编号：20095111003 贵阳中医学院GUIYANG COLLEGE OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE 毕业论文
题目:喙荚云实枝叶提取物对肝癌细
胞增殖的体外抑制作用研究
系（部）: 药学系
专业: 中药学
姓名: 林真欣
年级： 09 级
指导教师: 黄勇其
完成时间: 2013 年 01 月 20 日
贵阳中医学院本科毕业论文
诚信责任书
本人郑重声明：本人所呈交的毕业论文，是在导师的指导下独立进行研究所完成。毕业论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果、数据、观点等，均已明确注明出处。
特此声明。
论文（设计）作者签名：
日期：2013年01月20号
目录
摘要 (1)
Abstract (2)
前言 (3)
综述部分 (4)
1植物基原 (4)
1.1喙荚云实来源 (4)
1.2喙荚云实形态 (4)
2喙荚云实的化学成分 (5)
2.1 (5)
2.2 (5)
2.3 (5)
3喙荚云实的相关药理作用 (6)
3.1 抗病毒活性 (6)
3.1.1 抗Para 3病毒 (6)
3.1.2 抗流感病毒活性 (6)
3.2 抗肿瘤（癌）活性 (6)
3.3 抑菌活性 (6)
3.4 保肝作用 (6)
4小结 (6)
实验部分 (7)
第一部分：实验样品的提取分离 (7)
1．药用云实属植物喙荚云实的采集与鉴定...。.. (7)
1.1喙荚云实的采集 (7)
1.2喙荚云实的鉴定 (7)
2药材的提取分离实验仪器与试剂 (7)
2.1 仪器 (7)
2.2 试剂 (8)
3提取分离技术路线 (9)
4药材的提取 (10)
4.1 样品前处理 (10)
4.2 醇提物的制备 (10)
4.3 水提物的制备 (10)
5分部位萃取 (11)
5.1 石油醚部位的萃取 (11)
5.2 乙酸乙酯部位的萃取 (11)
5.3 正丁醇部位的萃取 (11)
5.4 萃取后剩余部位的制备 (12)
5.5 回收率统计 (12)
第二部分：喙荚云实枝叶的肿瘤增殖抑制作用的体外试验.. 13 1．实验材料 (13)
1.1 实验动物 (13)
1.2 实验瘤株 (13)
1.3实验仪器 (13)
1.4 实验试剂 (13)
2．实验方法 (14)
2.1 MTT法测定药物直接作用人肝癌细胞 (14)
2.1.1 实验样品 (14)
2.1.2 实验步骤 (14)
2.1.3 统计方法 (14)
2.2 MTT法测石油醚部位对人肝癌细胞作用强度 ..14
2.2.1 实验样品 (14)
2.2.2 实验步骤 (15)
2.3 腹腔注射（ip）给药的含药血清作用（MTT法） (15)
2.3.1 含药血清制备 (15)
2.3.2 实验步骤 (16)
2.4 灌胃（ig）给药的含药血清作用（MTT法） (16)
2.4.1 含药血清制备 (16)
2.4.2 实验步骤 (16)
3．实验结果 (18)
4. 讨论 (20)
4.1 实验样品的提取分离 (20)
4.1.1 样品的采集 (20)
4.1.2 样品的提取 (20)
4.1.3 萃取前处理 (21)
4.2 喙荚云实的肿瘤增殖抑制作用的体外试验 (21)
4.2.1 实验样品的制备 (21)
4.2.2 MTT法测定药物直接作用人肝癌细胞 (21)
4.2.3 MTT法测石油醚部位对人肝癌细胞（HuH-7）作用强度. 21
4.2.4 (21)
4.2.5腹腔注射（ip）给药的含药血清作用（MTT法） (22)
4.2.6灌胃（ig）给药的含药血清作用（MTT法） (22)
4.2.7 (22)
参考文献 (23)
致谢 (24)
附录 (25)
喙荚云实枝叶提取物对肝癌细胞增殖的体外抑制作用研究
摘要
目的：观察喙荚云实枝叶提取物对人肝癌细胞（HuH-7）和小鼠肝癌细胞（Hepa1-6）的增殖抑制作用及IC50。方法：用溶剂法对喙荚云实枝叶进行不同极性部位提取，用MTT法筛选抑制肝癌细胞的活性部位及测定IC50。ig、ip给药制作大白鼠含药血清并观察其对Hepa1-6细胞增殖作用的影响。结果：喙荚云实枝叶石油醚部位提取物在浓度为100μg/ml或20μg/ml时对HuH-7有明显抑制作用及IC50为58.90μg/ml。以0.4g/kg对大白鼠ip给药，含药血清对Hepa1-6有明显的抑制作用但效果较弱（抑制率为32.0%）。以2g/kg对大白鼠ig给药，含药血清对Hepa1-6无作用。结论：喙荚云实枝叶提取物的有效部位为石油醚部位，但作用较弱。ig给药生物利用度较低。
[关键词]喙荚云实枝叶；提取物；含药血清；抑制作用；肝癌细胞；
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Beak pod pharmacological effects of Caesalpinia
Abstract
Objective:Observed beak pod Caesalpinia foliage extract on human hepatoma cell (HuH-7) and mouse hepatoma cells (Hepa1-6) inhibited the proliferation and IC50. Methods:Pod Caesalpinia branches and leaves beak polar fractions using solvent extraction, screening inhibition of the active site of liver cancer cells by MTT assay and determination of IC50 of. ig、ip administration produced rat serum containing and observe its Hepa1-6 cell proliferation. Results:Beak pod Caesalpinia foliage petroleum ether extract at a concentration of 100ug/ml or 20μg/ml HuH-7 there are the obvious inhibition and IC5058.90μg/ml. The 0.4g/kg pair of rats administered ip, containing serum on Hepa1-6 significantly inhibited but weaker effect (inhibition rate of 32.0%). ig administration to 2g/kg rats, serum containing no role Hepa1-6. Conclusion:Beak pod Caesalpinia foliage petroleum ether extract effective parts, but the effect is weak. the ig administration bioavailability called low.
Key words：Beaked pod Caesalpinia foliage; Extracts; Containing serum; Inhibition;Hepatoma cells;
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前言
喙荚云实为豆科云实属植物Caesalpinia minax Harce.。现代研究表明，喙荚云实中含有萜类、黄酮类、脂肪酸类等多种化学成分。具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、保肝等药理作用。我们对喙荚云实枝叶进行提取，且用不同极性溶剂对提取液萃取，得到不同极性的化学部位，并进行体外抗癌活性筛选。
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综述部分
喙荚云实的研究概况
1 植物基原
1.1喙荚云实来源
喙荚云实C. minax Harce.：分布于华南及西南, 生于海拔400~1500m 的山沟、溪旁、灌丛及路边。分布区的土壤类型多为黄壤、黄红壤、黄棕壤、红壤, 主要分布区的植被类型为落叶-常绿阔叶混交林及常绿、落叶灌丛[3]。种子、根人药；具清热解毒，散瘀止痛，风湿骨痛，跌打损伤等功效。
1.2喙荚云实形态
喙荚云实：藤本；各部被短柔毛，有钩刺。托叶锥状。二回羽状复叶，长45厘米，叶轴具钩刺，被短柔毛，羽片5—8对，小叶6—12对，对生，长圆形或椭圆形，长2.5—4厘米，宽1—1.8厘米，先端圆钝或急尖，有细尖，基部圆形，微偏斜，两面沿中脉有短柔毛，小叶柄长约1毫米。总状或圆锥花序顶生，长20—40厘米，花序轴有刺，被绒毛，多花；苞片卵状披针形，长1.5—2.5厘米，宽5—7毫米，先端短渐尖，早落；花梗长1.6—3.5厘米，先端具关节；被短柔毛；萼筒倒锥形，长7毫米，被黄色绒毛，萼片不等大，长圆形，长15—18毫米，宽约10毫米，两面有黄色绒毛，下方1片稍长，风帽状；花瓣5，白色，有紫色斑点，不等大，倒卵形，长约18毫米，宽12毫米，先端钝圆，外面及边缘有柔毛，上方1片较短；雄蕊10，较花瓣稍短，花丝下半部密被长柔毛；子房近无柄，密生细刺，花柱比雄蕊稍长，无毛。荚果长圆形，长10—15厘米，宽4—5厘米，先端圆，有长5—25毫米的喙，稍扁，果瓣密生棕色针状刺。种子4—8粒，椭圆形，似莲子，长18毫米，宽10毫米，铅灰色，一端稍凹，有
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环纹。花期4—5月，果期7—9月。
2 喙荚云实的化学成分
2.1 吴兆华等[4]从体积分数为95% 的乙醇溶液提取物中的化学成分进行了系统研究。通过硅胶柱色谱、凝胶柱色谱和重结晶等方法从中分离得到了7 个化合物, 根据其波谱数据并结合文献, 确定了这7 个化合物的结构, 分别鉴定为β-amy rin(1) 、Caf feine(2) 、Caesalmin C(3) 、Caesalmin D(4) 、Caesalpin F(5) 、β-谷甾醇(β- sitosterol, 6) 、胡萝卜苷( Daucosterol,7)。然后吴兆华等研究，从喙荚云实95%乙醇回流提取物中通过硅胶和凝胶等柱色谱以及重结晶等方法分离得到的1个化合物,根据其波谱数据并结合文献报道,确定了化合物的结构,为一新的呋喃二萜类化合物,命名为neocaesalp in L1 (1) [5]和另一个新的呋喃二萜类化合物，命名为喙荚云实星A (m inax in A ) [6]。
2.2 黄明堦等人通过喙荚云实种皮黄酮提取物溶解性试验、显色反应以及产品在不同诊断试剂中的紫外－可见吸收光谱等特征判断其基本构型，确定喙荚云实种皮中含有具有A-环邻位二羟基（6，7或7，8-）的二氢黄酮或二氢黄酮醇苷类化合物[7]。
2.3 袁经权等[8] 通过石油醚常温渗滤提取方法和甲酯衍生华技术，采用GC-MS联用分析手段对喙荚云实的脂肪酸甲酯化产物及挥发油成分进行了分离鉴定，共检出174个色谱峰，鉴定出其中的63个化合物。结果显示不饱和脂肪酸类化合物是喙荚云实油脂的主要化学成分。
3 喙荚云实的相关药理作用
3.1 抗病毒活性
3.1.1 抗Para 3 病毒：有研究表明,喙荚云实的体积分数为95 %的乙醇提取物有抗Para 3 病毒的活性,而其抗病毒作用的活性物质主要为二萜类化合物[9]。
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3.1.2 抗流感病毒活性：苦石莲（喙荚云实种仁）的乙酸乙酯萃取物和caesalmin C对流感甲型病毒活性的抑制作用最强[10]。
3.2 抗肿瘤（癌）活性
余旭亚等[11－12]最早从喙荚云实中分离提纯出相对分子重量为19800的南蛇簕蛋白（CMP）。当CMP浓度为22.0μg/ml时，CMP可抑制黑色素瘤细胞增殖60%（P<0.05），抑制率为96%（P<0.05），表明CMP对黑色素瘤细胞K17535M2的增殖具有抑制作用。
3.3 抑菌活性
喙荚云实95%乙醇提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和镰刀菌有抑制作用，尤其对绿脓杆菌的抑菌效果较好，最低抑菌浓度（MIC）为0.25%，最低杀菌浓度（MBC）为0.5%[13]。
3.4 保肝作用
刘明等[14]研究了喙荚云实60%乙醇提取物对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的保护作用。结果表明，喙荚云实个剂量均能对抗四氯化碳引起的急性肝损伤小鼠血清ALT（谷丙转氨酶）、AST（谷草转氨酶）及肝脏系数升高，且这些作用均呈剂量依赖性，但具体护肝作用机理尚不清楚。
4.小结
综上所述，目前喙荚云实的开发利用尚处于起步阶段。喙荚云实中含有萜类、黄酮类、脂肪酸类等多种化学成分。具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、保肝等药理作用。在抗癌方面，我认为有进一步的研究价值和较好的发展前景。
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实验部分
第一部分：实验样品的提取分离
1．药用云实属植物喙荚云实的采集与鉴定
1.1喙荚云实的采集
喙荚云实采自贵州省册亨县，采回的药材经由贵阳中医学院药学系何顺志教授鉴定为豆科云实属喙荚云实（C.minax）。
1.2喙荚云实的鉴定
喙荚云实 C.minaxHanc荚果革质，长椭圆形，膨胀，不开裂，长10cm～14cm，宽4cm～4.5cm，顶端有喙，表面棕褐色，密生针状刺，味微苦甜，种子4～8颗，椭圆形，长1.7cm～1.8cm，宽0.9cm～1.1cm，黑褐色，表面有环状纹，味苦涩。
2．药材的提取分离实验仪器与试剂
2.1仪器：BüCHI旋转蒸发仪：R-215瑞士步琪有限公司
BüCHI水浴锅Hearting Bath:B-491瑞士步琪有限公司
循环水真空泵：SHZ-D（Ⅲ）巩义市予华仪器责任有限公司
超声清洗仪：SG8200HPT 上海冠特超声仪器有限公司
电子调温电热套：98-1-B 10000ml 天津泰斯特仪器有限公司
真空干燥箱：DZ-2BCⅡ天津泰斯特仪器有限公司
长颈圆底烧瓶蜀牛GG-17 10000ml 1个；抽滤瓶10000ml 1个；布氏漏斗1个；分液漏斗3000ml 4个；圆底烧瓶2000ml 2个；80cm冷凝管1个；蒸发皿若干
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2.2试剂：乙醇（EtOH）：实用酒精
石油醚（Pe）：AR分析纯，沸点60℃-90℃，批号：20121019，成都市科龙化工试剂厂
乙酸乙酯（AcOET）：AR分析纯，成都市科龙化工试剂厂，批号：20120312 正丁醇（n-BuOH）：AR分析纯，成都市科龙化工试剂厂，批号：20110826 甲醇（MeOH）：AR分析纯，天津市瑞金特化学品有限公司，批号：20110613
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3. 提取分离技术路线
药材粉碎后制成粗粉
合并3次提 取液醇提取物
一半挥干后制成
干浸膏① 一半挥去溶液中乙醇后用于萃取
残留药渣挥干
用蒸馏水提取残留药渣3次
合并3次水提液，挥干制成
浸膏⑥
用75%EtOH 提 取3次，每次2h
Pe 萃取
萃取后水溶液用AcOET 继续萃取
合并Pe 萃取层溶液挥干后得浸膏②
合并正丁醇萃取层溶液挥干后得浸膏④
合并AcOET 萃取层溶液挥干后得浸膏③
萃取后水溶液用正丁醇继续萃取
萃取后的水溶液挥干后得浸膏⑤
4.喙荚云实枝叶的提取
4.1样品前处理
将采集来的喙荚云实枝叶直接阴干；阴干后的药材分别粉碎，为方便实验中的热回流提取，粉碎时至粗粉即可，粒度过细有可能会导致回流提取时过滤的不便，甚至有可能在提取时出现糊化现象，然后保存，备用。
4.2 醇提物的制备称取1000g喙荚云实的枝叶，用75%乙醇5000ml提取，沸腾后计时，提取时间2h，将药液滤出，药材残渣继续加乙醇提取，如此反复3次，将3次提取的的提取液合并后回收乙醇，残渣阴干后备用，得膏率见表1.1。
表1.1醇提物浸膏得膏率
名称代号药材用量（g）浸膏重量（g）得膏率（%）
喙荚云实枝叶醇提物CBL.E 1000 133.0 13.3将3次回流提取得到的提取液合并后用旋转蒸发仪回收提取液中的乙醇，接收瓶内的乙醇可重复使用，回收瓶中的溶液转入至蒸发皿内，置于水浴锅上蒸干，蒸干后放入真空干燥箱真空干燥，得到的干浸膏用密封袋保存于玻璃干燥器中，备用。
4.3 水提物的制备经过乙醇热回流提取后的药材残渣阴干后先用药材量12倍的蒸馏水浸泡2小时，然后用电热套加热2小时，过滤，滤渣继续加热提取1小时，蒸馏水用量为药材8倍，同样过滤后再次加热提取0.5小时，蒸馏水用量为药材的6倍；合并3次的滤液，浓缩至适量后转入蒸发皿中挥干，与醇提物一样挥干后放入真空干燥箱内真空干燥，密封袋保存置于玻璃干燥器内备用，所得浸膏得膏率见表1.2。
表1.2 水提物浸膏得膏率
名称代号药材用量（g）浸膏重量（g）得膏率（%）喙荚云实枝叶水提物CBL.W 1000 42.6 4.26
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5.分部位萃取同4.2方法另外称取适量喙荚云实枝叶的药材粗粉，用75%乙醇提取，药材量与乙醇用量认为1：5，合并3次的提取液，用旋转蒸发仪回收提取液中的乙醇，回收瓶中的溶液转入蒸发皿内置于在水浴锅上挥发，待残存的乙醇挥干后加蒸馏水至3000ml，分成2份，各1500ml并转入3000ml分液漏斗中进行萃取，基于相似相容的萃取原理，萃取所用的试剂极性不同，本实验采用一般萃取规则由小极性到大极性依次萃取，从而可以将总提物中的各个极性部位分离出来。
5.1石油醚部位的萃取将已制备好的滤液转移至分液漏斗中，分液漏斗须得洗净后用适量真空油脂涂抹在活塞处，以防止漏液，按1:1的比例量取石油醚进行萃取；加入石油醚萃取时要充分振摇，振摇3次后静置待其分层，极性较小的一些脂溶性成分通过振摇后会充分溶于石油醚中，而水溶液及水溶液中的大极性物质因为跟石油醚不相容而产生分层，且位于下层，故而从分液漏斗下面放出水溶液，再从上面倒出石油醚萃取液，多次萃取直至石油醚萃取层至无色时合并石油醚萃取层，通过用旋转蒸发仪回收石油醚后，将回收瓶中的萃取液转入蒸发皿中置于水浴锅上挥干，挥干后放入真空干燥箱内真空干燥，密封袋保存于玻璃干燥器中备用。
5.2乙酸乙酯部位的萃取石油醚部位萃取完全后将水溶液转置于大烧杯中水浴加热，挥发掉残余的石油醚，待挥发完全后按1:1的比例量取乙酸乙酯进行萃取，分液漏斗同样要洗净并涂有真空油脂于活塞上，萃取步骤与石油醚萃取相同，多次重复直至萃取层溶液为无色，萃取液回收后合并挥干，挥干后放入真空干燥箱内真空干燥制成干浸膏，密封保存于干燥器内，备用。
5.3 正丁醇部位的萃取乙酸乙酯萃取完全后同样水浴锅挥干残余的乙酸乙酯，转入分液漏斗中后按1:1的比例量取正丁醇多次萃取直至萃取成无色，步骤与石油醚部位萃取相同，萃取完全后将萃取液回收并挥干放入真空干燥箱内真空干燥制成干浸膏，密闭保存备用。
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5.4 萃取后剩余部位的制备正丁醇萃取完成后的剩余部位转至蒸发皿中并置于水浴锅上浓缩，待全部水分蒸干后放进真空干燥箱内干燥制成干浸膏，最后密闭保存。
5.5回收率统计
整个萃取过程中所得到的浸膏须得称重后计算萃取率，并记录，见表1.3
表1.3 分部位浸膏萃取率
名称代号生药材重量（g）萃取率(%) 喙荚云实枝叶石油醚部位CBL.P 500 16.04
喙荚云实枝叶乙酸乙酯部位CBL.A 500 8.52
喙荚云实枝叶正丁醇部位CBL.N 500 15.04
喙荚云实枝叶萃取后剩余部位CBL.S 500 19.05
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第二部分：喙荚云实枝叶的肿瘤增殖抑制作用的体外试验1. 实验材料
1.1实验动物：大白鼠（Wistar），雌雄各半，体重180-200g，第三军医大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXU(渝)2007-0005；自由进食与饮水。1.2 实验瘤株：人肝癌细胞（HuH-7）及小鼠肝癌细胞（Hepa1-6）：中科院上海细胞库提供。
1.3 实验仪器
超净工作台：型号：BHC-1300ⅡA2，厂家：苏州安泰
二氧化碳培养箱：型号：MCO-175，厂家：日本三洋
倒置显微镜：型号：CKX-41，厂家：OLYMPUS;
8联排移液器：型号：BRAND ，厂家：普立德
1000μl、200μl移液器：型号：EPPENDORF
96孔板：厂家：广州洁特
酶标仪：型号：2S-3型，厂家：北京新风机电
1.4 实验试剂
培养基(DMEM/HIGH GLUCOSE)：厂家：Hyclone ，批号：NXKO731
胎牛血清：厂家：Hyclone ，批号：NXCO582
胰蛋白酶：厂家：Hyclone ，批号：SH30042.01
MTT（噻唑蓝）：厂家：Amresco 北京索莱宝公司分装，批号：012013
二甲基亚砜（DMSO）：厂家：天津科密欧公司，批号：2012062
一级食用菜籽油：厂家：道道全重庆粮油有限公司，批号：2012.10.24
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2. 实验方法
2.1 MTT法测定药物直接作用人肝癌细胞
2.1.1实验样品:将CBL.P、CBL.A、CBL.N用二甲基亚砜（DMSO）溶解，配至浓度为1%，另外将CBL.S、CBL.W用生理盐水（NS）溶解，浓度为1%。2.1.2 实验步骤:将人肝癌细胞（HuH-7）常规传代培养至对数生长期，用0.25%胰蛋白酶消化处理，以含10%胎牛血清的新鲜培养基配制成浓度约为1×105的细胞悬浮液，紧接着将其接种在96孔培养板中，每孔接种200μl，于37℃下含5%CO2饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养24小时，抽弃培养基。
设空白对照组，药物干预组及调零组；CBL.P、CBL.A、CBL.N样品的空白对照组加1%DMSO，CBL.S、CBL.W样品的空白对照组加生理盐水（NS）；药物干预组加入不同浓度的供试液；调零组则不加人肝癌细胞（HuH-7）；同样于37℃下二氧化碳培养箱中培养，48小时后，抽弃上清液，用培养液洗3次以去除药液，每孔加50μl浓度为5mg/ml的MTT无血清培养基，37℃培养4小时，小心抽弃上清液，加150μl二甲基亚砜（DMSO），摇床振荡10min，用酶标仪测570nm下光密度（OD）值，并按公式：抑制率（％）＝（对照组OD值均值－样品组OD值均值）／对照组OD值均值×100％求其抑制率，设3个剂量，每个剂量平行3个复孔，实验重复2次。用2.1.3 统计方法处理2次实验数据，样品CBL.P、CBL.A、CBL.N与1％DMSO比较，样品CBL.S、CBL.W与NS比较。实验结果见表2.1。
2.1.3统计方法
所有数据均采取统计学软件SPSSV16.0进行统计学处理分析，各项指标结果采用 (X±S)表示。组间数据比较：若符合正态分布，采用完全随机设计资料单因素方差分析两两样本比较，其中方差齐性者采用LSD法检验，方差不齐者采用Dunnett's 法检验。本实验处理数据均用此统计方法。
2.2 MTT法测石油醚部位对人肝癌细胞（HuH-7）作用强度
2.2.1 实验样品:根据初筛实验的结果可知，喙荚云实枝叶石油醚部位为有效活
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HuH-7 人肝癌细胞 Catalogue No.: C165 Product Format: a T25 flask Culture Properties：贴壁 Complete Growth Medium:89%H-DMEM+10%FBS+1%双抗 Atmosphere: air, 95%; carbon dioxide (CO2), 5% Application:Cells and cancer research NOTE: FOR RESEARCH USE ONLY. Components Operation steps for cell culture 1.吸走用于培养基，加入3-5mL PBS后轻轻晃动培养瓶润洗细胞； 2.吸干净PBS后加入1mL 0.25%胰酶-0.53mM EDTA，轻轻摇晃培养皿使胰酶 浸没细胞表面，培养瓶放37度培养箱消化； （细胞对于消化比较敏感，消化过度会严重影响细胞状态，导致细胞传代死亡漂浮或者传代后不长。细胞消化到细胞间隙变大但未脱落，可以轻轻吹下时即可终止，禁止消化到细胞完全漂浮。混匀细胞时尽量轻柔，不要吹出大量气泡。） 3.加入6-8ml完全培养基终止消化，轻轻吹下细胞混匀； 4.将混匀的细胞1000rpm（约150g）离心3min，弃上清，再用新鲜培养基 重悬37度培养箱继续培养； 传代比例: 不同细胞生长速度不一，具体传代比例视细胞生长速度而定，大部分细胞适用1:3-1:4传代，生长较慢的细胞可以1:2传代。 Cell cryopreservation 1.冻存液：92%完全培养基+8%DMSO（可以根据实验室条件自行选择） 2.降温步骤：4度10min，-20度2h，-80过夜后液氮保存。
［文章编号］ １６７１－５８７Ⅹ（２０１２）０３－０４３８－ ０５［收稿日期］ ２０１１－０４－ １６［基金项目］ 国家自然科学基金面上项目资助课题（ＮＳＦＣ ３０９７２９１４）；广东省科技计划项目资助课题（２００９Ｂ０６０７０００２４）；广东省自然科学基金面上项目资助课题（１０１５１００８９０１０００２０８ ）；中山大学高校基本科研业务费重大项目培育基金资助课题（１０ｙｋｊ ｃ０３）［作者简介］ 汪田甜（１９８３－） ，女，安徽省明光市人，医师，医学硕士，主要从事肝脏恶性肿瘤方面的研究。［通信作者］ 吴祥元（Ｔｅｌ：０２０－８５２５２２１７，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｘｙ３０７＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ）肝癌相关成纤维细胞的培养和鉴定及其对肝癌细胞增殖的影响 汪田甜１，贾昌昌２，张 琪２，董 敏１，李 星１，陈冠中２，吴祥元１ （１．中山大学附属第三医院肿瘤内科，广东广州５１０６３０；２．中山大学附属第三医院肝移植中心，广东广州５１０６３０）［摘 要］ 目的：分离、培养及鉴定原代肝癌相关成纤维细胞（ ｈＣＡＦ），阐明其在肝癌发生发展中的作用。方法：采用酶消化法分离、纯化人ｈＣＡＦ，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法鉴定其相关蛋白标记物的表达，流式细胞术检测肝癌细胞Ｈｅｐ ３Ｂ经ｈＣＡＦ上清处理后的增殖速度及细胞周期的变化，建立裸鼠移植瘤模型，观察ｈＣＡＦ对肝癌细胞生长的影响。结果：在肝癌组织标本中成功分离出ｈＣＡＦ，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ结果显示ｈ ＣＡＦ特异性地高表达α－平滑肌肌动蛋白（α－ＳＭＡ）。ＣＣＫ８细胞增殖检测试剂盒检测证实，经ｈＣＡＦ上清处理后的Ｈｅｐ ３Ｂ细胞增殖量为完全培养基处理４８ｈ细胞增殖量的１２６．０％、１２５．０％及１２０．５％，细胞增殖量差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５） 。流式细胞术结果显示，经ｈＣＡＦ上清处理后的Ｈｅｐ ３Ｂ细胞增殖速度及细胞周期中处于Ｓ期的细胞数目均高于完全培养基处理的Ｈｅｐ３Ｂ细胞（Ｐ＜０．０５）。ｈＣＡＦ与Ｈｅｐ ３Ｂ共同接种至裸鼠皮下的成瘤体积［（１．３４±０．５２）ｃｍ３］明显大于单独接种Ｈｅｐ ３Ｂ组［（０．５１±０．０９）ｃｍ３］，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。结论：ｈＣＡＦ可以明显促进肝癌细胞系Ｈｅｐ ３Ｂ的生长，其可能在肝癌生长过程中发挥重要作用。［关键词］ 癌相关成纤维细胞；肝细胞肿瘤；增殖；肿瘤微环境 ［中图分类号］ Ｒ３２２．４７ ［文献标志码］ Ａ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐ ａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｐ ｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆ ｈｅｐ ａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓＷＡＮＧ Ｔｉａｎ－ｔｉａｎ１，ＪＩＡ Ｃｈａｎｇ－ｃｈａｎｇ２，ＺＨＡＮＧ Ｑｉ ２，ＤＯＮＧ Ｍｉｎ１，ＬＩ Ｘｉｎｇ１，ＣＨＥＮ Ｇｕａｎ－ｚｈｏｎｇ２，ＷＵ Ｘｉａｎｇ －ｙｕａｎ１（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｕｎ Ｙａｔ－ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇ ｚｈｏｕ５１０６３０，Ｃｈｉｎａ；２．Ｌｉｖｅｒ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｈｉｒｄ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｕｎ Ｙａｔ－ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ，Ｇｕａｎｇ ｚｈｏｕ ５１０６３０，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｓｏｌａｔｅ，ｃｕｌｔｉｖａｔｅ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ（ｈＣＡＦ）ａｎｄ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅｉｒ ｐ ｏｓｓｉｂｌｅ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅｐｒｉｍａｒｙ ｈＣＡＦ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈＣＡＦ ｗｅｒｅ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅｓ ｏｆ Ｈｅｐ３Ｂｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒｈＣＡＦ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｅｒｅ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｈＣＡＦ ｏｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｔｈｏｕｇｈ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ａ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌ ｉｎ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｈＣＡＦ ｗｅｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄα－ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ（α－ＳＭＡ）ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｐ３Ｂｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈＣＡＦ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉａ．Ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｃａｐａｃｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｈｅｐ３Ｂｗｅｒｅ １２６．０％，１２５．０％ａｎｄ １２０．５％ｏｆ ｔｈｏｓｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｍｐ ｌｅｔｅ ｍｅｄｉｕｍｆｏｒ ４８ｈ（Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ ｏｆ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｓ ｐｈａｓｅ ｗｅｒｅ ｈｉｇ ｈｅｒ８３４第３８卷 第３期２０１２年５月吉 林 大 学 学 报 （医 学 版）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．３ Ｍａｙ ２０１２
项目名称：肿瘤干细胞的动态演进及干预研究首席科学家：刘强中山大学 起止年限：2012.1至2016.8 依托部门：教育部
一、关键科学问题及研究内容 拟解决的关键科学问题： 肿瘤干细胞的动态演进及干预研究。本项目将围绕“肿瘤干细胞的动态演进及干预研究”这一关键科学问题，选择造血和消化系统恶性肿瘤为研究对象，以肿瘤干细胞动态演进过程为切入点，通过体内外功能实验及临床标本验证“干性”及转移潜能调控中的关键基因，明确肿瘤干细胞演进的分子机制、关键调控分子和信号通路，探索靶向肿瘤干细胞演进过程的干预方法和手段，阐明肿瘤干细胞的演进过程及靶向干预肿瘤细胞动态演进过程的干预新模式。本研究将为肿瘤干细胞的动态演进模型及创新性靶标药物的临床应用提供充实的理论和实验依据，为攻克肿瘤开创新的突破口。 围绕拟解决的关键科学问题，本项目的主要研究内容是： 1. 肿瘤干细胞的起始与动态演进机制：本课题组将运用TEL-AML1及PML-RARα白血病相关模型，探索白血病干细胞的动态演进过程（白血病起源细胞→白血病前癌干细胞→白血病干细胞）：（1）TEL-AML1 相关白血病起始和发展过程中起源细胞、Pre-LSC和LSC的鉴定，以及这些干细胞动态演进的遗传和表观遗传调控机制；（2）PML-RARα相关白血病起始和发展过程中不同阶段的干细胞鉴定和动态演进机制。另一方面，本课题组还将探讨肝癌干细胞在肝癌发生发展过程（原发、复发及转移）中的动态演进过程。 2. 肿瘤干细胞“干性”的分子调控及临床意义：（1）应用新一代高通量测序技术，系统分析全基因组、全外显子组、转录组、表观遗传组、代谢组等变化，绘制造血和消化系统肿瘤干细胞异质性相关基因序列谱、表达谱和表观遗传学图谱，分析肿瘤干细胞“干性”相关的调控分子及关键信号通路；（2）运用小鼠模型等体内外功能实验对候选分子在肿瘤干细胞动态演进过程中的功能进行鉴定，并通过临床标本检验肿瘤干细胞动态演进模型的临床意义；（3）结合本课题组已有工作基础，展开肿瘤干细胞细胞周期、非对称分裂等分子调控方面的细致研究。 3. 肿瘤干细胞转移潜能获得的分子机制：肿瘤干细胞的“干性”决定着其转移潜能，EMT作为肿瘤转移的重要机制，与肿瘤干细胞的动态演进过程紧密关联，剖析二者之间的相互作用，将为寻找肿瘤发生及转移的靶点提供有力的理论基础：（1）
有丝分裂练习题 例1：用洋葱为材料，观察植物细胞的有丝分裂： （1）洋葱根培养时，由于没有经常换水，结果出现烂根现象，其原因是 。 （2）制作装片时，某学生用1％盐酸在300C下把根尖解离15分钟，然后漂洗、染色、压片，结果观察时发现装片内细胞没有分开，其原因是。 （3）观察装片时，生长点细胞中处于什么时期的细胞最多? ； （4）如果在培养根尖时，用适当浓度的秋水仙素处理，然后按实验步骤操作，就能发现这些细胞有丝分裂期与正常细胞不同，这些细胞的变化是。 例2：在细胞有丝分裂的分裂期开始时，如果它的染色体数为N，DNA含量为Q，则该细胞分裂后，每个子细胞中的染色体数和DNA含量分别是 A．N和Q B．N／2和Q／2 C．N和Q／2 D．N／2和Q 例3：马蛔虫体细胞中有4条染色体，用显微镜观察其受精卵卵裂装片，请回答： （1）若马蛔虫受精卵细胞中DNA含量在细胞周期即将开始时为a，则在 一个细胞周期中核内DNA含量变化的规律是→→。 （2）光镜下，观察到某一处在分裂状态的细胞，其染色体数目为8条， 对此的解释是 （3）马蛔虫的受精卵连续分裂四次后，每个细胞中有染色体条。 （4）画出马蛔虫细胞有丝分裂后期示意图，并注明各部分名称。 例4；如右下图是两个细胞有丝分裂的图示，请据图回答； （1）A图示细胞有丝分裂，B图示 细胞的有丝分裂，判断的依据是。 （2）A图示有丝分裂期，主要特点是 （3）B图示有丝分裂的期，其主要特点是 。 一、选择题； 1．用某种物质强烈抑制肿瘤细胞的DNA复制，这些细胞将会停留在细胞周期的A．间期B．前期C．中期D．末期 2．一般情况下，下列有细胞周期的是 ①根毛细胞②叶肉细胞③生发层细胞④分生区细胞：⑤神经细胞⑥茎的形成层细胞 ⑦口腔上皮细胞⑧洋葱表皮细胞 A．①②③B．③④⑥C．④⑤⑦D．⑥⑦⑧ 3．下列关于细胞有丝分裂的叙述中不正确的是 A．间期染色体复制后，每个细胞中的染色体就增加一倍 B．分裂前期和分裂中期时，细胞中的染色体数目是相同的 C．分裂前期和分裂中期的每个染色体都含有两个姐妹染色单体 D．后期的细胞中的染色体不含有染色单体 4．洋葱体细胞中含有8对同源染色体，可观察到32条染色体的细胞是 A．根毛区细胞B．根尖分生区细胞C．种子的胚乳细胞D．花粉粒5．连续分裂的细胞，相邻的两周期可表示为下图，对此不正确的叙述是 A．a+b是一个细胞周期B．a段的主要变化是DNA的复制及有关蛋白质的合成C．b+c是一个细胞周期D．d段主要完成遗传物质的平均分配 6．下列关于动、植物细胞有丝分裂的区别，其中正确的是 A．分裂前期染色体的活动不同B．着丝点的分裂和纺锤体的形成方式不同C．着丝点的分裂和细胞质的形成方式不同D．纺锤体的形成和细胞质的分裂方式不同7．下列关于动、植物细胞有丝分裂过程基本相同的叙述中，错误的是 A．间期进行染色体的复制B．中期形成纺锤体 C．后期染色单体分离D．末期染色体平均分配到两个子细胞中去8．保证两个子细胞中染色体的形态和数目与母细胞完全相同的机制是 A．染色体复制B．着丝点的分裂C．纺锤丝的牵引D．A、B、C三项均起作用9．用高倍镜观察洋葱表皮细胞装片时，能清楚地看到细胞核，但看不到染色体。主要原因是A．洋葱表皮细胞结构不完整B．洋葱表皮细胞处于分裂期 C．洋葱表皮细胞不分裂D．洋葱表皮层数太多 10．人体小块擦伤的皮肤能重新长好，主要是由于发生层细胞能进行 A．无丝分裂B．减数分裂C．有丝分裂D．减数分裂和有丝分裂11．右图是下列那种细胞处于何时期的分裂图。 ①肝细胞②茎形成层细胞③蓝藻④有丝分裂前期 ⑤有丝分裂后期⑥有丝分裂末期 A．①④ B．③⑥ C．②⑤ D．②④ 12．有丝分裂前期所发生的最重要的变化 A．出现染色体B．出现纺锤体C．核膜解体D．核仁消失 13．一般来说参与植物细胞有丝分裂这一生理过程的细胞器有 ①线粒体②核糖体③高尔基体④中心体⑤内质网 A．①②③B．②③④C．③④⑤D．①③⑤ 14．在显微镜下能看到细胞核的是 A．洋葱根尖细胞有丝分裂的中期B．洋葱根尖细胞有丝分裂的后期 C．洋葱根尖中刚分裂形成的两个子细胞D．正在分裂的细胞 15．无丝分裂与有丝分裂的最主要区别是 A．无染色体的变化和纺锤体的出现B．无染色体的复制 C．形成的子细胞染色体数目减少D．形成的两个子细胞大小不同
现代生物医学进展https://www.doczj.com/doc/e713900463.html, Progress in Modern Biomedicine Vol.12NO.1JAN.2012 白藜芦醇对肝癌细胞增殖和凋亡影响及其机制* 戴维奇徐凌王锋卫巍沈杰黄银实杨丽娟何姗姗郭传勇△ （同济大学附属第十人民医院消化内科上海200072） 摘要目的：研究白藜芦醇（resveratrol ，Res ）对肝癌细胞LM3周期及凋亡的影响并探讨其可能的分子机制。方法：分别用50、 100、150、200μmol/L 浓度的Res 作用LM3肝癌细胞24、48和72h ，CCK-8测定Res 对细胞的增殖作用；分别以相同剂量的DMSO 及 无处理的LM3细胞为随机和空白对照，观察150μmol/L Res 作用72小时后对肿瘤细胞周期及凋亡的影响； Real time-PCR 及Western blot 分析Res 对LM3细胞中Bak 和Bcl-2mRNA 及蛋白表达的影响。结果： Res 体外能明显抑制肝癌细胞LM3的生长增殖，在一定范围内呈现作用浓度（F=101.183，P ＜0.001）和时间依赖性（F=192.371，P ＜0.001）； 150μmol/L Res 作用72小时后能显著减缓肝癌细胞LM3的周期转换（P ＜0.001），并诱导明显的细胞凋亡效应（P ＜0.001）；进一步的检测发现Res 作用LM3细胞后，Bak mRNA （P=0.002，0.007）及蛋白（P =0.004，0.01）表达增强，而Bcl-2mRNA （P=0.027，0.007）及蛋白（P =0.001，0.001）表达 出现显著下降。结论：Res 可能通过对Bak 及Bcl-2表达的调节来抑制肝癌细胞LM3的增殖，并诱导其细胞凋亡。 关键词：肿瘤；周期； Bcl-2；Bak 中图分类号：R735.7，R285.6文献标识码：A 文章编号：1673-6273（2012） 01-16-04Effects of Resveratrol on Cell Cycle and Apoptosis of Hepatocellular Carcinoma Cells and its Possible Mechanism* DAI Wei-qi,XU Ling,WANG Feng,WEI Wei,SHEN Jie,HUANG Yin-shi,YANG Li-juan,HE Shan-shan,GUO Chuan-yong △ （Tong Ji University,Department of Gastroenterology,Tenth People's Hospital,Shanghai,200072） ABSTRACT Objective:To investigate the effect of resveratrol (Res)on cell cycle and apoptosis of hepatocellular carcinoma LM3cells and the possible molecular mechanisms.Methods:Cell counting kit-8(CCK-8)assay was used to examine the effect on cell prolifer-ation of hepatocellular carcinoma LM3cells treated by Res with the concentration of 50μmol/L for 24and 72hours;LM3cells were treated by DMSO or no treatment as randomized and blank control,and then were detected.The expression of Bak and Bcl-2mRNA and protein in LM3cells treated by Res were evaluated by Real-time PCR and western blot,respectively.Results:Res inhibited the prolifera-tion of LM3cells in time-dependent manner （F=101.183，P ＜0.001）and concentration-dependent manner （F=192.371，P ＜0.001）in vit-ro.It was found that Res could accelerate cells cycle transition and induce apoptosis after treatment by Res at 150μmol/L for 72hours.The expression of Bak mRNA (P=0.002，0.007)and protein （P =0.004，0.01） were obviously up-regulated on treated LM3cells,while the expression of Bcl-2mRNA （P=0.027，0.007）and protein （P =0.001，0.001） decreased remarkably.Conclusion:Res can not only in-hibit proliferation of LM3cells but also induce cellular apoptosis through accommodating the expression of Bak and Bcl-2. Key words:Carcinoma;cycle;Bcl-2;Bak Chinese Library Classification(CLC):R735.7,R285.6Document code:A Article ID:1673-6273(2012)01-16-04 *基金项目：国家自然科学基金(81072005)。上海市科委基金(0941*******) 作者简介：戴维奇(1985-)，男，硕士生； E-mail ：dai_yue@https://www.doczj.com/doc/e713900463.html, △通讯作者：郭传勇， E-mail ：guochuanyong@https://www.doczj.com/doc/e713900463.html, （收稿日期：2011-07-12接受日期：2011-08-06）前言 原发性肝癌（primary liver cancer,PLC ）包括肝细胞癌（hep- atocellular carcinoma,HCC ）、肝胆管细胞癌（cholangiocarcino- ma ）、肝细胞及胆管混合癌等几种类型， PLC 是我国高发肿瘤，位于恶性肿瘤病死率第二位，这其中又以乙型肝炎病毒感染后 的肝细胞癌为主[1]。因此， 针对能够明显抑制原发性肝细胞肿瘤的药物研究就显得十分重要。 白藜芦醇（Resveratrol,Res ）是1940年首次从毛叶黎芦的 根部分离得到的非黄酮类多酚化合物。Res 在新鲜葡萄皮中含 量较高，在中药植物虎杖中含量最为丰富。因Res 具有抗炎、抗氧化、抑制血小板聚集、保护心血管、鳌合自由基等作用，长期以来一直广泛用于心血管病的防治中。最近研究表明Res 可显著抑制多种人类肿瘤细胞的生长增殖[2-6]，本研究主要通过白藜芦醇处理肝癌细胞株LM3，观察白藜芦醇对肝癌细胞增殖及凋亡的影响，检测相关基因及蛋白的变化情况，以期阐明白藜芦醇抗肿瘤的可能机制。1材料与方法1.1细胞和主要试剂人肝细胞癌细胞株LM3(购自美国ATCC 公司)；Res(纯度>99.9％)(Sigma)用二甲基亚(DMSO)溶解后配成100mmol ／L 16··
体外刺激淋巴细胞增殖试验 1 样品配制 精确称取样品于灭过菌的eppendorf管中，用无菌的PBS配制成浓度5mg/mL 的样品液。充分溶解然后以15000g离心30min，无菌条件下将上清转移至新的无菌eppendorf管中，将样品稀释成所需浓度待用。 2 小鼠淋巴细胞的制备 选取8-10周龄，体重22±1g的Balb c或C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死，取脾脏，用PBS冲洗3~4次。将脾脏磨碎后过100目筛，过筛后的混悬液以400g/min 离心6min。吸去上清液，沉淀中按每只小鼠1.5mL的量加入氯化铵红细胞裂解液，反复冲打，静置10min后，加PBS至50mL，然后以400g/min离心6min，吸去上清液，加PBS缓冲液冲洗并离心2遍后，吸去上清，加入RPMI1640培养基（含双抗及10％胎牛血清）混匀，用细胞计数仪计数并稀释成2×106个/mL细胞液备用。 3 细胞培养 将2×106个/mL淋巴细胞悬浮液加至96孔板中，每孔加180μL，同时加入20μL样品液，以20μL PBS和20μL 60μg/mL的PHA溶液分别作阴、阳性对照。于37℃、含5%的CO 条件下培养3d，加入相应试剂测定 2 4 淋巴细胞增殖率的测定 4.1 Alamarblue试剂测定法 在上述细胞培养的96孔板中，每孔分别加入20μL Alamar Blue试剂，再培养，加Alamar Blue试剂前及变色后分别用ELISA自动读板仪测定570nm和600nm处的吸光度，然后根据Alamar Blue试剂的公式计算各种样品对淋巴细胞增殖率。计算公式为： 增殖率(%)=[117216×Aλ570(sample)-80586×Aλ600(sample)] /[117216×Aλ570(control)-80586×Aλ600(control)]×100% 4.2 MTT法测定 4.2.1 MTT 溶液的配制方法 称取MTT 0.5g溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）中，用0.22μm滤膜过滤分装，－20℃避光保存。在配制和保存的过程中容器最好用铝箔纸包住。在用酶标仪检测结果的时候为了保证实验结果的线性，MTT吸光度最好在0-0.7 范围
干细胞研究进展(综述) Advances in the research of stem cells（LR） 【摘要】：干细胞是人体及其各种组织细胞的最初来源,具有高度自我复制、高度增殖和多向分化的潜能。干细胞技术是生物技术领域最具有发展前景和后劲的前沿技术，其已成为世界高新技术的新亮点，势将导致一场医学和生物学革命。干细胞研究正在向现代生命科学和医学的各个领域交叉渗透,干细胞技术也从一种实验室概念逐渐转变成能够看得见的现实。干细胞研究作为一门新兴学科已成为生命科学中的热点。本文对近几年来国内外对干细胞的研究现况作一综述。 【关键词】：干细胞因子帕金森病神经干细胞糖尿病 ABSTRACT：Stem cells are the body and cells of various tissues of origin, has high self replication, high proliferation and multilineage differentiation potential. Stem cell technology is the field of biotechnology has the most development prospect and potential of cutting-edge technology, it has become a new bright spot in the world of high-tech, will lead to a revolution in medicine and biology. The research of stem cell is to modern life science and medical fields intersection, stem cell technology from a laboratory concept gradually transformed to be able to see the reality. Stem cell research as a new discipline has become the hotspot of life science. Based on the domestic and abroad in recent years on stem cell research summarizes. Keywords:Stem cell factor Parkinson disease Neural stem cells Diabetes mellitus 干细胞技术最显著的特征就是能再造一种全新的、正常的甚至更年轻的细胞、组织或器官。由此人们可以用自身或他人的干细胞和干细胞衍生组织、器官替代病变或衰老的组织、器官，并可以广泛涉及用于治疗传统医学方法难以医治的多种顽症。 干细胞研究是一门新兴的学科,干细胞生物学研究与应用几乎涉及所有的生命科学和生物 医学领域。 一、目前干细胞的主要研究热点
目录 中文摘要 (Ⅰ) Abstract (Ⅲ) 缩略语 (Ⅶ) 前言 (1) 研究现状、成果 (1) 研究目的、方法 (4) 一、对象和方法 (5) 1.1材料和仪器 (5) 1.2试剂配制 (6) 1.3实验方法步骤 (7) 1.3.1细胞培养 (7) 1.3.2Western blot检测GDF11蛋白表达 (10) 1.3.3CCK-8法检测SMMC-7721细胞体外增殖能力 (14) 1.3.4平板克隆形成实验 (14) 1.3.5CCK-8检测SMMC-7721细胞顺铂敏感性 (15) 1.3.6流式细胞术检测细胞周期分布 (15) 1.3.7裸鼠皮下移植瘤增殖实验 (16) 1.3.8免疫组化法检测GDF11、Ki-67蛋白表达及肿瘤微血管密度 (17) 1.3.9免疫组化结果判定 (18) 1.3.10统计学方法 (18) 二、结果 (20) 2.1GDF11在肝细胞癌SMMC-7721细胞中表达水平检测 (20) 2.2 GDF11过表达明显降低肝细胞癌SMMC-7721细胞体外增殖能力 (20) V
2.3 GDF11过表达明显降低SMMC-7721细胞的克隆形成能力 (21) 2.4 GDF11过表达增加肝细胞癌SMMC-7721细胞对顺铂的敏感性 (22) 2.5 GDF11过表达将肝细胞癌SMMC-7721细胞阻滞在G1期 (23) 2.6 GDF11过表达抑制SMMC-7721细胞裸鼠皮下移植瘤的增殖能力 (24) 2.7 GDF11、Ki-67、及CD34蛋白在裸鼠皮下移植瘤组织中的表达 (25) 2.8 GDF11蛋白、Ki-67蛋白、MVD的相关性分析 (27) 讨论 (28) 结论 (33) 参考文献 (34) 发表论文和参加科研情况说明 (40) 综述 (41) GDF11蛋白研究进展 (41) 综述参考文献 (46) 致谢 (49) 个人简历 (50) VI
肝癌干细胞的研究进展 肝癌是世界第5大常见癌症，以其高致死率成为名副其实的健康杀手。而肝癌发生发展的生物学机制仍未明确【1】。而近年来随着肿瘤干细胞概念的提出，同样在肝癌组织中发现了一群能显著影响肝癌发生、发展，并影响肿瘤复发、转移及耐药性的一类细胞，即肝癌干细胞（LCSCs）。肝癌干细胞（Liver Cancer stem cells，LCSCs）概念的提出，为肝癌的认识及诊治提供了新的思路【2】。本文即肝癌干细胞做一综述。 【关键词】干细胞肝癌LCSC 肿瘤干细胞的概念： 在肿瘤组织中，肿瘤细胞表现出较正常细胞不同的多种形态学及功能学上的差异，传统上多认为这种差异是由于肿瘤细胞内正常基因的过表达【3】或异常突变【4】所致。同时细胞生长赖以维持的微环境亦可影响正常细胞的向恶性细胞演变【5】。近年来多向研究表明，肿瘤细胞的多样性及异质性是一类具有类似于正常干细胞的自我修复，多向分化及无限增殖能力的细胞群分化演变的结果，这类细胞群即被称之为肿瘤干细胞（CSCs）。【6-7】肿瘤干细胞是影响肿瘤转移、耐药性及复发的重要因素，因此，基于肿瘤干细胞的诊治将是肿瘤（包括肝癌）诊治的关键。 CSCs最初是从白血病中分离得到的，随后，在多种实体肿瘤组织，包括胃癌、前列腺癌、胰头癌等中先后发现了类似的细胞群。但现阶段关于CSCs的具体来源仍不甚明确，现有的说法认为，其来源：一是干/祖细胞周围细胞微环境的变化和细胞本身基因异常表达所致干细胞的肿瘤化；二是干细胞增殖产生的前体细胞发生突变，丧失成熟能力，仅保留高度增殖能力所致。
而关于肝癌干细胞（LCSCs）的来源亦可分为： 一、慢性肝病（Chronic Liver Disease，CLD）介导下，反复的慢性炎症刺激及肝细胞再生过程中，正常肝干/祖细胞的基因表达及遗传调控的异常而产生。【8】 二、肝细胞所处微环境的改变，正常肝脏细胞的脱分化所致【9】。Barone 等人经过实验发现，正常成熟肝脏细胞或胆管上皮细胞在特殊条件下以可发展成为具有无限制恶性增殖分化的细胞群。【10】 LCSCs关系到肝癌起病、进展及治疗的预后。其概念的提出为对肝癌的认识和诊疗提供了新思路。目前，如何有效分离出LCSCs，并在此基础上实现对肝癌的靶向治疗将是临床上对于肝癌诊疗的重点。现有的常用分选方法有：1）基于LCSCs细胞表面标志物（cell surface marker）的分选法； 关于LCSCs的细胞表面标志物： 1.EpCAM：EpCAM (Epithelial Cellular Adhesion Molecule)，亦称为CD326、17-A、ESA、EGP4，是一种由GA-733-2基因编码的分子量为40kDa的跨膜糖蛋白。EpCAM 在早期肝脏发育中就有表达，广泛存在于肝脏干细胞及肝母细胞中，而正常成熟肝细胞上无表达【11】，它的活化和高表达预示了肿瘤的活性、侵袭能力和恶性程度。Bae【12】等检测到EpCAM在结节性肝恶性肿瘤中存在高表达。而沉默EpCAM基因后，肝癌的肿瘤等级、APF水平等显著下降。 2．CD133(cluster of differentiation 133)又名AC133，同样也是一种细胞跨膜糖蛋白，表达于多种干/祖细胞表面，在肝脏肿瘤组织中，CD133（+）细胞相对于CD133（-）的细胞具有更强的增殖能力与致瘤性【13】。Yin【14】等人以1000个CD133（+）细胞注入小鼠皮下导致成瘤。而CD133（-）细胞不具备致瘤性。
EFTUD2维持肝癌细胞生存并促进其增殖、侵袭转移的相关研究研究背景肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。最新的全球癌症数据显示,肝癌全球发病率位列第八,死亡率位列第四,其中男性中肝癌死亡率位居前三。 而全球每年一半以上的肝癌新发及死亡病例均发生在中国。在我国,肝癌患者能够早期诊断并接受手术治疗的比例仅有10%-20%,大多数患者在诊断为肝癌时己是晚期或终末期,治疗手段非常局限且预后较差。 多病灶的发展、肝内或远处转移是肝癌患者手术切除后,预后差和高复发率的主要原因。然而,目前关于肝癌术后复发和转移的机制以及有效的控制手段仍未明确。 因此,新的预测指标亟待发现以提高肝癌的早期诊断,进而降低肝癌致死率。延长因子结合蛋白(elongation factor Tu GTP binding domain-containing protein,EFTUD2)是U5小核核糖核蛋白(U5 snRNP)的核心组件,是一种高度保守的GTP酶,参与催化RNA的剪接以及剪接复合体剪接后的解离。 文献报道eftud2基因突变可引起的下颌骨发育不全、头小畸形、唇裂等头面部发育畸形,提示EFTUD2可能是生长发育所必需。此外,研究发现EFTUD2能够介导乳腺癌细胞及神经前体细胞的凋亡。 而EFTUD2在肝癌发生发展中的作用尚无相关报道。本研究通过检测EFTUD2在肝癌组织及其匹配的癌旁组织和正常肝组织中的表达及分布情况,分析EFTUD2对肝癌术后患者生存预后的影响,并进一步探索EFTUD2在肝癌发展过程中发挥的作用及其相关的分子机制。 研究结果1.通过TCGA数据库及疫组织化学染色(IHC)检测组织芯片及126例肝癌及其对应的癌旁组织中EFTUD2的表达情况,结果表明肝癌内EFTUD2高表
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 干细胞及其研究进展 1 干细胞及其研究进展姓名： 曹晶晶导师： 邓锦波专业: 神经生物学学号： 104753130913 2 干细胞及其研究进展摘要： 干细胞是一类具有自我更新能力的多向分化潜能细胞，在一定 条件下可以分化为多种功能的组织和器官，具有重要的理论研究意 义和临床应用价值。 近年来的研究成果不仅揭示了许多有关细胞生长发育的基础理 论难题，也在创伤修复、神经再生、抵抗衰老、糖尿病、帕金 森氏症、老年痴呆、白血病、肿瘤等疾病的治疗方面显示了巨大 的应用潜力，是应用生物学进入一个崭新的领域。 关键词： 干细胞；分化；诱导性多能干细胞；糖尿病；肿瘤；伦理 争议；正文： 1. 干细胞在人类生命形成的开始，单个受精卵可以分裂发 育形成不同的组织和器官，并通过进一步分裂分化，形成生命个体。 在成体细胞中，大部分高度分化的细胞则失去了再分化的能力， 而特定组织正常的生理代谢或病理损伤也会引起组织或器官的修复 再生，这种具有在分化能力的细胞，即为干细胞。 1 / 17
在一定的条件下，它可以分化成多种功能的器官组织。 这些细胞呈圆形或椭圆形，体积较小，核质比大，具有较强的端粒酶活性，因此具有较强的增殖能力。 干细胞是一种未充分分化、尚不成熟的细胞，其再生各种组织器官和人体的潜在功能，吸引着越来越多人的眼球。 2. 干细胞的研究历史干细胞的研究被认为起始于二十世纪六十年代，加拿大科学家 James E. Till 和 Ernest A. McCulloch 发现并命名造血干细胞之后。 60 年代，几个近亲种系的小鼠睾丸畸胎瘤的研究表明，其来源于胚胎干细胞，确立了胚胎癌细胞是一种干细胞； 1968 年，Edwards 和 Bavister 在体外获得了第一个人卵子； 1978 年，第一个试管婴儿 Louise Brown 在英国诞生。 1981 年， Evan, Kaufman 和 Martin 从小鼠胚泡内细胞群分离出小鼠 ES 细胞，建立了小鼠干细胞体外培养条件，将干细胞注入上鼠，能诱导形成畸胎瘤。 1984-1988 年， Anderews 等人从人睾丸畸胎瘤细胞系 Tera-2 中产生出多能的、克隆化的胚胎癌细胞，克隆的干细胞在视黄酸的作用下分化形成神经元细胞和其他类型的细胞。 1992年， Reynolds和Richards先后在成年鼠的纹状体和海马中分离出神经干细胞。 1996年，轰动世界的polly羊诞生，引发了干细胞研究的热潮。
实验室用肝癌细胞株 细胞英文名称Hep G2 [HepG2]细胞中文名人肝癌细胞 形态特性上皮样生长特性贴壁生长 特征特性该细胞来源于一名15岁的白人少年的肝癌组织。该细胞表达甲胎蛋白、白蛋白、α-2-巨球蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、转铁蛋白、α-1-抗凝乳蛋白酶、结合珠蛋白、铜蓝蛋白、纤溶酶原、补体C4、C3激活物、纤维蛋白原、α-1酸性糖蛋白、α-2-HS-糖蛋白、β-脂蛋白、视黄醇结合蛋白；表达胰岛素受体和胰岛素样生长因子IGFⅡ的受体；该细胞具有3-羟基-3-甲酰辅酶A还原酶和肝甘油三酯脂肪酶的活性。目前尚未证明该细胞中有HBV基因组。 培养基MEM-EBSS: Minimum Essential Medium (MEM Eagles with Earle＇s Balanced Salts) 血清10%FBS其它因子1%NEAA 传代方法1:4~1：6传代；每周2次。传代情况C5 冻存条件基础培养基+5%DMSO+20%FBS支原体检测阴性 细胞英文名称SMMC-7721 [SMMC7721]细胞中文名人肝癌细胞 形态特性上皮样生长特性贴壁生长 特征特性取人肝癌组织，采用静置和旋转管法培养11天细胞开始生长，首次传代23天。AFP阳性。用Northern blot方法，未能检测到细胞中1.3kb LFIRE-1/HFREP-1 mRNA的表达，免疫缺陷小鼠体内可成瘤。 培养基RPMI 1640 (w/o Hepes) 血清10%FBS其它因子无 传代方法1:3传代；3~4天1次。传代情况C5 冻存条件基础培养基+5%DMSO+20%FBS支原体检测阴性 细胞英文名称Hep3b 细胞中文名人肝癌细胞 形态特性上皮细胞样生长特性贴壁生长。 特征特性该细胞源自一位患有肝癌的7岁黑人男童，HBV阳性。 培养基MEM-EBSS: Minimum Essential Medium (MEM Eagles with Earle＇s Balanced Salts) 血清10%FBS 其它因子无 传代方法1:4～1:6传代，每周换液2次传代情况C2 冻存条件基础培养基+8%DMSO+20%FBS 支原体检测培养法（-） 国内还有，： 小鼠肝癌细胞Hepa 1-6 [Hepa1-6] 人胆管细胞型肝癌细胞HCCC-9810 小鼠肝癌瘤株H22 人肝癌细胞HHCC 人肝癌细胞PLC/PRF/5 人肝癌细胞HB611 人肝癌细胞BEL-7402 人肝癌细胞QGY-7701 （有疑问细胞待定） 人肝癌细胞QGY-7703 （有疑问细胞待定） 人肝癌细胞BEL-7404 人肝癌细胞BEL-7405
网络出版时间：2012-11-08 16:08 网络出版地址：https://www.doczj.com/doc/e713900463.html,/kcms/detail/61.1399.R.20121108.1608.001.html HMGB1对人肝癌细胞增殖及转移能力的影响 刘亚萍，董蕾，史海涛，刘欣，鲁晓岚，姜炅 （西安交通大学医学院第二附属医院消化科，陕西西安710004) 摘要：目的观察高迁移率族蛋白1（HMGB1）对人肝癌细胞株HepG2体外增殖及转 移能力的影响，并阐明其可能的作用机制。方法MTT法检测细胞增殖能力及细胞对 Matrigel基质胶的粘附能力；Transwell小室模型测定细胞侵袭及迁移能力；Western blot 和逆转录PCR（RT-PCR）分别检测基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶 9(MMP-9)和血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白及mRNA表达情况。结果HepG2经不 同质量浓度（10、100、1000ng/mL)的重组人HMGB1（rHMGB1）干预，24、48、72h 细胞增殖能力均明显高于对照组（P<0.01）；随着时间和浓度的增加，细胞增殖能力逐 渐增强。100ng/mL的rHMGB1干预HepG2 48h，细胞对Matrigel基质胶的粘附能力较 对照组明显增高(P<0.01)，侵袭和迁移实验中穿膜细胞数均明显多于对照组(P<0.01)。 此外，rHMGB1可明显上调MMP-9和VEGF的蛋白及mRNA表达水平(P<0.01)，但 MMP-2的蛋白及mRNA表达与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论HMGB1 可促进人肝癌细胞的增殖、粘附、侵袭及迁移能力，这可能与上调MMP-9和VEGF 蛋白及mRNA表达水平有关。 关键词：HMGB1；肝癌细胞；增殖；肿瘤转移；基质金属蛋白酶2(MMP-2)；基质金 属蛋白酶9(MMP-9)；血管内皮生长因子(VEGF) 中图分类号：R735 文献标志码：A 文章编号：1671-8259 Effects of HMGB1 on proliferative and metastatic abilities of hepatoma cell line HepG2 LIU Ya-ping, DONG Lei, SHI Hai-tao, LIU Xin, LU Xiao-lan, JIANG Jiong (Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital, Medical School of Xi’an Jiao tong University, Xi'an 710004, China) 收稿日期：2012-05-20 修回日期：2012-09-16 基金项目：国家自然科学基金青年基金（No.81200310） Supported by the Youth Fund of National Natural Science Foundation of China (No.81200310) 通讯作者：董蕾，主任医师，E-mail：dong556 @ https://www.doczj.com/doc/e713900463.html, 作者简介：刘亚萍（1985-），女（汉族），硕士研究生，主要研究慢性肝病及胃肠动力. E-mail: liuyaping5222491 @ https://www.doczj.com/doc/e713900463.html,