细胞冻存方法 一、概述 目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。 二、主要冷冻设备和材料 常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器，规格有35L3和50L3两种。使用时要注意以下几点：（1）一般两周需充液氮一次，至少一个月充氮一次。液氮温度达-196℃，使用时注意勿让液氮溅到皮肤上，以免引起冻伤。 （2）液氮容器为双层结构，中间为真空层，瓶口有双层焊接处，应防止焊接部裂开。（3）在装入液氮时，要注意缓慢小心，并用厚纸卷筒或特制漏斗作引导，使液氮直达瓶底，如有专用液氮灌注装置则更好。若为初次使用，加液氮时更要缓慢，以免温度骤降而使容器损坏。 细胞冻存时常备的材料有：0.25%胰蛋白酶，含10%～20%的血清培养液，DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油(121°C蒸气高压消毒)，2mL安瓿（或专用细胞冻存管）、吸管、离心管、喷灯、纱布袋（或冻存管架）等。 三、细胞冻存方法 主要操作步骤为： （1）选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，10分钟)。 （2）去上清液，加入含20%小牛血清的完全培养基，于4℃预冷15分钟后，逐滴加入已无菌的DMSO或甘油，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为3×106～1×107/mL之间。（3）将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料管中，安瓿装1～1.5mL在火焰喷灯上封口，封口处要完全封闭，圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记（日期、细胞种类及代次、冻存支数）。 （4）将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内；置于液氮容器颈口处存放过夜，次日转入液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤：先将安瓿置入4℃冰箱中2～3小时，再移至冰箱冷冻室内3～4小时（此步可省略），再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时，最后沉入液氮中。 细胞冻存在液氮中可以长期保存，但为妥善起见，冻存半年后，最好取出一只安瓿细胞复苏培养，观察生长情况，然后再继续冻存。
细胞传代培养的原理及操作步骤 （一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 （二）细胞传代培养具体操作 1、细胞：贴壁细胞株 2、操作步骤 1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。 观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。 4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 细胞冻存 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水 浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的 细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀 6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储 存。-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。 细胞复苏 1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。 2.自液氮罐中取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，离心。 3.去上清，加入培养基，吹打，然后移入培养瓶中，用培养基清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。 4.于培养瓶中加入适量培养基，放入CO2培养箱中培养 5.记录复苏日期；次日换液。
实验步骤一、材料准备 1. 仪器：净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱。 2. 玻璃器皿：吸管（弯头、直头）、培养瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、废液缸。 3. 塑料器皿：吸头、枪头、胶塞、移液管（10ml）、15ml离心管、冻存管（1～2ml）。 4. 其他物品：微量加样枪、红血球计数板、记号笔、医用橡皮膏、移液枪。 5. 试剂：D-Hanks液、小牛血清、培养液、双抗（青霉素、链霉素）、胰蛋白酶（0.08%）、1NHCl、7.4%NaHCO3、DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油。 二、细胞冻存 1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液。 2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中。 3. 离心1 000 rpm，5 min。 4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml。 5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml。 6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者。 7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2 h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。 三、细胞复苏 1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。 2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀。 3. 离心，1 000 rpm，5 min。
二甲基亚砜说明书中文名称：二甲基亚砜（DMSO） 英文名 :Dimethyl sulfoxide（DMSO） 别称：二甲亚砜 化学式： C2H6OS 分子量： 78.13 CAS登录号： 67-68-5 EINECS登录号： 200-664-3 熔点： 18.4 °C 沸点： 189°C 水溶性：能溶 密度： 1.100g/mL 外观：无色液体 闪点： 95°C 应用：有机高分子合成稳定溶剂 安全性描述：避光低温稳定 危险性符号：36/37/38 危险性描述：不可食用，接触就医 相对分子量： 78.078 供应商：乔羽生物 储存条件：2-8°C 低温避光保存
二甲基亚砜（DMSO）简介: 二甲基亚砜（DMSO）是一种含硫有机化合物，常温下为无色无臭的透明液体，是一种吸湿性的可燃液体。具有高极性、高沸点、热稳定性好、非质子、与水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物，被誉为“万能溶剂”。在酸存在时加热会产生少量甲基硫醇、甲醛、二甲基硫、甲磺酸等化合物。在高温下有分解现象,遇氯能发生剧烈反应,在空气中燃烧发出淡蓝色火焰。可作有机溶剂、反应介质和有机合成中间体。也可用作合成纤维的染色溶剂、去染剂、染色载体,以及回收乙炔、二氧化硫的吸收剂。 二甲基亚砜（DMSO）物理性质: 无色粘稠液体。可燃，几乎无臭，带有苦味，有吸湿性。除石油醚外,可溶解一般有机溶剂。能与水、乙醇、丙酮、乙醛、吡啶、乙酸乙酯、苯二甲酸二丁酯、二恶烷和芳烃化合物等任意互溶，不溶于乙炔以外的脂肪烃类化合物。 [1] 有强烈吸湿性，在20℃，当相对湿度为60%时，可从空气吸收相当于自身重量70%的水分。该品是弱氧化剂，不含水的二甲基亚砜对金属无腐蚀性。含水时对铁；铜等金属有腐蚀性，但对铝不腐蚀。对碱稳定。在酸存在时加热会产生少量的甲基硫醇；甲醛；二甲基硫；甲磺酸等化合物。在高温下有分解现象，遇氯能发生激烈反应，在空气中燃烧发出淡蓝色火焰。 二甲基亚砜（DMSO）化学性质: 二甲亚砜还原生成甲硫醚。受强氧化剂作用氧化成二甲砜； 2．二甲基亚砜与酰氯类物质如氰尿酰氯、苯酰氯、乙酰氯、苯碘酰氯、亚硫酰氯、硫酰氯、三氯化磷等接触时，发生激烈的放热分解反应。与硝酸结合，生成（CH3）2SO·NHO3。与碳酸钡作用可使二甲基亚砜再生。与浓氢碘酸作用，生成二甲硫磺化合物。 3．二甲基亚砜有吸水性，用前需要进行干燥处理。 二甲基亚砜（DMSO）物性数据: 1、性状：无色黏稠透明油状液体或结晶体。具弱碱性，几乎无臭，稍带苦味，常用的有机溶剂。 2、相对密度（g/mL,20/4℃）：1.100 3、相对蒸汽密度（g/L,空气=1）：2.7 4、熔点（℃）：18.45 5、沸点（℃）：189 6、折射率：1.4795 7、黏度（mPa·s）：1.987（25℃）；2.2（20℃）；1.290（50℃） 8、闪点（℃，开口）：95 9、燃点：300~302℃ 10、蒸发热（KJ/mol，℃）：52.92 11、熔化热（KJ/mol）：13.94 12、生成热（KJ/mol）：-197.66 13、燃烧热（KJ/mol，定容）：1793.16 14、比热容（KJ/(kg·K)，℃，定压）：1.95 15、电导率（S/m，℃）：3×10-8 16、蒸气压（kPa，℃）：0.049 17、蒸气压（kPa，℃）：0.101 18、蒸气压（kPa，℃）：0.376
馏分油色谱模拟蒸馏方法介绍 一、馏分油色谱模拟蒸馏分析方法（ASTM D2887、SH/T 0558方法） ●适用范围 本方法适用于测定常压终馏点低于或等于550℃、蒸汽压低到能在室温下进样和沸点范围大于55℃的石油产品或馏分的馏程分布，如汽油、煤油、柴油、润滑油、蜡油等。此方法为 ASTM D2887-01a标准及行业标准SH/T 0558-95方法。 ●方法原理 色谱模拟蒸馏方法是用具有一定分离度的非极性色谱柱，在线性程序升温条件下测定已知正构烷烃混合物组分的保留时间。然后在相同的色谱条件下，将试 样按组分沸点次序分离，同时进行切片积分，获得对应的累加面积，以及相应的 保留时间。经过温度－时间的内插校正，就可以得到对应于百分收率的温度，即 馏程。其中，累加面积百分数即收率，因烃类的相对重量校正因子近似于1，故 可认为即是试样的质量百分含量[% (m/m)]。并且，根据质量百分含量，通过相 应的计算可以得到与ASTM D86方法具有可比性的体积百分含量馏程结果。 ●仪器及实验条件 (1)仪器及设备 HP 6890气相色谱仪； HP 化学工作站； HP 6890系列自动进样器。 (2)主要试剂 C5～C40正构烷烃混合标样 二硫化碳(CS2) 分析纯 (3)色谱操作条件 色谱柱： 长10m，内径0.53mm，液膜厚0.15μm，甲基硅酮弹性石英毛细管柱。 推荐的典型色谱操作条件见表1 。
表1 馏份油模拟蒸馏操作条件 实验结果 (1)基线补偿 正式进样之前，在与运行油样相同的操作条件下进行空白作业，以便对基线漂移、噪声和残存作适当扣除。基线补偿见图1。 (a)不合格基线 (b)合格基线 (c)不合格基线 图1. 基线补偿
细胞冻存的方法与步骤文件编码（GHTU-UITID-GGBKT-POIU-WUUI-8968）
细胞冻存、解冻方法与细胞计数 江苏大学附属医院风湿科李晶??????〖〗 一、细胞冷冻保存 1.材料： 生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(SigmaD-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4％（w/v）trypanblue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII) 2、冷冻保存方法： （1）传统方法:冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16～18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存。 -20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 （2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。 3、步骤： （1）冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。 （2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。 （3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。 （4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1～2ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。
二甲基亚砜化学品安全技术说明书 第一部分：化学品名称回目录 化学品中文名称：二甲基亚砜 化学品英文名称：dimethyl sulfoxide 中文名称2：二甲亚砜 英文名称2：methyl sulfoxide 技术说明书编码：2023 CAS No.：67-68-5 分子式：C2H6OS 分子量：78.13 第二部分：成分组成信息回目录 有害物成分含量CAS No. 有害物成分含量CAS No. 二甲基亚砜67-68-5 第三部分：危险性概述回目录 健康危害：吸入、摄入或经皮肤吸收后对身体有害。对眼睛、皮肤、粘膜和上呼吸道有刺激作用。可引起肺和皮肤的过敏反应。 燃爆危险：本品可燃，具刺激性，具致敏性。 第四部分：急救措施回目录 皮肤接触：脱去污染的衣着，用大量流动清水冲洗。 眼睛接触：提起眼睑，用流动清水或生理盐水冲洗。就医。 吸入：脱离现场至空气新鲜处。如呼吸困难，给输氧。就医。 食入：饮足量温水，催吐。就医。 第五部分：消防措施回目录 危险特性：遇明火、高热可燃。受热分解产生有毒的硫化物烟气。能与酰氯、三氯硅烷、三氯化磷等卤化物发生剧烈的化学反应。 有害燃烧产物：一氧化碳、二氧化碳、氧化硫。 灭火方法：消防人员须戴好防毒面具，在安全距离以外，在上风向灭火。尽可能将容器从火场移至空旷处。喷水保持火场容器冷却，直至灭火结束。处在火场中的容器若已变色或从安全泄压装置中产生声音，必须马上撤离。灭火剂：雾状水、泡沫、干粉、二氧化碳、砂土。 第六部分：泄漏应急处理回目录 应急处理：迅速撤离泄漏污染区人员至安全区，并进行隔离，严格限制出入。切断火源。建议应急处理人员戴自给正压式呼吸器，穿防毒服。尽可能切断泄漏源。防止流入下水道、排洪沟等限制性空间。小量泄漏：用砂土、蛭石或其它惰性材料吸收。也可以用大量水冲洗，洗水稀释后放入废水系统。大量泄漏：构筑围堤或挖坑收容。用泵转移至槽车或专用收集器内，回收或运至废物处理场所处置。 第七部分：操作处置与储存回目录 操作注意事项：密闭操作，全面排风。操作人员必须经过专门培训，严格遵守操作规程。建议操作人员佩戴自吸过滤式防毒面具（半面罩），戴化学安全防护
二甲基亚砜 本文由南通润丰石油化工收集整理二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，简称DMSO），是分子式为(CH3)2SO的化学物质。其为一无色液体，并为重要的极性非质子溶剂。它可与许多有机溶剂及水互溶。二甲基亚砜具有极易渗透皮肤的特殊性质，造成使用人员感觉类似牡蛎般的味道。
危险性 欧盟危险性符号 刺激性Xi
制造 二甲基亚砜是纸浆制造过程的副产物。 用途 二甲基亚砜是许多化学反应的常用溶剂，尤其在S N2烷基化反应中是极佳的溶剂：若使用氢氧化钾为硷将吲哚烷基化，能得到极高产率；亦可使用苯酚取代吲哚进行相似的反应。二甲基亚砜可与碘甲烷反应而生成锍离子，并与氢化钠反应而生成硫叶立德。因为硫氧基对其共轭硷的稳定化作用，二甲基亚砜中的甲基略具酸性（p K a=35）。 二甲基亚砜早在1867年即已发现，但在第二次世界大战之后才开始在商业上使用。除作为有机合成及工业应用(聚合物化学、制药及农业化学品)的溶剂之外，也是优良的油漆清除剂，可在短时间内去除木材和金属上的涂料。相对于许多其他油漆清除剂，如硝基甲烷及二氯甲烷，二甲基亚砜被认为是比较安全的。在有机合成中，二甲基亚砜亦可用于许多氧化反应中，例如Pfitzner-Moffatt氧化反应和斯文氧化反应。 二甲基亚砜亦用于电子工业上的清洗剂，而其重氢取代物（DMSO-d6）则是核磁共振的优良溶剂，因它可广泛溶解多种化合物，并几乎不会对样品的讯号造成影响。在低温生物学中，二
甲基亚砜则作为抗冻剂使用，并仍是用来保存器官、组织与细胞悬浮液的抗冻剂玻璃化混合物的主要成分之一。尤其在冷冻与长期储存胚胎干细胞与造血干细胞方面更为重要，通常是以10%二甲基亚砜与90%胚胎血浆的混合物冷冻。在自体骨髓移植中，二甲基亚砜与病人的造血干细胞一并重新注射入体内。另一种在生物学上重要的功能，他可以使未分化的干细胞，诱导为成熟的肌肉细胞。它也广泛应用于溶解在生化或细胞生物学实验的化学品。 二甲基亚砜使用可回溯自1963年，俄勒冈大学以Stanley Jacob为首的医学院团队发现二甲基亚砜能深入渗透但不破坏皮肤与其他皮膜，而且可携带其他物质深入生物系统中。一些人表示在接触皮肤之后，有类似洋葱或大蒜的气味产生，乃是因为二甲基亚砜被代谢作用还原为二甲基硫的关系。在医药上，二甲基亚砜最主要利用于局部止痛剂、局部药物载体、消炎药与抗氧化剂。二甲基亚砜曾被测试用于治疗极多的健康状况与疾病上。美国食品药物管理局（FDA）目前只核准二甲基亚砜用于缓和间质性膀胱炎症状的治疗。药物的专利权只有17年的期限, 数十年前便已开始使用的二甲基亚砜现在已经不可能取得专利权。由于药品公司甚少会投资在没有专利权保障的药物上，关于二甲基亚砜的药性的研究并不多。二甲基亚砜也是一种马用的药膏。 二甲基亚砜是常用的有机溶剂中，溶解能力最强的一种。它可以溶解大部份的有机物，包括碳水化合物、聚合物、肽，以及很多的无机盐和气体。它可以溶解相等于自己50-60%重量的溶质（其他一般溶剂只可以溶解10-20%），所以它在样本管理和高速药物筛检中是很重要的。 在某些条件下，当二甲基亚砜与酰氯接触时，会发生爆炸性反应。 其他极性非质子性溶剂 二甲基亚砜是重要的极性非质子性溶剂。它的毒性比其他如二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基乙酰胺（DMAC）、N-甲基吡咯烷酮（NMP）及六甲基磷酰胺（HMPA）等此类溶剂低。安全性
细胞冻存、解冻方法与细胞计数 江苏大学附属医院风湿科李晶〖返回主页〗 一、细胞冷冻保存 1、材料： 生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Sｉｇma D-2６５0）、无菌塑料冷冻保存管(Naｌgene 5０0０—00２0)、0、４％（w／ｖ)tryｐan blue(GibcoBＲL1５250-061）、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KＲYＯ10Sｅri ｅsIＩ) 2、冷冻保存方法： （１)传统方法：冷存管置于4℃１0分钟－--＞-20℃3０分钟--－>-80℃１6~18小时（或隔夜)——->液氮槽ｖaｐorphａsｅ长期储存. -20℃不可超过１小时,以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入—80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。 (２）程序降温:利用已设定程序得等速降温机以—１～-3℃／分钟之速度由室温降至（－8０℃以下）-12０℃，再放在液氮槽vａｐｏrphａｓｅ长期储存。适用于悬浮型细胞与hybｒidoｍａ之保存。 ３、步骤： （1）冷冻前2４－4８小时更换半量或全量培养基,使细胞处于指数生长期。 （2)配制冷冻保存溶液（使用前配制）：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMＳO）至20％浓度,即制成双倍得冻存液，置于室温下待用。 (3）离心收集培养之细胞，用加血清得培养基重悬起细胞,取少量细胞悬浮液(约０、1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。 （4）取与细胞悬液等量得冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管,制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×１0６cｅlls/ｍl，混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中，1~2mｌ/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测.严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。 4、注意事项: （１）欲冷冻保存之细胞应在生长良好（lｏgphase）且存活率高之状态，约为80~90%致密度。冷冻前检测细胞就是否仍保有其特有性质,例如hｙbrｉdoｍa应在冷冻保存前一至二日测试就是否有抗体之产生。
01/2008:0763 二甲亚砜（EP8.0） DIMETHYL SULFOXIDE C2H6OS Mr 78.1 [67-68-5] 【定义】 二甲亚砜(Sulfinylbismethane) 【性状】 外观：澄清液体或无色结晶，有吸湿性。 溶解性：与水和乙醇（96%）混溶。 【鉴别】 首先鉴别：C。 其次鉴别：A、B、D A 比重（参见检查项） B 折光率（参见检查项） C红外吸收光谱（附录2.2.24）。 对比：EP二甲亚砜化学对照品。 D 取样品5mL、加入50mg氯化镍（试剂），使溶解。溶液呈黄绿色。于50℃水浴中加热，溶液颜色变为绿色或淡蓝绿色，冷却。溶液颜色变回黄绿色。 【检查】 酸度溶解样品50.0g至100mL无二氧化碳的水（R），加入0.1mL的酚酞试液（R1，Phenolphthalein Solution R1 A 1.0% w/v solution of phenolphthalein in ethanol (96%).），中和，加入50g供试液。用0.1M的氢氧化钠试液滴定至粉红色，消耗的氢氧化钠试液不得过5.0 mL。 比重（附录2.2.5）：1.100~1.104。 折光率（附录2.2.6）：1.478~1.479。 凝固点（附录2.2.18）：不高于18.3℃。
吸光度（附录2.2.25）：用氮气（R）冲洗15分钟。用水（R）作为空白测定吸光度，在275nm不大于0.30，再285nm和295nm都不大于0.20。在270nm与350nm之间进行扫描待测样品，应无最大吸收。 有关物质。GC法（附录2.2.28） 内标液：溶解0.125g联苯（R）与丙酮（R）中，并用该丙酮稀释至50mL。 供试液（a）：溶解5.0g待检样品于丙酮（R），并用该试剂稀释至10.0mL。 供试液（b）：溶解5.0g待检样品于丙酮（R），加入1.0mL内标溶液，并用同一丙酮（R）稀释至10.0mL。 对照液：溶解50.0mg待检样品与50mg二甲基砜（R）于丙酮（R），加入10.0mL 内标溶液，并用同一丙酮（R）稀释至100.0mL。。 色谱柱： ——材料：玻璃； ——尺寸：长1.5m，直径4mm； ——固定相：气相色谱级硅藻土（125~180μm），经10%（m/m）聚乙二醇己二酸酯（R）固化 载气：色谱用氮气（试剂）。 流速：30.0mL/min。 温度： ——柱温:165℃； ——进样口与检测器：190℃ 检测器：FID； 进样量：1μL 记录时间：二甲亚砜保留时间的4倍。 洗脱顺序：二甲亚砜，二甲基砜，联苯， 保留时间：二甲亚砜约5分钟。 系统适应性： ——分离度：在对照液色谱图中，二甲亚砜与二甲基砜色谱峰之间的分离度不小于3； ——供试液（a）色谱图中，应无与内标物相同保留时间的色谱峰。 限度：
分析单CERTIFICATE OF ANALYSIS Product Nameroduct Name 产品名称Dimethyl Sulfoxide(DMSO) 二甲基亚砜 COA No. 分析单号码 DMSO131014 Crade 级别Pharmaceutical Grade 医药级 Batch Size 批量 22.5Tons Batch No. 批号201301013 Testing Date 检测日期 2013-10-14 Sample Source 样品来源HANSEN Date of &Package Date 生产及包装日期 2013-10-13 Package 包装225Kg PE Drums 225kg塑料桶 Expiration Date 到期日 2015-10-12 Analysis Standard 检测标准USP32 /BP2007 Standard 美国32/英国2007标准 Drum No. 桶数 100 INSPECTION ITEMS 检测项目PRODUCT INDEX 产品指标 INSPECTION RESULT 检测结果 CONCLUSON 单项判断 DMSO CONTENT二甲基亚砜含量% ≥99.90 99.96 Passed CRYSTALIZING POINT 结晶点(℃) ≥18.10 18.40 Passed ACID V ALUE酸值(mgKOH/g) ≤0.02 0.01 Passed REFRACTIVE INDEX折射率(nd20℃) 1.4780 ~1.4790 1.4786 Passed TRANSMITTANCE透光度400nm50% ≥96.096 Passed WATER CONTENT水含量% ≤0.10.1 Passed SPECIFIC GRA VITY 比重 1.095 ~ 1.101 1.100 Passed ODOUR 气味Odorless or little peculiar smell Little peculiar smell Passed UV ABSORPTION 紫外清光值275nm≤0.30 0.30 Passed 295nm/275nm≤0.45 0.45 Storage 储存Store in cool and dry place & keep away from strong light and heat. 放置于干燥阴凉处，避光避热 Conclusion: Meet the requirements 检验者Inspector： 校验者Reinspector：测试专用章 Stamp Used only inspection：
培养细胞的冷冻保存与复苏 ?概述?冻存过程 ?冷冻保存与复苏的原理?冻存结果 ?冷冻速率?讨论 ?冷冻保存温度?冻存细胞的复苏 ?复温速率?非玻璃化冻存细胞的复 苏 ?冷冻保护剂?主要材料 ?冷冻保存方法?复苏过程 ?非玻璃化冻存方法?结果 ?主要材料?讨论 ?冻存过程?玻璃化冻存细胞的复苏 ?冻存结果?主要材料 ?讨论?复苏过程 ?玻璃化冻存方法?结果 ?主要材料?讨论
? Polge等人（1949）发现了甘油对低温下贮存的细胞具有保护作用，他们仍然以精子进行研究发现，加入甘油能够大大提高贮存于-790C下精子的存活率。接下来的重大进展是Luyet（1951）与Lovelock（1953）等多位学者发现了电解质浓度对贮存细胞的损伤作用。他们的结论是，电解质浓度增大是造成贮存细胞损伤的主要原因。冷冻理论后来得到Merryman（1956）、Rey（1957）以及Smith （1961）等学者的继续和发展。 1949年至1960年这一段时间可以称为冷冻保存的“甘油时期”，这一时期对生物材料的冷冻保存一般都是以甘油作为保护剂。Lovelock（1959）等人发现了一种新的化学保护剂，这就是人们熟悉的二甲基亚砜（DMSO）。而且，用于冷冻保存的仪器也有明显的发展。目前，无论是冷冻保存理论、各种保护剂、冷冻用品和设备以及各种生物材料的保存与复苏技术都已十分成熟和完备。 返回页首 ?冷冻保存与复苏原理 在低于-700C的超低温条件下，有机体细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。水在低于零度的条件下会结冰。如果将细胞悬浮在纯水中，随着温度的降低，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶的损伤。如果将细胞悬浮在溶液中，随着温度的降低，细胞外部的水分会首先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时
二甲基亚砜 中文名称：二甲基亚砜 英文名称：dimethyl sulfoxide;DMSO 定义：一种氢键破坏剂。因其抗冻作用，可用于细胞的冻存；因其对大分子的变性作用，用于变性凝胶电泳等。 应用学科： 生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科） 以上内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide或DMSO），无色液体，重要的极性非质子溶剂。它可与许多有机溶剂及水互溶。二甲基亚砜具有极易渗透皮肤的特殊性质，造成使用人员感觉类似牡蛎般的味道。 基本资料 物性数据 毒理学数据 分子结构数据 计算化学数据 简介 性质与稳定性 贮存方法 合成方法 生产情况 中国生产情况 消费情况 存在问题及发展建议 应用 在石油加工中的应用 在合成纤维中的应用 在医药生产中的应用 在医疗中的应用 在农药、农肥中的应用 在染料中的应用 在涂料中的应用 在防冻剂中的应用 在气体分离中的应用 在合成树脂中的应用 在焦化副产中的应用 在稀有金属湿法冶炼中的应用 在电子工业中应用在有机合成中的应用在细胞冻存中的应用 基本资料
结构式 产品名称：二甲基亚砜 结构简式：(CH3)2-S-O 英文名：Dimethyl sulfoxide 别名：Dimethylsulfoxide; Methyl sulfoxide; Sulfinylbis (methane); DMSO；Me2SO 分子式：C2H6OS 分子量：78.12 CAS号：67-68-5 MDL号：MFCD00002089 EINECS号：200-664-3 RTECS号：PV6210000 BRN号：506008 PubChem号：24893703物理化学性质密度：1.1 物性数据 1．性状：无色黏稠透明油状液体或结晶体。具弱碱性，几乎无臭，稍带苦味。 2．密度（g/mL,20/4℃）：1.100 3．相对蒸汽密度（g/mL,空气=1）：2.7 4．熔点（ºC）：18.45 5．沸点（ºC,常压）：189 6．折射率（25ºC）：1.4795 7．黏度（mPa·s,25ºC）：1.1 8．闪点（ºC,开口）：95 9．燃点（ºC）：300~302 10．蒸发热（KJ/mol,25ºC）：52.92 11．熔化热（KJ/mol）：13.94 12．生成热（KJ/mol）：-197.66 13．燃烧热（KJ/mol,定容）：1793.16 14．比热容（KJ/(kg·K),25ºC,定压）：1.95 15．电导率（S/m,20ºC）：3×10-8 16．蒸气压（kPa,20ºC）：0.049 17．蒸气压（kPa,30ºC）：0.101 18．蒸气压（kPa,47.4ºC）：0.376 19．蒸气压（kPa,56.6ºC）：0.681 20．爆炸下限（%,V/V）：2.6 21．爆炸上限（%,V/V）：28.5 22．体膨胀系数（K-1）：0.00088 23．溶解性：可与水以任意比例混合，除石油醚外，可溶解一般有机溶剂。在20℃时能吸收氯化氢30%（重量）、二氧化氮30%（重量）、二氧化硫65%（重量），不溶于除乙炔外的脂肪烃化合物。对多种化合物有溶解能力。溶于水、乙二醇、丙酮、乙醚、苯、烃类氯化物、
背景知识： 细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。 原理： 细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。 主体内容（操作步骤）： 一、材料 （一）仪器 1. 净化工作台 2. 离心机 3. 恒温水浴箱 4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃） 5. 倒置相差显微镜 6. 培养箱 7. 液氮冰箱 易生物仪器库：https://www.doczj.com/doc/ed7306833.html,/yp/product-list-42.html （二）玻璃器皿 1. 吸管（弯头、直头） 2. 培养瓶 3. 玻璃瓶（250ml、100ml） 4. 废液缸 （三）塑料器皿 1. 吸头 2. 枪头 3. 胶塞 4. 移液管（10ml） 5. 15ml离心管 6. 冻存管（1～2ml） （四）其他物品 1. 微量加样枪 2. 红血球计数板 3. 记号笔 4. 医用橡皮膏 5. 移液枪 （五）试剂 1. D-Hanks液 2. 小牛血清
DMSO 二甲基亚砜 分子式：（CH3）2SO（简写DMSO） 分子量：78.13 沸点：189(760mmHg) 结晶点：18.45 比重：1.1014(20) 闪点：95 燃点：304 规格：优级品、医药级、光谱级、食品级、电子级。 性质：一种透明、无色、无臭、呈微苦味的液体，毒性极低。它是一种水溶性的化合物，能溶解绝大多数有机化合物，甚至对无机盐也能溶解。液态的二甲基亚砜能高度缔合。属极性溶剂具有很强的吸水性和对肌体的渗透性。纯品对金属无腐蚀，含水对铁、锌、铜有轻微腐蚀。性质稳定，长时间在沸点温度下加热微量分解在碱性状态下可抑制腐蚀或分解。 用途：用作农药、染料、医药中间体等有机合成溶剂；芳烃抽提、纶纺丝高分子聚合、石蜡精致、柴油精致、电子元件清洗、气体吸收、稀有金属萃取溶剂；电容器介质防冻剂、液压液原料；化学反应加速溶剂；农药、农肥医药效剂。本身具有消炎、止痛、镇静、利尿、促进伤口愈合作用；并能将溶于其中的其它药物通过皮肤涂抹渗入体内，代替口服或注射。用于治疗关节炎、皮炎、脚气、牛皮癣、扭伤、肿瘤等各种疾病。故得名“万能药”或“万能溶媒”。 储运：密闭、防晒、防水，18以下结晶。 一，DMSO 产品介绍 1)工业级-DMSO用途：主要用于无水有机化学合成反应和医药及中间体合成反应溶剂，使用该溶剂能提高化学反应速度，提高反应物的了收率，缩短反应时间，使合成反应变得更加顺利。 工业级―DMSO质量技术指标 项目指标执行标准 含量（以DMSO） % ：≥ 99．8 GB/T2307-1986 结晶点℃：≥ 18．10 GB/T7533-1993 酸值 (0.1N/ml NaOH/50g) ：≤ 0．01 GB/T9736-1988 水分%：≤ 0．1 GB/T6283----86 蒸发残渣 PPM：≤ 5. GB/T3209----82 重金属 % ：≤ 10. GB/T7532----87 包装：PE塑料桶225 kgs, 100kgs, 50kgs, 25kg 2)药用级-DMSO用途：主要用于医药及中间体合成反应溶剂，医药溶剂及药物的载体等，使用该溶剂能提
冷冻保存方法： （1）传统方法：冷存管置于4℃10分钟→ -20℃30分钟→ -80℃16～18小时（或隔夜）→液氮槽vaporphase长期储存。-20℃不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 （2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。 3、步骤： （1）冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。 （2）配制冷冻保存溶液（使用前配制）：将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5～10％，混合均匀，置于室温下待用。 （3）依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液（约0.1ml）计数细胞浓度及冻前存活率。 （4）离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。 4、注意事项： （1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好（logphase）且存活率高之状态，约为80–90％致密度。 （2）冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。 （3）注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色（以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650），以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。 这是我的实验记录，经过实践检验的，成功率很高。 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入1.5ml新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与1ml的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀
实验六Cu(II)与二甲亚砜配合物的制备与红外光谱分析 一、实验目的 1．了解配合物的制备原理及方法 2．通过红外光谱分析确定配合物中金属与配体的成键方式 二、基本原理 无水CuCl2与二甲亚砜（DMSO，(CH3)2S=O）反应合成配合物CuCl2?2DMSO，其反应式如下： . CuCl2 + 2DMSO CuCl2 2DMSO 在DMSO中，S=O键的正常红外振动频率为1050cm-1。当与金属形成配合物时，金属可通过与O或S与DMSO成键。若S用孤对电子与金属以M←S=O形式成键，则S=O双键增强，S=O键的红外振动频率大于1050cm-1；若O用孤对电子与金属以M←O=S形式成键，则S=O双键减弱，S=O键的红外振动频率小于1050cm-1，因此可以通过红外光谱分析确定配合物中金属与配体的成键方式。 三、主要仪器与药品 仪器：磁力搅拌器、锥形瓶、天平、抽滤装置、红外光谱仪 试剂：无水CuCl2、二甲亚砜、无水乙醇 四、操作步骤 1．制备配合物CuCl2?2DMSO 准确称取0.10~0.15g 范围的CuCl2于干燥的10mL锥形瓶中，放入磁搅拌子，再加入1mL无水乙醇，搅拌至全溶，再缓慢加入0.25mL DMSO，立即发生放热反应，生成绿色沉淀，继续搅拌10分钟，抽滤，以0.5mL冷无水乙醇洗涤，干燥，称量，测定熔点（156~157?C）。2．测定红外光谱 用KBr压片，在700-4000范围内记录产品的红外光谱。 五、结果与讨论 1．计算配合物的产率。 2．在测得的红外光谱图上标出主要的特征峰，确定金属Cu与配体DMSO的成键方式。六、思考题 1．写出DMSO的Lewis结构式。 2．根据硬软酸碱理论，预测当DMSO与PtCl2、SnCl4、FeCl3、AuCl结合时的成键方式。 七、参考文献 1．周怀宁主编，微型无机化学实验，科学出版社，2000，189-190。 执笔石尧成
实验十六原油的实沸点蒸馏曲线及性质曲线 一、实验目的 在对原油进行实沸点蒸馏后，要对蒸馏所得的各窄馏分进行性质测定，以全面深入了解原油的性质。 二、实验内容和要求 1. 密度 ρ20或ρ70按GB/T 1884-2000或GB/T 2540-81(88)测定。样品在测定温度时必须呈无任何固体析出的液体状态。轻馏分也可用比重瓶法，重馏分也可用比重瓶法或固体比重测定法。 2. 运动粘度 按GB/T 265-88测定。<350℃馏分测ν20或ν50，>350℃馏分测ν50或ν100。 3. 硫含量 <350℃馏分用GB/T 380-77(88)测定，>350℃馏分用GB/T 387-90法测定。 4. 凝点 按GB/T 510-83(91)测定。 5. 苯胺点 只对180～360℃的窄馏分进行测定，测定方法为GB/T 262-88。 6、折射率 在20℃或70℃测定。样品在测定温度时必须是液体，否则需要在较高温度下测定。 7. 酸度或酸值 测定方法为GB/T 258-77(88)（<350℃馏分测酸度），GB/T 7304-2000（>350℃馏分测酸值）。 8. 特性因数（K值） 对小于350℃馏分，K值可用下式计算： K = 1.216T1/3 d15.615.6 式中d15.615.6为相对密度，T为立方平均沸点，对窄馏分而言T可用实沸点馏分的中沸点（6.156.15oK）。
对大于350℃馏分，因立方平均沸点确定的准确性差，主要用50℃或100℃时运动粘度与比重指数（API），由关系曲线查得立方平均沸点T 值。 9. 粘重常数（VGC） 它一定程度上反映润滑油的粘温性质和烃类分布，石蜡基润滑油的VGC小于0.82，环烷基润滑油的VGC大于0.85。VGC按下式计算： VGC＝d15.615.6-0.24-0.038logν100 0.755-0.011 logν100 式中ν100为100℃的运动粘度。 10. 结构族组成 对于200℃～350℃馏分，用n-d-ν或n-d-M（实测值）法由图表查得。对于高沸点馏分用n-d-M法，凝点<20℃的馏分也可用VGC-交折点图表查得。 这里必须指出，n-d-M法测定结构族组成是比较公认的和最普遍的。n-d-ν法与n-d-M法所得的结果，在大多数情况下是吻合的。由于分子量测定是比较费事的，因此后来提出n-d-ν法和VGC-交折法。但n-d-ν和VGC-交折点法只适用于20℃分析的结果。 11. 相关指数（BMCI）或（CI） 相关指数与特性因数类似，在一定程度上反映了馏分的烃类特性，用下式计算： BMCI = 48640 T+ 473.7d 15.6 15.6 ? 456.8 式中：T──窄馏分用算术平均沸点，宽馏分用体积平均沸点，K。 3种常用的特性参数的意义见表16.1。 表16.1 3种常用的特性参数的意义 石油馏分特性参数值 特性参数 石蜡基中间基环烷基特性因数（K）>12.1 11.5～12.1 <11.5 相关指数（BMCI或CI）0～10（烷烃）24～52（环烷烃）55～100（单环芳烃）粘重常数（VGC）<0.82 0.82～0.85 >0.85 三、计算 1. 总产率-沸点曲线 在16cm × 32cm坐标纸上，以总馏出率为横坐标，该馏出物的沸点为纵坐标，