从环境样品中分离筛选石油 降解菌的方案
引言 随着经济技术的迅速发展，石油日渐成为我过的主要能源，且需求量日益增大。研究表明，石油生产和运输环节会对土壤造成严重污染，且污染面积不断扩大。目前，我国石油行业每年产生的含油污泥多大八十万吨。由于石油的粘度大、粘滞性强，会再短时间内形成小范围的高浓度污染，长期的石油污染还会影响土壤的通透性，减少土壤肥力，阻碍植物生长。同时，石油中所含的多环芳香烃具有“三致”效应，一些挥发组分能引起人体麻醉、窒息和化学性肺炎等疾病。因此，石油污染对土壤生态系统的平衡和人体健康都有很大的危害。 目前，针对石油污染治理的方法主要包括：物理方法、化学方法以及生物修复法，但物理方法修复费用较高，耗材较多：化学方法会使用大量化学淋洗剂，很容易造成二次污染。相较而言，微生物修复技术由于生产费用低、不产生二次污染等特点而被视为一项最具有应用前景的修复技术。而且随着分子生物学的发展，无论是DNA文库的建立，还是多态性分析方法的进步，都为污染物的生物修复提供了全新的技术支持。既然生物修复法有诸多优点，那么就应该充分发挥其特性。本文则是着眼于环境样品，分离筛选其中的石油降解菌，以扩大培养进行更大规模的石油降解。 摘要 在长期被石油污染的土壤中，微生物可逐渐改变自身的代谢条件以适应环境。即以石油烃为碳源进行生长、繁殖，同时将石油烃降解。因此在这种土壤中存在着可降解石油烃的微生物，但石油烃降解菌的筛选、分离是生物法处理石油污染的关键。从这个角度考虑，以长期石油污染的土壤中微生物为菌源，从中筛选、分离出高效的石油烃降解菌。要降解哪里的石油就用哪里的土壤培养石油降解菌。目前，国内对极端条件下石油降解微生物研究较少，尤其是对低温、耐盐的石油降解菌，中国北方的大部分湿地，盐碱程度比较高，成年气温较低。无论是来源于海上还是来源于石油化工的污染都比较严重。本文针对大连开发区因石油泄露而被污染的白石湾，就地选取材料进行石油降解菌的筛选以及分离研究。
石油烃类的微生物降解研究 石油作为重要能源之一已被世界各国广泛使用，随之而来的石油烃污染已经对人类生存的土壤及水体环境造成了严重的危害，微生物降解是一种处理石油烃污染的理想方法。综述了降解菌种类和不同烃类的微生物代谢途径，分析了包括温度、营养物、氧和pH值等环境因素对石油烃降解的影响，为进一步的研究应用提供参考依据。 随着工业和经济的发展，人类对能源的需求日渐增多，促进了石油工业的飞速发展；在石油生产、贮运、炼制加工及使用过程中，不可避免地会有石油烃类的溢出和排放，造成土壤及水体的石油污染。据统计全球每年倾注到海洋的石油总量在200~1000万t之间。辽宁省环境中心监测站的化验结果显示，在辽河油田的重度污染区内，土壤中的含油量已达到10 000 mg／kg以上，是临界值(200 mg／kg)的50多倍，严重影响了油田附近的生态环境。 石油烃类物质引起的环境污染越来越引起人们的关注。利用物理、化学方法处理石油烃可以得到较受到了限制翻。生物处理方法是近年来发展起来的，具有处理效果好、费用低、对环境影响小、无二次污染及应用范围广等优点，是迄今为止处理石油烃污染比较好的一种方法。 1.降解石油烃类的微生物种类 国外在20世纪40年代就开展了细菌降解石油烃的研究，我国这方面的研究始于20世纪70年代末期。研究表明，在土壤和水体环境中存在着大量能够降解石油烃的微生物，主要是细菌和真菌；细菌在海洋生态系统的石油烃类降解中占主导地位，而真菌则是淡水和陆地生态系统中更为重要的修复因子。石油烃降解菌和藻类见表1。
大量研究表明，当菌群处于石油污染环境中时，利用烃类化合物的微生 物数量急剧增长，尤其是含降解质粒的微生物。Atlas报道在正常环境下降解菌一般只占微生物群落的1％，而当环境受到石油污染时，降解菌比例可提高到10％。含质粒细菌在石油烃污染环境中出现的频率和数量LL-t~污染环境高，说明质粒在石油烃的降解中可能起着重要作用。降解质粒的存在为降解工程 菌的构建提供了可能。 2.石油烃类的微生物代谢途径 2.1 直链烷烃 通常认为饱和烃在微生物作用下，直链烷烃首先被氧化成醇，醇在脱氢 酶的作用下被氧化为相应的醛，然后通过醛脱氢酶的作用氧化成脂肪酸；氧 化途径有单末端氧化、双末端氧化和次末端氧化[7]。在转化为相应的脂肪酸后，一种转化形式为直接经历随后的／3一氧化序列，即形成羧基并脱落2个 碳原子；另一种转化形式为脂肪酸先经历60一羟基化形成∞一羟基脂肪酸， 然后在非专一羟基酶的参与下被氧化为二羧基酸，最后再经历一氧化序列
海洋中高效石油降解菌的筛选 楼浩 04016158
摘要 本研究利用原油为唯一碳源，采用富集培养分离的方法从象山港的表层海水和底泥混合物中筛选到两株石油降解菌株F3和F4。通过检测，两种菌株在油浓度为2000mg·L-1、温度为28℃的条件下培养七天后，降解率分别达到了48.1%和51.3%，与目前已筛选出的海洋石油降解菌相比较，F3、F4均属于降解率较高的菌株。本研究还对营养盐、原油浓度等影响F3、F4菌株生长和降解率的相关因素进行了初步探讨。结果表明：①氮、磷营养盐在较大程度上限制了F3、F4菌株对原油的降解率，是主要的限制因子。在氮磷浓度≥1.0m g·L-1时，F3菌株才能达到最大的降解效率48.1%，在氮磷浓度≥1.5m g·L-1时，F4菌株才能达到最大的降解效率57.3%。②F4菌株的降解率随原油浓度的降低而增加。在原油浓度为400mg·L-1时，F3、F4菌株的降解率分别达到57.6%和61.5%，而在油浓度为4000 mg·L-1时，F3、F4菌株的降解率仅为27.5%、11.2%，相比之下F3菌株对原油浓度的耐受能力更强。 关键词：石油降解菌；筛选；原油降解率；氮磷营养盐；原油浓度
ABSTRACT The use of oil as the sole carbon source, using enrichment culture method from the surface water and sediment which in the Xiangshan Port isolated two strains of oil degradation, Named as F3 and F4. To detect these two strains in the oil concentration was 2000mg/L, the temperature is 28℃ training seven days ,The degradation rate respectively reached 48.1% and 51.3%, compared with that which has been selected marine oil degrading bacteria, F3, F4 belong to the higher efficiency degradation of crude oil strain. The issue also conducted a preliminary test about nutrients, oil concentration and so on which Impact F3, F4 strain growth and the degradation efficiency. The results showed that: ①nitrogen and phosphorus nutrient limitation to a greater extent on the F3, F4 strains degradation efficiency , is the main limiting factor. In the concentration of nitrogen and phosphorus ≥ 1.0mg/L, F3 strain to achieve normal degradation efficiency 48.1%, the concentr ation of nitrogen and phosphorus in ≥ 1.5 mg/L, F4 strains to reach the degradation efficiency is 57.3%. ② the degradation of the F4 strain increasing when the concentration of oil reduced. in the concentration of 400 mg/L, The degradation rate of F3, F4 strains respectively reached 57.6% and 61.5%, the concentration of oil in the 4000mg/L, The degradation rate F3, F4 strains of was only 27.5%, 11.2%, but compared with F4, F3 strains better adapted to the higher concentration of oil. Key Words: Petroleum Degrading strains; Screening;Degradation of oil;nutrients of nitrogen and phosphorus; Oil concentration
文献综述 食品科学与工程 石油烃降解菌的研究 [摘要]石油烃降解菌，是一种能在油水表面上生长而降解石油的微生物，因土壤和近海中含有丰富的N、P等营养原料，所以在近海和土壤中的石油烃降解菌的密集度较高，然而，由于远海中会缺乏N、P等营养物质，所以石油降解菌的繁殖受到一定的制约。当海水一旦受到石油的污染后，降解菌就不能很快消除污染物，所以培养适应能力和降解率高的石油降解菌是解决石油污染的主要方法。 [关键词]石油污染；石油烃降解菌；石油烃（TPH），微生物 作为现代工业的关键燃料和原料，石油及其加工品广泛应用在生产和生活的各个领域，包括工业、军事、交通等各行业，但是随着石油工业的快速发展,石油同时也成为海洋环境的主要污染物.据初步统计,由于各种原因,全世界每年有约1.0×107t的石油进入海洋环境中,我国每年排入海洋的石油达1.15×105t[1]。 由于工艺水平的限制和处理技术的落后，大量含石油类的废水、废渣不可避免的被排入到生态环境中，严重了影响整个生态系统，尤其是土壤和海洋系统。虽然石油在人类社会发展提供有力的能源来源，但伴随带来的环境污染问题也日益加剧。土壤，是人类赖以生存的重要自然资源之一，要对受石油污染土壤进行完整的治理，并使它在短时间内达到可耕作的标准水平，对于保护生态环境、实现农业和工业的可持续发展具有非常重要的意义。在污染土壤的各种治理的方法中，微生物修复法对环境破坏性小而且消费低而受到人们的重视，近年来的发展尤为迅速，在一定程度上为污染土壤的修复带来技术上的更新，也为解决石油污染问题带来新的希冀。但是，从污染性质来看，即使油井关闭后，其对环境的影响仍会持续相当长的时间[2]。这些都引起了社会各界的普遍关注,近年来，从中央到地方各大主要媒体对这一问题均作了大量专题报道[3]。 一、土壤石油污染的来源 石油污染,一般指原油的初级加工产品(包括汽油、柴油等)以及各类石油的分解产物所造成的污染。在石油的开采、加工和使用的过程中，造成的石油溢出和泄漏，对环境（空气、土壤、海洋等）产生极大的负面影响。而土壤是作为物质流动和能量循环的重要环境，常常是污染物迁移、停留和积累的最终承受者。 石油污染物主要是通过五种方式进入到土壤中：⑴原油的泄漏和溢油意外引起的落地原油污染；⑵含油的矿渣、污泥和废物的堆放，导致石油向土壤渗透并向四周扩散；⑶使用含油污水灌溉农田；⑷汽车尾气的排放所产生的气态石油类污染物渗入到土壤中；⑸药剂污染，即作为各种杀虫剂、防腐剂的溶剂和乳化剂等的石油类物质随药剂使用而进入到土壤中。在这些因素中，前三个因素是引起土壤石油污染最主要的原因，造成污染的面积
云南化工Yunnan Chemical Technology Sep.2018 Vol.45，No.9 2018年9月第45卷第9期 石油是一种重要的能源，可以说是现代经济的血液。日常生活、工业生产、航天军工都需要石油作为能源和原料，是国家生存和社会发展不可或缺的战略资源。但是，与此同时石油在开采、运输、储存、加工和利用过程中的各种泄漏事故对环境造成的污染和破坏也是不可估量的，其对人类和其他生物的生存和发展也造成一定的威胁，并已成为全球范围内亟待解决的重要问题。了解石油烃污染物在自然界的生物降解转化规律，研究石油烃污染物微生物降解的技术和方法，培养可高效降解石油烃的工程菌，消除和减少石油烃在环境中的滞留，将有利于维护和创造高质量的人类生存环境。 1 石油烃降解菌的降解机理 微生物对石油中不同烃类化合物的代谢途径和机理是不同的。饱和烃包括正构烷烃、支链烷烃和环烷烃。通常认为，在微生物作用下，直链烷烃首先被氧化成醇，源于烷烃的醇在醇脱氢酶的作用下被氧化为相应的醛，醛则通过醛脱氢酶的作用氧化成脂肪酸。相同条件下，一般微生物对不同种类石油烃降解的倾向先后顺序是不同的。一般而言，石油烃被微生物降解的先后规律为：直链烷烃>支链烷烃>环烷烃>多环芳烃>杂环芳烃。在某石油烃降解菌修复不同碳链石油烃污染的研究中得出结论，该菌属对短链石油烃的分解率相对较高，而对芳香烃和润滑油组分的降解率较短链石油烃低。一般微生物降解正烷烃由氧化酶酶促进行。正烷烃第一步氧化为醇后，醇氧化成醛，醛再转化为相应脂肪酸，脂肪酸经 β-氧化为乙酰辅酶A，乙酰辅酶A进入三羧酸循环，分解成CO2和H2O，或进入其他生化过程。另外，链状烷烃可经脱氢步骤转变为烯烃，烯经氧化成为醇，然后醇可转化为醛，最后醛变为脂肪酸；链状烷烃还可通过直接氧化成烷基过氧化氢，然后经脂肪酸途径进行降解。有的可通过亚末端氧化成仲醇，再变成伯醇或脂肪酸进行氧化分解。还有些微生物可将烯烃变为不饱和脂肪酸，通过双键位移或甲基化等，变为支链脂肪酸，再进行降解。 2 石油烃降解菌的种类 2.1 普通石油烃降解菌 在受石油污染的土壤和水环境中存在许多能降解石油烃的微生物，细菌、放线菌、真菌、酵母、霉菌和藻类中均有能降解石油烃的微生物，据研究表明目前发现100余属、200多种石油烃降解微生物。不同种类的微生物对石油烃的降解能力不同，通常细菌比真菌、放线菌对原油的降解能力强。细菌中降解石油烃的主要有无色杆菌属、假单胞菌属、不动杆菌属、产碱杆菌属、黄杆菌属、芽孢杆菌属、诺卡氏菌属以及微球菌属等。 2.2 特殊石油烃降解菌 2.2.1 低温石油烃降解菌 低温微生物在地球上广泛存在，一般分布于南北极、海洋深底、高原冰川以及冻土地区等低温环境中。目前发现的低温微生物种类繁多，通常为真细菌、酵母菌、蓝细菌、单细胞藻类等，这些微生物正逐渐引起科学家的广泛重视[1]。随着石油污染问题日益突出和国内外对低温石油烃降解菌研究的深入，低温石油烃降解菌修复 doi：10.3969/j.issn.1004-275X.2018.09.081 微生物对石油烃的降解机理研究 李 洲 （西安石油大学，陕西 西安 710065） 摘 要：随着工业和经济的发展，环境问题成为人们普遍关注的焦点，石油污染成了不可忽视的问题。微生物修复作为一种新型环保的生物修复技术，已成为石油污染生物修复的核心技术。对石油降解微生物的种类即细菌、蓝藻、真菌以及藻类进行了总结，对微生物对石油烃的降解途径与降解机理进行了综述。 关键词：微生物；石油烃；降解机理 中图分类号：X74 文献标识码：A 文章编号：1004-275X（2018）09-179-02 Study on the mechanism of microbial degradation of petroleum hydrocarbons Li Zhou （Xi’an Petroleum University，Xi’an 710065，China） Abstract：With the development of industry and economy，environmental problems have become the focus of attention，and oil pollution has become a problem that can not be ignored.As a new environmental protection bioremediation technology，microbial remediation has become the core technology of bioremediation of petroleum pollution.The types of petroleum-degrading microorganisms such as bacteria，cyanobacteria，fungi and algae were summarized.The pathways and mechanisms of petroleum hydrocarbon degradation by microorganisms were reviewed. Key wordss：microorganism；petroleum hydrocarbon；degradation mechanism；research ·179·
一前言 石油给人们带来巨大的利用价值和经济利益的同时,也对生态环境造成了巨大的威胁。在勘察、开采、运输以及储存过程中,油田周围大面积的受到严重污染。石油污染使得土壤理化性质发生改变,从而不利于农作物正常生长，石油类物质还通过地下水的污染以及污染的转移构成对人类生存环境多个层面上的不良胁迫。因此,治理石油污染具有重要意义。当今世界，治理石油污染具体措施中最安全、最环保、最经济的方法是生物修复技术，石油降解菌是一类具有分解矿化石油烃能力的微生物，在石油污染的生物修复中具有重要作用。本文就石油污染物生物降解方面的研究进行了综述及展望。
二本论 2．1 石油降解和菌的种类和分离 2．1．1石油降解和菌的种类 国外在20世纪40年代就开展了细菌降解油污的研究[1]，我国这方面的研究始于20世纪70年代末期[2]。已知降解石油的微生物共有70属200余种。细菌有28个属，霉菌30个属，酵母12个属。能够降解石油烃的细菌有假单胞菌属（Pseudomonas)、弧菌属（Vibrio）、不动杆菌属（Acinetobacter）、黄杆菌属（Flavobacterium）、气单胞菌属（Aeromonas）、无色杆菌属（Achromobacter）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae)、棒杆菌属（Coryhebacterium）、节杆菌属（Arthrobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、微球菌属（Micrococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、诺卡氏菌属（Nocardia）等；酵母菌有假丝酵母属（Candida）、红酵母菌属（Rhodotorula）、毕赤氏酵母菌属（Pichia）等；霉菌有青霉属（Penicillium）、曲霉属（Apergillus）、镰孢霉属（Fusarium）等[3]。 2．1．2 石油降解和菌的分离 石油降解菌一般从受石油污染的土壤、水中进行分离并筛选，为了进一步的应用，还要进行驯化。根据研究目的与要求不同，在筛选时往往控制不同的条件从而得到不同功能的菌落。以烷烃为底物筛选出的菌落，对烷烃的去除效率会较高，由于烷烃相对于芳烃较易分解，且大部分的石油降解菌对烷烃的降解效果均较好，因此专门以烷烃为底物进行的研究不多见，郑金秀[4]以烷烃为底物培养出分属于不同菌属的菌落，其中不动细菌菌属的菌株降解率为69%，芽孢杆菌属的菌株降解率为71%，假单胞菌属的降解率可达73%；以环烷烃为底物，得到不动细菌菌属与芽孢杆菌属的菌株，石油降解率均为67%。两种底物研究降解时间均为48h。由于芳香烃及多环芳烃降解难度大，且其危害比较大，对降解芳烃的研究比较多。 2．2 石油降解菌的降解机理与影响因素 2．2．1石油降解菌的降解机理 微生物对石油的降解作用存在选择性,优先消耗碳链长度中等(C10—C24)的n-链烷烃类分子，其规律为:小于C10的直链烷烃>C10—C24或更长的直链烷烃>单环芳烃>环烷烃>多环芳烃,同种类型的烃类中分子量越大,降解越慢[5]。 通常认为饱和烃在微生物作用下，直链烷烃首先被氧化成醇，醇在脱氢酶的作用下被氧化为相应的醛，然后通过醛脱氢酶的作用氧化成脂肪酸；氧化途径有单末端氧化、双末
开题报告 食品科学与工程 石油烃降解菌的筛选 一、综述本课题国内外研究动态，说明选题的依据和意义 目前，常有有关石油及其产品的微生物降解方面的研究报道，但对这些研究大多数以分离鉴定微生物种类为主，对混合菌株性能评价以及它们对高含油量的油泥降解研究很少。 作为现代社会的最主要动力燃料与化工原料，石油及其产品广泛应用于生产和生活的各个方面，包括工业、农业、军事、交通运输等各个行业，因此人们将石油称作“黑色的金子”。但是随着石油工业的发展，由于工艺水平和处理技术的限制，在许多环境特别是海洋环境中，石油污染已经成为一个普遍而严重的问题，石油的主要成分是烃类，在一个典型的石油样品中，含有的烃类可达200~300种之多，石油进入海洋后，石油中的一些成分可直接挥发而进入空气；一小部分海洋表面的石油受到紫外线作用可发生光化学分解，但速度极慢；而绝大部分石油要通过微生物的降解作用才得到净化。石油烃降解菌是一类能在油水界面上生长繁殖而降解石油的微生物，在近海、海湾等处，因海水中含有丰富的N、P等营养物质，石油降解菌的数量较多，然而，由于外洋海水中N、P等营养组织的缺乏，石油降解菌的繁殖受到制约，一旦污染，不容易很快消除，所以培养石油降解菌成为治理海上石油污染的主要方式。 而且在污染土壤的各种治理方法中，微生物修复由于具有费用低、处理效果好并且对环境破坏性小等诸多优点而受到人们的重视。所以筛选和培养石油烃降解菌对减轻石油污染是一个非常有意义的事情。 二、研究的基本内容，拟解决的主要问题： 1、降解石油烃的菌类哪些比较常见 2、石油烃降解菌降解石油的情况是怎样，会不会对环境产生二次污染 3、石油烃降解菌降解石油的能力会受环境的哪些因素影响 三、研究步骤、方法及措施： 1.用牛肉膏蛋白胨培养基进行菌种分离纯化与斜面保藏。