＲ3与VEGF165之间的平衡解离常数为54nmol/L。采用划痕损伤修复实验来证明KDＲ3能够显著抑制EA.hy926细胞的迁移能力。最后通过鸡胚尿囊膜实验表明，KDＲ3在体内同样能够抑制新生血管生成。因此，该文初步论证外源性KDＲ3作为一种血管内皮生长因子阻滞剂的能力。
关键词血管内皮生长因子受体；血管抑制能力；鸡胚尿囊膜模型；表面等离子共振技术；划痕修复实验；血管阻断剂
中图分类号Q51文献标志码A文章编号1005-8915（2013）03-0203-04
血管的新生是一种非常精确而且复杂的生理过程。新生血管细胞必须打破原有的内皮细胞并且穿过基底膜来进行迁移和增殖。这其中的每个步骤都对应不同的促血管生成因子，每个过程均由正负调控因子严密控制和制衡以达到平衡，而这些因子则由不同类型的细胞或细胞膜粘附分子分泌［1］。
血管内皮生长因子（VEGF）是一种非常重要的血管生成因子，通过与特定的膜受体—血管内皮生长因子受体2（VEGFＲ2，KDＲ）结合以发挥作用［2］。KDＲ表达在大多数人血管内皮细胞和循环内皮祖细胞中。VEGF-KDＲ之间的相互作用可以激活数个胞内信号通路，包括有内皮细胞的增殖、迁移、分化，管状结构的形成，促进血管通透性以及完整性。KDＲ基因编码1356个氨基酸，其胞外区有7个免疫球蛋白区。其中3区已被证明在VEGF的信号转导中有着至关重要的作用［3］。
VEGF阻滞剂已被研究了几十年。研究人员通过增加它们与VEGF的亲和力等方法以提高其抗血管生成活性。VEGF阻滞剂可以调节肿瘤的迁移和生长，已有研究表明相关的疾病有转移性结直肠癌，非小细胞肺癌，胶质母细胞瘤和血管的眼科疾病等［4-7］。比如基因泰克公司研发的雷珠单抗，是一种重组人源化的抗VEGF-A单克隆抗体药物；还有由辉瑞公司研发的舒尼替尼，是一种抗VEGFＲ2的多克隆抗体药物；以及由Ｒegeneron制药公司研发的阿柏西普，是一种能够阻断VEGF-VEGFＲ通路的新型融合蛋白等［8-9］。然而，没有专门研究KDＲ3抑制新生血管生成能力的相关文献报道。因此，该文将研究KDＲ3作为一种新型的血管内皮生长因子阻滞剂的可能性。
1实验材料
酵母抽提物和蛋白胨购自Merck（Manheim，Germany）；氨苄青霉素购自Sigma公司；IPTG是Cinnagen（Iran）；其他在文中直接标注。
2实验方法
2.1KDＲ3的制备
KDＲ3的基因来自保存于实验室的菌株BL21（DE3）/ pET32a-KDＲ。设计上游引物：5'-CCG GAA TTC（EcoＲI）TGT GCT GTT CTT CTT GG-3'，下游引物：5'-CCG CTC GAG（Xho I）GGT AGA ATT TTT CTT CGT CAT-3'，通过PCＲ，酶切回收目的基因片段，酶联，将KDＲ3核酸序列克隆到表达载体pET22b（+）（Novagen）中。通过测试表达载体pET22b-KDＲ3在不同的表达系统中进行优化，获得能够可溶性表达KDＲ3的大肠杆菌。大批量培养重组大肠杆菌，收集菌体表达的可溶性蛋白，镍柱分离纯化以得到高纯度的KDＲ3。
2.2表面等离子体共振分析配体和受体间相互作用
该实验采用BiacoreX100（GE）来对KDＲ3和VEGF165的动力学进行研究。由于KDＲ3含有his标签，故采用NTA芯片捕获KDＲ3以进行相关动力学实验。实验中KDＲ3（10μg/mL）以30μL/min的体积流量串联流过未螯合镍离子的通道1和螯合了镍离子的通道2（30μL/min，
302
*收稿日期：2013-03-22修回日期：2013-04-01
基金项目：国家自然科学基金资助项目（NSFC81072561，NSFC81102364，NSFC81273425）；国家大学生创新性实验计划项目（G12071）。
作者简介：曹婉璐（1989-），女，在读硕士，微生物与生化药学，E-mail：724576084@https://www.doczj.com/doc/e016189184.html,。
*通讯作者：王旻，男，教授，Tel：025-********。张娟，女，副教授，Tel：025-********。
药物生物技术第20卷第3期
500Um NiCl 2），经平衡后通入一定浓度的VEGF 165，检测
通道2减通道1的反应信号（Fc2-Fc1），采用350mmol /L EDTA 对NTA 芯片再生（30μL /min ，30s ）。该实验通过
NTA 芯片表面定量的KDＲ3对不同浓度的VEGF 165（1.25，2.5，5，10，20，40，80和160nmol /L ）结合量的检测［10］。2.3划痕修复实验
EA.hy926细胞在37?，5%CO 2的培养箱中培养（含10%FBS 的DMEM 培养基）。用显微镜观察细胞生长状况，等细胞长满约80% 90%后，用0.25%胰蛋白酶消化
并传代于12孔板，使每孔细胞数约为2?105
个/mL 。置于37?培养箱中至细胞长满约80% 90%，换用不含血清的DMEM 培养基饥饿培养12h 。接着，
弃去原有培养基并划痕，然后用PBS 清洗2遍，加入含浓度为0，
40，200和1000nmol /L KDＲ3的10%FBS DMEM 培养基。在培养时间为0，6，12和24h 的时候，于相同区域拍照（?100）。
该实验使用Image-pro plus6.0来计算划痕恢复区域［11］。计算公式为：面积恢复=面积0h －面积时间。
2.4鸡胚实验
20枚普通鸡胚（南京药械厂）置于37?，湿度约为55%孵育箱中培养6d 。然后使用医用小弯镊开窗，窗口的
面积约为1cm 2
左右，以不超过气室大小，不小于药片大小
为标准。孵育箱中孵育过夜，
第二天分别加入浸满有10μg /mL 、1000μg /mL KDＲ3以及10ng /mL VEGF 的大小
一致的滤纸片，
滤纸片的位置以无主血管处为佳，用生理盐水作为对照。加药后的鸡胚放置于37?孵育48h 。接着，
加入固定液（甲醇?丙酮=1?1）约1.5mL ，室温放置15min 。最后，用医用弯剪剪下尿囊膜，用生理盐水清洗后平铺于载
玻片上拍照。用Image-pro plus6.0软件分析实验结果［12］。3实验结果
3.1
KDＲ3的表达和纯化
通过Ｒosetta-gami （DE3）/pET22b-KDＲ3重组菌表达获得可溶性KDＲ3目的蛋白，
纯度达到90%，通过检测目的蛋白表达完整，相对分子质量为15000
。
M ：Marker ；1：Bovine serum albumin as a control ；2：Whole
broth ；3：Uninduced broth as negative control ；4：Purified KDＲ3protein
Fig 1The SDS-PAGE result of the expression
and purification of KDＲ3
3.2
表面等离子体共振分析配体和受体间相互作用
该实验中使用Biacore X100作为SPＲ-依赖的生物传感
器来检测KDＲ3和VEGF 165之间的相互作用，所使用的芯片
是NTA 芯片，
NTA 芯片具有氮川三乙酸表面，适用于连接带有His-Tag 标记的重组蛋白质分子。分别检测浓度为1.25，2.5，5.0，10，20，40，80和160nmol /L 的VEGF 165，获得结合与解离曲线，用BIA 评估软件分析，结果表明（图2），在KDＲ3
与VEGF 165的实时结合中，快速结合速率（Ka ）为2.060?10
5
（1/Ms ），快速解离速率（Kd ）为1.114?10－2（1/s ）。通过计算获得了平衡解离速率常数Kd 约为54nmol /L 。Ｒmax 为
1155ＲU ，tc 值为1.73?107，U-value 为10
。
A-h stands for the tested association-dissociation curve of
concentration 1.25，2.5，5，10，20，40，80and 160nmol /L VEGF 165.VEGF 165has on-rate Ka =2.06?105（1/Ms ），off-rate Kd =1.114?10－2
（1/s ），
and equilibrium dissociation rate constant Kd =54nmol /L
Fig 2Kinetics of KDＲ3binding to VEGF 165with Biacore 3.3
划痕修复实验
划痕修复实验中，EA.hy926细胞在划痕后培养24h ，在时间分别为0，6，12，24h 于相同区域拍摄划痕，用Image-Pro Plus 6.0软件计算愈合区域面积。实验结果表明，未经
KDＲ3处理的细胞运动迁移基本完全覆盖了划痕区域，而含有1000，
200，40nmol /L 药物的孔仍然有不同面积的划痕区域。因此，
随着时间的延长，KDＲ3仍然能够抑制EA.hy926细胞迁移运动。同时，KDＲ3对于EA.hy926细胞
的划痕修复效果呈现浓度依赖性（图3）。3.4
鸡胚尿囊膜实验
该实验采用鸡胚尿囊膜作为研究模型。采用滤纸作为载药片，实验分为4组，分别为低剂量药物组，高剂量药物组，生理盐水对照组以及VEGF 组，每组5枚鸡胚。实验结果显示（图4），高剂量组KDＲ3能够明显抑制药片覆盖下的尿囊膜区域的血管生成，
低剂量组也能够抑制血管生成但是效果没有高剂量组明显。VEGF 能够起到促进血管生成的作用。同时，通过Image-pro plus6.0软件分析结果也说明了同样的趋势（图4）。4
讨论
通过抑制血管生成来治疗肿瘤生长和迁移是一个非常有吸引力的医学研究领域。该实验的目的是初步研究KDＲ3
402
曹婉璐等：血管内皮生长因子受体2胞外区3（KDＲ3）
血管抑制活性研究After scratching a clean wide wound area ，EA.hy926cells
were incubated in 12-well plates for 24h.Then ，
healing areas were photographed （?100）（a ）and calculated with the Soft-ware Image-pro plus 6.0（b ）.Area healing =Area 0h －Area time
Fig 3Scratch-wound healing assay of
KDＲ3
Ｒesults are presented as mean ?SD of three assays ，*
signifi-cant difference in comparison to control group ，P ＜0.05．A filter-paper disk with 0，10or 1000μg /mL or VEGF
10ng /mL was placed onto CAMs.After 48h ，CAMs were fixed and photographed.
（a ）：Ｒepresentative photographs of chick CAM assays ；（b ）：Analysis with Image-pro plus 6.0；（c ）：Quantitative analysis
of neovascularization from the photographs.
Fig 4KDＲ3inhibits angiogenesis in vivo
作为一种血管生长抑制剂的潜力。表面等离子共振技术是一种高度灵敏，精确而且高效的研究抗原抗体相互作用的评估技术。依赖于生物传感器的表面等离子共振技术是研究固定化的生物分子和液相分析物之间的相互作用的理想选择，因为它会产生可靠的具有约束力的动力学常数（Ka 和Kd ），不仅不需要对检测物进行特定的信号标记，而且能够
提供实时分析数据
［13-14］
。在该文中，SPＲ技术用来证明KDＲ3与VEGF 165之间的结合能力。该实验数据表明，KDＲ3
能够有效地结合VEGF 165。Tc 值略显小，有两个可能的原
因：（1）Ｒmax 及其他循环响应值太大，
导致软件计算所得Tc 值大；（2）NTA 芯片结合情况不稳定，导致实验数据的偏差。
研究人员已经证明，
EA.hy926细胞表面高丰度表达KDＲ，因此可溶性KDＲ3可能的抑制机制是通过与细胞表面的KDＲ竞争结合细胞分泌的内源性VEGF 以抑制
VEGF-KDＲ细胞通路，达到抑制细胞增殖与迁移的作用
［15］
。
另外，促进或者抑制血管生成的经典体内实验对象包括：金黄地鼠颊囊，
兔耳室，鼠背皮肤，鼠气囊，啮齿类动物的虹膜或者缺血性角膜以及鸡胚尿囊膜（CAM ）等［16］
。鸡
胚尿囊膜是一个血管密集并且属于胚胎外层的组织。这两个特点使得鸡胚尿囊膜成为一个适合快速并且精确研
究血管生成或者抗血管生成的体内模型［17］
。该实验中采用CAM 作为血管生成模型研究KDＲ3是否能够在体内抑制新血管的形成。目前的研究中有4种不同的判断依据来定量鸡胚的新生血管：（1）血管的延伸程度；（2）血管的密度和分布；（3）血管的长度；（4）血管的面积。以这4个判断标准衍生出不同的定量方法。近20年比较常用的方法有以下两种：（1）计数给药后特定视野内的血管分支数；（2）直接观察药物对于新生血管生长趋势和数目的影响。方法（1）的缺陷是鸡胚血管密布交错，人为计数在精确性上引人质疑。方法（2）的缺陷是没有统一完善的评价标准，以主观判断主导实验结果。因此该实验中采用使用图像分析软件计算出尿囊膜上新生血管的面积，以新生血管面
积百分比作为评价标准
［18-20］
。计算公式为：Area 血管百分比=Area 血管面积/Area 膜面积?100。这样不仅可以反映药物对于鸡
胚尿囊膜血管的影响，同时能够避免统计实验数据的误差。
因此，该实验通过以上实验初步证明了KDＲ3作为一种血管抑制药物的可能性。在接下来的工作中，将采取更多的体内外实验来检测KDＲ3的血管抑制能力，比如流式
细胞分析技术，细胞粘附试验和小鼠肿瘤模型实验等，期望获得理想的阻断VEGF-KDＲ结合的效果，为抑制肿瘤血管形成，治疗癌症奠定基础。
参考文献
［1］Papadopoulos N ，Martin J ，Ｒuan Q ，et al ．Binding and neutraliza-tion of vascular endothelial growth factor （VEGF ）and related ligands by VEGF Trap ，ranibizumab and bevacizumab ［J ］．Angio-genesis ，2012，15：171.
5
02
药物生物技术第20卷第3期
［2］周红霞，刘景晶．血管内皮细胞生长因子及其阻断在抗肿瘤中的应用［J］．药物生物技术，2004，11（4）：274.
［3］Ferrara N，Gerber HP，LeCouter J．The biology of VEGF and its receptors［J］．Nat Med，2003，9：669.
［4］Farhat FS，Tfayli A，Fakhruddin N，et al．Expression，prognostic and predictive impact of VEGF and bFGF in non-small cell lung
cancer［J］．CritＲev Oncol Hemat，2012，84：149.
［5］Zaher K Otrock，Hatoum HA，Musallam KM，et al．Is VEGF a predictive biomarker to anti-angiogenic therapy［J］．CritＲev
Oncol Hemat，2011，79：103.
［6］Tarhbalouti M，Liu JJ．Advances of study on recombinant vascular endothelial growth factor［J］．Pharma Biotechnol，2000，7
（3）：190.
［7］刘煜，恽冬杰，唐立曼，等．人源VEGF单克隆抗体Fabμ，和Fc5μ片段的制备［J］．药物生物技术，2008，15（5）：343.［8］Lowe J，Araujo J，Yang J，et al．Ｒanibizumab inhibits multiple forms of biologically active vascular endothelial growth factor in
vitro and in vivo［J］．Experimental EyeＲesearch，2007，85：425.［9］Mitchell EP．Targeted Therapy for Metastatic Colorectal Cancer：Ｒole of Aflibercept［J］．C lin Colorectal Canc，2012，12（2）：73.［10］Hou XM，Tian H，Wu JY，et al．Ｒeal-time analysis of the interac-tion of a multiple-epitope peptide with antibodies against classical
swine fever virus using surface plasmon resonance［J］．J Biotech-
nol，2012，161：221.
［11］Shan YJ，Zhang LW，Bao YP，et al．Epithelial-mesenchymal tran-sition，a novel target of sulforaphane via COX-2/MMP2，9/Snail，ZEB1and miＲ-200c/ZEB1pathways in human bladder cancer
cells［J］．J Nutr Biochem，2012，24（6）：1062.
［12］Li YJ，Duan CL，Liu JX，et al．Pro-angiogenic actions of Salvianol-ic acids on in vitro cultured endothelial progenitor cells and chick
embryo chorioallantoic membrane model［J］．J Ethnopharmacol，2010，131：562.
［13］Chenail G，Brown NE，Shea A，et al．Ｒeal-time analysis of anti-body interactions with whole enveloped human cytomegalovirus
using surface plasmon resonance［J］．Anal Biochem，2011，411：58.
［14］Feng Y，GongＲ，Dimitrov DS．Design，expression and characte-rization of a soluble single-chain functional human neonatal Fc
receptor［J］．Protein Expres Purif，2011，79：66.
［15］Hseu YC，Chen SC，Lin WH，et al．Toona sinensis（leaf extracts）inhibit vascular endothelial growth factor（VEGF）-induced angio-
genesis in vascular endothelial cells［J］．J Ethnopharmacol，2011，134：111.
［16］Ｒibatti D，Vacca A，Bertossi M，et al．Angiogenesis induced by B-cell non-Hodgkin's lymphomas．Lack of correlation with tumor
malignancy and immunologic phenotype［J］．AnticancerＲes，1990，10：401.
［17］Su L，Ｒao K，Guo F，et al．In ovo leptin administration inhibits chorioallantoic membrane angiogenesis in female chicken embryos
through the STAT3-mediated vascular endothelial growth factor
（VEGF）pathway［J］．Domest Anim Endocrin，2012，43：26.［18］许扬，赵英凯，毕明刚，等．Image-Pro Plus图像分析软件定量鸡胚尿囊膜血管新生面积的方法［J］．中国比较医学杂志，2007，17：745.
［19］Sharili AS，Allen S，Smith K，et al．Snail2promotes osteosarcoma cell motility through remodeling of the actin cytoskeleton and
regulates tumor development［J］．Cancer Lett，2013，333
（2）：170.
［20］Ｒibatti D．Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis［J］．IntＲev Cel Mol Bio，2008，270：181.
Antiangiogenic ActivityＲesearch of the Vascular Endothelial Growth
FactorＲeceptor2ExtracellularＲegion3（KDＲ3）
CAO Wan-lu，ZHANG Juan*，TU Xiao-jie，XU Zhuo-bin，JIN Hai-zhen，WANG Min*
（School of Life Science and Technology，China Pharmaceutical University，Nanjing210009，China）
Abstract Vascular endothelial growth factor（VEGF）is a vital mediator of angiogenesis．VEGF receptor2（VEGFＲ2）interacts with VEGF，as one of its specific membrane receptors．Ｒesearchers have found out that a VEGF blocker can restrain some vital processes of tumor suppression by blocking the signal pathway of VEGF-VEGFＲ2．However，there is no literature evidence of investi-gation on the antiangiogenic ability of single domain3of VEGFＲ-2（KDＲ3），as the key domain in the signal transduction of VEGF．In this article，Escherichia coliＲosetta-gami（DE3）/pET22b was taken to express the soluble KDＲ3．The binding between KDＲ3and VEGF
165
was tested with BiacoreX100（GE）．Scratch-wound healing assay was used to evaluate KDＲ3's cell migration ability．The in vivo anti-angiogenic effect of KDＲ3was tested with chicken embryo chorioallantoic membrane（CAM）model．The outcome showed that the soluble KDＲ3was expressed successfully with prokaryotic expression system．The surface plasmon resonance（SPＲ）tech-
nology was adopted to test the binding between KDＲ3and VEGF
165
，which equilibrium dissociation rate constant（Kd）was 54nmol/L．KDＲ3can suppress EA．hy926cell'migration with a dose-dependent tendency．Also the in vivo investigation showed that KDＲ3is capable of inhibiting neovascularization，adopting the CAM assay．This article has therefore provided a novel antiangiogenic drug candidate relating to VEGF-VEGFＲ2pathway.
Key words VEGFＲ；Anti-angiogenesis；CAM；SPＲ；Scratch-healing assay；Vascular blocker
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