基于四氢异喹啉-3-羧酸骨架的热休克蛋白90抑制剂的设计、合
成及抗肿瘤活性研究
热休克蛋白90(heat shock protein 90,Hsp90)是ATP依赖的分子伴侣蛋白,参与客户蛋白的构象成熟和功能稳定,防止蛋白经由泛素蛋白酶体系统降解。在Hsp90调控的客户蛋白中,有很多是致癌信号通路中的原癌基因表达蛋白或重要的信号转导因子,参与调控肿瘤细胞的基本特征,与肿瘤的发生和发展关系密切。
因此,针对Hsp90单一靶点的单一用药抑制其伴侣功能,导致多种客户蛋白的降解,多重阻断肿瘤信号通路,最终摧毁肿瘤赖以生存的整个信号通路网络,能够同时拮抗多个甚至全部肿瘤细胞的标志性特征,有效减少药物耐受。在充分调研文献的基础上,针对Hsp90蛋白N端ATP结合域的三维结构及Hsp90与其抑制剂的作用模式进行了深入的研究。
采用基于片段的药物设计(FBDD)方法,选取根赤壳霉素的5-氯-2,4-二羟基苯甲酸片段,以四氢异喹啉-3-羧酸为骨架,设计、合成了(S)-Tic(A1-13)和(R)-Tic(B1-13)两个系列的化合物。抗肿瘤细胞增殖活性实验揭示了目标化合物的构效关系,含手性(R)-Tic骨架的分子活性更高。
CETSA靶向Hsp90α活性筛选结果印证了抗肿瘤细胞增殖活性实验结
果,(R)-Tic骨架的B系列化合物靶向Hsp90α,而且其芳香侧链提高化合物的活性。两轮活性筛选结果表明,含(R)-Tic骨架的化合物B7呈现最强的抗肿瘤细胞增殖活性和最佳的靶向Hsp90α活性。
CETSA“熔化曲线”和ITDRFCETSA(等温剂量反应)曲线证实化合物B7在胞内直接与Hsp90α结合。此外,如同公认的Hsp90抑制剂GA,化合物B7同样能够引起Hsp90客户蛋白水平下调和Hsp70水平上调,进一步证实了化合物B7靶向
Hsp90。
分子模拟结果阐明了化合物B7活性最佳的原因,(R)-Tic骨架维持小分子独特的活性构象,苄胺侧链深入诱导疏水口袋,与氨基酸残基Phe138形成π-π相互作用。所有的这些特性保证化合物B7是一个可靠的Hsp90抑制剂的先导化合物。
为了提高先导化合物B7苄胺侧链与疏水口袋的空间适配,我们设计、合成了C系列侧链苯环取代衍生物和D系列侧链芳杂环衍生物。活性筛选实验显示芳环取代基的种类、个数、位置显著影响化合物的活性。
芳环对位单取代的氢键受体取代基有利于提高化合物活性,其中含对位吡啶基的化合物D4活性最佳。CETSA“熔化曲线”和ITDRFCETSA曲线证实化合物D4在胞内直接与Hsp90α结合。
此外,同GA 一样,化合物D4同样能够引起Hsp90客户蛋白水平下调和Hsp70水平上调,进一步证实了化合物D4靶向Hsp90。分子模拟结果阐明了化合物D4活性最佳的原因,5-氯-2,4-二羟基苯甲酰基片段与Hsp90 口袋底部结
合,(R)-Tic骨架维持D4独特的活性构象,酰胺侧链深入诱导疏水口袋,吡啶环不仅与氨基酸残基Phe]38形成π-π相互作用,而且与氨基酸残基Tyr139形成氢键结合。
抗肿瘤细胞增殖活性普筛实验表明化合物D4具有广谱的抗肿瘤细胞增殖活性,并且这种活性呈现时间与浓度依赖性。在MDA-MB-453细胞中,D4诱导细胞G0/G1期阻滞。
Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术和western blot实验证实D4诱导MDA-MB-453细胞凋亡。在NF-κB信号途径中IKK是关键激酶。
Hsp90抑制剂D4不仅降低IKK的蛋白水平,而且还能通过磷酸化Hsp27降低IKK的生物活性。通过对IKK的调控,D4成功地抑制TNF-α诱导的NF-κB的活化。
综上所述,化合物D4是一个可靠的Hsp90抑制剂,具有进一步探索其生物作用机制的价值。化合物D4的进一步结构优化集中在四氢异喹啉片段。
化合物D4的分子模拟结果显示四氢异喹啉的苯环临近Lys58并且朝向溶剂暴露区,就此两种优化策略产生E系列化合物和F系列化合物。期望与Lys58产生氢键作用提高靶向活性,同时优化物理化学性质和药代动力学行为,提高用药安全性。
目前,这两个系列化合物的合成及活性筛选工作已完成,抗肿瘤机制研究正在进行中。综上,本课题基于Hsp90 N端ATP结合域的三维结构及抑制剂与Hsp90的作用模式,综合应用药物化学、化学生物学、计算机化学等前沿学科,合理设计、合成了系列的四氢异喹啉-3-羧酸类化合物。
引入细胞热转变分析(CETSA)检验化合物的靶向性,并对代表性化合物进行了深入的机制研究。本课题的研究内容拓展了 Hsp90抑制剂的结构类型,为下一代抑制剂的研发提供了借鉴意义。